Formålet med denne protokol er at påvise forskellige Clostridium perfringens toxinotypes i lokalt indkøbte fødevarer, især Epsilon-toksin, der producerer stamme typer B og D, uden brug af anaerobe kamre.
Clostridium perfringens (C. perfringens) er en produktiv toksin producent og forårsager en bred vifte af sygdomme i forskellige værter. C. perfringens er kategoriseret i fem forskellige toxinotypes, A gennem E, baseret på transport af fire store toksin gener. Forekomsten og distributionen af disse forskellige toxinotyper er undersøgt, især deres omsiggribende i amerikanske detail-fødevarer. Af særlig interesse for os er de type B og D stammer, som producerer Epsilon toxin, en ekstremt dødelig toksin foreslået at være den miljømæssige udløser af multipel sklerose i mennesker. For at evaluere tilstedeværelsen af forskellige C. perfringens toxinotypes i forskellige fødevareprøver, udviklede vi en nem metode til selektivt kultur disse bakterier uden brug af en anaerob container system kun involverer tre dyrkning trin. Fødevarer købes fra lokale købmandsforretninger og transporteres til laboratoriet under omgivende forhold. Prøverne hakes og inokuleres i modificerede Rapid perfringens-medier (RPM) og inkuberet natten over ved 37 °C i et forseglet, lufttæt konisk rør. Overnight kulturer er inokuleret på et bund lag af solid Tryptose sulfit Cycloserin (TSC) agar, og derefter overlagt med et øverste lag af smeltet TSC agar, hvilket skaber en “Sandwiched”, anaerobe miljø. Agarpladerne inkuberes natten over ved 37 °C og evalueres derefter for udseendet af sorte, sulfit reducerende kolonier. C. perfringens-mistænkte kolonier fjernes fra TSC-agar ved hjælp af sterile øjen pipetter og inokuleres i omdrejninger og sub-dyrkes natten over ved 37 °c i et lufttæt konisk rør. DNA udvindes fra RPM Subculture, og derefter analyseres for tilstedeværelsen af C. perfringens toksin gener via polymerase kædereaktion (PCR). Afhængigt af den type mad, man prøver at prøve, testes typisk 15 – 20% af prøverne positivt for C. perfringens.
Clostridium perfringens (C. perfringens) er en gram positiv, anaerob, sporedannende, stang formet bakterie, der findes allestedsnærværende i miljøet. Denne art af bakterier bærer gener, der indkode for over 17 toksiner og, historisk, er blevet karakteriseret i fem toxinotypes (A-E) baseret på tilstedeværelsen af fire forskellige toksin gener: Alpha, beta, Epsilon, og Iota toxin (tabel 1)1. For nylig er det blevet foreslået, at denne Typing-ordningen skal udvides til at omfatte typer F og G, som havnen C. perfringens enterotoksiner (CPE) og NetB toksin, henholdsvis2. Men mere forskning er nødvendig, før dette skemat system er formelt accepteret. Mens alfa toksin genet er strengt kromosomalt placeret, kan CPE-genet findes både på kromosom og plasmider. Til sammenligning findes de resterende toksiner gener på forskellige mellemstore plasmider. Vi er især interesseret i forekomsten af C. perfringens typer B og D, da disse stammer producerer Epsilon toxin, en yderst potent, pore dannende toksin, som er blevet foreslået at spille en rolle i at udløse multipel SKLEROSE (MS) i mennesker3 ,4,5,6,7. Hvordan folk bliver smittet eller koloniseret af disse stammer er ukendt. En mulig forklaring er gennem indtagelse af forurenede fødevarer. For at hjælpe med at besvare dette spørgsmål, vi søgte at bestemme forekomsten af forskellige C. perfringens toxinotypes i amerikanske fødevareprøver.
Tilstedeværelsen af C. perfringens toxinotypes i amerikanske fødevareprøver er undersøgt og kræver ofte brug af anaerobe containersystemer og talrige subculturing trin8,9,10,11 . Selv om der er behov for talrige subculturing trin for at opnå oprenset isolater, kan denne metode føre til tab af plasmider over tid12,13,14, hvilket muligvis påvirker påvisning af plasmid-bårne toksin gener herunder Epsilon-toksin genet. Vi søgte at udvikle en nem metode, med færre sub-culturing trin, til selektivt kultur C. perfringens uden brug af anaerobe kamre, krukker eller poser. Kort fortalt inokuleres fødevareprøver i hurtige perfringens-medier (RPM) natten over (ON) og derefter “klemt” ind i TSC agar og inkuberet på. Kolonier, der mistænkes for at være C. perfringens , bliver derefter under dyrket i rpm og inkuberet igen på. DNA udvindes og PCR udføres for at bestemme genotype (figur 1). Vi valgte at bruge RPM, da det har vist sig at øge inddrivelsen af C. perfringens stammer fra fødevareprøver sammenlignet med andre mere standard Media15. Desuden blev RPM anvendt med succes til at isolere et Epsilon-toksin, der producerede type B-stamme fra en MS-patient4. Vi bruger en modificeret version af RPM i stedet for den oprindelige version til at tillade nem DNA-ekstraktion. Denne metode gør det let at identificere toksin gener i prøverne, men det er muligt, at en enkelt prøve indeholder mere end én C. perfringens toxinotype. Da vores metode ikke isolerer rensede stammer ved hjælp af flere rensnings runder, er det ikke muligt at identificere flere toxinotyper fra en prøve. Men, standard rensning teknikker (typisk striber på TSC plader eller blod agar plader) kan anvendes i slutningen af vores protokol for at opnå renset kulturer.
Her beskriver vi en metode til at identificere C. perfringens prævalens i detail fødevareprøver med begrænset opdyrkning og uden brug af et anaerob kammer system. Denne metode bruger en kombination af teknikker til at øge identifikationen af C. perfringens fra fødevareprøver. Ved at bruge en modificeret version af RPM-medier, giver vi mulighed for selektiv vækst af C. perfringens. Ved at sandwichere den inokulerede RPM i mellem lag af TSC agar, er vi i stand til at identificere og isolere anaerobe, sulfit-reducerende bakterier karakteristisk for C. perfringens. For at bekræfte tilstedeværelsen af C. perfringens, sulfit-reducerende kolonier er sub-kultiveret i frisk rpm. Den modificerede version eller RPM giver os mulighed for nemt at udtrække DNA fra kulturer, hvilket muliggør PCR-bekræftelse af specifikke toksin gener. Bekræftelse af C. perfringens kontaminerede fødevareprøver kan opnås inden for tre dage.
I tidlige eksperimenter blev madprøver simpelthen inokuleret i RPM og DNA udvundet fra på kulturer. Denne metode resulterede i påvisning af C. perfringens i et begrænset antal prøver (data ikke vist). Selv om RPM er selektiv for c. perfringens vækst, er den ikke eksklusiv for c. perfringens vækst. Andre, gram-positive, D-cycolserin resistente bakterier kan stadig vokse i RPM. Vi hypotese, at forurening med andre bakterielle arter kan have reduceret vores påvisning af C. perfringens stammer ved at reducere følsomheden af vores PCR analyse i vores første på rpm kultur. Et afgørende skridt i at øge påvisning af C. perfringens var inddragelsen af TSC agar “sandwich” teknik. Dette tillod os at differentiere og vælge for anaerobe, sulfite-reducerende kolonier, karakteristisk for C. perfringens. Et vigtigt skridt i denne proces er at sikre, at det øverste lag af smeltet TSC agar er ved 40 °C. Selv om nogle C. perfringens stammer kan vokse ved højere temperaturer (46 – 48 °c)15,16, tilsætning af smeltet agar ved højere temperaturer reducerer mængden af genvundne kulturer, for det meste sandsynligvis på grund af celledød .
Der er flere potentielle begrænsninger for denne metode. Som tidligere nævnt udvælger eller differentierer hverken RPM eller TSC agar udelukkende for C. perfringens , hvilket giver mulighed for vækst af andre bakteriearter, som findes i fødevareprøver. Dette kan reducere følsomheden af analysen til at vælge for C. perfringens kun. Men, dette er en fælles begrænsning i næsten alle dyrkning teknikker. Genotyping bekræftelse af rensede isolater er den bedste metode til endeligt at identificere C. perfringens og andre bakteriearter. En anden begrænsning af denne undersøgelse er, at vi ikke tester de rensede isolater. Vi bevidst gjorde dette for at begrænse mængden af afdyrkning, som gentagne afdyrkning frygtes at resultere i plasmid tab. Fordi vi ikke isolerer til renhed, er det muligt, at flere C. perfringens toxinotypes kan være til stede i samme prøve eller subkultur. Hvis forskerne ønsker at få renset isolater, kan standard rensningsmetoder anvendes på den sidste RPM-kultur, der er beskrevet i denne metode; Dette kræver typisk brug af anaerobe kamre. Selv om det oprindeligt blev brugt til at isolere c. perfringens fra mad, kan denne metode bruges til at identificere og isolere c. perfringens fra et væld af kilder. Specifikt, en sådan anvendelse af denne metode er at teste fækale prøver fra mennesker (eller dyr), der mistænkes for at være inficeret med C. perfringens og toxinotype bakterierne til bedre at forstå kilden til infektion.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning har ikke modtaget nogen specifik finansiering fra den offentlige, kommercielle eller ikke-profit sektorer.
D-Cycloserine | Sigma-Aldrich | C6880 | |
Dextrose | Sigma Life Science | D9434-250G | |
Disposable Transfer Pipets | any brand | Select one with slim tip like Thermo Scientific Disposable Transfer Pipets 137116M/EMD | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | Note: numerous DNA and plasmid extractions kits were evaluated, this kit gave the most desirable results. |
Dry Incubator | any brand | ||
Fluid thioglycolate medium | Remel | R453452 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma Life Science | G1890-500G | |
Individual Primers | Invitrogen | ||
Iron (II) sulfate heptahydrate | Sigma Life Science | F8633-250 G | |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | Needed for DNA extraction, not provided in kit |
microcentrifuge tube | any brand | ||
parafilm or plastic wrap | any brand | ||
Peptone from casein and other animal proteins | Sigma-Aldrich | 70173-100G | |
Perfringens Agar Base (TSC + SFP) | Oxoid | CM0587 | Make TSC agar according to instructions |
Potassium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | P2222-100G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S-7653 | |
Sterile Cell Scraper | any brand | ||
Sterile cell Spreader | any brand | ||
Sterile petri dishes | any brand | ||
Supplies and equipment for gel electrophoresis | any brand | ||
table top centrifuge | any brand | ||
Taq PCR Master Mix Kit | Qiagen | 201443 | |
Thermocycler for PCR reaction | any brand | ||
water bath | any brand | ||
Yeast extract | Sigma-Aldrich | 70161-100G |