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Genetics

उच्च घनत्व डीएनए और आरएनए microarrays - Photolithographic संश्लेषण, संकरीकरण और बड़े न्यूक्लिक एसिड पुस्तकालयों की तैयारी

Published: August 12, 2019 doi: 10.3791/59936
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Inorganic Chemistry, Faculty of Chemistry, University of Vienna

Summary

इस अनुच्छेद में हम उपस्थित हैं और संश्लेषण और न्यूक्लिक एसिड microarrays के अनुप्रयोगों में नए घटनाक्रम पर चर्चा situ में निर्मित. विशेष रूप से, हम बताते हैं कि कैसे डीएनए संश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल आरएनए करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और कैसे microarrays retrievable न्यूक्लिक एसिड पुस्तकालयों बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

फोटोलिथोग्राफी कांच स्लाइड पर डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड ्स्डल के संश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है, क्योंकि यह माइक्रोमीटर आकार के दर्पण से परावर्तित यूवी प्रकाश की परिशुद्धता और घनत्व के साथ फॉस्फोरामिआइट युग्मन प्रतिक्रियाओं की दक्षता को जोड़ती है। फोटोलिथोग्राफी microarrays कि कई लाख अलग डीएनए दृश्यों, 100-nt या अब, केवल कुछ ही घंटों में हजारों की सैकड़ों से समायोजित कर सकते हैं पैदावार. यह बहुत बड़े अनुक्रम अंतरिक्ष के साथ, microarrays न्यूक्लिक एसिड-लिगंड बातचीत, जो आरएनए के मामले में विशेष रूप से प्रासंगिक हैं के तंत्र की खोज के लिए आदर्श प्लेटफार्मों रहे हैं. हमने हाल ही में आरएनए फॉस्फोरामिडीज के एक नए सेट की तैयारी के बारे में रिपोर्ट की है जो सिटू फोटोलिथोग्राफी के साथ संगत है और जिसे बाद में आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स, होमोपॉलीमर के साथ-साथ मिश्रित-आधार दृश्यों को विकसित करने के लिए उपयोग किया गया था। यहाँ, हम आरएनए microarray निर्माण की प्रक्रिया को विस्तार से वर्णन, प्रयोगात्मक डिजाइन से, वाद्य सेटअप करने के लिए, सरणी संश्लेषण, deprotection और अंतिम संकरीकरण परख एक टेम्पलेट 25mer एक उदाहरण के रूप में सभी चार ठिकानों युक्त अनुक्रम का उपयोग कर. समानांतर में, हम संकरीकरण आधारित प्रयोगों से परे जाते हैं और जटिल न्यूक्लिक एसिड पुस्तकालयों के लिए एक सस्ती प्रवेश द्वार के रूप में microarray photolithgraphy शोषण. ऐसा करने के लिए, उच्च घनत्व डीएनए microarrays एक आधार के प्रति संवेदनशील मोनोमर है कि डीएनए आसानी से cleaved और संश्लेषण और deprotection के बाद प्राप्त किया जा करने की अनुमति देता है पर निर्मित कर रहे हैं. निर्माण प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है ताकि सिंथेटिक त्रुटियों की संख्या को सीमित किया जा सके और उस प्रभाव को, यूवी फोटॉनों को अवशोषित करने के लिए जेड-कैरोटीन समाधान की एक परत पेश की जाती है जो अन्यथा संश्लेषण substrates पर वापस प्रतिबिंबित हो सकती है। हम एक कदम दर कदम तरीके से पुस्तकालय की तैयारी की पूरी प्रक्रिया में वर्णन, डिजाइन से दरार और परिमाणीकरण के लिए.

Introduction

डीएनए माइक्रोरेरेंस का व्यावहारिक उपयोग पारंपरिक रूप से दो कोशिकाओं की आबादी के बीच जीन अभिव्यक्ति के स्तर में बदलाव के अध्ययन में रहा है, एक पहचान विधि1के रूप में पूरक किस्में और फ्लोरोसेंट का उपयोग करते हुए। कभी कभी, डीएनए microarrays ऐसे प्रोटीन के रूप में गैर न्यूक्लिक एसिड ligands के साथ बाध्यकारी घटनाओं में उद्यम, व्यवस्थित अनुक्रम क्रम क्रम परिवर्तन की एक रणनीति है कि बाध्यकारी परिदृश्य2,3की एक व्यापक सिंहावलोकन प्रदान करता है के साथ, 4,5. यह दृष्टिकोण प्रभावी रूप से व्यापक अनुक्रम कवरेज के साथ प्लेटफार्मों में मात्र संकरीकरण सतहों से microarrays बदल देती है, जो आरएनए संरचना और समारोह के अमीर और अधिक जटिल दुनिया के अध्ययन के लिए एक परिसंपत्ति होगी। अत्यंत कुशल फॉस्फोरामिडाइट युग्मन प्रतिक्रिया6द्वारा समर्थित , situ संश्लेषित डीएनए सरणियों में अब भी डीएनए7के एक सस्ते स्रोत के रूप में माना जा सकता है , जो विशेष रूप से प्रासंगिक होता जा रहा है के लिए बढ़ती मांग पर विचार जीन एसेम्बली8,9, डीएनए आधारित नैनोस्ट्रक्चर10, सूचना भंडारण या अनुक्रमण11,12के लिए न्यूक्लिक एसिड सामग्री . इसी प्रकार अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों से उन विधियों के विकास से लाभ होने की संभावना है जो आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स13के बहुत जटिल मिश्रण उत्पन्न करते हैं। इस संदर्भ में, सरणी निर्माण प्रोटोकॉल है कि oligonucleotides के लिए अनुमति देने के लिए situ में संश्लेषित किया जा करने के लिए और उच्च घनत्व पर आदर्श न्यूक्लिक एसिड जैव प्रौद्योगिकी के तेजी से विस्तार क्षेत्र की जरूरतों को पूरा करने के लिए रखा जाता है. हालांकि, जैव प्रौद्योगिकी के रूप में विविध के रूप में एक क्षेत्र के साथ, प्रत्येक आवेदन के उद्देश्य की आवश्यकता हो सकती है कि microarray पर डीएनए या तो उच्च throughput पर या सिंथेटिक त्रुटियों की एक बहुत कम राशि के साथ उत्पादन किया जा14,15, या दोनों, की आवश्यकता होती है एक डीएनए microarrays के संश्लेषण प्रोटोकॉल पर करीब देखो, जो ऐतिहासिक, मुख्य रूप से संकरीकरण assays के लिए अनुकूलित किया गया है. इस बीच, आरएनए microarrays के situ संश्लेषण में एक चुनौतीपूर्ण प्रयास हो पाया गया है, 2'-OH समारोह के लिए सुरक्षा समूह के साथ जुड़े कठिनाई के अधिकांश के साथ, आमतौर पर मानक ठोस चरण संश्लेषण है कि के साथ हटा दिया जाता है में एक silyl moiety फ्लोरीन आधारित अभिकर्मकों, रसायन है कि कांच या सिलिकॉन सतहों के साथ असंगत हैं. उन मुद्दों और डीएनए और आरएनए microarray संश्लेषण में चुनौतियों हाल ही में काम का एक बड़ा शरीर का विषय रहा है, विशेष रूप से photolithgraphy दृष्टिकोण16के साथ .

फोटोलिथोग्राफी युग्मन से पहले ओलिगोन्यूक्लिओटाइडको अनब्लॉक करने के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग करता है और यूवी जोखिम के पैटर्न का निर्माण करने के लिए मास्क की आवश्यकता होती है, जिससे स्थानिक रूप से आयोजन और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के विकास को नियंत्रित किया जाता है। भौतिक मास्कों को कंप्यूटर-नियंत्रित माइक्रोमिरोर्स द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है जिसका झुकाव चुनिंदा रूप से माइक्रोरेरे सब्सट्रेट17,18,19पर यूवी प्रकाश को दर्शाता है . एक यूवी स्रोत के रूप में, हम एक उच्च शक्ति एलईडी स्रोत20से 365 एनएम प्रकाश का उपयोग करें। वर्तमान photolithographic setups 1024 - 768 दर्पण युक्त micromirror सरणियों से लैस हैं, अधिक से अधिक 780.000 व्यक्तिगत addressable स्पॉट के लिए इसी ("विशेषताएं") सिर्फ 1.4 सेमी2के एक छोटे से क्षेत्र पर, या 1080p की सरणियों के साथ 1920 $ 1080, या 2 लाख दर्पण. इसलिए डिवाइस में दर्पण के प्रत्येक इसी सुविधा पर हो अनुक्रम पर सीधा नियंत्रण है. यूवी प्रकाश के अपवाद के साथ, एक ठोस चरण संश्लेषण तकनीक की तरह photolithgraphy कार्य करता है और चक्र आधारित फॉस्फोरामिाइट रसायन शास्त्र को गोद ले। केवल यह आरएनए संश्लेषण के लिए एक पूरी तरह से अलग सुरक्षा रणनीति की आवश्यकता है सफल होने के लिए. हमने प्रकाश-संवेदी आरएनए फॉस्फोरामिडाइट्स की एक नई श्रृंखला विकसित की है जिसमें हाइड्रैजीन-लेबिल सुरक्षा समूह21हैं। इन मोनोमरों से आरएनए को हल्की परिस्थितियों में निष्क्रिय किया जा सकता है जो सतह की अखंडता को प्रभावित नहीं करते हैं। एक पहले deprotection कदम cyanoethyl फॉस्फोडाइस्टर की रक्षा समूहों को दूर करने के लिए triethylamine का उपयोग करता है, जबकि hydrazine एक दूसरे में प्रयोग किया जाता है, अलग कदम 2'-OH और exocyclic amine कार्यों में उन लोगों को दूर करने के लिए. ऐसा करने में, आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स की लंबाई में और किसी भी अनुक्रम का अब माइक्रोरेयरे पर स्थिति में संश्लेषित किया जा सकता है22,23. समानांतर में, हमने हाल ही में डीएनए और आरएनए फोटोलिथोग्राफी में थ्रूपुट, गुणवत्ता और गति के प्रश्नों का समाधान करना भी शुरू किया है। हम युग्मन क्षमता मापा और सभी डीएनए और आरएनए amidites के लिए 99% (चित्र 1) और oligonucleotide बढ़ाव चक्र में प्रत्येक व्यक्ति के कदम की जांच की, ऑक्सीकरण समय से, उत्प्रेरक के चुनाव के लिए और इष्टतम यूवी जोखिम24 , 25.हम नए प्रकाश के प्रति संवेदनशील 5 ' सुरक्षा समूहों है कि सेकंड में ही हटाया जा सकता है में लाया है, कुछ ही घंटों लंबी प्रक्रिया26में 100mers के हजारों की सैकड़ों के संश्लेषण को बदलने . हमने27एक साथ दो सब्सट्रक् रेटों को उजागर करके सरणी निर्माण के थ्रूपुट को भी दोगुना कर दिया है . अंत में, हमने एक डीटी फॉस्फोरामाइड पेश किया है जिसमें आधार-संवेदी सक्सिनिल समूह शामिल है, जो डीएनए को इकट्ठा करने और विश्लेषण करने का एक सुविधाजनक तरीका है, जो पुस्तकालय की तैयारी28के लिए केंद्रीय है।

डीएनए और आरएनए ठोस चरण संश्लेषण के अपेक्षाकृत सांसारिक पहलू के बावजूद, विशेष रूप से न्यूक्लिक एसिड केमिस्टों के लिए, microarray photolithgraphy एक जटिल सेटअप की आवश्यकता होती है एक गैर-trivial उन्नयन रहता है, सावधान नियंत्रण और प्रक्रिया के पर्यवेक्षण, और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड की प्रकृति और अनुप्रयोग के प्रकार के आधार पर पोस्ट-सिंथेटिक हैंडलिंग के लिए अलग-अलग निर्देश। इस अनुच्छेद में, हम उपकरणों की तैयारी पर जोर देने के साथ, प्रयोगात्मक डिजाइन से डेटा विश्लेषण करने के लिए, फोटोलिथोग्राफी द्वारा डीएनए और आरएनए microarrays के situ संश्लेषण में पूरे कदम दर कदम प्रक्रिया की एक विस्तृत प्रस्तुति प्रदान करना चाहते हैं और उपभोग्य वस्तुएं। हम तो पोस्ट सिंथेटिक deprotection तरीकों है कि microarray निर्माण के उद्देश्य से मेल खाते हैं (यानी, या तो संकरीकरण या न्यूक्लिक एसिड पुस्तकालयों की वसूली).

Protocol

1. माइक्रोरेरे डिजाइन

  1. एक पाठ संपादक में संश्लेषित किया जा करने के लिए दृश्यों लिखें, 5''$3', अनुक्रम प्रति एक पंक्ति. गुणवत्ता नियंत्रण 25mer के लिए, अनुक्रम "GTCATCATGAACCACCCTGGTC" का उपयोग करें। डीएनए न्यूक्लिओटाइड के लिए ए, सी, जी और टी अक्षरों का प्रयोग करें और आरएनए न्यूक्लिओटाइड के लिए 5, 6, 7 और 8 नंबरों का उपयोग करें।
  2. पुस्तकालय की तैयारी के मामले में, प्रत्येक अनुक्रम के 3's अंत में एक अतिरिक्त संख्या (यानी, 9) जोड़ें। यह आधार-संवेदी मोनोमर के युग्मन के अनुरूप होगा।
  3. प्रत्येक अनुक्रम एक अल्पविराम द्वारा पीछा किया जाना चाहिए। अल्पविराम के बाद प्रत्येक अनुक्रम के लिए कोई नाम असाइन करें, और सत्यापित करें कि प्रत्येक लेन [अनुक्रम,#sequence_name] प्रारूप (कोष्ठक के बिना) का अनुसरण करता है। अनुक्रमों की सूची को .txt फ़ाइल के रूप में सहेजें.
  4. MatLab प्रारंभ करें फिर प्रोग्राम ChipDesign.mलोड करें। प्रोग्राम चलाएँ।
  5. गुण कक्ष विंडो में, microarray EntireChip लेआउट फ़ाइल लोड करें। उद्देश्य चार समान स्थानों पर पूरे सरणी संश्लेषित करने के लिए है, तो MilliChip लेआउट फ़ाइल लोड करें।
  6. गुण फलक विंडो में, चिप विनिर्देशके अंतर्गत, कंटेनर का चयन करें फिर संश्लेषण क्षेत्रका चयन करें. पैटर्न केतहत, पता करने योग्य सुविधाओं की सही राशि पैदावार पैटर्न का चयन करें, अनुक्रम की संख्या की गिनती - प्रतिकृति की संख्या. गुणवत्ता नियंत्रण 25mer के लिए, 25:36 पैटर्न का चयन करें.
  7. कंटेनर का चयन करें के अंतर्गत, Fiducialका चयन करें . Fiducial विशेषताएं आमतौर पर संश्लेषण क्षेत्र के कोनों पर संश्लेषित कर रहे हैं और संबन्वेकरण डेटा निकालने के लिए उपयोग किया जाता है. Fiducial चयनित के साथ, एक अनुक्रम लिखने (5'$3') कि fiducial सुविधाओं पर संश्लेषित किया जाएगा और जो एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य कर सकते हैं. 25mer प्रयोग के लिए, एक ही डीएनए अनुक्रम का उपयोग करें.
  8. अनुक्रमके अंतर्गत, सभी लिखित अनुक्रमों वाली पाठ्य फ़ाइल को लोड करें. सुनिश्चित करें कि Randomize चयनित है. परियोजना शीर्षक में प्रयोग के लिए एक शीर्षक दे और, Linker अनुक्रममें, TTTTT लिखने (एक टी5 linker के लिए संगत).
  9. जेनरेट दबाएँ,तो सरणी डिजाइन फ़ाइलें और मास्क ढूँढें (चित्र 2) MaskGen-delta]rc1/Designs फ़ोल्डर के अंतर्गत. सुनिश्चित करें कि इसमें एक डिस्प्लेस्क्रिप्ट, प्रवाह अनुक्रम और एक डिज़ाइन फ़ाइलहै .
  10. लायब्रेरी तैयार करने के लिए, प्रदर्शन स्क्रिप्ट खोलें. प्रदर्शन स्क्रिप्ट के निचले भाग पर एक अतिरिक्त पंक्ति जोड़ें जो स्क्रिप्ट की ठीक पहली पंक्ति प्रतियां (उदाहरण के लिए, First$Mask.bmp 150 प्रदर्शितकरें). यह सभी ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स के 5'अंत में टर्मिनल फोटो-सुरक्षा समूह को हटा देगा।
  11. कार्य निर्माता AutoJob प्रोग्राम प्रारंभ करें, लोड टेम्पलेटपर क्लिक करके एक टेम्पलेट लोड करें, फिर MatLab द्वारा जनरेट की गई प्रदर्शन स्क्रिप्ट फ़ाइल को लोड करने के लिए प्रदर्शन स्क्रिप्ट पर क्लिक करें। प्रेस उत्पन्न| यह कदम निर्देशों की एक श्रृंखला पैदा करेगा, एक jobfile कहा जाता है, कि micromirrors और डीएनए सिंथेसाइज़र के साथ कंप्यूटर के संचार को नियंत्रित करेगा.

2. स्लाइड तैयारी और कार्यात्मककरण

  1. संश्लेषण सेल पर इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग के स्थान के अनुरूप दो स्थितियों पर एक स्लाइड ड्रिल करें। ठीक है और मज़बूती से ड्रिल करने के लिए एक सीएनसी रूटर पर एक 0.9 मिमी हीरा बिट का प्रयोग करें। अल्ट्राप्योर पानी के साथ drilled स्लाइड कुल्ला और उन्हें एक स्लाइड रैक में व्यवस्था।
  2. 35 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक अमोनिया आधारित विशेष उद्देश्य क्लीनर के 5% युक्त एक पानी के स्नान में स्लाइड sonicating द्वारा सतहों को साफ। डबल डिस्टिल्ड एच2ओ के साथ स्लाइड कुल्ला और उन्हें एक साफ, सूखी रैक में हस्तांतरण।
  3. एक स्लाइड रैक में drilled और undrilled माइक्रोस्कोप स्लाइड की व्यवस्था करें। एक बड़े स्नातक सिलेंडर में, 25 एमएल डीएच2ओ, 10 ग्राम सिलेनाइज़िंग अभिकर्मक (एन -(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide) और एसिटिक एसिड के 1 एमएल के साथ इथेनॉल (EtOH) के 475 एमएल को मिलाकर कार्यात्मक समाधान तैयार करें। सजातीय तो एक उपयुक्त, बंद कंटेनर में हस्तांतरण जब तक अच्छी तरह से हिलाओ.
  4. कंटेनर में भरी हुई रैक प्लेस, ढक्कन बंद करें और कमरे के तापमान पर 4 एच के लिए एक कक्षीय शेकर पर धीरे से रॉक करते हैं।
  5. 4 ज के बाद, कार्यात्मक विलयन को त्याग ें और 500 एमएल धोने के घोल से बदलें, जिसमें 475 एमएल एथोएच, 25 एमएल डीएच2व् और एसिटिक एसिड का 1 एमएल शामिल है। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए धीरे धीरे आंदोलन, तो त्याग और ताजा धोने समाधान के 500 एमएल के साथ बदलें।
  6. कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 20 मिनट के बाद, समाधान को त्यागें, स्लाइड को आर्गन की एक धारा के साथ सुखाएं और 120 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म वैक्यूम ओवन में उनका इलाज करें। 2 ज के बाद, ओवन और वैक्यूम पंप बंद कर दें, लेकिन स्लाइड को रात भर कम दबाव में छोड़ दें। फिर, ओवन वापस वायुमंडलीय दबाव के लिए लाने के लिए और आगे का उपयोग जब तक एक desicator में स्लाइड की दुकान.

3. संश्लेषण अभिकर्मकों और reactants की तैयारी

  1. फॉस्फोरामिाइट पाउडर (चित्र 1) को उनके भंडारण तापमान (-25 या -45 डिग्री सेल्सियस) से एक शुष्कक में कमरे के तापमान में लाएं।
  2. जब फॉस्फोरामिडाइट्स कमरे के तापमान पर पहुंच गया, तो पाउडर को अल्ट्रा-ड्राई एसीटोनिट्रिल (और 30 पीपीएम एच2ओ) की मात्रा के साथ भंग करें ताकि मानक डीएनए और आरएनए फॉस्फोराममिडाइट्स के लिए 30 एमएम एकाग्रता तक पहुंच सके, और बेस-सेंसिटिव डीटी मोनोमर के लिए 50 एमएम ( पुस्तकालय की तैयारी) आर्द्रता के किसी भी निशान जाल के लिए एक छोटे से आणविक छलनी बैग जोड़ें.
  3. 11 ग्राम इमिडाज़ोल को 1 L dry DMSO में भंग करके DMSO में 1% (w/w) इमिडाज़ोल का समाधान तैयार करें। पूरी तरह से भंग होने तक अच्छी तरह से हिलाओ। डीएनए सिंथेसाइज़र के सहायक बंदरगाह के लिए समाधान संलग्न करें। यह जोखिम विलायक 5 "फोटो प्रोटेकिंग समूह के पूर्ण हटाने के लिए आवश्यक हो जाएगा.
  4. पुस्तकालयों के संश्लेषण के लिए, डाइक्लोरोमेथेन के 10 एमएल में 100 मिलीग्राम जेड कैरोटीन को घोलकर डाइक्लोरोमेथेन में 1% (w/v) जेड कैरोटीन का घोल तैयार करें। एक एम्बर कांच की बोतल में अच्छी तरह से हिला तो एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटो.

4. माइक्रोरे संश्लेषण की तैयारी और निगरानी।

  1. माइक्रोरे निर्माण कक्ष में रिकॉर्ड तापमान और आर्द्रता और सुनिश्चित करें कि डीएनए सिंथेसाइज़र पर्याप्त हीलियम दबाव में है।
  2. यूवी एलईडी और उसके ठंडा प्रशंसक चालू करें। आने वाली यूवी प्रकाश के फोकल तल पर एक यूवी तीव्रता मीटर संलग्न करें और इसे चालू करें (चित्र 3ए) ।
  3. कंप्यूटर पर, कार्य फ़ाइल/micromirror/synthesis फ़ाइलें नियंत्रक सॉफ्टवेयर (नाम WiCell) शुरू करते हैं। फिर माइक्रोमिरो डिवाइस को प्रारंभ करें और DMDपर राइट-क्लिक करके एक ऑल-व्हाइट मास्क फ़ाइल लोड करें, फिर लोड छविका चयन करें।
  4. UVS आइकन पर राइट क्लिक करें और यूवी शटर ओपनका चयन करें | तीव्रता मीटर पर शक्ति मान (mW/cm2में) पढ़ें और 60 s गिनती. 60 s के बाद, पावर मान फिर से पढ़ें और शुरुआत और अंत मान नीचे नोट करें। यूवी शटर बंद का चयन करके शटर बंद करें और तीव्रता मीटर बंद कर देते हैं। उWध सेमी2में औसत उवी तीव्रता मान की गणना कीजिए।
  5. 5'-एनपीपीओसी photodeprotection (डीएनए और आरएनए microarrays) और 3 J/cm2 के लिए 5'-BzNPPOC photodeprotection (डीएनए पुस्तकालयों) के Equation 1 लिए 6 J/cm2 की एक उज्ज्वल ऊर्जा तक पहुँचने के लिए आवश्यक जोखिम समय की गणना, बस रिश्ते के बाद.
  6. डीएनए सिंथेसाइज़र कार्य केंद्र सॉफ्टवेयर में, MatLab द्वारा उत्पन्न प्रवाह अनुक्रम की सामग्री को कॉपी और पेस्ट करके अनुक्रम संपादक में एक अनुक्रम फ़ाइल बनाएं। पहले युग्मन पर जाने से पहले substrates की सतह को धोने के लिए 3' अंत (डिफ़ॉल्ट चक्र पत्र: "s") पर एक अतिरिक्त दो धोने कदम जोड़ें। सहेजें और अनुक्रम फ़ाइल निर्यात करें।
  7. कार्यकेंद्र सॉफ़्टवेयर के प्रोटोकॉल संपादक में, अनुक्रम फ़ाइल में मौजूद प्रत्येक अक्षर और संख्याओं के नाम पर एक समर्पित चक्र बनाएँ (उदा., यदि अनुक्रम फ़ाइल में केवल अक्षर A, C, G और T है, तो प्रोटोकॉल फ़ाइल आवश्यक है चार चक्र होते हैं, नाम ए, सी, जी और टी).
  8. डीएनए फॉस्फोरामिटाइट्स (चक्र ए, सी, जी और टी) के लिए युग्मन समय 15 s, आरयू फॉस्फोरामिटाइट के लिए 120 s (चक्र 8) और आरए, आर सी और आरजी फॉस्फोएमिटाइट्स (चक्र 5, 6 और 7) के लिए 300 s के लिए सेट करें। पुस्तकालय की तैयारी के लिए, आधार-संवेदी, क्लीवेबल डीटी मोनोमर के युग्मन को 2 $ 120 s (तालिका 1 और तालिका 2) पर सेट करें।
  9. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक चक्र में दो इवेंट 2 आउट संचार घटनाओं के बीच प्रतीक्षा समय आवश्यक विकिरण ऊर्जा तक पहुंचने के लिए परिकलित यूवी जोखिम समय से मेल खाता है। अनुक्रम फ़ाइल के लिए के रूप में, सहेजें और प्रोटोकॉल फ़ाइल निर्यात करें।
  10. WiCell सॉफ्टवेयर में, उनके संबंधित उप-खिड़कियों में काम, अनुक्रम और प्रोटोकॉल फ़ाइलों को लोड तो डीएनए सिंथेसाइज़र के लिए अनुक्रम और प्रोटोकॉल फ़ाइलों को भेजने के लिए भेजें क्लिक करें.
  11. अनुक्रम फ़ाइल में, प्रत्येक फॉस्फोरामिाइट के लिए युग्मन की संख्या की गणना.
  12. प्रत्येक संश्लेषण को निष्पादित करने के लिए आवश्यक फॉस्फोरामिदीट समाधान की आवश्यक मात्रा (जेडएल में) को मापने के लिए युग्मनों की संख्या को 60 से गुणा करें। सुरक्षा और डीएनए सिंथेसाइज़र पर लाइन के प्राइमिंग के लिए प्रत्येक मात्रा के लिए 250 डिग्री एल जोड़ें. फॉस्फोरामिडाइट्स के लिए 250 डिग्री सेल्सियस की आधार मात्रा का उपयोग करें जिसके लिए केवल एक युग्मन की आवश्यकता होती है।
  13. जल्दी से प्रोटोकॉल चक्र में बंदरगाह पत्र / संख्या के लिए इसी डीएनए सिंथेसाइज़र पर शीशियों में समाधान हस्तांतरण।
  14. अभिकर्मक के साथ लाइनों को भरने के क्रम में प्रत्येक 10 प्रमुख दालों के साथ फॉस्फोरामिइट समाधान के साथ बंदरगाहों प्रधानमंत्री। प्रतिक्रिया सेल संलग्न करने से पहले एसीटोनिट्रिल वॉश लाइन को प्राइम करें।
  15. संश्लेषण कोशिका को इकट्ठा करने के लिए, कोशिका के क्वार्ट्ज ब्लॉक पर पहले एक मोटी (250 डिग्री मी) perfluoroelastomer (FFKM) गैसकेट रखें। पहली गैसकेट के शीर्ष पर एक drilled, functionalized माइक्रोस्कोप स्लाइड प्लेस, और सत्यापित करें कि स्लाइड पर छेद इनलेट और संश्लेषण सेल के आउटलेट टयूबिंग के साथ कनेक्ट.
  16. दो छेदों के आस-पास, ड्रिल्ड स्लाइड पर एक दूसरा, पतला (50 डिग्री मी) पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (PTFE) गैस्केट रखें। अंत में, दूसरे गैसकेट के ऊपर एक सेकंड, कार्यात्मक लेकिन undrilled स्लाइड जगह (चित्र3बी). इकट्ठे डबल-सब्सट्रेट सेल के शीर्ष पर एक 4-स्क्रू धातु फ्रेम रखें और एक टोक़ पेचकश का उपयोग कर एक ही clamping बल (0.45 एनएम) के लिए पेंच कस।
  17. डीएनए सिंथेसाइज़र के लिए इनलेट और आउटलेट टयूबिंग संलग्न करें। एसीटोनिट्रिल वॉश लाइन को प्राइम करें और सबस्ट्रेट्स के माध्यम से एसीटोनिट्रिल (एसीएन) के उचित प्रवाह की पुष्टि करें। इस स्तर पर ए सी एन के किसी भी रिसाव को देखा जा सकता है, तो सेल को अलग और फिर से इकट्ठा करें। ACN प्राइमिंग के 7 चक्र के माध्यम से जाने के बाद अपशिष्ट लाइन पर ACN की मात्रा को मापने. यह खंड 2 एमएल होना चाहिए।
  18. आने वाली यूवी प्रकाश के फोकल तल पर संश्लेषण सेल संलग्न करें। पुस्तकालय की तैयारी के मामले में, कक्ष के पीछे एक अतिरिक्त इनलेट और आउटलेट लाइन संलग्न करें और वापस कक्ष को जेड-कैरोटीन समाधान (2 एमएल समाधान के लिए पर्याप्त है) से भरें। सुनिश्चित करें कि कोई रिसाव नहीं है (चित्र 3ग)
  19. पहले WiCell सॉफ्टवेयर में चलाएँ पर क्लिक करके संश्लेषण शुरू करो. नौकरी फ़ाइल में पहले प्रतीक्षा आदेश पर, डीएनए सिंथेसाइज़र पर प्रारंभ दबाएँ.
  20. संश्लेषण के दौरान, नियमित रूप से सत्यापित करें कि मुखौटा फ़ाइलों का प्रदर्शन यूवी जोखिम और शटर के उद्घाटन के साथ मेल खाता है।
  21. नियमित microarrays के संश्लेषण के बाद, सिंथेसाइज़र से सेल डिस्कनेक्ट, सेल disassemble और कांच स्लाइड पर संश्लेषण संख्या etch करने के लिए एक हीरे की कलम का उपयोग करें. प्रत्येक स्लाइड के गैर-synthesized चेहरे पर संख्या etch. आगे उपयोग करने तक एक शुष्क क्षेत्र में 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में स्लाइड स्थानांतरण।
  22. पुस्तकालय माइक्रोरैरेंस के संश्लेषण के बाद, पहले कक्ष से जेड-कैरोटीन विलयन को निकाल लें और फिर इसे ब्एच 2 ब्ल2के 2 ब्ल्यू2के 2 एमएल बहकर धो लें, फिर छान लें। चरण 4.21 के अनुसार disassembling के साथ आगे बढ़ें. संश्लेषित सरणी नग्न नेत्रों को दिखाई दे सकती है (चित्र 4)।

5. डीएनए microarray deprotection

  1. एतोएच के 20 एमएल और एथिलीनडिमिन (ईएसए) के 20 एमएल के साथ एक धुंधला ग्लास जार भरें। जार में डीएनए केवल microarrays खड़ी प्लेस, ढक्कन बंद करो, और कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए deprotect करने के लिए स्लाइड छोड़ दें.
    चेतावनी: EDA एक तीव्रता से विषाक्त, संक्षारक और ज्वलनशील तरल है. एक अच्छी तरह से हवादार धूआं हुड में दस्ताने के साथ काम करते हैं।
  2. 2 ज के बाद, टम्भल का उपयोग कर स्लाइड पुनः प्राप्त करने और उन्हें डबल-डिस्टिल्ड एच2ओ के साथ अच्छी तरह से कुल्ला।
  3. स्लाइड को कुछ सेकंड के लिए माइक्रोरेरे सेंट्रीफ्यूज में सुखालें फिर एक शुष्कक में स्टोर करें।

6. आरएनए microarray deprotection

  1. 50 एमएल अपकेंद्रित्र नली में, क्रमशः 2:3 ट्राइएथिलामाइन/एसीएन (20 एमएल और प्रत्येक के 30 एमएल) का शुष्क विलयन तैयार करें। एक आरएनए microarray स्लाइड को अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, ढक्कन बंद करें फिर प्लास्टिक सीलिंग फिल्म के साथ लपेट लें। कमरे के तापमान पर 1h और 30 मिनट के लिए एक कक्षीय शेकर पर अपकेंद्रण ट्यूब को धीरे से हिलाएं।
  2. 1h और 30 मिनट के बाद, स्लाइड को हटा दें, 2 डिग्री 20 एमएल सूखी ACN के साथ धो लें फिर कुछ सेकंड के लिए एक माइक्रोरेरे सेंट्रीफ्यूज में सूख जाते हैं।
    चेतावनी: Triethylamine एक तीव्रता से विषाक्त, संक्षारक और ज्वलनशील तरल है. एसीटोनिट्रल विषाक्त और ज्वलनशील होता है। एक अच्छी तरह से हवादार धूआं हुड में दस्ताने के साथ काम करते हैं।
    नोट: पहले deprotection चरण पूर्ण.
  3. 3:2 पाइरिडीन/ऐसीटिक एसिड में 0.5 एम हाइड्रेजीन हाइड्रेट घोल तैयार करें। सबसे पहले, एक स्नातक सिलेंडर में एसिटिक एसिड के 20 एमएल और 30 एमएल पाइरीडीन मिलाएं। हाइड्रेजीन हाइड्रेट के 1.21 एमएल जोड़ने से पहले ठंडा करने के लिए समाधान के लिए प्रतीक्षा करें। परिणामी विलयन के लगभग 40 एमएल को 50 एमएल अपकेंद्रित्र नली में स्थानांतरित करें।
    चेतावनी: हाइड्रैज़ीन हाइड्रेट एक तीव्र विषाक्त और संक्षारक तरल है। पायरिडीन अत्यधिक ज्वलनशील और तीव्र रूप से विषाक्त होता है। एसिटिक एसिड ज्वलनशील और संक्षारक है। एक अच्छी तरह से हवादार धूआं हुड में दस्ताने के साथ काम करते हैं।
  4. पहले deprotection चरण के बाद, हाइड्रैज़ीन हाइड्रेट समाधान में आरएनए स्लाइड स्थानांतरित करें, ढक्कन बंद करें और प्लास्टिक सीलिंग फिल्म के साथ रैप करें। कमरे के तापमान पर 2 ज के लिए कक्षीय शेकर पर ट्यूब को धीरे से हिलाएं। 2 ज के बाद, स्लाइड को हटा दें, 2 डिग्री 20 एमएल सूखी ACN के साथ धो लें फिर कुछ सेकंड के लिए एक माइक्रोरेरे सेंट्रीफ्यूज में सूख जाते हैं।
    नोट: दूसरा deprotection चरण पूरा.
  5. यदि आरएनए microarray भी डीएनए न्यूक्लिओटाइड होते हैं, एक तीसरे deprotection कदम के साथ आगे बढ़ें. 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 20 एमएल ईडा को 20 एमएल एटोएच के साथ मिलाइए। 1:1 EDA/EtOH समाधान करने के लिए DNA/RNA microarray जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए छोड़ दें।
  6. 5 मिनट के बाद, स्लाइड को हटा दें, 2 डिग्री 20 एमएल बाँझ पानी से धोएं फिर माइक्रोरे रेफ्रिजे सेंट्रीफ्यूज में सूख जाएं और एक शुष्कक में स्टोर करें।

7. एक फ्लोरोसेंट-लेबल पूरक किनारा के साथ हाइब्रिडाइजेशन

  1. Thaw acetylated गोजातीय सीरम एल्बुमिन (10 mg/mL) और Cy3 लेबल पूरक किनारा (100 एनएम) और कमरे के तापमान को गर्म.
  2. एक 1.5 एमएल बाँझ microcentrifuge ट्यूब में, मिश्रण 150 $L 2x एमईएस बफर (200 एम एम 2-(एन-मॉर्फोलिनो)इथेनेसल्फोनिक एसिड; 1.8 एम एन एसीएल; 40 एमएम एडीटीए; 0.02% ट्वीन-20) के साथ 26.7 डिग्रीएल साइ3-लेबल डीएनए, 13.4 डिग्री एल एसिटाइल बीएसए और 110 स्टरल के। भंवर. हाइब्रिडाइजेशन के लिए उपयोग किया जा करने के लिए दोनों स्लाइड्स हैं, तो वॉल्यूम को डबल करें।
  3. डुप्लेक्स के टीएम से नीचे के तापमान के लिए एक हाइब्रिडेशन ओवन को प्री-वार्म करें, लेकिन पूरे मैच और गैर-मैच दृश्यों के बीच अच्छा भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त उच्च। गुणवत्ता नियंत्रण 25mer के लिए, तापमान को 42 डिग्री सेल्सियस (59 डिग्री सेल्सियस कात्) निर्धारित करें।
  4. सावधानी से प्रत्येक स्लाइड पर संश्लेषण क्षेत्र पर एक आत्म चिपकने वाला 300 डिग्री सेल्सियस संकरीकरण कक्ष जगह है और ऊपर तैयार संकरीकरण समाधान में पाइप. चिपकने वाला डॉट्स के साथ कक्ष के छेद को कवर और एल्यूमीनियम पन्नी में पूरी स्लाइड लपेटो.
  5. माइक्रोएरे स्लाइड को हाइब्रिडेशन ओवन में रखें, इसे कवर करें और इसे धीरे से 2 ज के लिए चयनित हाइब्रिडाइजेशन तापमान पर घुमाएं।
  6. 2 ज के बाद, स्लाइड को अलग करें, एल्यूमीनियम पन्नी को हटा दें और ध्यान से हाइब्रिडेशन चैम्बर को फाड़ दें। स्लाइड को एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 30 एमएल गैर-स्केलवॉश बफर (एनएसडब्ल्यूबी; 0.9 एम नाक्सेल, 0.06 एम फॉस्फेट, 6 एमएम एडा, 0.01% ट्वेन20, पीएच 7.4) और कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए जोरदार हिला।
  7. 30 एमएल की कड़ी वॉश बफर (एसडब्ल्यूबी; 100 एम एम एम एम एम एस, 0.1 एम नैकल, 0.01% ट्वेन20) वाले एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्लाइड को स्थानांतरित करें और 1 मिनट के लिए जोरदार हिलाएं।
  8. अंत में, स्लाइड को 30 एमएल अंतिम वॉश बफर (FWB; 0.1x सोडियम लवण साइट्रेट) युक्त एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और कुछ सेकंड के लिए हिलाएं। स्लाइड को माइक्रोरेरे अपकेंद्रित्र में सुखा लें।
  9. माइक्रोरेरे स्कैनर के स्लाइड धारक में, सूखी माइक्रोरेरे, संश्लेषण क्षेत्र को नीचे का सामना करना पड़ रहा है। Cy3 लेबल डुप्लेक्स के लिए, एक 532 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य, एक 575 एनएम फिल्टर और 350 की एक photopliplier के साथ 5 डिग्री मीटर संकल्प पर स्कैन. उच्च रिज़ॉल्यूशन स्कैन को .tif छवि फ़ाइल के रूप में सहेजें (चित्र 5A).

8. डेटा निष्कर्षण और विश्लेषण

  1. डेटा निष्कर्षण से पहले, स्कैन के ऊपरी-बाएँ कोने में fiducial सुविधाओं की सबसे लंबी श्रृंखला बैठ करने के लिए इतनी के रूप में एक छवि संपादक में बचाया सरणी स्कैन बारी बारी से। घुमाया गया चित्र सहेजें.
  2. NimbleScanप्रारंभ करें, फिर फ़ाइल दबाएँ | सरणी स्कैन खोलें और लोड करें. उसके बाद, डिज़ाइन फ़ाइल उप-खंड में ब्राउज़ करें क्लिक करके, लोड करें. ndf डिजाइन फ़ाइल है कि स्वचालित रूप से microarray प्रयोग के डिजाइन के दौरान उत्पन्न किया गया था. फिर खोलेंक्लिक करें.
  3. दृश्यमें, ऑटो कंट्रास्ट/चमकपर क्लिक करें . चिह्न पर क्लिक करें मैन्युअल रूप से स्कैन के ऊपर संरेखित करें. स्कैन के चार कोनों पर चार वर्ग के आकार के मार्कर रखें, फिर अब हरे रंग के आइकन पर फिर से क्लिक करें। विश्लेषणपर क्लिक करके हाइब्रिडेशन डेटा निकालें, रिपोर्ट फिर रिपोर्ट की जांच करें.
  4. खोलें. एक स्प्रेडशीट संपादक में जांच रिपोर्ट फ़ाइल. कॉलम B और I रखें और निकाले गए डेटा से औसत मानों और मानक विचलन की गणना करने से पहले शेष को छोड़ दें (चित्र 5B) .

9. पुस्तकालय deprotection, दरार और वसूली

  1. डीएनए पुस्तकालयों को निष्क्रिय करने और बंद करने के लिए, 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1:1 सूखी EDA/toluene का समाधान तैयार करें। दरार समाधान में स्लाइड विसर्जित, स्लाइड बंद करें और प्लास्टिक सील फिल्म के साथ लपेटो, तो धीरे कमरे के तापमान पर 2 एच के लिए एक कक्षीय शेकर में बारी बारी से।
  2. 2 ज के बाद, स्लाइड को हटा दें और ईमानदारी से सूखी ACN के 2 $ 20 एमएल के साथ धो लें। स्लाइड निकालें और इसे हवा सूखी.
  3. एक पिपेट के साथ, अब समझदार संश्लेषण क्षेत्र पर बाँझ एच2हे के 100 डिग्री सेल्सियस लागू होते हैं। इसे 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने से पहले कई बार घोल को ऊपर और नीचे रखें। प्रक्रिया को दोहराइए तथा माइक्रोरेरे को एक ही ट्यूब में संयोजित करें (चित्र 6)।
  4. 2 डिग्री 100 डिग्री सेल्सियस की चिप एल्यूएट को सूखापन के लिए पुनः भंग कर दिया जाता है, फिर न्यूक्लीज-मुक्त H2व् के 10 डिग्री एल में पुन: घुलने के लिए एक यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर अवशोषण को मापें।
  5. C18 राल से सुसज्जित एक 10 $L पिपेट टिप पर डीएनए पुस्तकालय Desalt. सबसे पहले, चिप एक 0.1 एम triethylammonium एसीटेट (TEAA) बफर समाधान में eluate बदलना.
  6. एच2O/ACN 1:1 के 3 x 10 डिग्री सेल्सियस के इच्छुक 3 x 10 डिग्री सेल्सियस द्वारा राल गीला करें, और 0.1 एम TEAA बफर के 3 x 10 डिग्री सेल्सियस के साथ धोने से राल को बराबर कर दें। चिप को पाइप करके डीएनए को 10 बार ऊपर और नीचे राल के माध्यम से अलग कर दिया जाता है। 0ण्1 एम टीईए बफर, 3 x 10 डिग्री सेल्सियस एच2व् के 3 x 10 डिग्री एल के साथ राल को धोएं।
  7. एच2ओ/एसीएन 1:1 के 10 डिग्री एल के साथ राल धोने से टिप से desalted डीएनए Elute. विलवणित विलयन को सुखाकर 10 डिग्री सेल्सियस बंध्य H2व् के 10 डिग्री सेल्सियस में पुनः घोलकर एक यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर अवशोषण को मापें (चित्र 7)। सूखापन और आगे का उपयोग करने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए पुस्तकालय का इर्द-ए-तोव ित करें।

Representative Results

डीएनए और आरएनए माइक्रोरे संकरीकरण
चित्र 5 एक microarray पर प्रदर्शन किया एक संकरीकरण परख के परिणामसे पता चलता है एक 25mer अनुक्रम के डीएनए और आरएनए संस्करणों युक्त (5'-GTCATCATGAACCCTGGTC-3' डीएनए के रूप में). चित्र 5 क में स्कैन एक ग्रीनस्केल प्रारूप में दिखाई देता है जो Cy3 फ्लोरोसेंट के उत्तेजना/उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के अनुरूप होता है, जिसमें 0 और 65536 के बीच मनमाने ढंग से इकाइयों में फ्लोरोसेंट तीव्रता दर्ज की गई है। सरणी डिज़ाइन प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित 25:36 सुविधा लेआउट का पालन किया। स्कैन परिण्य सुविधाओं की सबसे लंबी श्रृंखला के साथ आबादी वाले शीर्ष बाएं कोने के साथ, सरणी के उचित अभिविन्यास के बाद दिखाया गया है। यहाँ, fiducial सुविधाओं 25mer के डीएनए संस्करण होते हैं और चाहिए, सिद्धांत रूप में, हमेशा स्कैन संरेखण और डेटा निष्कर्षण प्रदर्शन करने के लिए एक सकारात्मक फ्लोरोसेंट संकेत दे. संकरित microarray समान रूप से उज्ज्वल दिखाई देना चाहिए, संश्लेषण क्षेत्र के किनारों के साथ हालांकि आम तौर पर केंद्र की तुलना में उज्जवल जा रहा है (अप करने के लिए 50% उज्जवल). अनुक्रम की बड़ी राशि प्रतिकृति, बेतरतीब ढंग से क्षेत्र भर में वितरित, स्थानिक कलाकृतियों के प्रभाव को कम कर देता है. यहाँ, प्रत्येक अनुक्रम (डीएनए और आरएनए) 2,000 यादृच्छिक स्थानों पर संश्लेषित किया गया था. वहाँ आम तौर पर कम फ्लोरोसेंट शोर (पृष्ठभूमि), और lt;50 a.u., जो एक संकेत की ओर जाता है / डेटा निष्कर्षण के बाद, फ्लोरोसेंट तीव्रता बाहर औसत कर रहे हैं और साजिश रची $एसडी.

प्रयोगों के बीच निरपेक्ष फ्लोरोसेंट मानों में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता है। यहाँ, हम एक ही निर्माण मानकों और एक ही पोस्ट सिंथेटिक हैंडलिंग का उपयोग कर तीन स्वतंत्र syntheses के लिए परिणाम दिखाते हैं. 25mer डीएनए, जब अपने पूरक Cy3 लेबल डीएनए किनारा करने के लिए संकरित, 20,000 से 30,000 तक कहीं भी लेकर फ्लोरोसेंट संकेतों उपज होगी, बहुत शायद ही कभी ऊपर या नीचे. 25mer आरएनए, जब एक ही Cy3 लेबल डीएनए पूरक करने के लिए संकरित, 15,000 से 20,000 तक इसी सुविधाओं पर फ्लोरोसेंट तीव्रता दे देंगे. हालांकि, आरएनए/डीएनए डुप्लेक्स की फ्लोरोसेंट तीव्रता कभी-कभी 8,000 से नीचे गिर जाएगी, जब संबंधित डीएनए/डीएनए डुप्लेक्स अभी भी 20,000-30,000 रेंज के भीतर फ्लोरेसेस होगा। ऐसे मामलों में, आरएनए के लिए परिणाम उप इष्टतम के रूप में माना जा सकता है. एक संश्लेषण या संकरीकरण विफलता, या तो डीएनए या आरएनए के लिए, फ्लोरोसेंट के स्पष्ट कमी से स्कैनिंग के दौरान तुरंत ध्यान देने योग्य हो जाएगा. वहाँ आरएनए संश्लेषण के लिए कई अवसर ों या तो असफल या आंशिक रूप से सफल हो रहे हैं और वे चर्चा भाग में रेखांकित किया जाएगा.

लाइब्रेरी deprotection, दरार और वसूली
जटिलता और पुस्तकालय के घनत्व पर निर्भर करता है, आकार और संश्लेषित सरणी की रूपरेखा आवर्धन के बिना देखा जा सकता है, लेकिन उचित प्रकाश व्यवस्था के तहत (चित्र4), डीएनए के साथ अभी भी संरक्षित रूप में. EDA/toluene के साथ deprotection के बाद, और पानी के अलावा के बाद आदेश में cleaved पुस्तकालय इकट्ठा करने के लिए, संश्लेषण क्षेत्र अब deprotected oligonucleotides युक्त एक हाइड्रोफिलिक क्षेत्र के रूप में बाहर खड़े हो सकते हैं, जब कांच स्लाइड के बाकी दिखाई देगा एक अशांत हाइड्रोफोबिक परत के साथ कवर किया गया। संश्लेषण क्षेत्र का प्रत्यक्ष अवलोकन ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स संश्लेषित करने के लिए उपयोग किए गए कुल क्षेत्र पर निर्भर करता है: संश्लेषण क्षेत्र का अधिक से अधिक उपयोग सतह पर हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक क्षेत्रों के बीच स्पष्ट अंतर का एक बड़ा मौका के अनुरूप होगा। इसके विपरीत, पुस्तकालयों कम दर्पण का उपयोग कर संश्लेषित और छोटी सुविधाओं के साथ तुरंत अवलोकन नहीं किया जा सकता है.

इसी प्रकार, desalting के बाद बरामद डीएनए की मात्रा संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया कुल क्षेत्र के लिए सीधे आनुपातिक है. यदि सभी सुविधाओं oligonucleotide संश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, दरार और वसूली प्रक्रिया के बीच उपज चाहिए 25 और 30 डीएनए के pmol. संश्लेषण क्षेत्र का एक 10% उपयोग इसलिए डीएनए के केवल 3 pmol के आसपास खर्च होगा.

Figure 1
चित्र 1 . माइक्रोरे फोटोलिथोग्राफी द्वारा ओलिगोन्यूक्लिओटाइड संश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले डीएनए और आरएनए फॉस्फोएमिडीज की रासायनिक संरचनाएं। मानक नाइट्रोफेनिलप्रोपिओक्सीकार्नोइल (एनपीपीओसी) 5'-OH पर प्रकाश संवेदी सुरक्षा समूहों का उपयोग नियमित डीएनए और आरएनए माइक्रोरेयर संश्लेषण में हाइब्रिडीकरण उद्देश्यों के लिए किया जाता है। जटिल डीएनए पुस्तकालयों के संश्लेषण के लिए, अधिक photolabile benzyl-NPPOC (BzNPPOC) 5'-OH पर पसंद कर रहे हैं, के रूप में BzNPPOC दो बार NPPOC के रूप में तेजी से हटा दिया जाता है, जो काफी कुल microarray संश्लेषण समय कम कर देता है. पुस्तकालयों के लिए डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को भी 3 के अंत में एक क्लीवेबल डीटी मोनोमर के युग्मन की आवश्यकता होती है। इस मोनोमर, जो एक succinyl एस्टर समारोह किया जाता है, deprotection के दौरान cleaved किया जाएगा, डीएनए के लिए माइक्रोचिप से एकत्र करने के लिए अनुमति देता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . यूवी जोखिम के दौरान micromirror डिवाइस के लिए भेजा एक छवि फ़ाइल के रूप में एक मुखौटा का उदाहरण. सफेद पिक्सल दर्पण के अनुरूप हैं जो "पर" स्थिति में झुका होगा, संश्लेषण सेल पर यूवी प्रकाश को दर्शाती है. काले पिक्सल के अनुरूप "बंद" दर्पण, जहां यूवी प्रकाश सेल से दूर परिलक्षित होगा. सफेद पिक्सल इसलिए कांच substrates पर इसी सुविधाओं पर पाया ओलिगोन्यूक्लिओटाइड पर अगले आने वाली फॉस्फोरामिआइट के युग्मन के लिए अनुमति देगा। Oligonucleotides सुविधाओं जिसका इसी दर्पण हैं पर संश्लेषित, इस मुखौटा फ़ाइल में, काले पिक्सल हालांकि अगले युग्मन घटना के दौरान निष्क्रिय रहेगा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . माइक्रोरेरे फोटोलिथोग्राफी ऑप्टिकल और संश्लेषण सेटअपके फोटो। (ए) यूवी जोखिम के लिए ऑप्टिकल सर्किट. यूवी-एलईडी से यूवी प्रकाश पहले एक आयताकार-क्रॉस-सेक्शन प्रकाश पाइप के माध्यम से homogenized है तो micromirrors पर दर्शाता है। Micromirrors जो एक "बंद" स्थिति में झुका दिया गया है यूवी प्रकाश संश्लेषण सेल से दूर प्रतिबिंबित करेगा, लेकिन micromirrors "पर" स्थिति में संश्लेषण सेल पर प्रकाश को प्रतिबिंबित करेगा, फोकल विमान में स्थित, पहले एक के माध्यम से गुजर द्वारा 1:1 Offner रिले इमेजिंग प्रणाली. (बी) संश्लेषण कक्ष, एक बार इकट्ठे हुए, एक ड्रिल्ड स्लाइड के होते हैं जो सेल के क्वार्ट्ज ब्लॉक पर पहले रखा जाता है, जो एक मोटी पीटीएफई गैस्केट (नहीं दिखाया गया) द्वारा अलग किया जाता है। एक दूसरी, गैर drilled स्लाइड तो drilled स्लाइड पर तैनात है, एक पतली PTFE गैसकेट द्वारा अलग. एक धातु फ्रेम (नहीं दिखाया गया) विधानसभा एक साथ रखती है. (ग) पुस्तकालय की तैयारी के लिए, एक बार संश्लेषण कोशिका आने वाली यूवी प्रकाश के फोकल तल पर संलग्न हो जाने के बाद क्वार्ट्ज ब्लॉक और ड्रिल्ड स्लाइड के बीच स्थित कक्ष ब्एच 2 सीएल2में $ कैरोटीन के 1% समाधान से भर जाता है। ऐसा करने के लिए, एक अतिरिक्त इनलेट और आउटलेट टयूबिंग क्वार्ट्ज ब्लॉक से जुड़ा हुआ है और नारंगी समाधान सबसे बाईं स्थिति में सबसे ऊपर से बहती है। संश्लेषण के लिए अभिकर्मकों और सॉल्वैंट्स का प्रवाह सफेद तीरों में दिखाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . संश्लेषण क्षेत्र आमतौर पर नग्न आंखों को दिखाई देता है. यहाँ, एक डीएनए पुस्तकालय सही संश्लेषण के बाद कांच की सतह पर देखा जा सकता है, डीएनए के साथ अभी भी संरक्षित रूप में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 . संकरीकरण 25mer डीएनए और आरएनए दृश्यों microarrays पर situ में संश्लेषित करने के लिए assays. (ए) संपूर्ण संकरित डीएनए और आरएनए माइक्रोरेरे के फ्लोरोसेंस स्कैन। 25mer डीएनए और आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स उनके Cy3 लेबल पूरक किस्में करने के लिए संकरित कर रहे हैं। सरणी एक 532 एनएम उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर एक लेजर के साथ स्कैन किया गया था, पर 5 डिग्री मीटर संकल्प. (बी) डीएनए:डीएनए और आरएनए:डीएनए डुप्लेक्स की फ्लुओरेसेंस तीव्रता (मध्यस्थ इकाइयां) तीन अलग-अलग प्रयोगों में। स्थिति संश्लेषित आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के लिए हल्के हरे रंग के डेटा को उपऑप्टिमल माना जा सकता है, जब इसी डीएनए दृश्यों की फ्लोरोसेंट तीव्रता की तुलना में। त्रुटि पट्टियाँ SD हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 . डीएनए पुस्तकालयों के लिए deprotection, दरार और वसूली प्रक्रिया के Schematic प्रतिनिधित्व microarrays पर संश्लेषित. डीएनए दृश्यों एक आधार के प्रति संवेदनशील cleavable डीटी न्यूक्लिओसाइड पर बड़े हो रहे हैं (बढ़ी हुई क्षेत्र में दिखाया गया है). संश्लेषण के बाद, डीएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स (आधार सुरक्षा समूहों को लाल क्षेत्रों के रूप में प्रतिनिधित्व किया जाता है) के संरक्षण में ईडीए/टॉलूईन deprotected सामग्री स्थिरस्टैटिक रूप से सतह से बाध्य छोड़ देता है और फिर की एक छोटी राशि को लागू करके बाहर पाइप ेट किया जा सकता है संश्लेषित क्षेत्र पर पानी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7 . प्रतिनिधि अवशोषण स्पेक्ट्रम (220 - 350 एनएम) एक cleaved, desalted डीएनए पुस्तकालय 4,000 विभिन्न दृश्यों, लंबाई में 100-nt युक्त. डीएनए के 940 एनजी की कुल एक सरणी संश्लेषण से अलग किया गया था, डीएनए कुल के 30 pmol के लिए इसी, या कांच सब्सट्रेट प्रति 15 pmol. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1. युग्मन/ऑक्सीकरण/फोटोडेप्रोटाइजेशन के लिए प्रतिनिधि चक्र प्रोटोकॉल 5'-BzNPPOC-dA, यह मानते हुए कि इसी फॉस्फोरामिडाइट पोर्ट "ए" पर लोड किया गया था। युग्मन समय (सेकंड में) "युग्म मोनोमर" लाइन पर दिखाया गया है। यूवी photodeprotection समय, यहाँ 3 J/cm2 (BzNPPOC photochemistry) की एक उज्ज्वल ऊर्जा के लिए इसी, दो "घटना 2 बाहर" संचार संकेतों के बीच गुजरे समय के रूप में गणना की है.

Table 2
तालिका 2. युग्मन/ऑक्सीकरण/फोटोडेप्रोटाइजेशन के लिए प्रतिनिधि चक्र प्रोटोकॉल 5'-एनपीपीओसी-आरए, यह मानते हुए कि संबंधित आरएनए फॉस्फोरैमाइड पोर्ट "ए" पर लोड किया गया था। युग्मन समय (सेकंड में) "युग्म मोनोमर" लाइन पर दिखाया गया है। यूवी photodeprotection समय, यहाँ 6 J/cm2 (NPPOC photochemistry) की एक उज्ज्वल ऊर्जा के लिए इसी, दो "घटना 2 बाहर" संचार संकेतों के बीच गुजरे समय के रूप में गणना की है.

Discussion

ठोस चरण डीएनए और आरएनए संश्लेषण हर न्यूक्लिक एसिड रसायन विज्ञान प्रयोगशाला की रोटी और मक्खन है, और हालांकि photolithgraphy घटक के अलावा बेशक एक जटिल आपरेशन है, microarray निर्माण यूवी प्रकाश द्वारा मध्यस्थता भी एक बहुत ही विश्वसनीय प्रक्रिया है . इसके अतिरिक्त, माइक्रोरेअर्स पर इन सीटू आरएनए संश्लेषण के लिए एकमात्र उपलब्ध विधि है। फिर भी, के रूप में किसी भी बहु चरण प्रयोगात्मक प्रक्रिया में, वहाँ मानव त्रुटि के लिए पर्याप्त जगह है.

शायद सबसे महत्वपूर्ण कदम एक फॉस्फोरामिदीट का युग्मन है, क्योंकि कुछ सिंथेटिक त्रुटियों के साथ ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को वहन करने के लिए इसे लगातार उच्च उपज वाली रासायनिक प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है। हमारे microarray संश्लेषण प्रोटोकॉल में, फॉस्फोरामिआइट युग्मन समग्र संश्लेषण गुणवत्ता के लिए और भी अधिक निर्णायक है क्योंकि निर्माण प्रक्रिया कैपिंग को नजरअंदाज कर देती है और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड शोधन को रोकती है। चरणबद्ध युग्मन क्षमता 99% से ऊपर सभी photosensitive डीएनए और आरएनए फॉस्फोरामिडीज के लिए गणना की गई है, यहां तक कि बहुत कम युग्मन समय के लिए (15 s)24 लेकिन कम युग्मन पैदावार कभी कभी हो सकता है, विशेष रूप से डीजी amidites के मामले में. कमरे के तापमान पर solubilized फॉस्फोरामिडाइट्स की स्थिरता पहले जांच की गई है और न्यूक्लिओबेस की प्रकृति पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया था, ग्वानोसाइन फॉस्फोरामिडाइट्स के साथ केवल29दिनों के एक मामले में व्यापक गिरावट के लिए प्रवण , 30| लेकिन जब -25 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है, तो डीजी फॉस्फोरामिडाइट्स एसीएन में भंग हो जाते हैं क्योंकि 30 एमएम समाधान कई हफ्तों तक स्थिर पाया गया। कमरे के तापमान पर डीजी फॉस्फोरामिदीट समाधान के रिश्तेदार अस्थिरता हालांकि वे कई दिनों के लिए डीएनए सिंथेसाइज़र से जुड़े नहीं रखा जाना चाहिए कि इसका मतलब है.

आरएनए फॉस्फोरामिडीज के लिए, युग्मन उपज फॉस्फोरामिटाइट गुणवत्ता पर बहुत निर्भर है (जो 31पी एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है) और युग्मन समय। rA, rG, rC और rU के लिए 2 मिनट के लिए 5 मिनट के युग्मन समय आवश्यक दिखाई देते हैं. वास्तव में, हमने पाया कि सभी आरएनए फॉस्फोऐस्फोऐमिडीज के लिए संघनन समय को 2 मिनट तक कम करने से संकरीकरण संकेतों में काफी कमी आई।

डीएनए सिंथेसाइज़र ही, साथ ही अभिकर्मकों और सॉल्वैंट्स, निश्चित रूप से oligonucleotide संश्लेषण के उच्चतम उपज को प्राप्त करने के क्रम में संभव के रूप में स्वच्छ होने की जरूरत है. हालांकि, अघुलनशील सामग्री, लवण या कणों, लाइनों और वितरण प्रणाली की ट्यूबिंग में समय के साथ जमा कर सकते हैं, अभिकर्मकों और reactants की खपत में एक क्रमिक कमी करने के लिए अग्रणी. जहां सिंथेसाइज़र की एक सामान्य सफाई एक कम उत्पादन मात्रा को हल नहीं करता है, दालों की संख्या में वृद्धि एक वैकल्पिक समाधान हो सकता है. कम फॉस्फोरामिआइट खपत के मामले में विशेष रूप से उपयोगी, युग्मन प्रोटोकॉल में रेखा फॉस्फोरामिआइट और उत्प्रेरक के मिश्रण के पम्पिंग के लिए संगत (तालिका 1 और तालिका 2में युग्मन उपधारा की तीसरी पंक्ति) हो सकता है संशोधित, से 6 करने के लिए 9 दालों संश्लेषण की गुणवत्ता पर किसी भी प्रशंसनीय नकारात्मक प्रभाव के बिना. इसके अलावा, उत्प्रेरक की दालों की संख्या संश्लेषण सब्सट्रेट करने के लिए amidite / सक्रियक मिश्रण लाने की जरूरत (वर्तमान में 6, युग्मन उपधारा में चौथी लाइन, तालिका 1 और तालिका 2देखें) डीएनए सिंथेसाइज़र पर ही के रूप में अच्छी तरह से पर निर्भर करता है संश्लेषण कोशिका में ट्यूबिंग लंबाई. यह संख्या एक रंगीन समाधान के साथ फॉस्फोरामिडाइट की जगह और युग्मन के लिए कांच सब्सट्रेट करने के लिए रंगीन मिश्रण पुश करने के लिए आवश्यक दालों की संख्या की गिनती के बाद समायोजित किया जा सकता है।

विधि यहाँ वर्णित डीएनए और आरएनए संश्लेषण के लिए एक साथ आगे बढ़ने के लिए अनुमति देता है, एक ही microarray पर. डीएनए और आरएनए के संकर भी सरणी निर्माण प्रोटोकॉल के लिए किसी भी परिवर्तन के बिना तैयार किया जा सकता है, और जब तक तीन कदम deprotection प्रोटोकॉल का पालन किया है. हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि आरएनए केवल microarrays केवल एक दो कदम deprotection की आवश्यकता: एक decyanoethylation पहले के साथ एट3एन के बाद हाइड्रेक्सिल और base deprotection hydrazine के साथ. डीएनए न्यूक्लिओबेस उन परिस्थितियों में अपूर्ण रूप से deprotected पाया गया, और PHENoxyacetyl (Pac) समूहों की पूरी तरह से हटाने को प्रभावित करने के क्रम में EDA में अतिरिक्त कदम की जरूरत है. EDA के साथ यह अतिरिक्त उपचार कम है (5 मिनट) डीएनए microarrays के मानक deprotection के लिए की तुलना में31, लेकिन यह triethylamine और hydrazine उपचार के बाद पूरा करने के लिए इसे ड्राइव करने के लिए पर्याप्त है. इसके अलावा, EDA के साथ एक छोटी प्रतिक्रिया समय बुनियादी स्थितियों के लिए एक पूरी तरह से संरक्षित आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के जोखिम को सीमित करता है।

पता लगना आर एन ए सरणी संश्लेषण का एक लाभ के वैकल्पिक तरीकों पर खोलना या डीएनए प्रतिलेखन32,33,34 का उपयोग करें, इस प्रकार से बचने तक संरक्षित रूप में संश्लेषित आरएनए माइक्रोचिप स्टोर करने की क्षमता है संभावित आरएनए गिरावट का खतरा. आरएनए के लिए पोस्ट-सिंथेटिक प्रक्रियाओं, दूसरी ओर, मतलब है कि उपभोग्य और अभिकर्मकों बाँझ रखा जाता है और है कि हैंडलिंग RNase मुक्त शर्तों के तहत किया जाता है. नोट की, हमने पाया कि संकरीकरण मिश्रण करने के लिए RNase अवरोध करनेवाला के अलावा आरएनए सुविधाओं के लिए मजबूत संकरीकरण संकेतों उपज नहीं था.

एक आधार के प्रति संवेदनशील मोनोमर पर डीएनए पुस्तकालयों के संश्लेषण एक सतह पर कुछ नियंत्रण दृश्यों के संश्लेषण की तुलना में अधिक जटिल है, और इस तरह के रूप में निश्चित रूप से अधिक डिजाइन त्रुटियों के लिए प्रवण है. फिर भी, यह मानते हुए कि अनुक्रम डिजाइन (यानी, प्रकृति और दृश्यों की संख्या) सही है, जोखिम मास्क का एक संग्रह में इस सूची को बदलने और युग्मन चक्र का एक आदेश दिया श्रृंखला एक सीधी प्रक्रिया बनी हुई है. हालांकि, मानक microarray संश्लेषण से महत्वपूर्ण बदलाव मौजूद हैं और एक उच्च घनत्व पुस्तकालय सरणी के एक सफल निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हैं.

सबसे पहले, एक आधार के प्रति संवेदनशील डीटी मोनोमर linker के संश्लेषण के बाद पहले फॉस्फोरामिडाइट के रूप में युग्मित है। इस मोनोमर की युग्मनउपज अपेक्षाकृत कम पाई गई , लगभग 85%28, यही कारण है कि इसके निगमन दर में सुधार करने के प्रयास किए जाते हैं, या तो ACN में अपनी सांद्रता को 30 m से बढ़ाकर 50 M, या दोहराकर युग्मन कदम: ताजा monomers, या दो अलग लेकिन लगातार युग्मन चक्र का उपयोग कर दो लगातार युग्मन प्रतिक्रियाओं.

दूसरा परिवर्तन संश्लेषण सेल के पिछले कक्ष में एक जेड-कैरोटीन विलयन का योग है, जो आसानी से 365 एनएम प्रकाश को अवशोषित करता है। यह photolithgraphy सेटअप का एक महत्वपूर्ण संशोधन के रूप में यह सरणी सब्सट्रेट पर वापस प्रतिबिंबित से यूवी प्रकाश रोकता है. वास्तव में, substrates के बीच अंतराकाशी माध्यम traversing के बाद, आने वाली यूवी प्रकाश drilled स्लाइड के माध्यम से बाहर निकालता है और सेल के क्वार्ट्ज ब्लॉक तक पहुँचता है. फ्रेनल समीकरणों का अनुमान है कि सीधा घटना यूवी प्रकाश के 4% तीन बहाव हवा ग्लास इंटरफेस में से प्रत्येक से प्रतिबिंबित करेगा (2एन डी सब्सट्रेट के एक तरफ और क्वार्ट्ज ब्लॉक के दोनों पक्षों) और वापस संश्लेषण सब्सट्रेट पर, जिससे फोटोप्रोक्षित ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स का अनपेक्षित प्रदर्शन होता है। Diffraction और प्रकीर्णन भी करने के लिए योगदान "ऑफ-लक्ष्य" photodeprotection और, इसलिए, न्यूक्लिओटाइड प्रविष्टि के लिए, जो सीधे संश्लेषण की त्रुटि दर को प्रभावित करता है, लेकिन इन योगदान प्रतिबिंब की तुलना में बहुत छोटे हैं और मुख्य रूप से संबोधित किया जा सकता है संश्लेषण घनत्व को कम करने (सुविधाओं के बीच अंतराल छोड़). हमने पाया है कि सेल के निचले कक्ष में र्-कैरोटीन विलयन का स्तर केवल सरणी संश्लेषण के प्रथम मिनट के दौरान ही कम हो जाता है, और इसलिए इसकी निगरानी और पुनर्समायोजित करने की आवश्यकता होती है।

अंत में, तीसरा परिवर्तन deprotection समाधान है, toluene के लिए EtOH की जगह, जो सतह से बाध्य cleaved डीएनए पुस्तकालय रहता है, संभवतः इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत के माध्यम से. ACN धोने के बाद संश्लेषण क्षेत्र के लिए पानी की एक छोटी राशि लागू करने के लिए पुस्तकालय आसानी से एकत्र किया जा करने के लिए अनुमति देता है. प्रक्रिया लेकिन केवल सफल अगर EDA और toluene में पानी की सामग्री कम है, deprotection कॉकटेल में पूरी तरह से अघुलनशील न्यूक्लिक एसिड प्रतिपादन. वैकल्पिक रूप से, डीएनए पुस्तकालयों को अमोनिया9,10,14,35का उपयोग करके चिप को बंद कर दिया जा सकता है, फिर रात भर 55 डिग्री सेल्सियस के लिए डीएनए युक्त जलीय अमोनिया समाधान को गर्म करके और अधिक असुरक्षित किया जा सकता है। अमोनिया का उपयोग कर डीएनए पुस्तकालयों की वसूली हालांकि आरएनए के साथ संगत नहीं है. आरएनए ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को आधार-क्लीवेबल सब्सट्रेट पर ऊपर वर्णित एक ही EDA/toluene प्रक्रिया का उपयोग करके सतह से हटाया जा सकता है, लेकिन केवल एट3एन और हाइड्रेज़ीन के बाद अंतिम चरण में दो-चरण deprotection रणनीति28.

वैकल्पिक रणनीतियों एक विशिष्ट बुनियादी उपचार के लिए आवश्यकता के बिना microarrays से oligonucleotide पूल ठीक करने के लिए मौजूद हैं, सिद्धांत रूप में photolithgraphy के साथ संगत हैं और एंजाइमों के उपयोग पर भरोसा करते हैं. उदाहरण के लिए, एक एकल deoxyuracil न्यूक्लिओटाइड uracil-डीएनए ग्लाइकोसील (UDG) का लक्ष्य हो सकता है और डीएनए अनुक्रम के बाकी से excised, या एक एकल आरएनए इकाई RNase एच प्रकार 2 एंजाइमों और फॉस्फोडाइस्टर बांड 5' आरएनए cled के लिए द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है , 5 'डीएनए भाग23जारी .

अब हमारे पास डीएनए, आरएनए और हाइब्रिड डीएनए/आरएनए माइक्रोरेअर्स के संश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली, विश्वसनीय और उच्च घनत्व विधि है। ये न केवल संकरीकरण या बाध्यकारी assays36के लिए प्लेटफार्मों के रूप में सेवा कर सकते हैं, लेकिन वे भी जटिल न्यूक्लिक एसिड पुस्तकालयों का उत्पादन करने के लिए एक तेजी से और सस्ती तरीका प्रतिनिधित्व करते हैं. डीएनए आधारित डिजिटल डेटा भंडारण के लिए, microarray photolithography "लेखन" बाधाओं के लिए एक संभावित समाधान बन सकता है (यानी, संश्लेषण द्वारा जानकारी के एन्कोडिंग के लिए). डीएनए पर और de नोवो जीन विधानसभा में डिजिटल एन्कोडिंग में सफलता अनुक्रम निष्ठा पर निर्भर करता है जो, संश्लेषण स्तर पर, त्रुटि दर में तब्दील. हमारे वर्तमान सरणी निर्माण प्रोटोकॉल में सिंथेटिक और ऑप्टिकल त्रुटियों पर चर्चा की जाएगी और कहीं और पर रिपोर्ट. समानांतर में, अब निर्माण पैमाने और थ्रूपुट को और बढ़ाने के प्रयास किए जा रहे हैं।

Disclosures

लेखक प्रमाणित करते हैं कि उनका लाभ के लिए किसी संगठन से कोई संबंध नहीं है.

Acknowledgments

यह काम ऑस्ट्रिया ईएसआइ साइंस फंड (FWF अनुदान P23797, P27275 और P30596) और स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (ग्रेंट #PBBEP2_146174) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Slide functionalization
Acetic acid >99.8% Sigma 33209 For RNA deprotection
CNC router Stepcraft 300 CK
Ethanol absolute VWR 1.07017.2511 For deprotection and functionalization
N-(3-triethoxysilylpropyl)-4-hydroxybutyramide Gelest SIT8189.5 Silanizing reagent
Nexterion Glass D microscope slides Schott 1095568
Polymax 1040 Heidolph Orbital shaker
Proclean 507 Ultrasonic water bath Ulsonix To clean slides after drilling
Tickopur RW 77 Special Purpose Cleaner Sigma Z860086 To clean slides after drilling
Microarray synthesis
0.25 M dicyanoimidazole in ACN Biosolve 0004712402BS Activator
0.7 XGA DMD Texas Instruments Digital Micromirror Device
20 mM I2 in pyridine/H2O/THF Sigma L860020-06 Oxidizer
250 μm thick Chemraz 584 perfluoroelastomer FFKM Lower teflon gasket
2'-O-ALE RNA phosphoramidites ChemGenes
365 nm high-power UV-LED Nichia NVSU333A
5'BzNPPOC DNA phosphoramidites Orgentis
5'NPPOC DNA phosphoramidites FlexGen
Acetonitrile Biosolve 0001205402BS For DNA synthesis
Amidite Diluent for DNA synthesis Sigma L010010 For dissolving phosphoramidites
Cleavable dT ChemGenes Base-sensitive monomer for library preparation
DMSO Biosolve 0004474701BS As exposure solvent
DNA and RNA microarray deprotection
Ethylenediamine >99.5% Sigma 3550 For deprotection
Expedite 8909 PerSeptive Biosystems DNA synthesizer
Hydrazine hydrate 50-60% hydrazine Sigma 225819 For RNA deprotection
Imidazole Sigma 56750
Industrial Strength lower-density PTFE tape Gasoila Thin, upper teflon gasket
Pyridine >99% Sigma P57506 For RNA deprotection
Triethylamine >99% Sigma T0886 For RNA deprotection
β-carotene Sigma C9750 For library preparation
Hybridization and scanning
20x Sodium Saline Citrate Roth 1054.1
5'Cy3-labelled complementary strand Eurogentec For duplex hybridization
Biopur Safe-Lock microcentrifuge tube Eppendorf
BSA (10 mg/mL) Promega R3961
EDTA molecular biology grade Promega H5031
GenePix 4100A Molecular Devices Microarray scanner
Hybridization oven Boekel Scientific 230500
MES monohydrate Sigma 69889
MES sodium Sigma M3058
NaCl >99.5% Sigma 71376
SecureSeal SA200 hybridization chamber Grace BioLabs 623503
Spectrafuge mini Labnet C1301 Microarray centrifuge
Tween-20 molecular biology grade Sigma P9416
Data extraction
Excel Microsoft For data extraction
MatLab MathWorks Microarray design
NimbleScan 2.1 Roche NimbleGen
Desalting and quantification
NanoDrop One Spectrophotometer Thermo Scientific
Toluene Merck
ZipTip C18 Millipore ZTC18s008 Desalting pipet tips

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References

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