Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

High-density DNA og RNA-mikroarrays-Photolithographic syntese, hybridisering og fremstilling af store nukleinsyre biblioteker

Published: August 12, 2019 doi: 10.3791/59936
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Inorganic Chemistry, Faculty of Chemistry, University of Vienna

Summary

I denne artikel præsenterer og diskuterer vi nye udviklinger i syntesen og anvendelser af nukleinsyre-mikroarrays, som er fabrikeret in situ. Konkret viser vi, hvordan protokollerne for DNA-syntese kan udvides til RNA, og hvordan mikromatricer kan bruges til at oprette hentes nukleinsyre-biblioteker.

Abstract

Photolithography er en kraftfuld teknik til syntesen af DNA-oligonukleotider på glas skred, da det kombinerer effektiviteten af phosphoramidite kobling reaktioner med præcision og tæthed af UV-lys reflekteres fra mikrometer-størrelse spejle. Photolithography giver mikroarrays, der kan rumme fra hundredtusinder op til flere millioner forskellige DNA-sekvenser, 100-NT eller længere, på kun et par timer. Med denne meget store sekvens plads, er mikroarrays ideelle platforme til at udforske mekanismerne i nukleinsyre · ligand interaktioner, som er særligt relevante i tilfælde af RNA. Vi rapporterede for nylig om forberedelsen af et nyt sæt af RNA-phosphoramiditer, der er kompatible med in situ-fotolitografi, og som efterfølgende blev brugt til at dyrke RNA-oligonukleotider, homopolymere samt blandede base sekvenser. Her illustrerer vi i detaljer processen med RNA-mikroarray fabrikation, fra det eksperimentelle design, til instrumentelle setup, array syntese, deprotection og endelige hybridiseringassay ved hjælp af en skabelon 25mer sekvens, der indeholder alle fire baser som et eksempel. Parallelt, vi går ud over hybridization-baserede eksperimenter og udnytte microarray litografiske som en billig gateway til komplekse nukleinsyre biblioteker. For at gøre dette, er high-density DNA-mikroarrays fremstillet på en base-følsom monomer, der gør det muligt for DNA at være bekvemt spaltet og hentes efter syntese og debeskyttelse. Fabrikations protokollen er optimeret for at begrænse antallet af syntetiske fejl, og med henblik herpå introduceres et lag β-caroten-opløsning for at absorbere UV-fotoner, der ellers kan afspejle sig tilbage på syntese substrater. Vi beskriver i en trinvis måde den komplette proces af bibliotekets forberedelse, fra design til spaltning og kvantificering.

Introduction

Den praktiske anvendelse af DNA-mikrosystemer har traditionelt været i studiet af variationerne i genekspressions niveauerne mellem to cellepopulationer ved hjælp af komplementære tråde og fluorescens som en detektionsmetode1. Lejlighedsvis, DNA-mikroarrays venture i bindende begivenheder med ikke-nukleinsyre ligands, såsom proteiner, med en strategi for systematisk sekvens permutation, der giver et omfattende overblik over det bindende landskab2,3, 4,5. Denne tilgang omdanner effektivt mikroarrays fra blotte hybridiserings flader til platforme med bred sekvens dækning, hvilket ville være et aktiv for studiet af den rigere og mere komplekse verden af RNA-struktur og-funktion. Understøttet af den ekstremt effektive phosphoramidite kobling reaktion6, in situ SYNTETISEREDE DNA-arrays kan nu også betragtes som en billig kilde til DNA7, som er ved at blive særlig relevant i betragtning af den stadigt stigende efterspørgsel efter nukleinsyre materiale til genmontering af genet8,9, DNA-baserede nanostrukturer10, informationslagring eller sekvensering11,12. Tilsvarende kan sekvensering teknologier forventes at drage fordel af udviklingen af metoder, der giver meget komplekse blandinger af RNA oligonukleotider13. I denne sammenhæng, array fabrikations protokoller, der giver mulighed for oligonukleotider at syntetiseres in situ og ved høj densitet er ideelt placeret til at opfylde behovene i det hastigt voksende område af nukleinsyre bioteknologi. Med et så mangfoldigt område som bioteknologi kan formålet med hver ansøgning dog kræve, at DNA på mikroarray produceres enten ved høj gennemløb eller med en meget lille mængde syntetiske fejl14,15eller begge, hvilket kræver en nærmere kig på de syntese protokoller af DNA-mikroarrays, som historisk set primært er blevet optimeret til hybridiseringassays. I mellemtiden, in situ syntese af RNA-mikroarrays har været fundet at være en udfordrende bestræbelse, med de fleste af de vanskeligheder forbundet med beskyttelse gruppe for 2 '-Oh funktion, normalt en af-delen i standard solid-fase syntese, der er fjernet med fluor baserede reagenser, kemikalier, der er uforenelige med glas-eller silicium-overflader. Disse problemer og udfordringer i DNA og RNA-mikroarray syntese har sidst været genstand for en stor mængde af arbejde, især med litografiske tilgang16.

Photolithography bruger UV-lys til at fjerne blokeringen af oligonukleotider før kobling og kræver masker til at konstruere et mønster af UV-eksponering, og dermed spatialt organisere og kontrollere væksten af oligonukleotider. Fysiske masker er blevet erstattet af computerstyrede micromirrorer, hvis hældning selektivt reflekterer UV-lys på mikroarray substratet17,18,19. Som en UV-kilde, bruger vi 365 nm lys fra en høj effekt LED kilde20. Nuværende fotolitografiske opsætninger er udstyret med betegnelsen Micromirror Device arrays, der indeholder 1024 × 768 spejle, svarende til mere end 780.000 individuelt adresserbare pletter ("funktioner") på et lille område på kun 1,4 cm2eller 1080p med arrays af 1920 × 1080, eller > 2 millioner spejle. Hver af spejlene i enheden har derfor direkte kontrol over den sekvens, som dyrkes på den tilsvarende funktion. Med undtagelse af UV-lys, fotolitografi funktioner som en solid-fase syntese teknik og vedtager cyklus-baserede phosphoramidite kemi. Kun det kræver en helt anden beskyttelse strategi for RNA syntese til at lykkes. Vi har udviklet en ny serie af lysfølsomme RNA-phosphoramiditter, der bærer hydrazin-labile beskytter grupper21. Disse monomerer gør det muligt for RNA at blive debeskyttet under milde forhold, der ikke påvirker integriteten af overfladen. Et første deprotection trin bruger triethylamin til at fjerne cyanoethyl fosfodiester beskyttende grupper, mens hydrazin anvendes i et andet, separat trin for at fjerne dem på 2 '-OH og exocyclic Amin funktioner. Derved kan RNA-oligonukleotider ~ 30-NT i længden og af enhver sekvens nu syntetiseres in situ på mikroarrays22,23. Parallelt hermed er vi også for nylig begyndt at behandle spørgsmålene om gennemløb, kvalitet og hastighed i DNA og RNA photolithography. Vi målte koblings effektivitet > 99% for alle DNA-og RNA-amiditter (figur 1) og undersøgte hvert enkelt trin i oligonukleotidforlængede cyklussen, fra oxidations tiden, til valg af aktivator og til optimal UV-eksponering24 , 25. vi har bragt i nye lys-følsomme 5 ' beskyttelse grupper, der kan fjernes i sekunder kun, omdanne syntesen af hundredtusinder af 100mers i et par timer-lang proces26. Vi har også fordoblet gennemløb af array fabrikation ved at udsætte to substrater samtidigt27. Endelig har vi introduceret en dT phosphoramidite, der indeholder en base-følsom succinyl gruppe som en bekvem måde at kløve, indsamle og analysere DNA og RNA-oligonukleotider, hvilket er centralt for Biblioteks forberedelse28.

På trods af den relativt verdsligt aspekt af DNA og RNA solid-fase syntese, især for nukleinsyre kemikere, mikroarray litografiske forbliver en ikke-triviel opgradering kræver en kompleks opsætning, omhyggelig kontrol og tilsyn med processen, og separate instruktioner for post-syntetisk håndtering afhængigt af arten af oligonukleotid og typen af ansøgning. I denne artikel ønsker vi at give en detaljeret præsentation af hele trin-for-trin procedure af in-situ syntese af DNA og RNA-mikroarrays ved photolithography, fra eksperimentel design til dataanalyse, med vægt på forberedelse af instrumenter og Forbrugsvarer. Vi beskriver derefter de post-syntetiske debeskyttelses metoder, der svarer til det tilsigtede formål med mikroarray fabrikation (dvs. enten hybridisering eller genopretning af nukleinsyre biblioteker).

Protocol

1. mikroarray design

  1. Skriv de sekvenser, der skal syntetiseres i en tekst editor, 5 ' → 3 ', en linje pr. sekvens. For kvalitetskontrol 25mer, brug sekvensen "GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC". Brug A-, C-, G-og T-bogstaverne til DNA-nukleotider og 5, 6, 7 og 8-tal til RNA-nukleotider.
  2. I tilfælde af bibliotek forberedelse, tilføje et ekstra nummer (dvs., 9) ved den 3 ' ende af hver sekvens. Dette vil svare til koblingen af base-følsom monomer.
  3. Hver sekvens skal efterfølges af et komma. Tildel et navn til hver sekvens efter kommaet, og kontroller, at hver bane følger formatet [sekvens, #sequence_name] (uden kantede parenteser). Gem listen over sekvenser som en. txt-fil.
  4. Start MatLab derefter indlæse programmet chipdesign. m. Kør programmet.
  5. Indlæs layout filen til microarray Entirechip i vinduet egenskabs panel. Indlæs Milli chip -layout filen, hvis målet er at syntetisere hele matrixen på fire identiske steder.
  6. I vinduet egenskabs panel under chip specifikationskal du vælge Vælg container og derefter syntese område. Under mønsterskal du vælge det mønster, der giver den korrekte mængde adresserbare funktioner, tælle antallet af sekvenser × antal replikater. For kvalitetskontrol 25mer skal du vælge 25:36-mønsteret.
  7. Vælg Fiducialunder Vælg container. Fiducial funktioner er normalt syntetiseres i hjørnerne af syntese området og bruges til at udtrække hybridiserings data. Med Fiducial valgt, skrive en sekvens (5 ' → 3 '), der vil blive syntetiseret på Fiducial funktioner, og som kan fungere som en positiv kontrol. Brug den samme DNA-sekvens til det 25mer eksperiment.
  8. Indlæs tekstfilen, der indeholder alle skriftlige sekvenser, under sekvens. Sørg for, at Randomize er valgt. Giv en titel til eksperimentet i projektets titel , og Skriv ttttt (svarende til en T5 -linker) i linker-sekvensen.
  9. Tryk på Generer, og find derefter Matrixdesign filer og masker (figur 2) under MaskGen_delta_rc1/designs folder. Sørg for, at den indeholder et display script, en flow sekvens og en designfil.
  10. Åbn skærm scriptet for at forberede biblioteket. Tilføj en ekstra linje nederst i skærm scriptet, der kopierer præcis den første linje i scriptet (f. eks. display First_Mask. bmp 150). Dette vil fjerne terminalen photoprottering gruppe på 5 ' enden af alle oligonucleotides.
  11. Start jobopretteren Autojob -programmet, Indlæs en skabelon ved at klikke på Indlæs skabelon, og klik derefter på display script for at indlæse den visnings scriptfil, der blev genereret af MATLAB. Tryk på Generer. Dette trin vil skabe en række instruktioner, kaldet en jobfil, der vil styre kommunikationen af computeren med micromirrors og DNA-synthesizer.

2. Skub forberedelse og funktionalisering

  1. Bor et dias på to positioner svarende til placeringen af indløbs-og udløbs slangen på syntese cellen. Brug en 0,9 mm diamant bit på en CNC-router til præcis og pålideligt boremaskine. Skyl de borede slides med ultrarent vand og Arranger dem i en slide rack.
  2. Rengør overfladerne ved at sonigere diasene i et vandbad, der indeholder 5% af en ammoniak-baseret Special rengøringsmiddel i 30 min ved 35 °C. Skyl sliden med dobbeltdestilleret H2O og overfør dem i en ren, tør rist.
  3. Arranger boret og uboret mikroskop slides i en slide rack. I en stor gradueret cylinder forberedes funktionaliserings opløsningen ved at blande 475 ml ethanol (EtOH) med 25 ml DDH2O, 10 g til reagens (N-(3-triethoxysilylpropyl) -4-hydroxybutyramid) og 1 ml eddikesyre. Rør godt, indtil homogen derefter overføres i en egnet, lukket beholder.
  4. Placer den belastede rack i beholderen, luk låget, og lad beholderen klippe forsigtigt på en orbital shaker i 4 timer ved stuetemperatur.
  5. Efter 4 timer kasseres funktionaliserings opløsningen og udskiftes med 500 mL vaskeopløsning, bestående af 475 mL EtOH, 25 mL ddH2O og 1 ml eddikesyre. Omrygt langsomt i 20 minutter ved stuetemperatur, og kassér og Udskift derefter med 500 mL frisk vaskeopløsning.
  6. Efter yderligere 20 min ved stuetemperatur, kassér opløsningen, tør slides med en strøm af argon og helbrede dem i en forvarmet vakuum ovn ved 120 °C. Efter 2 h, slukke ovnen og vakuumpumpen, men lad slides under reduceret tryk natten over. Derefter, bringe ovnen tilbage til atmosfærisk tryk og gemme slides i en ekssikkator indtil videre brug.

3. fremstilling af syntese reagenser og reactanter

  1. Phosphoramidite pulvere (figur 1) bringes fra deres opbevaringstemperatur (-25 eller-45 °c) til stuetemperatur i en desiccator.
  2. Når fosamiditterne nåede stuetemperatur, opløses pulveret med et volumen af ultra-Dry acetonitril (< 30 ppm H2O) for at nå 30 mm koncentration for standard DNA og RNA phosphoramidites, og 50 mm for base-følsomme dt monomer ( forberedelse af biblioteket). Tilsæt en lille molekyl pose til at fælde ethvert spor af fugt.
  3. Forbered en opløsning på 1% (w/w) imidazol i DMSO ved at opløse 11 g imidazol i 1 L tør DMSO. Omrystes godt, indtil det er helt opløst. Fastgør opløsningen til den ekstra port på DNA-synthesizeren. Dette vil være den eksponering opløsningsmiddel nødvendig for fuldstændig fjernelse af 5 ′-photoprotficerende gruppe.
  4. Til syntese af biblioteker forberedes en opløsning på 1% (w/v) β-caroten i dichlormethan ved at opløse 100 mg β-caroten i 10 mL dichlormethan. Ryst godt i en ravfarvet glas flaske og Pak derefter i aluminiumsfolie.

4. klargøring og overvågning af mikroarray syntese.

  1. Optag temperatur og fugtighed i mikrosystemets fabrikations rummet, og sørg for, at DNA-synthesizeren er under tilstrækkeligt helium tryk.
  2. Tænd for UV-LED og dens afkølingsventilator. Fastgør en UV-intensitets måler på brændplanet for indkommende UV-lys, og tænd den (figur 3a).
  3. På computeren, start jobfile/Micromirror/syntese files controller software (hedder Wicell). Slå derefter Initialiser betegnelsen Micromirror Device enheden og indlæse en hvid maskefil ved at højreklikke på DMDog derefter vælge Indlæs billede.
  4. Højreklik på ikonet UVS, og vælg UV - lukker åben. Læs effektværdien (i mW/cm2) på intensitets måleren og Tæl 60 s. Efter 60 s, Læs strømværdien igen og notér start-og slutværdierne. Luk udløseren ved at vælge UV - lukker lukning , og sluk for intensitets måleren. Beregn den gennemsnitlige UV-intensitetsværdi i mW/cm2.
  5. Beregn den eksponeringstid, der er nødvendig for at nå en stråleenergi på 6 J/cm2 for 5 '-NPPOC photodeprotection (DNA og RNA- Equation 1 mikroarrays) og 3 J/cm2 for 5 '-bznppoc photodeprotection (DNA-biblioteker), blot efter forholdet.
  6. I softwaren til DNA-synthesizer-arbejdsstationen opretter du en sekvens-fil i sekvens editoren ved at kopiere og indsætte indholdet af den flow sekvens, der genereres af MatLab. Tilsæt en ekstra to vaske trin ved 3 ' ende (standard cyklus bogstav: "s") for at vaske overfladen af substrater, før du går videre til den første kobling. Gem og Eksporter sekvens filen.
  7. I Protocol editor af arbejdsstation software, oprette en protokol, der indeholder en dedikeret cyklus, der er navnet efter hver af de bogstaver og tal til stede i sekvensen fil (f. eks, hvis en sekvens fil indeholder kun bogstaverne A, C, G og T, så protokollen filen skal indeholder fire cyklusser, der hedder A, C, G og T).
  8. Indstil koblings tiden for DNA-phosphoramiditer (cyklus A, C, G og T) til 15 s, til 120 s for rU phosphoramidite (cyklus 8) og til 300 s for rA, rC og rG phosphoramidites (cyklus 5, 6 og 7). Til Biblioteks klargøring indstilles koblingen af den base følsomme, spalte dt monomer til 2 × 120 s (tabel 1 og tabel 2).
  9. Sørg for, at ventetiden mellem to Event 2 -kommunikations hændelser i hver cyklus svarer til den beregnede UV-eksponeringstid for at nå den nødvendige stråleenergi. Med hensyn til sekvensen fil, gemme og eksportere protokol filen.
  10. I WiCell software, indlæse jobbet, sekvens og protokolfiler i deres respektive sub-Windows og derefter klikke på Send at sende sekvens og protokolfiler til DNA-synthesizer.
  11. Tæl antallet af koblinger for hver phosphoramidite i sekvens filen.
  12. For at måle den påkrævede mængde (i μL) phosphoramidit-opløsning, der er nødvendig for at udføre hver syntese, multipliceres antallet af koblinger med 60. Tilsæt 250 μL til hver volumen for sikkerhed og priming af linjen på DNA-synthesizeren. Brug et basis volumen på 250 μL til phosphoramiditter, der kun kræver en enkelt kobling.
  13. Overfør hurtigt opløsningen til hætteglassene på DNA-synthesizeren svarende til portbogstavet/-nummeret i protokol cyklusserne.
  14. Prime havnene med phosphoramidite opløsninger med 10 Prime impulser hver for at fylde linjerne med reagens. Prime acetonitril vask linje før fastgørelse af reaktions cellen.
  15. For at samle syntese cellen skal du først placere en tyk (250 μm) perfluelelastomer (FFKM) pakning på cellens kvarts blok. Placer et boret, funktionaliseret mikroskop slide på toppen af den første pakning, og kontroller, at hullerne på slidene forbindes med indløbs-og udløbs slangen i syntese cellen.
  16. Placer en anden, tynd (50 μm) polytetrafluorethylen (PTFE) pakning over det borede dias, omkring de to huller. Endelig placeres en anden, funktionaliseret, men uboret slide på toppen af den anden pakning (figur 3B). Placer en 4-skrue metal ramme oven på den samlede dobbelt substrat celle, og stram skruen til den samme klemkraft (0,45 nm) ved hjælp af en moment skruetrækker.
  17. Fastgør indløbs-og udløbs slangen til DNA-synthesizeren. Prime acetonitrilvasklinjen og Verificer den korrekte strøm af acetonitril (ACN) gennem substrater. Skil cellen ad, og Saml den igen, hvis en eventuel lækage af ACN kan observeres på dette stadie. Mål mængden af ACN på affalds linjen efter at have gennemgået 7 cyklusser med ACN-priming. Denne volumen skal være 2 mL.
  18. Fastgør syntese cellen på brændplanet for indkommende UV-lys. I tilfælde af Biblioteks forberedelse skal der monteres en ekstra indgangs-og udløbs linje på bagsiden af cellen, og der fyldes Bagkammeret med β-caroten-opløsningen (2 mL opløsning er tilstrækkelig). Sørg for, at der ikke er nogen lækage (figur 3C).
  19. Start syntesen ved først at klikke på Kør i wicell software. Ved den første WAIT-kommando i jobfilen skal du trykke på Start på DNA-synthesizer.
  20. Under syntese, regelmæssigt kontrollere, at visningen af maske filer falder sammen med UV-eksponering og åbning af lukkeren.
  21. Efter syntese af almindelige mikroarrays skal du frakoble cellen fra synthesizeren, adskille cellen og bruge en diamant pen til at etch det syntese nummer på glas gliderne. Etch nummeret på det ikke-syntetiserede ansigt af hvert dias. Slidene overføres til 50 mL centrifugeglas og opbevares i et tørre område indtil videre anvendelse.
  22. Efter syntesen af bibliotekets mikroarrays skal du først tømme β-caroten-opløsningen ud af kammeret og derefter vaske den ved at flyde 2 × 5 mL LM2CL2og derefter dræne. Fortsæt med demontering i henhold til trin 4,21. Det syntetiserede array kan være synligt for det blotte øje (figur 4).

5. DNA-mikroarray-debeskyttelse

  1. Fyld en glasbeholder med 20 mL EtOH og 20 mL ethylenediamin (EDA). Placer de DNA-only-mikroarrays lodret i glasset, luk låget, og lad diasene debeskytte i 2 timer ved stuetemperatur.
    Advarsel: EDA er en akut giftig, ætsende og brændbar væske. Arbejd med handsker i en godt ventileret røg hætte.
  2. Efter 2 h, hente slides ved hjælp af pincet og skyl dem grundigt med dobbelt-destilleret H2O.
  3. Tør diasene i en mikroarray centrifuge i et par sekunder og opbevar dem i en desiccator.

6. RNA-mikroarray-debeskyttelse

  1. I et 50 mL centrifugeglas forberedes en tør opløsning af 2:3 triethylamin/ACN (henholdsvis 20 mL og 30 mL af hver). Overfør et RNA-mikroarray-dias til centrifugeglasset, luk låget, og pak det derefter med plastik tætnings folie. Ryst forsigtigt centrifugeglasset på en orbital shaker i 1 time og 30 min ved stuetemperatur.
  2. Efter 1H og 30 min, Fjern sliden, vask med 2 × 20 mL tør ACN derefter tørre i en mikroarray centrifuge i et par sekunder.
    Forsigtig: triethylamin er en akut giftig, ætsende og brændbar væske. Acetonitril er giftigt og brændbart. Arbejd med handsker i en godt ventileret røg hætte.
    Bemærk: første debeskyttelses trin er fuldført.
  3. Forbered en 0,5 M hydrazinhydrat opløsning i 3:2 pyridin/eddikesyre. Bland først 20 mL eddikesyre og 30 mL pyridin i en gradueret cylinder. Vent på, at opløsningen afkøles, før du tilføjer 1,21 mL hydrazin hydrat. Ca. 40 mL af den resulterende opløsning overføres til et 50 mL centrifugeglas.
    Forsigtig: hydrazin hydrat er en akut giftig og ætsende væske. Pyridin er meget brandfarlig og akut giftig. Eddikesyre er brandfarlig og ætsende. Arbejd med handsker i en godt ventileret røg hætte.
  4. Efter det første beskyttelsestrin overføres RNA-diaset til hydrazinhydratopløsningen, lukkes låget og ombrydes med plastik tætnings folie. Ryst forsigtigt røret på en orbital shaker i 2 timer ved stuetemperatur. Efter 2 timer skal du fjerne sliden, vaske med 2 × 20 mL tør ACN og derefter tørre i en mikroarray centrifuge i et par sekunder.
    Bemærk: det andet beskyttelsestrin er fuldført.
  5. Hvis RNA-mikrosystemet også indeholder DNA-nukleotider, skal du fortsætte med et tredje beskyttelsestrin. I et 50 mL centrifugeglas blandes 20 mL EDA med 20 mL EtOH. Tilsæt DNA/RNA-mikrosystemet til 1:1 EDA/EtOH-opløsningen, og lad den ligge ved stuetemperatur i 5 minutter.
  6. Efter 5 min. fjernes diaset, vaskes med 2 × 20 mL sterilt vand og tørres derefter i en mikroarray centrifuge og opbevares i en desiccator.

7. hybridisering med en fluorescently-mærket komplementær streng

  1. Tø acetyleret bovint serumalbumin (10 mg/mL) og Cy3-mærket komplementær streng (100 nM) og varm op til stuetemperatur.
  2. I et 1,5 mL sterilt mikrocentrifuge glas blandes 150 μL 2x MES-buffer (200 mM 2-(N-morpholino) ethansulfonsyre; 1,8 M nacl; 40 mm EDTA; 0,02% Tween-20) med 26,7 μl Cy3-mærket DNA, 13,4 μl ACETYLERET BSA og 110 μl steril H2O. mix og Vortex. Fordoble lydstyrken, hvis begge slides skal bruges til hybridisering.
  3. Pre-Warm en hybridiseringsovn til en temperatur under Tm af duplex men høj nok til at sikre god diskrimination mellem Full-match og non-match sekvenser. For kvalitetskontrol 25mer, Indstil temperaturen til 42 °C (Tm af 59 °c).
  4. Placer forsigtigt et selvklæbende 300 μL hybridiserings kammer over syntese området på hver slide og pipet i hybridiserings opløsningen, der er fremstillet ovenfor. Dæk hullerne i kammeret med klæbende prikker og wrap hele diaset i aluminiumsfolie.
  5. Placer microarray-diaset i hybridiseringsovn, dæksel, og lad det forsigtigt rotere ved den valgte hybridiserings temperatur i 2 timer.
  6. Efter 2 h, Afmonter lysbilledet, Fjern aluminiumsfolie og Riv forsigtigt hybridiserings kammeret af. Slidene overføres til et centrifugeglas, der indeholder 30 mL ikke-streng vaske buffer (NSWB; 0,9 M NaCl, 0,06 M fosfat, 6 mM EDTA, 0,01% Tween20, pH 7,4) og rystes kraftigt i 2 minutter ved stuetemperatur.
  7. Diaset overføres til et centrifugeglas, der indeholder 30 mL streng vaske buffer (SWB; 100 mM MES, 0,1 M NaCl, 0,01% Tween20) og rystes kraftigt i 1 min.
  8. Endelig overføres diaset til et centrifugeglas, der indeholder 30 mL endelig vaske buffer (FWB; 0,1 x natrium saltvands citrat), og rystes i nogle få sekunder. Tør diaset i en mikroarray centrifuge.
  9. Placer den tørre mikroarray, syntese området nedad, i slide holderen på microarray scanneren. For Cy3-mærkede duplexer, Scan ved 5 μm opløsning med en 532 nm excitation bølgelængde, et 575 nm filter og en Photomultiplier af 350. Gem scanningen med høj opløsning som en. tif-billedfil (figur 5a).

8. udtræk og analyse af data

  1. Før dataudtræk, rotere den gemte array scanning i en billedredaktør for at placere den længste kæde af fiducial funktioner i øverste venstre hjørne af scanningen. Gem det roterede billede.
  2. Start Nimblescan, og tryk derefter på File | Åbn og Indlæs array scanningen. Når du klikker på Gennemse i under afsnittet design filer, skal du indlæse. NDF -designfil, der automatisk blev genereret under designet af microarray-eksperimentet. Klik derefter på Åbn.
  3. Klik på automatisk kontrast/lysstyrkei visningen. Klik på ikonet manuelt justere over scanningen. Placer fire firkantede markører i de fire hjørner af scanningen, og klik derefter på ikonet nu grøn igen. Uddrag hybridiserings data ved at klikke på analyse, rapporter derefter sonde rapport.
  4. Åbn. Probe rapport fil i en regneark editor. Behold kolonnerne B og I, og kassér resten, før du fortsætter med at beregne gennemsnitsværdier og standardafvigelse fra de udtrukne data (figur 5B).

9. bibliotek debeskyttelse, spaltning og nyttiggørelse

  1. For at debeskytte og Kløve DNA-biblioteker skal du tilberede en opløsning på 1:1 Dry EDA/toluen i et 50 ml centrifugeglas. Sænk sliden ind i spaltningen, Luk sliden og wrap med plastik tætnings folie, og drej forsigtigt i en orbital shaker i 2 timer ved stuetemperatur.
  2. Efter 2 timer fjernes sliden og vaskes med 2 × 20 mL omhyggeligt tør ACN. Fjern sliden, og lad den lufttørre.
  3. Med en pipette påføres 100 μL steril H2O over det nu mærkbare syntese område. Pipetér opløsningen op og ned et par gange, før den overføres til et 1,5 mL mikrocentrifuge glas. Gentag processen, og Kombiner mikromatrixeluatet i det samme rør (figur 6).
  4. De 2 × 100 μL spån eluatet fordampe til tørhed og derefter opløses i 10 μL nuklease frit H2O. absorbansen måles på et UV-Vis-Spektrofotometer.
  5. Desalt DNA-biblioteket på en 10 μL pipettespids udstyret med C18-harpiks. Først omdannes chip eluatet til en 0,1 M triethylammoniumacetat (TEAA) bufferopløsning.
  6. Harpiksen våd ved at håbe på 3 x 10 μL H2O/ACN 1:1 og ækvibrere harpiksen ved at vaske med 3 x 10 μl 0,1 M teaa buffer. Binde DNA ved at pipettere chippen eluatet 10 gange op og ned gennem harpiksen. Harpiksen vaskes med 3 x 10 μL 0,1 M TEAA buffer, 3 x 10 μL H2O.
  7. Elute det afsaltede DNA fra spidsen ved at vaske harpiksen med 10 μL H2O/ACN 1:1. Den afsaltede opløsning tørres ned og opløses i 10 μL steril H2O. absorbansen måles på et UV-Vis-Spektrofotometer (figur 7). Indløs biblioteket til tørhed og opbevar ved-20 °C indtil videre brug.

Representative Results

DNA-og RNA-mikroarray-hybridisering
Figur 5 viser resultaterne af en hybridiserings analyse udført på et mikroarray, der indeholder DNA-og RNA-versionerne af en 25mer sekvens (5 '-GTCATCATCATGAACCACCCTGGTC-3 ' i DNA-form). Scanningen i figur 5a vises i et grønskala format svarende til excitation/emission spektrum af Cy3 fluorescens, med fluorescens intensitet registreres i vilkårlige enheder mellem 0 og 65536. Matrix designet fulgte det 25:36-funktions layout, der er beskrevet i afsnittet protokol. Scanningen vises efter korrekt orientering af arrayet, med det øverste venstre hjørne befolket med den længste kæde af fiducial funktioner. Her indeholder de fiducial funktioner DNA-versionen af 25mer og bør i princippet altid give et positivt fluorescens signal for at udføre scannings justering og dataudtræk. Det hybridiserede mikroarray skal fremstå ensartet lyse, og kanterne af det sammenfattende område er dog normalt lysere end midten (op til 50% lysere). Den store mængde sekvens replikater, tilfældigt fordelt i hele området, reducerer virkningen af rumlige artefakter. Her blev hver sekvens (DNA og RNA) syntetiseret ved 2.000 tilfældige steder. Der er typisk lav fluorescens støj (baggrund), < 50 a.u., hvilket fører til et signal/støjforhold i rækkefølgen 200:1 til 800:1 i hybridiseringassays. Efter dataudvinding, fluorescens intensiteter er gennemsnit ud og plottet ± SD.

Der er signifikant variation i absolutte fluorescens værdier mellem forsøgene. Her viser vi resultaterne for tre uafhængige synteser ved hjælp af de samme fabrikations parametre og den samme post-syntetisk håndtering. Den 25mer DNA, når hybridiseret til sin komplementære Cy3-mærkede DNA-streng, vil give fluorescens signaler spænder overalt fra 20.000 til 30.000, meget sjældent over eller under. Den 25mer RNA, når hybridiseret til samme Cy3-mærkede DNA-komplement, vil give fluorescens intensiteter på de tilsvarende funktioner spænder fra 15.000 til 20.000. Dog vil fluorescens intensitet af RNA/DNA-duplexer lejlighedsvis falde til under 8.000, når de tilsvarende DNA/DNA-duplexer stadig vil fluorescerer inden for 20000-30000-området. I sådanne tilfælde kan resultaterne for RNA betragtes som suboptimale. En syntese eller hybridisering fiasko, enten for DNA eller RNA, vil være umiddelbart mærkbar under scanningen fra den indlysende mangel på fluorescens. Der er flere muligheder for at RNA-syntesen enten mislykkes eller delvist lykkes, og de vil blive skitseret i diskussions delen.

Bibliotek debeskyttelse, kavalergang og nyttiggørelse
Afhængigt af kompleksiteten og tætheden af biblioteket, formen og skitse af den syntetiserede array kan ses uden forstørrelse, men under ordentlig belysning (figur 4), med DNA stadig i beskyttet form. Efter debeskyttelse med EDA/toluen, og før tilsætning af vand for at indsamle det spaltet bibliotek, kan det syntese område, der indeholder de nu debeskyttede oligonukleotider, skille sig ud som en hydrofile zone, når resten af glas diaset vises dækket med et uklar hydrofobe lag. Den direkte observation af det sammenfattende område afhænger af det samlede areal, der anvendes til at syntetisere oligonukleotider: større brug af det sammenfattende område vil svare til en større chance for klar sondring mellem hydrofile og hydrofobe regioner på overfladen. Omvendt, biblioteker syntetiseres ved hjælp af færre spejle og med mindre funktioner kan ikke umiddelbart observerbare.

Tilsvarende er mængden af genvundet DNA efter afsaltningen direkte proportional med det samlede areal, der anvendes til syntese. Hvis alle funktioner anvendes til oligonukleotidsyntesen, skal spaltnings-og genvindings proceduren give mellem 25 og 30 pmol af DNA. En 10% anvendelse af det sammenfattende område vil derfor kun give ca. 3 pmol af DNA.

Figure 1
Figur 1 . Kemiske strukturer af DNA og RNA phosphoramidites anvendes i oligonucleotid syntese af microarray photolithography. Standard nitrophenylpropyloxycarbonyl (NPPOC) lysfølsomme beskyttelse grupper på 5 '-OH bruges i regelmæssig DNA og RNA mikroarray syntese til hybridisering formål. For syntesen af komplekse DNA-biblioteker, den mere photolabile benzyl-NPPOC (BzNPPOC) foretrækkes på 5 '-OH, som BzNPPOC fjernes dobbelt så hurtigt som NPPOC, hvilket reducerer den samlede mikroarray syntese tid betydeligt. DNA-oligonukleotider til biblioteker kræver også kobling af en spalte dt monomer ved 3 ' ende. Denne monomer, som bærer en succinyl ester funktion, vil blive kløvet under debeskyttelse, gør det muligt for DNA, der skal indsamles fra mikrochip. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Eksempel på en maske som en billedfil, der sendes til betegnelsen Micromirror Device enheden under UV-eksponering. De hvide pixels svarer til spejle, som vil blive vippes i positionen "on", hvilket afspejler UV-lys på syntese cellen. Sorte pixels svarer til "off" spejle, hvor UV-lys vil blive afspejlet væk fra cellen. Hvide pixels vil derfor give mulighed for koblingen af den næste indkommende phosphoramidite på oligonukleotider findes på de tilsvarende funktioner på glas substrater. Oligonucleotides syntetiseres på de funktioner, hvis tilsvarende spejle er, i denne maske fil, vil sorte pixels dog forblive inaktive under den næste koblings hændelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Fotografier af mikromatrixbilledlitografi optisk og syntese setup. (A) optisk kredsløb til UV-eksponering. UV-lys fra UV-LED er først homogeniseret gennem en rektangulær-tværsnit lys-pipe derefter reflekterer på micromirrors. Micromirrorer, der er blevet vippes ind i en "OFF" position vil afspejle UV-lys væk fra syntese cellen, men micromirrors i "ON" position vil afspejle lys på syntese cellen, beliggende på brændplanet, ved først at passere gennem en 1:1 Offner relæ billeddannelses system. B) den sammenfattende celle, når den er samlet, består af et boret dias placeret først på cellens kvarts blok, adskilt af en tyk PTFE-pakning (ikke vist). En anden, ikke-boret slide er derefter placeret over den borede slide, adskilt af en tynd PTFE pakning. En metal ramme (ikke vist) holder samlingen sammen. (C). for Biblioteks forberedelse, når syntese cellen er fastgjort på brændplanet for indkommende UV-lys, fyldes kammeret mellem kvarts blokken og den borede slide med en 1% opløsning af β-CAROTEN i LM2CL2. For at gøre dette, er en ekstra indløbs-og Udløbsslange fastgjort til kvarts blokken og den orange opløsning flyder fra højre til længst til venstre position. Strømmen af reagenser og opløsningsmidler til syntesen er vist i hvide pile. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Syntese området er normalt synligt for det blotte øje. Her kan et DNA-bibliotek ses på glasoverfladen lige efter syntese, med DNA stadig i beskyttet form. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Hybridiseringassays til 25mer DNA og RNA-sekvenser syntetiseres in situ på mikroarrays. (A) Fluorescens scanning af hele hybridiseret DNA og RNA-mikroarray. 25mer DNA og RNA-oligonukleotider er hybridiseret til deres Cy3-mærkede komplementære tråde. Arrayet blev scannet med en laser ved en 532 nm excitation bølgelængde, ved 5 μm opløsning. B) Fluorescens intensiteter (vilkårlige enheder) af DNA: DNA og RNA: DNA-duplexer i tre separate eksperimenter. De lyse grønne data for in situ syntetiserede RNA-oligonukleotider kan betragtes som suboptimale sammenlignet med fluorescens intensiteten af de tilsvarende DNA-sekvenser. Fejllinjer er SD. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 . Skematisk gengivelse af debeskyttelse, spaltning og nyttiggørelse procedure for DNA-biblioteker syntetiseret på mikroarrays. DNA-sekvenser dyrkes på en base-følsom spalte dt nucleosid (vist i zoomet område). Efter syntese er debeskyttelse af DNA-oligonukleotider (base beskyttende grupper repræsenteret som røde sfærer) i EDA/toluen efterlader det debeskyttede materiale elektrostatisk bundet til overfladen og kan derefter pipetteres ved at anvende en lille mængde vand på det syntetiserede område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 . Repræsentativt absorbans spektrum (220-350 nm) af et spaltet, antibiotikum DNA-bibliotek indeholdende 4.000 forskellige sekvenser, 100-NT i længden. I alt 940 ng af DNA blev isoleret fra en enkelt matrix syntese, svarende til 30 pmol af DNA i alt eller 15 pmol pr. glas substrat. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1. Repræsentativ cyklus protokol for kobling/oxidation/foto debeskyttelse af 5 '-BzNPPOC-da, forudsat den tilsvarende fosforamidite blev indlæst på port "A". Koblings tiden (i sekunder) vises på linjen "par monomer". UV-fotodebeskyttelsestid, her svarende til en stråleenergi på 3 J/cm2 (bznppoc photochemistry), beregnes som den tid, der er gået mellem de to "Event 2 out"-kommunikationssignaler.

Table 2
Tabel 2. Repræsentativ cyklus protokol for kobling/oxidation/foto debeskyttelse af 5 '-NPPOC-rA, forudsat at den tilsvarende RNA phosphoramidite blev indlæst på port "A". Koblings tiden (i sekunder) vises på linjen "par monomer". UV-fotodebeskyttelsestid, her svarende til en stråleenergi på 6 J/cm2 (nppoc photochemistry), beregnes som den tid, der er gået mellem de to "Event 2 out"-kommunikationssignaler.

Discussion

Solid-fase DNA og RNA syntese er brød og smør af hver nukleinsyre kemi Lab, og selv om tilsætning af litografiske komponenten er ganske vist en kompleks operation, mikroarray fabrikation medieret af UV-lys er også en meget pålidelig proces . Det er desuden den eneste tilgængelige metode til in situ-RNA-syntese på mikroarrays. Stadig, som i enhver flertrins eksperimenterende procedure, der er rigelig plads til menneskelige fejl.

Måske er det mest kritiske skridt koblingen af en phosphoramidite, da det skal være en konstant højtydende kemisk reaktion for at give oligonukleotider med få syntetiske fejl. I vores microarray syntese protokol, phosphoramidite kobling er endnu mere afgørende for den samlede syntese kvalitet, da fremstillingsprocessen omgår capping og forhindrer oligonucleotid rensning. Der er beregnet trinvis koblings effektivitet på over 99% for alle lysfølsomme DNA-og RNA-phosphoramiditer, selv for meget korte koblingstider (15 s)24 , men der kan lejlighedsvis forekomme lavere koblings udbytter, navnlig for GD amidites vedkommende. Stabiliteten af de solubilized phosphoramiditer ved stuetemperatur er blevet undersøgt før og blev påvist at afhænge af arten af nukleobasen, med guanosin phosphoramiditer tilbøjelige til omfattende nedbrydning i kun et spørgsmål om dage29, 30. Men ved opbevaring ved-25 °C blev GD phosphoramiditer opløst i ACN, da 30 mM opløsning fandtes at være stabile i flere uger. Den relative ustabilitet i GD phosphoramidite-opløsninger ved stuetemperatur betyder dog, at de ikke skal holdes fastgjort til DNA-synthesizeren i flere dage.

For RNA-phosphoramiditer er koblings udbyttet meget afhængigt af phosphoramidite-kvaliteten (som kan vurderes ved 31P NMR-spektroskopi) og koblings tiden. Koblingstider på 5 minutter for rA, rG, rC og 2 min for rU synes nødvendige. Faktisk fandt vi, at afkortning af kondensations tiden til 2 min for alle RNA phosphoramiditer førte til signifikant lavere hybridiserings signaler.

DNA-synthesizeren selv, såvel som reagenser og opløsningsmidler, skal helt sikkert være så ren som muligt for at opnå det højeste udbytte af oligonukleotidsyntesen. Imidlertid, uopløseligt materiale, salte eller partikler, kan ophobes over tid i linjer og slanger af leveringssystemet, hvilket fører til en gradvis fald i forbruget af reagenser og reactanter. Hvis en generel rengøring af synthesizeren ikke løser et lavt udgangsvolumen, kan en stigning i antallet af impulser være en alternativ løsning. Særlig nyttig i tilfælde af lavt phosphoramidit-forbrug kan linjen i koblings protokollen, der svarer til pumpning af en blanding af phosphoramidite og aktivator (tredje linje i koblings under afsnittet i tabel 1 og tabel 2), modificeret fra 6 til 9 impulser uden nogen mærkbar negativ virkning på syntese kvaliteten. Desuden er antallet af pulser af aktivator nødvendig for at bringe amidite/aktivator blandingen til syntesen substrat (i øjeblikket 6, fjerde linje i koblingen under afsnit, se tabel 1 og tabel 2) afhænger af DNA-synthesizer selv samt på slange længde i syntese cellen. Dette tal kan justeres efter udskiftning af phosphoramiditten med en farvet opløsning og tælle antallet af impulser, der er nødvendige for at skubbe den farvede blanding til glas substrat for kobling.

Den beskrevne metode gør det muligt for DNA og RNA-syntese at fortsætte samtidig, på samme mikroarray. Hybrider af DNA og RNA kan også forberedes uden ændring af array fabrikations protokollerne, og så længe tretrins-debeskyttelses protokollen følges. Det skal dog bemærkes, at kun RNA-mikroarrays kræver en to-trins debeskyttelse: en decyanoethylering først med et3N efterfulgt af hydroxyl og base deprotection med hydrazin. DNA-nukleobaser blev fundet ufuldstændigt debeskyttet under disse betingelser og har brug for yderligere trin i EDA for at gennemføre fuldstændig fjernelse af phenoxyacetyl (PAC) grupper. Denne ekstra behandling med EDA er kortere (5 min) end for standard debeskyttelse af DNA-mikroarrays31, men det er tilstrækkeligt at køre den til færdiggørelse efter triethylamin-og hydrazinbehandlinger. Desuden begrænser en kort reaktionstid med EDA eksponeringen af et fuldt debeskyttet RNA-oligonukleotid til grundlæggende betingelser.

En fordel af in situ RNA array syntese over alternative metoder som spotting eller DNA transkription32,33,34 er evnen til at opbevare den syntetiserede RNA mikrochip i beskyttet form indtil brug, og dermed undgå risiko for potentiel RNA-nedbrydning. Efter syntetiske procedurer for RNA betyder på den anden side, at forbrugsstoffer og reagenser holdes sterile, og at håndteringen udføres under RNase-frie forhold. Bemærk, vi fandt, at tilføjelsen af RNase-hæmmer til hybridiseringmixet ikke gav stærkere hybridiserings signaler til RNA-funktionerne.

Syntesen af DNA-biblioteker på en base-følsom monomer er mere kompleks end syntesen af et par kontrol sekvenser på en overflade, og som sådan er helt sikkert mere tilbøjelige til at designe fejl. Men under forudsætning af, at sekvens design (dvs. karakteren og antallet af sekvenser) er korrekt, omdanne denne liste til en samling af eksponerings masker og en bestilt serie af koblingscyklusser forbliver en ligetil proces. Men, vigtige variationer fra standard microarray syntese findes og er afgørende for en vellykket fabrikation af en high-density bibliotek array.

Først, en base-følsom dT monomer er koblet som den første phosphoramidite efter syntese af linker. Koblings udbyttet af denne monomer (figur 1) blev fundet at være relativt lav, omkring 85%28, hvilket er grunden til bestræbelserne på at forbedre sin iblanding, enten ved at øge sin koncentration i ACN fra 30 mm til 50 mm, eller ved at gentage koblings trin: to på hinanden følgende koblings reaktioner ved hjælp af friske monomerer eller to separate, men fortløbende koblingscyklusser.

Den anden ændring er tilføjelsen af en β-caroten opløsning i den bageste kammer af syntese cellen, som bekvemt absorberer 365 nm lys. Dette er en vigtig modifikation af fotolitografi opsætningen, da det forhindrer UV-lys i at reflektere tilbage på array substrat. Faktisk, efter at have krydset den interstitielle medium mellem substrater, indkommende UV-lys udgange gennemboret dias og når kvarts blok af cellen. Fresnel ligninger forudsige, at ~ 4% af vinkelret hændelse UV-lys vil afspejle fra hver af de tre downstream luft-glas interfaces (udgang side af 2nd substrat og begge sider af kvarts blokken) og tilbage på syntese substrat, som fører til utilsigtet eksponering af photoprotected oligonukleotider. Diffraktion og spredning bidrager også til "off-Target" foto beskyttelse og dermed til nukleotid indsættelse, som direkte påvirker fejlfrekvensen af syntese, men disse bidrag er meget mindre end refleksioner og kan primært løses ved reducere syntese tæthed (efterlader huller mellem funktioner). Vi har konstateret, at niveauet af β-caroten opløsning i det nedre kammer af cellen tendens til let falde kun i løbet af de første minutter af array syntese, og derfor skal overvåges og justeres.

Endelig er den tredje ændring den debeskyttelses løsning, der erstatter EtOH for toluen, som holder det kløvede DNA-bibliotek bundet til overfladen, formentlig gennem elektrostatiske interaktioner. Hvis du anvender en lille mængde vand til syntese området efter ACN-vask, kan biblioteket nemt samles. Processen er dog kun vellykket, hvis vandindholdet i EDA og toluen er minimal, hvilket gør nukleinsyre helt uopløseligt i deprotection cocktail. Alternativt kan DNA-biblioteker blive kløvet af chippen ved hjælp af ammoniak9,10,14,35og derefter yderligere debeskyttet ved at opvarme den DNA-holdige ammoniakopløsning til 55 °c natten over. Genopretning af DNA-biblioteker med ammoniak er dog ikke kompatibelt med RNA. RNA-oligonukleotider på et underlag med base-spaltning kan eluppes fra overfladen ved hjælp af den samme EDA/toluen-procedure, der er beskrevet ovenfor, men kun i den næstsidste fase efter et3N og hydrazin to-trins debeskyttelses strategi28.

Alternative strategier til at inddrive oligonucleotid puljer fra mikroarrays uden behov for en specifik grundlæggende behandling eksisterer, er i princippet forenelige med fotolitografi og stole på brugen af enzymer. For eksempel kan et enkelt deoxyuracil nucleotid være målet for uracil-DNA DNA (udg) og fjernet fra resten af DNA-sekvensen, eller en enkelt RNA-enhed kan genkendes af RNase H type 2-enzymer og fosfodiester-obligationen 5 ' til RNA-kløvet , frigivelse af 5 ' DNA del23.

Vi har nu en kraftfuld, pålidelig og high-density metode til syntese af DNA, RNA, og hybrid DNA/RNA-mikroarrays. Disse kan ikke kun fungere som platforme for hybridisering eller bindende assays36, men de repræsenterer også en hurtig og billig måde at producere komplekse nukleinsyre biblioteker. For DNA-baseret digital datalagring kan mikroarray fotolitografi blive en potentiel løsning på "skrivning" flaskehalsen (dvs. til kodning af oplysninger ved syntese). Succesen i digital kodning på DNA og i de Novo gensamling afhænger af sekvens troskab, som på syntese niveau, giver sig udslag i fejlfrekvensen. Syntetiske og optiske fejl i vores nuværende array fabrikations protokoller vil blive diskuteret og rapporteret på andre steder. Parallelt hermed er der nu bestræbelser på at øge fabrikations skalaen og-gennemstrømningen yderligere.

Disclosures

Forfatterne attesterer, at de ikke har nogen tilknytning til nogen for-profit organisation.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af den østrigske videnskabs fond (FWF Grants P23797, P27275 og P30596) og den schweiziske National Science Foundation (Grant #PBBEP2_146174).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slide functionalization
Acetic acid >99.8% Sigma 33209 For RNA deprotection
CNC router Stepcraft 300 CK
Ethanol absolute VWR 1.07017.2511 For deprotection and functionalization
N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide Gelest SIT8189.5 Silanizing reagent
Nexterion Glass D microscope slides Schott 1095568
Polymax 1040 Heidolph Orbital shaker
Proclean 507 Ultrasonic water bath Ulsonix To clean slides after drilling
Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner Sigma Z860086 To clean slides after drilling
Microarray synthesis
0.25 M dicyanoimidazole in ACN Biosolve 0004712402BS Activator
0.7 XGA DMD Texas Instruments Digital Micromirror Device
20 mM I2 in pyridine/H2O/THF Sigma L860020-06 Oxidizer
250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer FFKM Lower teflon gasket
2'-O-ALE RNA phosphoramidites ChemGenes
365 nm high-power UV-LED Nichia NVSU333A
5'BzNPPOC DNA phosphoramidites Orgentis
5'NPPOC DNA phosphoramidites FlexGen
Acetonitrile Biosolve 0001205402BS For DNA synthesis
Amidite Diluent for DNA synthesis Sigma L010010 For dissolving phosphoramidites
Cleavable dT ChemGenes Base-sensitive monomer for library preparation
DMSO Biosolve 0004474701BS As exposure solvent
DNA and RNA microarray deprotection
Ethylenediamine >99.5% Sigma 3550 For deprotection
Expedite 8909 PerSeptive Biosystems DNA synthesizer
Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine Sigma 225819 For RNA deprotection
Imidazole Sigma 56750
Industrial Strength lower-density PTFE tape Gasoila Thin, upper teflon gasket
Pyridine >99% Sigma P57506 For RNA deprotection
Triethylamine >99% Sigma T0886 For RNA deprotection
β-carotene Sigma C9750 For library preparation
Hybridization and scanning
20x Sodium Saline Citrate Roth 1054.1
5'Cy3-labelled complementary strand Eurogentec For duplex hybridization
Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube Eppendorf
BSA (10 mg/mL) Promega R3961
EDTA molecular biology grade Promega H5031
GenePix 4100A Molecular Devices Microarray scanner
Hybridization oven Boekel Scientific 230500
MES monohydrate Sigma 69889
MES sodium Sigma M3058
NaCl >99.5% Sigma 71376
SecureSeal SA200 hybridization chamber Grace BioLabs 623503
Spectrafuge mini Labnet C1301 Microarray centrifuge
Tween-20 molecular biology grade Sigma P9416
Data extraction
Excel Microsoft For data extraction
MatLab MathWorks Microarray design
NimbleScan 2.1 Roche NimbleGen
Desalting and quantification
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Scientific
Toluene Merck
ZipTip C18 Millipore ZTC18s008 Desalting pipet tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bumgarner, R. Current protocols in molecular biology. 101, 22 (2013).
  2. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).
  3. Tietjen, J. R., Donato, L. J., Bhimisaria, D., Ansari, A. Z. Sequence-specificity and energy landscapes of DNA-binding molecules. Methods in enzymology. 497, 3-30 (2011).
  4. Katilius, E., Flores, C., Woodbury, N. W. Exploring the sequence space of a DNA aptamer using microarrays. Nucleic Acids Research. 35 (22), 7626-7635 (2007).
  5. Franssen-van Hal, N. L. W., et al. Optimized Light-Directed Synthesis of Aptamer Microarrays. Analytical Chemistry. 85 (12), 5950-5957 (2013).
  6. Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. Nucleotide Chemistry .4. Synthesis of Deoxyoligonucleotides on a Polymer Support. Journal of the American Chemical Society. 103 (11), 3185-3191 (1981).
  7. Eroshenko, N., Kosuri, S., Marblestone, A. H., Conway, N., Church, G. M. Gene Assembly from Chip-Synthesized Oligonucleotides. Current Protocols in Chemical Biology. 2012, (2012).
  8. Kosuri, S., et al. Scalable gene synthesis by selective amplification of DNA pools from high-fidelity microchips. Nature Biotechnology. 28 (12), 1295 (2010).
  9. Richmond, K. E., et al. Amplification and assembly of chip-eluted DNA (AACED): a method for high-throughput gene synthesis. Nucleic Acids Research. 32 (17), 5011-5018 (2004).
  10. Schmidt, T. L., et al. Scalable amplification of strand subsets from chip-synthesized oligonucleotide libraries. Nature Communications. 6, (2015).
  11. Grass, R. N., Heckel, R., Puddu, M., Paunescu, D., Stark, W. J. Robust Chemical Preservation of Digital Information on DNA in Silica with Error-Correcting Codes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (8), 2552-2555 (2015).
  12. Erlich, Y., Zielinski, D. DNA Fountain enables a robust and efficient storage architecture. Science. 355 (6328), 950-953 (2017).
  13. Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
  14. Cleary, M. A., et al. Production of complex nucleic acid libraries using highly parallel in situ oligonucleotide synthesis. Nature Methods. 1 (3), 241-248 (2004).
  15. LeProust, E. M., et al. Synthesis of high-quality libraries of long (150mer) oligonucleotides by a novel depurination controlled process. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2522-2540 (2010).
  16. Lietard, J., Damha, M. J., Somoza, M. M. Enzymatic and Chemical Synthesis of Nucleic Acid Derivatives. Fernández-Lucas, J. , Wiley Online Books. (2018).
  17. Fodor, S. P. A., et al. Spatially Addressable Parallel Chemical Synthesis. Science. 251 (4995), 767-773 (1991).
  18. Singh-Gasson, S., et al. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array. Nature Biotechnology. 17 (10), 974-978 (1999).
  19. Pease, A. C., et al. Light-Generated Oligonucleotide Arrays for Rapid DNA-Sequence Analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (11), 5022-5026 (1994).
  20. Holz, K., Lietard, J., Somoza, M. M. High-Power 365 nm UV LED Mercury Arc Lamp Replacement for Photochemistry and Chemical Photolithography. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 5 (1), 828-834 (2017).
  21. Lackey, J. G., Mitra, D., Somoza, M. M., Cerrina, F., Damha, M. J. Acetal Levulinyl Ester (ALE) Groups for 2′-Hydroxyl Protection of Ribonucleosides in the Synthesis of Oligoribonucleotides on Glass and Microarrays. Journal of the American Chemical Society. 131 (24), 8496-8502 (2009).
  22. Lackey, J. G., Somoza, M. M., Mitra, D., Cerrina, F., Damha, M. J. In-situ chemical synthesis of rU-DNA chimeras on chips and enzymatic recognition. Chimica Oggi-Chemistry Today. 27 (6), 30-33 (2009).
  23. Lietard, J., Ameur, D., Damha, M., Somoza, M. M. High-density RNA microarrays synthesized in situ by photolithography. Angewandte Chemie International Edition. 57 (46), 15257-15261 (2018).
  24. Agbavwe, C., et al. Efficiency, Error and Yield in Light-Directed Maskless Synthesis of DNA Microarrays. Journal of Nanobiotechnology. 9, (2011).
  25. Sack, M., et al. Express photolithographic DNA microarray synthesis with optimized chemistry and high-efficiency photolabile groups. Journal of Nanobiotechnology. 14, (2016).
  26. Kretschy, N., Holik, A. K., Somoza, V., Stengele, K. P., Somoza, M. M. Next-Generation o-Nitrobenzyl Photolabile Groups for Light-Directed Chemistry and Microarray Synthesis. Angewandte Chemie International Edition. 54 (29), 8555-8559 (2015).
  27. Sack, M., Kretschy, N., Rohm, B., Somoza, V., Somoza, M. M. Simultaneous Light-Directed Synthesis of Mirror-Image Microarrays in a Photochemical Reaction Cell with Flare Suppression. Analytical Chemistry. 85 (18), 8513-8517 (2013).
  28. Lietard, J., et al. Base-cleavable microarrays for the characterization of DNA and RNA oligonucleotides synthesized in situ by photolithography. Chemical Communications. 50 (85), 12903-12906 (2014).
  29. Krotz, A. H., et al. Solution stability and degradation pathway of deoxyribonucleoside phosphoramidites in acetonitrile. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 23 (5), 767-775 (2004).
  30. Hargreaves, J. S., Kaiser, R., Wolber, P. K. The Degradation of Dg Phosphoramidites in Solution. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids. 34 (10), 691-707 (2015).
  31. McGall, G. H., et al. The efficiency of light-directed synthesis of DNA arrays on glass substrates. Journal of the American Chemical Society. 119 (22), 5081-5090 (1997).
  32. Collett, J. R., et al. Functional RNA microarrays for high-throughput screening of antiprotein aptamers. Analytical Biochemistry. 338 (1), 113-123 (2005).
  33. Buenrostro, J. D., et al. Quantitative analysis of RNA-protein interactions on a massively parallel array reveals biophysical and evolutionary landscapes. Nature Biotechnology. 32 (6), 562-568 (2014).
  34. Wu, C. -H., Holden, M. T., Smith, L. M. Enzymatic Fabrication of High-Density RNA Arrays. Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13514-13517 (2014).
  35. Tian, J., et al. Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA microchips. Nature. 432 (7020), 1050-1054 (2004).
  36. Lietard, J., et al. Mapping the affinity landscape of Thrombin-binding aptamers on 2'F-ANA/DNA chimeric G-Quadruplex microarrays. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1619-1632 (2017).

Tags

Genetik microarray photolithography in situ syntese phosphoramidite kemi acetalplast levulinyl ester fluorescens kløvende substrater DNA datalagring digital information
High-density DNA og RNA-mikroarrays-Photolithographic syntese, hybridisering og fremstilling af store nukleinsyre biblioteker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lietard, J., Schaudy, E., Hölz, … More

Lietard, J., Schaudy, E., Hölz, K., Ameur, D., Somoza, M. M. High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries. J. Vis. Exp. (150), e59936, doi:10.3791/59936 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter