Summary
フットプリント分析は、マウスの運動異常を定量化する研究者のためのデジタル化された歩行分析プログラムに代わる低コストの代替手段です。その速度、シンプルさ、縦方向の可能性のために、それはマウスモデルの行動表現型に最適です。
Abstract
動物の移動の測定は、所定の疾患、傷害、または薬物モデルの表現型を記述するために使用される一般的な行動ツールです。ここで示す歩行分析の低コスト方法は、マウスモデルにおける歩行異常の簡単かつ効果的な尺度である。足跡は、マウスの足を非毒性の洗浄可能な塗料で塗装し、被験者が紙の上のトンネルを歩くことを可能にすることによって分析されます。テストトンネルの設計は、自然なマウスの動作と小さな暗い場所に対する親和性を利用します。各マウスのストライドの長さ、ストライド幅、つま先の広がりは、定規と鉛筆を使用して簡単に測定できます。これは確立された信頼性の高い方法であり、デジタル システムに類似したいくつかのメトリックを生成します。このアプローチは、表現型プレゼンテーションの早い段階でストライドの変化を検出するのに十分な敏感さであり、非侵襲的なアプローチのために、寿命または表現型プレゼンテーション全体のグループのテストを可能にします。
Introduction
ロコモーションは、複雑な神経学的および筋骨格系の調整を必要とし、運動経路の単一の側面における欠損は、観察可能な歩行異常1、2を生成することができる。歩行分析は、特定の病気、傷害、または薬物が動物の動きにどのように影響するかに関する定量化可能な行動データを提供するので、マウスモデルをテストする研究者にとって重要なツールです3。しかし、歩行のデジタル化された分析には、トレッドミル、カメラ、および関連するソフトウェアを購入する必要があり、研究者にとっては非常に高価な場合があります。歩行解析は、運動機能の縦方向の変化を追跡するために断続的に使用されることが多いため、散発的に使用した場合に支出を正当化することは困難である場合があります4。デジタル化された分析は、単純なフットプリント分析よりも詳細な歩行メトリックを提供するかもしれませんが、これらのより複雑なメジャーは、行動表現型5の特性を決定するために必ずしも必要または関連しているとは限りません。
ここでは、デジタル化された歩行分析プログラム6,7に代わる迅速かつ機密性の高い代替手段として、低コストの手動フットプリント分析方法を紹介します。手動フットプリント分析は、多数のマウス病モデル4、7、8、9、10、11の多数の歩行差を検出することが実証されています。 ,12,13,14,15,16,17, そして、少なくとも1つのケースでは、この低コストの方法は、歩行の変化を特定しました。一般的なデジタル化された歩行分析プログラム12によって検出されませんでした。材料の総コストは公称であり、それは容易に他のげっ歯類の研究モデルに合わせることができる。
データを描画できる歩行メトリックは多くありますが、ここでは、ストライドの長さ、歩幅(別名「トラック幅」)、つま先の広がりの 3 つの特定のメトリックに焦点を当てます。評価するパラメータはモデルごとに決定する必要があります。歩行分析のこの方法は、認知機能を測定するように設計されていない、と歩行16の複雑な生体力学的測定を必要とする研究のために推奨されません。
運動ニューロン変性と筋萎縮を特徴とする神経筋疾患であるX連結脊髄およびバルバー筋萎縮症(SBMA)をモデル化する前および後の症候性マウスのコホートからの行動データを提示する。これらのマウスは、他の疾患特異的な型分型の発症と一致する歩行の進行性の欠損を開発する。これは、この方法の有効性と特異性を示し、影響を受ける動物と非影響動物を確実に区別できることを確認します。
本研究の実験マウスは、C57BL/6バックグラウンド(nエクスト=12)上の2.5(症状前)および9ヶ月齢(症後)BAC fxAR121トランスジェニックマウスであった。このモデルは私たちの研究室で生成され、完全にSBMA9の強力なマウスモデルとして特徴付けられました.非トランスジェニックリタークをコントロールとして使用した(nctrl=8)。SBMAは、男性のみで完全に現れる性制限疾患ですので、オスのマウスは、この研究のために排他的に使用されました。計画段階では、研究者は、グループの大きさと組成18を決定するために、生物学的変数としての性に関する国立衛生研究所の考慮事項を考慮する必要があります。
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Protocol
マウスで行われたすべての試験は、デューク大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によってレビューされ、承認されました。コホート全体で歩行分析と論文の採点が完了するまで、テストと採点を担当する担当者は、動物の遺伝子型または実験状態に目がくらむ必要があります。
1. 材料の調製をテストする
- 厚さ0.375インチのプリカットクリアアクリルパネル3枚から構築されたトンネルでテストを行います。特にアクリルを結合し、乾燥時に臭いを放出しないシーラントと一緒にパネルを接着することにより、トンネルを組み立てます。
- 標準的なC57BL/6マウスの場合は、幅2.5イン、高3、長さ13.inのトンネル測定値を使用します。マウスは、歩行を測定できるように、快適にトンネルを歩き、十分なステップ(>4)を取ることができる必要があります。
- トンネルで使用されるのと同じシーラントと一緒に接着された0.375インチの厚さのプリカットグレーのアクリルパネルでゴールチャンバーを構築します。チャンバーの内部測定値は、幅4インチ、長さ4インチ、高さ3インチです。トンネルの開口部(幅×高さ2.5インチ×3.0インチ)にこのチャンバーの開口部を合わせてください。マウスは明るい空間よりも暗い空間を自然に好むので、不透明で暗い色の素材を使用します。
- 厚くて滑らかなステップを追跡するために紙を使用します(水彩画はうまく機能します)。個々の用紙ストリップを、トンネルの幅と長さよりもわずかに広く長くカットします。ここで説明するトンネル寸法を使用する場合は、用紙を 15 in. に切り、幅を 3.5 で切ります。
- 非毒性洗浄水性塗料の2つの対照的な色(例えば、緑と紫)を使用してください。後肢に 1 色、前肢に 2 番目の色を割り当てます。マウスは、テスト後に足から残りの塗料を舐めるので、選択した塗料は完全に非毒性でなければなりません。
- 2つの丸いバレルペイントブラシを使用し、各塗料の色に1つずつ(直径約0.5cm、テーパー/尖ったブラシ先端)を使用します。
- ミリメートルまでのマーキングを持つ定規を選択し、0.1ミリメートルまでの測定値を持つキャリパーを選択します。
- 任意:高い不安または低いモチベーションを持つ動物のために、目標室で行動インセンティブを提供する。これには、少量の殺菌されたヒマワリの種子が含まれることができます(習慣を可能にする試験の2日前にホームケージに置きます)。テストの日に、ヒマワリの種をゴールチャンバー内に置き、マウスが止まらずに歩くように促します。
2. データ収集
- 別の部屋でテストを行う場合は、マウスを新しい部屋に30分間順応させ、行動アッセイを開始します。さらに、マウスは自然に夜行性であるため、すべてのマウスが完全に目を覚まし、テスト前に少なくとも5分間警告していることを確認してください。
- トンネルを用紙の上に置き、用紙 ID とテスト日で用紙に印を付けて、テストのセットアップを準備します。トンネルの端にゴールチャンバーを配置し、両方の開いた端を接続します。必要に応じて、トンネルの終わりにヒマワリの種を追加します(ゴール室内)。
- テストするマウスをケージから取り出し、そのスクラフトでしっかりと握り、後肢の動きを安定させるために尾を握るようにします。
- すべてのつま先の下側と足の中心が完全に塗料で覆われているように、ペイントフォアポー。後ろ足にペイントの対照的な色でこれを繰り返します。マウスが体の他の部分に付着した塗料を清潔な湿った布で拭き取り、データ収集を妨げる可能性のある汚れを防ぎます。
注:動物のストレスを最小限に抑えるために、経験豊富な研究者がマウスの取り扱いを行う必要があります。 - トンネルの先頭にマウスを置き、ゴールチャンバーまで歩いてから、マウスを取り出し、水で湿らせた布で足をそっと拭き取り、ホームケージに戻します。
- スコアリングの前にフットプリントを持つ紙を完全に乾燥させます。各動物の間にエタノールまたは同等の洗浄液で試験区域とトンネルを拭き取ります。
3. 採点基準
- スコアリングには、明確で汚れのないフットプリントを一貫して配置した手順を使用します。図1Bは、スコア付け可能なフットプリントシーケンスの良い例です。十分なスコアデータを生成するには、各フィートから少なくとも2つの連続したステップが必要ですが、1フィートあたり4〜6ステップが推奨されます。マウスが歩行速度を変更しているため、通常の歩行を表す可能性は低いため、用紙に最初と最後のフットプリントを含めないようにします。
- この方法を使用して分析できる歩行の3つの異なる尺法として、ストライドの長さ、ストライド幅、つま先の広がりを使用します。
注: ストライドの長さと幅には、前足領域がペイントで明確に定義されている明確なシーケンシャルプリントが必要です。つま先の広がりは、スコアリングのためのシーケンシャルプリントを必要とせず、片足で最初と最後のつま先の明確なプリントのみを必要とします。ただし、ストライドの長さまたは幅の測定値に特定のフットプリントが含まれていない場合、つま先の広がりについてスコアを付けることはできません。3 つのメジャーはすべてセンチメートルで評価されます。- ストライドの長さは、同じ足によって作成された 2 つの順次フットプリント間の距離 (つまり、1 つのストライド) として定義します (図 1A,1B)。
- 鉛筆を使用して、両方の前肢の足跡の前足領域の周りに 2 ~ 4 mm の円を 1 つのストライドで描画し、定規を使用してそれらの間に線を引きます。
- 各円の中央(各フットパッドの中心)からの2つのプリント間の距離を右フォア1(RF1)または左フォア1(LF1)として記録します。
- スコア付け可能なすべてのステップ(RF2、LF2、RF3、LF3 など)についても同じ手順を繰り返します。
- 右と左の後肢のフットプリントについても同じ手順を繰り返します。
- 各四肢のストライド距離を記録したすべての個々の距離を平均します。統計分析では、個々のコホート メンバーを一緒に平均化できます。
- ストライド幅は、左前肢または後肢間の距離の尺度として定義します (図 1A,1B)。
- この距離を評価するには、反対方向の後肢のストライド長さの線と垂直に交差する 1 つの後肢の円で囲まれた前足領域から線を描画および測定します。
- スコア付け可能なすべての後肢プリントに対してこれを繰り返し、測定値を平均します。ストライド幅の計算方法は、前肢と後肢の場合と同じです。
- つま先の広がりを、単一の前肢または後肢フットプリントの最初と最後のつま先の間の距離として定義します (図 1A,1B)。
- キャリパーを使用して、最初のつま先印刷の先端と最後のつま先印刷の先端との間の距離を測定します。
- スコア付け可能なすべての後肢プリントに対して繰り返し、測定値を平均化します。つま先の広がりの計算方法は、前肢と後肢で同じです。
- ストライドの長さは、同じ足によって作成された 2 つの順次フットプリント間の距離 (つまり、1 つのストライド) として定義します (図 1A,1B)。
- 用紙を採点できない場合は、動物が10分間休息してから再試行してください。
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Representative Results
十分な数の動物で、この手順は、時間の経過とともに同じ株内で、マウスのジェノタイプ間の歩行の違いを検出することができる。図1Bは、下部運動ニューロンおよび骨格筋に影響を与える神経変性疾患であるX連結脊髄およびバルバー筋萎縮症(SBMA)のマウスモデルを用いて、研究室で収集された足跡画像の代表的な痕跡を示す。我々は以前に、オスのBAC fxAR121トランスジェニックマウスが有意な体重減少、グリップ強度の障害、および非トランスジェニック・リッターメイトコントロール9と比較した場合、症状後の年齢でのストライド長の短縮を発症することを報告した。
ここでは、前症状(生後2.5ヶ月)と後症(生後9ヶ月)のコホートから歩行解析結果を提示します(図2)。疾患発症前、BAC fxAR121トランスジェニックマウスは、リターメイト非トランスジェニックコントロールと比較して、ストライド長さ、ストライド幅、つま先の広がりと同様の歩幅を示します。疾患発症後、BAC fxAR121トランスジェニックマウスは、歩行長が有意に短い(p前肢=0.001、p後肢=0.009)(図2A)。同様の縦方向分析では、テストされた年齢(p2.5ヶ月=0.709、p9ヶ月=0.204)でストライド幅に違いは見られなかった(図2B)。症候性BAC fxAR121トランスジェニックマウスは、年齢に一致したリッターメイトコントロール(図2C)よりも有意に狭い後肢の広がり(p=0.01)を有する。BAC fxAR121マウスは、主に後肢に影響を与える神経筋疾患をモデル化し、前肢歩行の詳細な測定は収集されなかった。我々は、この歩行分析方法を使用して、マウスモデルの表現型を考慮し、それに応じて前肢または後肢歩行メトリックを選択することを奨励する。
図 1: 歩行分析の対策とトラブルシューティング。
マウスの歩行解析の概略表現で、歩幅、歩幅、つま先の広がり情報を示します。B.3つのパラメータの測定値を示し、スコアリングできる歩行分析フットプリントシーケンスの代表的な例。C.採点できない問題のある歩行分析フットプリントシーケンスの代表的な例。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:SBMA BAC fxAR121トランスジェニックマウスは、歩行分析を介して検出できる進行性、神経変性歩行性歩行表現型を示す。
A.症状前の年齢(2.5ヶ月、nctl=11、nexpt=12)に違いはないにもかかわらず、BAC fxAR121マウスは、症候後段階での非トランスジェニック・リッターメイトコントロールと比較して、歩幅が著しく減少しました(9)月、nctl=8、nエクスパット=12)。B.いずれの年齢においてもストライド幅に変化は検出されなかった。C.症候性 SBMA BAC fxAR121 トランスジェニックマウスディスプレイは、非トランスジェニックリターメートコントロールと比較して後肢のつま先の広がりを有意に減少させた。N= 8-12/グループ。ポストホックTukeyテスト * p < 0.05, ** p < 0.01を持つANOVA.誤差バーはSEMを表し、この図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
上述の低コスト歩行解析法を用いて,SBMAのBAC fxAR121マウスモデルにおいて、症候後の年齢における歩行機能障害のいくつかのパラメータの同定に成功したことを示す.ストライド長の減少は、マウスモデルおよびヒト患者9の以前のSBMA研究と一致する。また、非トランスジェニック・リッターメートコントロールと比較して、症候性SBMAマウスにおける後肢のつま先の広がいに有意な差があることを初めて示した。興味深いことに、後足の広がりの減少は、足の伸張筋の弱さ、足の屈曲筋の締め付け、または神経の内気の悪さ2、19によって引き起こされる可能性があり、これはSBMAの病因とも一致する。
マウスは、小さな暗い空間のための自然な行動の好みのために容易にゴールチャンバーに実行する必要がありますが、一部のマウスは、トンネルを継続的に移動しない場合があります。マウスがトンネル内でジャンプ、停止、または旋回する場合(図 1Cの例を参照)、新しいスコアリング ペーパーの休止期間の後にアッセイを繰り返します。マウスがトンネルの最初に停止した場合、多くの場合、ゴール ボックスに向かって穏やかに実行するように突き出すことができるため、結果は回復可能です。
マウスの足に塗料を塗り過ぎたり少なすぎたりすると、使用できない結果が生じる可能性があります。塗料が不十分な場合は、汚れたり歪んだりする可能性がありますが、塗料が不十分な場合は、かすかなプリントや識別不能なプリントが生成される可能性があります(図1C)。いずれの場合も、不正確な測定を防ぐために、クリーンなスコアリングペーパーでアッセイを繰り返します。
非常に若いマウス(<3ヶ月)はトンネル内で前方にジャンプする可能性が高いのに対し、古い(>8ヶ月齢)または非常にフェオティピックなマウスは、完全に前方の動きを停止または抵抗する可能性が高い。目標チャンバーに行動インセンティブ(ヒマワリの種)を追加すると、やる気のないマウスが停止することなくトンネルを通過するように促すことによって、問題のある行動の頻度を減らすことができます。
トンネル寸法は、被写体の寸法を反映する必要があります。平均的なラボマウス(年齢、食事、または遺伝的変異による)よりも有意に大きいマウスまたは小さいマウスを使用する場合は、動物の大きさに合わせてトンネルと目標室の寸法を変更することをお勧めします。トンネルでは、マウスは直線で快適に歩くことができるはずですが、この行動を阻止するために振り向くのは困難です。目標室はトンネルの高さと一致する必要があり、マウスは部屋の中で快適にフィットする必要があります。
マウスのつま先クリッピング法を用いる研究者は、つま先の広がりに関するデータを収集できない場合がありますが、ストライドの長さやストライド幅などの歩行の他の手段は引き続き収集できます。つま先クリッピングは、マウス20ごとに2本以下のつま先が切り取られ続ける限り、マウスの歩行に大きな影響を与えません。
この歩行分析方法は認知機能を反映しないため、認知の尺度として使用すべきではありません。この方法を使用しようとする他の人は、マウスモデルで影響を受ける神経筋群を考慮し、それに応じて前肢または後肢のメトリックを選択する必要があります。この歩行分析方法は、フットパッド注射を必要とする疼痛反応を研究する研究者や、足跡だけでは説明できない移動の生体力学的測定を必要とする研究(四肢の時間的測定など)には推奨されません。モーションまたはジョイント回転21.
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
著者らは、動物の識別支援のために午前に感謝したいと思います。この研究は、米国国立衛生研究所(R01 7 RF1 AG057264からA.R.L.S.およびC.J.C.およびR01 NS100023からA.R.L.S.への助成)と筋ジストロフィー協会(A.R.L.S.への基礎研究助成金、C.J.C.への開発)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Caliper | n/a | n/a | must have markings down to 0.1 mm |
| Craft Glue | E6000 | n/a | |
| Footprint Paint (Tempera Paint) | Artmind | n/a | must be non-toxic |
| Round Barrel Paintbrushes | Symply Simmons | n/a | 0.5 cm diameter |
| Ruler | n/a | n/a | must have markings down to millimeters |
| Scoring Paper (Watercolor Pads) | Canson | n/a | cut to size |
| Tunnel and Goal Chamber | Interstate Plastics | n/a | cut to size |
References
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