Summary
הvivo לשעבר פרוסה מאפשרת העצב outculמניע העצבים כדי להיות בתמונה בזמן אמת. פרוסות מופקים על ידי הטבעת e 10.5 איי. איי. או. עוברי העוברים ב-agarose, הפרוסות על הרטט, וגדלים בחממה בשלב העליון. התפקיד של מסלולים הדרכה אקסון מוערך על ידי הוספת מעכבי התקשורת התרבות.
Abstract
תנועות עיניים מדויקות הם חיוניים לחזון, אבל הפיתוח של מערכת מנוע עינית, במיוחד מסלולים מולקולריים השליטה אקסון הדרכה, לא הובהר במלואו. הדבר נובע בחלקו ממגבלות טכניות של הנחיות האקסון המסורתיות. כדי לזהות רמזים נוספים הנחיות הדרכה המשפיעים על העצב מניע העיניים, vivo slice לשעבר התמונה לדמות את העצב מניע העיניים בזמן אמת כפי שהוא גדל לקראת העין פותחה. E 10.5 אי אן איי -gfp העוברים משמשים להפקת פרוסות vivo לשעבר על ידי הטבעת אותם בתוך agarose, פרוסות על הרטט, ולאחר מכן גדל אותם בשלב מיקרוסקופ העליון החממה עם הזמן לשגות photomicroscopy עבור 24-72 h. שליטה פרוסות לכידה בעיתוי vivo של צמיחה של אקסונים מן הגרעין אל המסלול. מולקולות קטנות מעכבי או חלבונים רקומביננטי ניתן להוסיף לתקשורת התרבות כדי להעריך את התפקיד של מסלולים הדרכה שונים אקסון. שיטה זו מקבלת את היתרונות של שמירה על יותר של המיקרו-סביבה המקומית שדרכה עוברים האקסונים, לא axotom, ומעריכים את האקסונים בנקודות מרובות לאורך מסלול שלהם. הוא יכול גם לזהות אפקטים בערכות ממשנה ספציפיות של axons. לדוגמה, עיכוב של CXCR4 גורם אקסונים עדיין בתוך המוח האמצע כדי לגדול dorsally ולא ventrally, אבל אקסונים כי כבר יצא ventrally לא מושפעים.
Introduction
מערכת מנוע עינית מספקת מערכת אלגנטית לחקירת מנגנוני הדרכה אקסון. זה מסובך יחסית, המורכב של שלוש עצבי הגולגולת innervating six שרירי העין (eoms) אשר להזיז את העיניים, ואת השריר palpebrae סופרוריס (lps) אשר מרים את העפעף. העצב מניע העיניים innervates LPS וארבעה EOMs-האלכסוני הנחות האמצעי, נחותים, והשרירים rectus מעולה. שני העצבים האחרים, הטרוליר והחוטפים, כל אחד מinnervate רק שריר אחד, השריר האלכסוני והשרירי הצדדי העליון, בהתאמה. תנועות עיניים לספק בדיקה קלה, מראה אם אינבציה היה מתאים, חסר או חריג. בנוסף, קיימות הפרעות בתנועת העין האנושית הנובעות מהליקויים בהתפתחות העצבית או הנחיית האקסון, כינה באופן קולקטיבי את הפרעות הגולגולת הולדות (CCDDs)1.
למרות יתרונות אלה, מערכת מנוע עינית משמש לעתים נדירות ב אקסון לימודי הדרכה2,3,4,5,6,7,8 , מיכל בן 10 , 10, עקב החסרונות הטכניים. באמצעות מבחנה מחוץ לספר ההדרכה יש חסרונות רבים11. שיתוף תרבות שותף, שבו האקסופלאליות מתורבת הם מתורבתים יחד עם explants של רקמת היעד12 או תאים מזוהמים13, תלוי הן בסימטריה של מיקום מדויק והמדויק בין רקמת המטרה. פס מספר14,15, שבו שני רמזים מונחים בפסים ואקטונים מתחלפים מוערך על גידול מועדף על פס אחד, רק לציין כי מצע אחד עדיף על השני, לא כי או הוא אטרקטיבי או דוחה, או רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. מיקרופלואידיקה צ'יימברס יכול ליצור מעברי צבע כימיים מדויקים, אבל כפופים הגדלים אקסונים כדי להטות את הלחץ16,17,18, אשר יכול להשפיע על התפתחותם. יתר על כן, בכל הגישות הללו, איסוף האקסוצמחים או תאים הנתק דורש כי אקסונים הגוברת להיות axotom, ולכן אלה בחני למעשה לבחון התחדשות אקסונים, במקום אקסונים הראשונית הצמיחה. לבסוף, בגישות החוץ-גופית מסירים את המיקרו-סביבה המשפיעה על האקסון ועל תגובותיהם לרמזים לאורך נקודות שונות, ובאופן מסורתי בודקים רק אות אחת בבידוד. הרכבה חסרונות אלה, הגודל הקטן של כל גרעין במערכת המנוע העינית מאפשר לקרע מאתגרת מבחינה טכנית עבור הרחבות או תרבויות הנתק. בנוסף, התרבויות הראשיות של נוירונים מוטוריים העינית הם בדרך כלל הטרוגנית, יש מוות תאים משמעותיים, והם תלויים צפיפות, המחייב אגירת תאים מעוברים מרובים (Ryosuki פוג'יקי, תקשורת אישית). עם זאת, בשיטות vivo, לרבות מודלים של עכבר מהממת, אינם מתאימים לשימוש בהקרנה, בהתחשב בזמן ובהוצאות הנדרשות.
שיטות שפותחו לתרבות העוברים שלמים19 לאפשר תיוג של תאים הגירה20 או מצור של מולקולות ספציפיות21, אבל תרבויות העובר השלם דורשים דגירה בבקבוקי רולר אשר מונע הדמיה בזמן אמת של תוויות מבנים. טכניקות כירורגיות המאפשרות מניפולציה של העובר ולאחר מכן לאחר מכן פיתוח נוסף ברחם או בבטן של האם (שמירה על חיבור הסביבה)22 הם גם אפשריים, אבל אלה גם לא לאפשר הזמן לשגות דמיה.
כדי להתגבר על המכשולים של מחוץ לבית הספר ולאפשר הקרנה מהירה של מסלולים איתות, הטכניקה vivo לשעבר התרבות פרוסה מתחלקים התפתחה23, המותאם מתוך פרוטוקול שפורסם בעבר היקפית היקפיים מוצלח24. באמצעות פרוטוקול זה, את העצב המתפתח מתפתח לאורך זמן בנוכחות רבים של המבנים שמסביב לעבר מסלול, כולל מטרות EOM. על ידי הוספת מעכבי מולקולה קטנה, גורמי גדילה, או רמזים הדרכה לתקשורת התרבות, אנחנו יכולים להעריך הדרכה רטבאליות בנקודות מרובות לאורך מסלול אקסון, המאפשר הערכה מהירה יותר של גורמי צמיחה פוטנציאליים הדרכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל העבודה בעלי חיים תיאר כאן אושרה והתבצע בציות לטיפול בבעלי חיים מוסדיים בבית החולים לילדים והוועדה לשימוש (IACUC) פרוטוקולים.
1. מועד מתוזמן
- מקום איי. איי. אן : gfp (מוטוריים איון תא העצב חלבון פלורסנט ירוק; MGI: J:132726; ג'אקס Tg (איי-באקס) 1Slp/J מלאי: 017952) עכבר זכר ונקבה ביחד בן לילה. שוקלים את הנקבות. והקליטו משקולות לפני ההזדווגות
הערה: איי. איי. אם : gfp במיוחד לתוויות נוירונים מוטוריים עם gfp בלתי ממונע, כי הוא לא ציטוטוקסיטים, לשים את קרום התא של נוירונים מוטוריים האקטונים שלהם, ומאפשר את העצבים להיות דמיינו במהלך פיתוח25. ניתן להשתמש בקווים אחרים המסומנים באמצעות פלואורוסקופים. - בדוק אם יש אטמי נרתיק בבוקר מוקדם. התאריך בו מזוהה התקע מוגדר כ-E 0.5.
- לאשר הריון באמצעות עלייה במשקל ו/או אולטרסאונד ב-E 10.5. סכרים הריון צריך להרוויח לפחות 1 g. עוברים ניתן לראות באולטרסאונד ב-E 10.5.
2. הכנת ריאגנטים והרטט לתרבות הפרוסה
- הכינו 500 mL של מאגר פרוסות: להוסיף 5 מ ל של HEPES ו 5 מ ל של פניצילין/סטרפטומיצין כדי 500 mL של פתרון מלח מאוזן של האנק (HBSS) ללא Ca2 + ו-Mg2 +. מקררים עד 4 ° c.
הערה: יש לאחסן את מאגר הפרוסות הנוסף ב-4 ° צ' וניתן להשתמש בו לניסויים עתידיים בתרבות הפרוסה. - להכין 50 mL של מדיה התרבות: בשכונה סטרילית, להוסיף 12.5 mL של HBSS, 12.5 mL של סרום שור העוברי, 250 μL של גלוקוז, 250 μL של L-גלוטמין, 125 μL של HEPES כדי 24.4 mL של הגברת Fluorobright. (הריכוזים הסופיים: dourobימניים הגברת עם 25% HBSS, 25% FBS, 0.5% גלוקוז, 1 מ"מ גלוטמין, ו 2.5 מ"מ HEPES.). חמם את מדיית התרבות עד 37 ° c באמבט מים סטרילי.
הערה: ניתן לאחסן את מדיית התרבות ב-4 ° צ' עד 3 שבועות.- במכסה סטרילי, להוסיף 1.5 mL של מדיית התרבות לכל טוב של צלחת 6-היטב. הוסף הוספת תרבות תא (טבלת חומרים) לכל באר. מניחים ב סטרילי 37 ° c ו 5% חממה2 .
- הכינו 4% טמפרטורה נמוכה התכה agarose: לפזר 2 גרם של טמפרטורה נמוכה התכה agarose ב 50 mL של ה-PBS סטרילי. מיקרוגל במרווחי זמן של 30-60 s עד התפרקה לחלוטין. מניחים באמבטיית מים 40 ° c כדי לשמור על הנוזל.
הערה: ניתן לאחסן תוספת נוספת בטמפרטורת החדר (RT) ומומסת לניסויים בתרבות הפרוסה העתידית. - כוונן את הרטט: הצב להב חדש על הרטט. בדוק הגדרות: עובי 400-450 μm. Pre-לצנן את השלב הרטט. . שים קצת קרח בתא החיצוני השתמש בחדר ובבמה המוקדש לפרוסות חיות. אין להשתמש באותו חדר הרטט לרקמות קבועות כמו תיקון שיורית יכול להזיק לפרוסות.
- הכינו את מיקרוסקופ שלב החממה העליון כדי 37 ° צ' ו 5% CO2.
- היכונו לחיתוך: מכשירי ניתוח נקיים וריסוס עם 70% אתנול. מלאו שתי צלחות פטרי עם HBSS, מקום על הקרח. פתחו לוחית 12 של תרבית רקמה והניחו את המכסה על הקרח כשפניו כלפי מעלה. פתח 6 היטב התרבות רקמה לוחית והמקום מוסיף ממברנה התרבות תאים ו 1.5 mL מדיה תרבות התא בכל באר. מחמם את הצלחת מראש ב-37 ° c ו-5% חממה2 .
3. קצירת E 10.5 עוברים והכנת פרוסות
הערה: יש לבצע את כל השלבים מנקודה זו במהירות האפשרית. שמור על העוברים. על הקרח כל הזמן
- המתת חסד הסכר ההרה (E 10.5) בחדר CO2 . . בצע פריקה בצוואר הרחם
- רסס את הבטן עם 70% אתנול. חותכים את הבטן עם מספריים, להסיר את הרחם ולמקם אותו צלחת פטרי עם HBSS קר קרח כדי לשטוף במהירות דם. להעביר את הרחם שטף ל פטרי שני ממולא צלחת קרח קר HBSS.
- תחת היקף מבתר, הסר את העוברים מקרן הרחם ומשקי השפיר הבודדים. מניחים את העוברים בצד התחתון של המכסה של 12 צלחת הבאר. . המשיכו לאכול
- תחת היקף מבתר, השתמש בנייר סינון כדי להסיר כל נוזל המקיף כל עובר.
הערה: עוברים תיצמד לנייר המסנן אם הוא נגע. - הטמע עוברים ב-agarose. יוצקים מומס נמס מעל כל עובר כדי לכסות אותו. . המשיכו לאכול ברגע שהאגקם התקשה, הפוך כל עובר ויוצקים תוספת נוספת בצד השני. . המשיכו לאכול
- באמצעות ניתוח פלורסנט היקף, לקצץ את agarose סביב כל העובר כך שהוא יהיה מונחה כראוי כאשר מודבק לשלב הרטט. הגרעין האוקולאלי והאקסון המוקדמת. מגדילה את הפלורסנט יישר את העובר כך שהגרעין, האקטונים המגודלים והעין יוצרים קו, וחתוך את הצמח בלהב התער שנחתך במקביל לקו זה (העובר אל העובר, ראה איור 1א).
הערה: זה יהיה הצד דבוק לשלב הרטט (העובר ימוקם על גבו, ראש הקרוב ביותר ללהב הרטט). קו בין הגרעין והעין האלקטרו-מ, צריך להיות מקביל ללהב הרטט. - מלאו את חדר הרטט עם מאגר פרוסה קר-קרח. הדבק את העובר לשלב הרטט, כך שהלהב יהיה מקביל לגרעין ולעיניים של האוקוליום. לאחר שהדבק הסופר יבש, יש לטבול את השלב הרטט, כך שהעובר מכוון אל הלהב.
- פרוסה 400-450 יקרומטר פרוסות. לאסוף כל פרוסה עם pipet העברה סטרילית. המקום לתוך מאגר חיתוך קר.
- תחת היקף הניתוח, בחר את הפרוסה המכילה את הגרעינים והעיניים של מניע הפעולה. באמצעות pipet העברה סטרילית, למקם אותו על הוספת תרבות התא ב 6 צלחת הבאר. החזר את הצלחת לאינקובטור 37 ° c. לחלופין, יש אדם אחד שחותך ואחר מציב את הפרוסות. מזער את הזמן בין חיתוך והצבת החממה.
הערה: יש לכוון פרוסות באופן שהזריחה המרבית הנפלטת מהגרעינים והאקטונים היא הקרובה ביותר למטרת המיקרוסקופ. במיקרוסקופ הפוך, יש להניח את הפרוסות על הקרום עם הגרעינים והאקונים הקרובים ביותר למטרה שמתחת לצלחת. - הסירו את השאריות משלב הרטט, הדבק את העובר הבא אל הבמה וחזור על שלבים 3.7-3.9 עד שכל העוברים היו פרוסים ומצופים.
- הוסף מולקולה מעכבי או רקומביננטי של בחירה למדיה בכל באר כדי ליצור עקומת תגובה מינון. דלל את הממס המתאים.
הערה: אם נעשה שימוש ב-DMSO, השתמש רק ברמת תרבות הרקמה DMSO. לחילופין, חרוזים משחררי חלבונים יכולים להיות ממוקמים במיקומים ספציפיים על הפרוסה. - מניחים על המיקרוסקופ ב-37 ° c ו-5% שיתוף2 . הגדר את המיקרוסקופ לקחת ניגודיות שלב ותצלומי פלורסנט של כל פרוסה כל 30 דקות (או לעתים קרובות יותר אם הרצוי). פרוסות ניתן לשמור עבור 48-72 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאות נורמליות: איור 1 מספק תרשים שרטוט של הניסוי. החל מוקדם ככל E 9.5 בעכבר, האקטונים הראשונים מתחילים לצאת מן הגרעין עושות26. על ידי E 10.5, העצב מניע העיניים, אשר מכיל את הנוירונים חלוץ מוקדם, ניתן לראות את mesenchyme. יש שונות משמעותית בין עוברים ב-E 10.5 (אפילו בתוך אותה המלטה) בכמה רחוק העצבים התקדמה לעבר המסלול, כנראה בשל הבדלים התפתחותיים של כמה שעות. במהלך נורמלי בהתפתחות הרחם, הראשון gfp-חיוביים ניע העיניים מגיעים למסלול/עין מעל 18-24 h הבא (על ידי e 11.5), ולאחר מכן להתחיל הסתעפות למטרות הסופיות שלהם27. בתרבות הפרוסה, התזמון הזה הוא מסכם (איור 2, וידאו 1). הפרוסה גדלה ומתרחבת (בכל הכיוונים) עד 72 h, ו אקסונים ניתן לראות הארכת מן הגרעין לכיוון העין. מצאנו את 36-48 h הראשון שימושי ביותר עבור הערכת מניע הגדילה. נוירונים מוטוריים יכולים לפעמים להיראות נע בתוך הגרעין (לא מוצג). בחלק מהפרוסות, בהתאם לאוריינטציה, מופיע גם גרעין הטרוליר. האקליר מרחיב את האזור בתוך הפרוסה ולעתים קרובות לעכב, כי המסלול הרגיל שלהם הוא לצאת הגרעין ה, לפני הפעלת הפתח, לפני הפיכת דורסלי והכחדתם, אשר יהיה מחוץ לפרוסה. לעיתים, נראה שהאקסון מצטרף לאקקולונים ומסתובב לכיוון העין, מה שהופך את הפרוסה לקשה יותר לפענוח, מאחר שלאקטונים אלה יש השפעה משנית על ההדרכה של האקסונים.
דוגמה לעיכוב אקסון חשוב מסלול הדרכה: עיכוב CXCR4 איתות גורם להיות במקום הצמיחה הגחוני של מניע העיניים. אנו העריכו את התפקיד של CXCR4 איתות על התפתחות מניע העיניים על ידי הוספת 1 μg/mL (1.26 μM) של AMD3100, מעכבי קטן מסיסים במים של CXCR428, ישירות למדיית התרבות ברגע שהתרבות הפרוסה מוכנה. לאחר מכן ניתן לראות את מסלול היציאה מהגרעין האוקולאלי ולצמוח הרחק מהמסלול ("הפוך") (איור 2, וידאו 2). האקטונים האלה שכבר עזבו את המוח התיכונה והיו בדרכם למסלול ב-10.5 ממשיכים בדרכם. עיכוב של CXCR4 משפיע גם על הצמיחה הכוללת של הפרוסה.
הכיוון של הפרוסה הוא קריטי. פרוסות אינן מפרשיתיות אם הן אינן מכוונות כראוי. מספר דוגמאות של פרוסות מכוונות שלא כהלכה מוצגות באיור 3. אם העובר מוטה לצדו, רק גרעין מניע אחד הוא בפרוסה (איור 3א). אם העובר המוטבע מוטה רחוק מדי לעבר גבו, העיניים אינן בתוך הפרוסה, ובמקום זאת הגפיים העליונות והמוח האחורי או חוט השדרה עשויים להיות בפרוסה (איור 3ב). במקרה זה, המסלול הרגיל של מסלול העיניים אינו קיים, והם נוטים לצמוח באופן אקראי. במהלך הצבת הפרוסה על קרום התרבות, הוא יכול להיות מקופל (איור 3ג).
ממיסים יכולים להיות רעילים. יש לנקוט טיפול בעת המסת מעכבי או גורמי גדילה בממיסים אורגניים. איור 4 מראה דוגמה של פרוסה שמתה לאחר הוספת אתנול למדיה. 118 μL נוספה ל 1.5 mL של מדיה (ריכוז סופי 7.8%), וריכוז גבוה זה הוכיח רעיל. כדי למנוע זאת, התמוססות מסיסות בכמות המינימום של הממס האפשרית (עד למגבלת המסיסות). . כל אימת שאפשר, מתמוססות במים אם משתמשים ב-DMSO, ודא שהוא עקר, כיתה של תרבות הרקמה DMSO.
איור 1 : סכימטי. E 10.5 אי אן איי -gfp עוברים (A: צילום, ב: סכמטית) פרוסים על הרטט (400-450 יקרומטר עבה) כך סעיפים כוללים הן את הגרעין של התנועה ואת המסלול. קווים מקווקווים מקבילים ב-A ו-B מציינות את המיקום של קיצוץ הרטט. הקו המקווקו התחתון במופעים שבהם יש לגזוז ולדבוק בשלב הרטט. (ג) חלקים מונחים שטוחים על קרום הרקמה התרבותית, המאפשר חילופי חומרים מזינים וחומרי הזנה, ומניחים בחממה בשלב העליון עבור מיקרוסקופ הזמן לשגות. בשלב זה, ניתן להוסיף מעכבי למדיה הצמיחה. (ד) תרבויות ניתן לשמור על 24-72 h, ואת האקגליות מניע ניתן לראות גדל לעין. . הותאם באישור מוויטמן, ואח אל. 201823. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : עיכוב של CXCR4 גורם CN3 misrouting. התרבויות פרוסה מ-E 10.5 העוברים איי-GFP התמונה ב 0, 12, 24, ו 36 h בתרבות. הפאנל העליון מראה העובר בקרת סוג פראי ו CN3 (ירוק) גדל לכיוון העיניים והענפים בהרחבה במהלך 36 h. ראה גם וידאו 1. הפאנל התחתון מציג פרוסה עם 1 μg/mL AMD3100 (מעכב ספציפי עבור CXCR4) הוסיף ו אקסונים לצאת הגרעין של מניע החיפוש. אלה שכבר יצאו מה, המשיכו לכיוון העין. ראה גם וידאו 2. ד: מידה, V: הגגול, E: העין, N: הגרעין מניע העיניים, SMN: מנוע השדרה נוירונים, חיצים: הקרנות מניע (לבן: הטלה מסוג wildtype צהוב: התחזיות החריגה). סרגל קנה מידה שווה ל-200 μm. ראה גם וידאו 1 ו- video 2. דמות דומה מראה דוגמאות אחרות הוצגה בוויטמן, et. אל. 201823. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : הכיוון של הפרוסות הוא קריטי. תמונות ראשוניות (זמן 0 שעות) של המייצג פרוסות לא מכוונות. A מראה פרוסה שבה העובר היה מוטה לצד כזה המציג CN3 אקסונים היו axotomזציה. האקטונים הקרנת מופיע רק בצד ימין של הפרוסה (חץ). ב מראה פרוסה שבה העובר היה מוטה לאחור כך CN3 גרעינים עם אקסונים מקרין (חץ) הם בקיעים גלויים, אבל העיניים לא נמצאים בפרוסה. במקום זאת מנוע השדרה נוירונים (SMN) והקרנות תא העצב המנוע על הגפיים ניתן לראות. C מראה פרוסה שמקופלת בזמן המיקום על הקרום. יש להיפטר מפרוסות כגון אלה המוצגות כאן. סרגלי קנה מידה מייצגים 500 יקרומטר בכל לוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : ממיסים יכולים להיות רעילים. זמן הדמיה של תרבויות פרוסה מתוך E 10.5 העוברים איי-אי-גFP ב -0 ו-12 בתרבות. פרוסה תרבותית במדיה ללא תוספים (A-B) גדל בדרך כלל עבור 12 h עם CN3 אקסונים מקרין כלפי העין. פרוסה תרבותית במדיה עם ריכוז גבוה של אתנול (7.8%) (C-D) אינו מתפתח כרגיל. ב CN3 לא גדל והוא בקושי נראה, והרקמה החלה להתפורר. סרגלי קנה מידה מייצגים 500 יקרומטר בכל לוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: CN3 מוצלח בתרבות פרוסה. הדמיית זמן הדמיה של תרבות פרוסה של שליטה מתוך E 10.5 העובר איי-GFP. תמונות שנלקחו כל 30 דקות מעל 18 h בתרבות. CN3 (ירוק) גדל מן הגרעין (למעלה) לכיוון העיניים ומתחיל הסתעפות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
וידאו 2: Mistargeting של CN3 עם עיכוב של CXCR4 איתות. זמן הדמיה של תרבויות פרוסה מתוך E 10.5 העוברים איי-GFP מעל 48 h בתרבות. כאשר 1 μg/mL AMD3100 (מעכב ספציפי עבור CXCR4) מתווסף ישירות למדיה, CN3 אקסונים כי הם עדיין לא היציאה הפריפריה הגרעין מניע העיניים dorsally (משמאל) ולא ventrally (מימין). הודפסה מודפס באישור ויטמן, et. אל. 201823. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון וידאו זה. (לחץ לחיצה ימנית להורדה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה הפרוטוקול הvivo לשעבר התרבות הפרוסה מספק יתרונות משמעותיים על הנחיית האקסון המסורתית שאומר23. הגודל של כל גרעין המנוע הגולגולתית אינו גורם מגביל, ואין צורך בניתוח קשה. הסביבה האנדודוגני שדרכה לנסוע אקסונים מתוחזק, מתן אפשרות לשינוי של מסלול איתות אחד תוך שמירה על מסלולים איתות אחרים. בנוסף, ניתן להעריך את ההשפעות בנקודות שונות לאורך מסלול אקסון. מאז הנחיית אקסון דורש מספר רמזים, ושילובים של רמזים, לאורך הדרך29, זה מספק יתרון משמעותי. בניגוד לתרבויות שאינן מקבילות או מעוררות התפתחות, האקטונים הגדלים אינם חתוכים להכנה זו, כך שניתן להעריך את האקסון הראשוני במקום התחדשות. ברוב ההנחיות האחרות, התחדשות אקסון היא למעשה להיות מוערך, ולא התחלתיים הראשונית הצמיחה. הימנעות מהפיום גם נמנעת מגורמים משמעותיים לכינון פוטנציאלי משום שהנוירונים אינם פגומים או תחת לחץ.
שני הצעדים הקריטיים ביותר הם כיוון העוברים לחיתוך ולצמצום הזמן בין המתת החסד של האם והצבת הפרוסות בחממה. העוברים חייבים להישמר. על הקרח כל הזמן לאוריינטציה, ניסינו מספר תבניות שונות, אבל בגלל השונות בין העוברים בגיל זה, מצאנו כי הכיוון ביד, מבוסס על הקרינה מתחת למיקרוסקופ מבתר, הוא היעיל ביותר. לעומת זאת, התמצאות ידנית מגבילה את חלון הזמן העובריים שניתן לחקור. מוקדם יותר e 10.0, מורידים את הפרוסה כראוי הוא מאתגר כי העין קשה לראות ומעט מאוד CN3 אקסונים ניתן לראות. זה אומר, עם זאת, כי אנחנו לא יכולים להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את האקסון חלוץ המוקדם ביותר, כפי שאנחנו צריכים לאפשר אקסון אלה כדי לצמוח באופן חלקי כדי להיות מסוגל לכוון את הפרוסה.
יש מספר מגבלות על ההכנה לתרבות הפרוסה. היא שימושית ביותר ללימוד החלטות הדרכה מוקדמות וביניים, במקום החלטות הסתעפות מסוף. ב-E 10.5, ה-EOMs נוכחים רק כאנאג שרירים. גם בזמן מאוחר יותר, עם טכנולוגיית ההדמיה הנוכחית, לא ניתן להבדיל בין מטרה בודדת EOMs בתוך הפרוסה. לפיכך, לא ניתן להעריך את החלטות הסתעפות המסוף בתנאים הנוכחיים. בגלל הפרוסות גדלים על ממברנות התרבות נקבובי רקמה, לאחר התרבות ההפרדה מן הקרום הוא קשה לעתים קרובות גורם נזק לרקמות, הפיכת נוגדנים מכתים ו הרכבה עבור הדמיה נוספת נכשל. למרות שהאקטונים אינם חתוכים, ובכך מזעור נזק עצבי, הרקמות שמסביב נחתכו ולכן ניזוקו, דבר שעלול להשפיע על ביטוי או שחרור איתות. חלון הזמן האידיאלי הוא גם מוגבל. כפי שצוין לעיל, מוקדם יותר מאשר התמצאות e 10.0 של הפרוסה קשה, ואחרי e 11.5, אקסונים רבים כבר הגיעו למסלול, כך החלטות הדרכה ביניים כבר נעשו.
ההכנה מחייבת מיקרוסקופ עם אינקובטור מדרגה ראשונה, שלב אוטומטי ויכולת לשגות בזמן. המטרות והמצלמה צריכים להיות ממוטבים עבור הדמיה של דגימות עבות ללא קרחת. החלטה ברמה של קונוס גדילה יחיד, ככל האפשר עם כמה ההכנות לתרבות, לא ניתן עם הגדרת ההדמיה הנוכחית. עם זאת, פרמטרי ההדמיה יכולים להיות מותאמים כדי לאפשר רזולוציה גבוהה יותר, עם מיקרוסקופ קונפוקלית או 2-פוטון, התמקדות בשטח קטן של כל פרוסה (העשויה להתאים כפרוסה כגון האקסונים גדלים). באמצעות המיקרוסקופ הנוכחי פלורסנטי והדמיה כל 30 דקות, לא ראינו הלבנת; מיקרוסקופיה קונפוקלית והדמיה תכופה יותר יכולה לשמש, אך הלבנת התמונה תהפוך לבעיה פוטנציאלית.
מאחר שמעכבי מולקולה קטנים עשויים להיות מחוץ ליעד אפקטים, כולל על הצמיחה הכוללת בריאות של הפרוסה, שיטת הפעולה הזו שימושית ביותר ככלי הקרנה. על התוצאות להיות מאומתות על-ידי שיטות אחרות, כגון מודלים של עכבר בנוקאאוט. לדוגמה, עם CXCR4 עיכוב, יש ירידה מתונה הצמיחה הכוללת של הפרוסה (ראה איור 2), התואמים את הפונקציות המרובות של CXCR4. בדגמי העכבר, עם זאת, האקסון הפנוטיפ שנראה בפרוסה היה מוחלק23.
פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי ללמוד אוכלוסיות עצבי אחרות הגולגולת, למרות כל אחד, את הכיוון הנכון של הפרוסות והעיתוי צריך להיות מקובע ביותר. בנוסף, עכברים עם תוויות פלורסנט שונים יכול לשמש כי לסמן קבוצות משנה שונות של נוירונים ו/או שפונים לגילאים מוקדמים או מאוחרים יותר.
תרבות הפרוסה יכולה להיות מניפולציות במספר דרכים. אנו מראים כאן דוגמה של חסימת איתות לקולטן עם מולקולה קטנה מדכא. לחילופין, נוגדנים (או הפעלת קולטן לקולטן) או חלבונים רקומביננטי, כגון הרמזים הדרכה אקסון או גורמי גדילה, ניתן להוסיף למדיה. כדי להעריך את השפעות הכיווניות על הנחיית אקסון, ניתן להניח חרוזים ליגטין על הפרוסה במיקומים מסוימים. באמצעות כל השיטות האלה, מסלולים אחרים הדרכה אקסון ניתן לזהות וללמוד במערכת המנוע העינית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מימון שסופקו על ידי מכון העין הלאומי [5K08EY027850], המכון הלאומי של בריאות הילד ופיתוח [U54HD090255], הרווארד-חזון המחקר הקליני תוכנית פיתוח [5K08EY027850], האבירים הטמפלרים עין הקרן [קריירה המתחיל גרנט], בית החולים לרפואת עיניים וקרן הילדים [פרס דיסקברי הפקולטה]. . הוא חוקר מכון רפואי הווארד יוז
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-107 | |
| 6-Well Tissue Culture Plate | Genesee Scientific | 25-105 | |
| Disposable Pasteur Pipet (Flint Glass) | VWR | 14672-200 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Fluorobrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | |
| Glucose (200 g/L) | Thermo Fisher Scientific | A2494001 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Thermo Fisher Scientific | 14175-095 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550H | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| L-Glutamine (250 nM) | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Loctite Superglue | Loctite | ||
| Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16520050 | |
| Millicell Cell Culture Insert (30mm, hydrophilic PTFE, 0.4 um) | Millipore Sigma | PICM03050 | |
| Moria Mini Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-19 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri Dish (100 x 15mm) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| Phosphate Buffered Saline (1X, pH 7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical Scissors - Blunt | Fine Science Tools | 14000-12 | |
| Ti Eclipse Perfect Focus with TIRF | Nikon | ||
| Vibratome (VT 1200S) | Leica | 1491200S001 | |
| Vibratome Blades (Double Edge, Stainless Steel) | Ted Pella, Inc. | 121-6 |
References
- Whitman, M. C., Engle, E. C. Ocular congenital cranial dysinnervation disorders (CCDDs): insights into axon growth and guidance. Human molecular genetics. 26, 37-44 (2017).
- Giger, R. J., et al. Neuropilin-2 is required in vivo for selective axon guidance responses to secreted semaphorins. Neuron. 25 (1), 29-41 (2000).
- Chen, H., et al. Neuropilin-2 regulates the development of selective cranial and sensory nerves and hippocampal mossy fiber projections. Neuron. 25 (1), 43-56 (2000).
- Lerner, O., et al. Stromal cell-derived factor-1 and hepatocyte growth factor guide axon projections to the extraocular muscles. Developmental Neurobiology. 70 (8), 549-564 (2010).
- Cheng, L., et al. Human CFEOM1 mutations attenuate KIF21A autoinhibition and cause oculomotor axon stalling. Neuron. 82 (2), 334-349 (2014).
- Tischfield, M. A., et al. Human TUBB3 mutations perturb microtubule dynamics, kinesin interactions, and axon guidance. Cell. 140 (1), 74-87 (2010).
- Kim, M., et al. Motor neuron cell bodies are actively positioned by Slit/Robo repulsion and Netrin/DCC attraction. Developmental Biology. 399 (1), 68-79 (2015).
- Montague, K., Guthrie, S., Poparic, I. In Vivo and In Vitro Knockdown Approaches in the Avian Embryo as a Means to Study Semaphorin Signaling. Methods in molecular biology. 1493, 403-416 (2017).
- Clark, C., Austen, O., Poparic, I., Guthrie, S. alpha2-Chimaerin regulates a key axon guidance transition during development of the oculomotor projection. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (42), 16540-16551 (2013).
- Ferrario, J. E., et al. Axon guidance in the developing ocular motor system and Duane retraction syndrome depends on Semaphorin signaling via alpha2-chimaerin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14669-14674 (2012).
- Dupin, I., Dahan, M., Studer, V. Investigating axonal guidance with microdevice-based approaches. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (45), 17647-17655 (2013).
- Ebendal, T., Jacobson, C. O. Tissue explants affecting extension and orientation of axons in cultured chick embryo ganglia. Experimental Cell Research. 105 (2), 379-387 (1977).
- Dazert, S., et al. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. Journal of cellular physiology. 177 (1), 123-129 (1998).
- Walter, J., Henke-Fahle, S., Bonhoeffer, F. Avoidance of posterior tectal membranes by temporal retinal axons. Development. 101 (4), 909-913 (1987).
- Vielmetter, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F., Stuermer, C. A. In vitro assay to test differential substrate affinities of growing axons and migratory cells. Experimental Brain Research. 81 (2), 283-287 (1990).
- Joanne Wang, C., et al. A microfluidics-based turning assay reveals complex growth cone responses to integrated gradients of substrate-bound ECM molecules and diffusible guidance cues. Lab Chip. 8 (2), 227-237 (2008).
- Wittig, J. H., Ryan, A. F., Asbeck, P. M. A reusable microfluidic plate with alternate-choice architecture for assessing growth preference in tissue culture. Journal of neuroscience methods. 144 (1), 79-89 (2005).
- Keenan, T. M., Folch, A. Biomolecular gradients in cell culture systems. Lab Chip. 8 (1), 34-57 (2008).
- Jimenez, D., Lopez-Mascaraque, L. M., Valverde, F., De Carlos, J. A. Tangential migration in neocortical development. Developmental Biology. 244 (1), 155-169 (2002).
- Miquelajauregui, A., et al. LIM-homeobox gene Lhx5 is required for normal development of Cajal-Retzius cells. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (31), 10551-10562 (2010).
- Garcia-Pena, C. M., et al. Neurophilic Descending Migration of Dorsal Midbrain Neurons Into the Hindbrain. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 96 (2018).
- Ngo-Muller, V., Muneoka, K. In utero and exo utero surgery on rodent embryos. Methods in Enzymology. 476, 205-226 (2010).
- Whitman, M. C., et al. Loss of CXCR4/CXCL12 Signaling Causes Oculomotor Nerve Misrouting and Development of Motor Trigeminal to Oculomotor Synkinesis. Investigative ophthalmology & visual science. 59 (12), 5201-5209 (2018).
- Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic slice culture of GFP-expressing mouse embryos for real-time imaging of peripheral nerve outgrowth. Journal of visualized experiments : JoVE. (49), e2309 (2011).
- Lewcock, J. W., Genoud, N., Lettieri, K., Pfaff, S. L. The ubiquitin ligase Phr1 regulates axon outgrowth through modulation of microtubule dynamics. Neuron. 56 (4), 604-620 (2007).
- Easter, S. S., Ross, L. S., Frankfurter, A. Initial tract formation in the mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 285-299 (1993).
- Michalak, S. M., et al. Ocular Motor Nerve Development in the Presence and Absence of Extraocular Muscle. Investigative ophthalmology & visual science. 58 (4), 2388-2396 (2017).
- Lewellis, S. W., et al. Precise SDF1-mediated cell guidance is achieved through ligand clearance and microRNA-mediated decay. The Journal of cell biology. 200 (3), 337-355 (2013).
- Stoeckli, E. T. Understanding axon guidance: are we nearly there yet. Development. 145 (10), (2018).
