Summary
Bu makalede, ortam kütle spektrometresi dayalı benzersiz bir gerçek zamanlı analitik yöntem için örnek hazırlama yöntemleri tanıtılmaktadır. Bu yöntem, herhangi bir özel ön işlem olmadan in vivo biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı analizini yapmamızı sağlar.
Abstract
Kütle spektrometresi (MS), molekül ağırlıklarını ve yapılarını anlamaya yararlı olan kütle-yük oranları(m/z)gibi moleküller hakkında çok doğru bilgiler sağladığından analitik kimyada güçlü bir araçtır. Esasen yıkıcı bir analitik yöntem olmakla birlikte, ortam iyonizasyon tekniğindeki son gelişmeler, dokuları bütünlük açısından nispeten sağlam bir durumda bırakırken veri elde etmemizi sağlamıştır. Probu elektrosprey iyonizasyonu (PESI), numunelerin karmaşık ve zaman alıcı ön işlemesini gerektirmediği için doğrudan bir yöntemdir. İnce bir iğne örnek toplayıcı nın yanı sıra iyonizasyon yayıcısı olarak da hizmet vermektedir. Sonda ucunun çok keskin ve ince özelliğine dayanarak, numunelerin imhası çok azdır, bu da canlılardan gerçek zamanlı moleküler bilgiyi yerinde elde etmemizi sağlar. Burada, biyomedikal araştırma ve geliştirme için yararlı olacak PESI-MS tekniğinin üç uygulama tanıtmak. Bunlardan biri, tıbbi tanı için bu tekniğin temel uygulaması olan katı dokuya uygulama içerir. Bu teknik numunenin sadece 10 mg'ını gerektirdiğinden, rutin klinik ortamlarda çok yararlı olabilir. İkinci uygulama, insan kan serumu ölçülür in vitro tıbbi tanı içindir. Sıvı numunelerini ölçme yeteneği, geleneksel analitik teknikler için yeterli numune hacminin sağlanamadığı çeşitli biyolojik deneylerde de değerlidir. Üçüncü uygulama, belirli organlardaki metabolitlerin veya ilaçların gerçek zamanlı dinamiklerini elde edebileceğimiz canlı hayvanlarda prob iğnelerinin doğrudan uygulanmasına doğru eğilir. Her uygulamada, MS tarafından tespit edilen molekülleri çıkartabilir veya tıbbi tanı almak için yapay zeka kullanabiliriz.
Introduction
Kütle spektrometresi (MS) indirgemecılığın teknolojik bir gerçekliğidir; analiz nesnesini moleküler türler veya basamaklar temelinde yorumlanabilecek bir birime indirir. Bu nedenle, analitik kimya temsili bir yöntemdir. Dört işlemden oluşur: iyonizasyon, analiz, algılama ve spektral edinim. Molekülün iyonizasyonu kütle spektrometresindeki ilk işlem olduğundan, genellikle işlenecek analitlerin şeklini kısıtlar. Çoğu iyonizasyon işlemi organik örneklerin yapısının, morfolojisinin ve gerçek zamanlı biyolojik süreçlerinin yok edilmesini gerektirir. Örneğin, elektrosprey iyonizasyon (ESI) MS, numunelerin verimli iyonizasyon1için sıvı halde olmasını gerektirir. Bu nedenle numuneler, moleküllerin bileşimini değiştiren karmaşık bir biyokimyasal preparattan geçmelidir. Alternatif olarak, matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI) MS ince kesitli doku moleküler haritaları yeniden inşa ederken2,3, iyonlaşma verimliliği örneklerdeki tüm molekülleri tespit etmek için çok düşük, ve yağ asitlerini analiz özellikle zayıftır. Bu sınırlamalar göz önüne alındığında, prob elektrosprey iyonizasyon (PESI)4 yapısal bütünlüğü yok etmeden yerinde biyolojik sistemlerde gerçek zamanlı değişiklikleri gözlemlemek için kullanılabilir5, biyolojik organizma gözlemlenen bir canlı durumda iken. Çok ince bir iğne aynı anda bir örnek toplayıcı ve bir iyon yayıcısı olarak hizmet vermektedir bu durumda kullanılır. Bu karmaşık örnek ön işlem dizileri yerinde yaşayan sistemin moleküler bileşenleri yansıtan kütle spektrumları elde etmek için atlanabilir anlamına gelir.
PESI-MS'e rakip olan birkaç iyonlaşma yöntemi vardır. Bunlardan biri hızlı buharlaşma iyonlaşma kütle spektrometresi (REIMS)6. Bu teknik ameliyat sırasında iyi çalışır, çünkü elektrik bıçağı ile monte edilir ve kesi sırasında oluşan iyon tüylerini toplar. REIMS ameliyat için çok yararlı olsa da, aslında dokunun elektrikablasyon gerektiren yıkıcı bir yöntemdir. Bu nedenle, önleyici bir numunede veya laboratuvar analizlerinde hücre ve dokuların detaylı analizi nde yararlı değildir. Ayrıca, doku enkazı içeren tüy büyük miktarda toplar çünkü, böylece özel cerrahi prosedürler için bu makinenin kullanımını sınırlayan, her kullanımdan sonra cihazların uzun bakım gerektirir. Benzer bir yöntem, lazer desorpsiyon iyonizasyon kütle spektrometresi denir (LDI-MS)7,noninvaziv ve yüzey analizi için yararlı başka bir tekniktir. Bu teknik bir numunenin yüzeyini taramakta iyi olduğundan, MALDI görüntüleme kütle spektrometresi8,9gibi kapsamlı iki boyutlu analizler elde eder. Ancak, LDI-MS sadece yüzey analizi için geçerli olduğundan, PESI-MS örneğin doku içinde örnekleri analiz etmek için avantajlıdır. Başka bir teknik, MasSpec Pen10, tiroid kanseri tanısında yüksek özgüllük ve duyarlılık elde etmek için bildirilmiştir, ancak sonda çapı mm sırasına göre ve yüzey analizi için özel, bu kanser veya derin lokalize lezyonların küçük nodülleri tespit edemez anlamına gelir. Ayrıca, bu yöntem prob kalemine gömülü bir mikrokapiller akış kanalı kullandığından, ldi-MS'e benzer şekilde çapraz kontaminasyon göz önünde bulundurulmalıdır. Akış probu ve iyonizasyon formu11gibi klinik ortamlara uygulanan diğer teknikler vardır, ancak yaygın değildir.
PESI ESI aşırı minyatürleştirme, nano-elektrosprey kılcal birkaç yüz nm bir uç eğrilik yarıçapı ile katı bir iğne üzerinde yakınsama nerede. İyonizasyon bir Taylor koni oluşturarak iğne ucu nun son derece kısıtlı alanda gerçekleşir, hangi örnekler ucunda ki tüm sıvı iyonizasyon tamamlanana kadar kalır12. Analit metal iğnenin ucunda kalırsa, metal iğne ile analit arasındaki arabirimde sürekli olarak aşırı yük üretilir. Bu nedenle, moleküllerin ardışık iyonizasyonu yüzey aktivitelerine bağlı olarak gerçekleşir. Bu özellik, iğne ucunu bir tür kromatogram yapar ve analitleri yüzey aktivitelerine bağlı olarak ayırır. Daha teknik olarak, daha güçlü yüzey aktivitesine sahip moleküller Taylor koninin yüzeyine gelir ve iyonlaşma işleminin sonuna kadar iğnenin yüzeyine yapışan daha zayıf yüzey aktivitesine sahip moleküllerden daha erken iyonize edilirler. Böylece iğne ile alınan tüm moleküllerin tam iyonizasyonuelde edilir 13. Ayrıca, bu teknik numuneye gereksiz çözücü eklenmesini içermediğinden, yüzlerce femtolitre daha fazla analiz için kütle spektrumları almak için yeterlidir14. Bu özellikler bozulmamış biyolojik numunelerin analizi için avantajlıdır. Ancak PESI-MS'in en büyük dezavantajı, iğnenin dikey eksen boyunca karşılıklı hareketi nedeniyle iyonizasyonda süreksizlikte yatar, testere makinesine benzer. İyonlaştırma, yalnızca iyon deliğin yüksekliği yatay eksenüzerinde hizalandığında sondanın ucu en yüksek noktaya ulaştığında gerçekleşir. İğne numuneleri alırken iyonizasyon durur ve böylece iyonlaşma nın stabilitesi geleneksel ESI'dekine eşit değildir. Bu nedenle PESI-MS proteomik ler için ideal bir yöntem değildir.
Pesi-MS bugüne kadar temel araştırmalardan klinik ortamlara kadar geniş bir alanı kapsayan biyolojik sistemlerin analizine uygulanmıştır. Örneğin, ameliyat sırasında hazırlanan insan dokusunun doğrudan analizi hem renal hücreli karsinom15 hem de faringeal skuamöz karsinom16triasilgliserin birikimini ortaya çıkarmak başardı. Bu yöntem aynı zamanda lipid profiliodaklanmak için kan gibi sıvı örnekleri, ölçebilirsiniz. Örneğin, bazı moleküller tavşan diyet değişiklikleri sırasında hatlarını olmuştur; bu moleküllerin bazılarının deneylerin çok erken aşamalarında azaldığı bildirilmiştir, bu da bu sistemin klinik tanı için yüksek hassasiyetini ve kullanışlılığını göstermektedir17. Ayrıca, canlı bir hayvan doğrudan uygulama oruç sadece bir gece sonra karaciğer biyokimyasal değişikliklerin tespiti ne izin5. Zaitsu ve ark.18 bu deneyitekrar 5 ve hemen hemen aynı şekilde karaciğer metabolik profilleri analiz, istikrar ve orijinal yöntemin tekrarlanabilirlik güçlendirdi sonuçları ile. Ayrıca, bu tekniği kullanarak farelerde kanser olmayan karaciğer çevreleyen kanser dokusu ayırt başardık19. Bu nedenle, bu in vivo ve in vitro hem de çeşitli ortamlarda yararlı olan çok yönlü bir kütle spektrometresi tekniğidir. Başka bir açıdan, PESI modülü montaj eki ayarlayarak çeşitli kütle spektrometresığacak şekilde yapılabilir. Bu kısa makalede, temel leri ve uygulamaları örnekler tanıtmak (Şekil 1), canlı hayvanlar la uygulamalar da dahil olmak üzere5.
Her ülkedeki mevzuat ve yasalara göre, her kurumun kriterlerini karşılamak için bu protokolün bazı bölümlerinin gözden geçirilmesi gerekecek. Canlı organizmaya uygulama en ilginç ve zorlu dur, çünkü canlı hayvanlarda doku veya organlarda biyokimyasal veya metabolik değişiklikler sağlayabilir. Bu başvuru Yamanashi Üniversitesi hayvan bakımı için kurumsal komite tarafından onaylanırken, 20135yılında, hayvan deneyleri için düzenlemelerde yapılan son değişiklikler nedeniyle yeni bir onay turu daha gerekli olacaktır. Deneysel şemada çeşitli değişiklikler, bu nedenle, tavsiye edilir. Deneylerde elde edilen kütle spektrumları ile ilgili olarak, her ölçüm arasındaki kütle spektrumlarının dalgalanmaları dikkate alınarak, nükleotit dizilimi topluluğu için ortak olan spektral bilgi paylaşım sistemi yoktur. Operatör iğne sapı kazalarını önlemek için iğneyi kollarınca, özellikle iğneyi iğne tutucudan çıkarırken dikkatli olunmalıdır. İğneyi ayırmak için özel bir cihaz bu amaç için çok yararlıdır. PESI modülünün bölmesi hava geçirmez, kapalı bir hazne olduğundan, kütle spektrometresi talimatlara göre çalıştırılırsa iyon tüyü sızıntısı oluşmaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yamanashi Üniversitesi hayvan bakımı için kurumsal komite tüm protokolleri ve deneysel hayvanların kullanımını burada belirtilen onayladı. İnsan örneği kullanımı Yamanashi Üniversitesi kurumsal etik kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Katı doku hazırlığı
NOT: Doku tazeliğini korumak için numuneler hayvandan veya insan vücudundan çıkarıldıktan sonra buz üzerinde tutulmalıdır. Ölçümler diseksiyonu hemen takip etmiyorsa, -80 °C'de doku ların depolanmaları önerilir. Onlar doku bazı içeriğini ayıklamak olabilir, çünkü tampon veya tuzlu herhangi bir tür doku yerleştirmek için tavsiye edilmez. Aldehitlerle sabitlenmiş veya parafin/balmumu veya kriyogel içine gömülü doku MS ölçümleri için uygun değildir.
- Doku örneğini neşter veya bıçak kullanarak yaklaşık 2 x 2 x 2 mm'ye kesin. Alternatif olarak, deri muayenesi için kullanılan bir trepan (tek kullanımlık biyopsi yumruğu, delik boyutu 3 mm) ile numune dışarı yumruk. Bu durumda, sütunun uzunluğunu 2 mm'ye kadar kırpın.
NOT: Herhangi bir doku bu yöntem kullanılarak analiz edilebilir. Bu deneyde, karaciğer15 ve böbrek19, başarıyla kütle spektrumları elde etmek için analiz edilmiştir. Genellikle, parankimal organlar iyi kütle spektrumları vermek, lifli bileşenleri olanlar yok iken. - Doku kan ile kontamine ise, buz gibi fosfat tamponlu tuzlu ile kısa bir süre yıkayın.
NOT: Postmortem doku hasarını en aza indirmek için, bu adımı en kısa sürede, oda sıcaklığında tamamlayın. Ölçümler hemen yapılmazsa, sıvı nitrojendeki dokuyu tutturun ve -80 °C'de saklayın. - Kesilmiş veya delilmiş numuneyi (yaklaşık 10 mg) plastik bir mikrotüp içine yerleştirin ve %50 etanol 100 μL ekleyin.
NOT: Bu sistemde kullanılan kütle spektrometresi nicel veri sağlamadığından örneklerin tam ağırlığı belirlenmemiştir. Yaklaşık 10 mg parankimal doku için en uygun. - Bir mikroenjeksle kullanarak numuneyi homojenize edin.
- Homojenin 10 μL'sini kartuşun kuyuya yerleştirin(Şekil 2).
- Kartuşun kütle spektrometresinin iyonizasyon odasına yerleştirin ve numune iyonizasyonu için kullanılacak paslanmaz çelik iğne probu yerleştirin(Şekil 2).
NOT: Prob iğneleri üretici tarafından temin edilir. Paslanmaz çelikten imal edilmiştir ve yaklaşık 400 nm'lik bir eğrilik yarıçapına sahiptir. - Güvenlik cihazını otomatik olarak etkinleştirmek için oda kapağını sıkıca kapatın.
- Analiz etmek için Başlat simgesine tıklayarak yerleşik bilgisayarı başlatın. Ekran panellerini kullanarak, elektrosprey oluşturmak ve iğne frekansının 3 Hz olduğundan emin olmak için iğneye 2,3 kV'luk bir voltaj uygulayın.
- Ölçümün tamamlanması için 30 s bekleyin.
NOT: Veri toplama tamamlandığında oturum otomatik olarak durdurulur. Analizin kalitesi toplam iyon kromatogramı (TIC) ile izlenir. Ölçüm süresi temsili kütle spektrumları elde etmek için tanımlanır ve kısaltılabilir veya uzatılabilir. - Her numuneyi ölçtükten sonra kartuş ve iğneyi biyolojik tehlike verici bir bertaraf layıcıya atın.
NOT: Aynı anda yalnızca bir örnek ölçülebilir. Her ölçümden önce makineyi kalibre etmek gerekli değildir; kalibrasyon, tedarikçinin altı ayda bir düzenli olarak check-up'ına bağlıdır. - Kütle spektrumlarını analiz edin ve kütle spektrometresi ile ilişkili yazılımı kullanarak kütle spektral metin verilerini dışa aktarın (bkz. Malzeme Tablosu)aşağıdaki adımlarda belirtildiği gibi(Şekil 3).
- Yazılımın veri dosyası tarayıcı penceresindeki lcd dosyaya tıklayın.
- Kitle spektrum penceresinde tek bir tepeye tıklayın ve otomatik olarak çıkarılan bir iyon kromatogramını (EIC) gösterin.
- TIC ve EIC'yi kontrol edin ve kütle spektrumu oluşturmak için zaman aralığı penceresini seçmek için ortalama spektrum simgesine tıklayın.
NOT: Bu analizde hedef moleküller kütle-yük oranı(m/z) penceresinde görünürler (Şekil 3). Ayrıca, iğne hareketinin tek inme başına iyonizasyon süresi çok kısa olduğundan, elde edilen tüm kütle spektrumları aslında 10 s (300 taramaları) üzerinde spektrum ortalaması vardır. - Daha fazla analiz için Dışa Aktarma sekmesine tıklayarak m/z ve iyon yoğunluğu içeren bir metin dosyası oluşturun. Bu metin dosyası herhangi bir klasörde saklanabilir.
NOT: Herhangi bir RNA koruyucu numunelerin yerli spektral modelini etkileyecektir. Buna ek olarak, depolama sırasında sıvı içine doku moleküler bileşenlerin elümesini önlemek için herhangi bir sıvı (fosfat-tamponlu tuzlu gibi) olmadan doku işlemek ve depolamak için tavsiye edilir. İdeal olarak, herhangi bir tedavi olmadan taze veya taze dondurulmuş numuneler kullanılır.
2. Vücut sıvıları (serum) hazırlanması
NOT: Tüm bu prosedür katı doku için kullanılan hemen hemen aynıdır. Sıvı numunesi için kartuş üreticiden temin edilebilir. Kırmızı kan hücreleri (RBC) tarafından kontaminasyon büyük ölçüde amaçlanan bileşenin spektral edinimi verimliliğini azaltabilir çünkü (plazma veya serum), ölçümlerden önce santrifüj ederek tüm RBC'leri ortadan kaldırmak için emin olun.
- Serum örneğinin 10 μL'sini alın ve 1,5 mL'lik bir mikrotüp içine koyun.
NOT: Hem taze hem de depolanmış serum kullanılabilir. - 1.5 mL tüpe %50 etanol 190 μL ekleyin, ardından oda sıcaklığında 2 dakika girdap.
- Sıvıyı 15.000 x g'de 1-5 dk 4 °C'de santrifüj edin.
- 10 μL'lik supernatant'ı kartuşun kuyusu içine aktarın.
- Kartuşun iyonizasyon odasına yerleştirin ve numune iyonizasyonu için kullanılacak paslanmaz çelik iğne probu kurun(Şekil 2).
- Güvenlik cihazını otomatik olarak etkinleştirmek için oda kapağını sıkıca kapatın.
- Iyonize etmek için Başlat simgesine tıklayarak yerleşik bilgisayarı başlatın.
- Ölçümler yapıldıktan sonra numune kartuşunu ve iğneyi 1.10'da açıklandığı gibi atın.
- Elde edilen AYM kümelerini aşağıda belirtildiği gibi analiz edin (Şekil 3).
- Veri tarayıcısındaki lcd dosyasını açın.
- TIC ve EIC'yi görüntülemek için tek bir tepeye tıklayın.
- Ortalama spektrum simgesini kullanarak kütle spektrumları oluşturmak için zaman aralığı penceresini seçin.
- Monitördeki dışa aktarma sekmesini tıklatarak, ilgili tepenin hem m/z hem de iyon yoğunluğunu içeren oluşturulan dosyayı dışa aktarın.
NOT: Bu işlem tükürük, idrar ve diğer vücut sıvılarına da uygulanabilir.
3. Canlı organizmada in vivo PESI-MS hazırlığı
NOT: Bu bölümde yaşayan bir fare modelinde 5-Fluoro-2'-deoksiürinin (5-FdU) metabolik profilini izlemek için bir uygulama sunulmuştur. Boyunca aseptik koşulları kullanın.
- 100 μL 100 mM 5-FdU çözeltisini 2 aylık bir farenin kuyruk damarına (yaklaşık 20 g ağırlık) aşılayın.
NOT: Cinsiyet, yaş veya fare türü tercihi yoktur. Bu protokol deney iybesini gerçekleştirdiğimiz sırada onaylanırken5, bu deneyin fizibilitesi, yapılacak olan ülkenin etik kısıtlamalarına bağlıdır. - Onaylanan hayvan bakım protokolüaşağıdaki fare anestezi. Kuyruk kıstırma yanıt eksikliği ile anestezi derinliğini değerlendirin.
NOT: Hayvan deneyleri için etik komite tarafından sodyum pentobarbital kullanımına izin verilmiyorsa, ketamin hidroklorür gibi alternatif yöntemler kullanılabilir. - Elektrikli bir jilet kullanarak karın boşluğu tıraş ve gözlere veteriner merhem uygulayın.
- Anestezili fareyi bir supine pozisyonuna getirin ve pençeleri tamir bandı kullanarak plastik plakaya sabitleyin. Cerrahi bölgeyi üç kez %70 alkollü önlüklerle temizleyin.
- Makasla karın boşluğunu kesin. İlk olarak, diyaframın hemen üstünden deriyi (10 mm) yanal olarak kesin. Yanal karın vücut duvarı ve periton kas kesmek (yaklaşık 7 mm) ve karaciğer yüzeyini ortaya çıkarmak için paslanmaz tel kullanarak yara açık tutun.
NOT: Karaciğer yüzeyine nüfuz etmeye gerek yoktur. - Sonda iğnesinin ucunu karaciğer yüzeyine uygulayın. İyonizasyon verimliliğini optimize etmek için iğnenin derinliğini yaklaşık 0,5 mm derinliğe ayarlayın ve TIC ve spektral deseni aynı anda kontrol edin. Kontrol panelinin ekranında yüksek gerilimi 2,3 kV'a, frekansı 3 Hz'e ayarlayın.
- Hayvanı plastik plakadan çıkarın.
- Cerrahi bir bağırsak sütür kullanarak yara dikiş ve kafese fare dönün. Fareyi, sert bir şekilde recumbency korumak için bilinç kazandı kadar gözetimsiz bırakmayın. Fareyi tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine geri verme.
- AYM'de iyon yoğunluğunun zaman seyrini ve AYM tasvirinin 1.11.1 ile 1.11.4 arasında olduğunu gösterin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3'tede belirtildiği gibi PESI-MS tekniği ile elde edilen veriler bu sistemde m/z aralığı 10 ile 1.200 arasında değişen kütle spektrumlarıdır. M/z 2.000'e kadar olan molekülleri tespit etmekle birlikte, m/z 1.200'ün kütle aralığında bu teknik kullanılarak elde edilen az sayıda zirve vardı. Bu nedenle, m/z 10'dan 1.200'e kadar olan zirveleri analiz ettik. M/z 800 ve 900 civarında dikkat çekici zirve grupları vardı; eski hücre zarı bileşenleri temsil eder, fosfatidil kolin gibi (PC) türler, ve ikinci triasil gliserol temsil eder (TAG). Şekil 4 normal bir insan böbreği ve böbrek hücreli karsinom (RCC) kitle spektrumlarını göstermektedir. Kütle spektrumları protokol 1'de açıklanan doğrudan doku yöntemi kullanılarak elde edildi. Berrak hücre tipi RCC sitoplazmada TAG birikir çünkü, m/z 900 etrafında spektrum bir grup çok belirgindir. Şekil 4'te elde edilen sonuç, katı numuneler için Şekil 1'de tanıtılan ekstraksiyon yöntemi ile elde edilmiştir.
Hastalığın ilerlemesi sırasında hepatosellüler karsinomun lipid metabolizması değiştiğinden20,PESI-MS ile birlikte rutin biyopsi ile hastalığın evrelerini izlemek mümkündür. Şekil 5'teki sonuç, normal karaciğer dokusu ile HCC arasındaki spektral desen farklılıklarını gösteriş. Özellikle, HCC TAG birkaç dikkat çekici spektrumları vardır. Kütle spektrometresinin çözünürlüğü daha yüksekse, her spektrumun moleküler ekaçıklamasının kanserin moleküler mekanizmasının yanı sıra normal hücresel fizyolojinin de aydınlanmasına olanak sağlaması mümkündür.
Pesi kullanılarak ilaç metabolizmasının gerçek zamanlı takibi yapılabilir. Deneylerimizde, anti-onkotik ajan 5-FdU'nun farmakodinamiği bir farenin kuyruk damarına enjekte edildikten sonra 10'dan fazla izlenmiştir. Spektrumun çok hızlı saptanması, ilacın enjekte edilmesinden sadece birkaç saniye sonra gözlenmiştir(Şekil 6),ilacın kan dolaşımı yoluyla karaciğere hızlı bir şekilde taşınmasını ima eden. 5-FdU'nun sodyum addüktlerinin yoğunluğu, ölçüme başladıktan sonra kayıttaki iyon sinyalinin kısa bir kusuru ile 6-7 s civarında azaldı. Bu karaciğer parankim PESI iğne değişen derinliği nedeniyle, anestezili farenin vücut hareketleri sonucu oldu. Bu nedenle, dikkatli canlı hayvanların gerçek zamanlı ölçüm için PESI iğne derinliğini ayarlamak için alınmalıdır. İğnenin en uygun derinliğini bulmak için önerilen bir yol yoktur, ancak pratik ile belirgin hale gelir.
Üç kişiden alınan kan örnekleri PESI-MS ile incelendi. Bu durumda 10 μL serum %50 etanol 190 μL ile karıştırılarak PESI-MS analizinde kullanıldı. Genel spektral desenler birkaç ortak zirveleri paylaşmak gibi görünse de(Şekil 7),bu üç kişiden spektrumbirçok dakika farklılıklar vardır. Metabolik aktiviteler açısından her kişinin parmak izidir. Moleküler kimlikler hakkında ayrıntılı bilgi için, bir high-end makine kullanmak gereklidir. Deneylerde kullanılan kütle spektrometresi molekülleri tanımlamak için yeterince yüksek bir çözünürlük sağlamadı.
Polimer bileşikleri ile kontaminasyon varsa, Şekil 4'teki orijinal spektrumlar, spektrumları orijinal örnekten bulanıklaştıran kapatılan periyodik ve göze çarpan zirvelere yol açar(Şekil 8). Bunu deneysel olarak göstermek için, bir kontaminasyon vakasını yeniden üretmek için %2.5'e polipropilen gliserol triol (PPGT) ekledik. Şekil 8'de görülen spesifik spektrumların hemen hemen tamamı PPGT ilavesi ile maskelendi.
Şekil 1: Örnek hazırlama akışının şematik genel bakışı. Numuneler için, kararlı veri toplama için özel bir örnek kartuş idealdir. Sıvı numune analizi, çözümü kartuşa yerleştirerek PESI-MS gerçekleştirmenin en kolay yoludur. Katı dokuya bu yöntemi uygulamak için iki yöntem vardır. PESI'nin dokuya doğrudan uygulanması çok kolay ve hızlıdır, ekstraksiyon yöntemi ise örnek türlere bağlı olarak spektrumların çok daha istikrarlı bir şekilde elde edilmesini sağlar. Bu işlemde doku örneğinin küçük bir parçası 100 μL%50 etanol içeren bir mikrotüp içine konur ve mikroenjektül ile homojenize edilir. Elde edilen homojenin 10 μL'si kütle spektrometresi için kullanılır. Canlı bir hayvanın analizi durumunda hedef organın serozal yüzeyine %50 etanol 30 μL yerleştirilir ve ardından ölçüm yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: PESI-MS'in genel bakışı ve temel bileşenleri. PESI modülü ile donatılmış bir kütle spektrometresi. İyndeleştirme kısmı, iyon girişinin, iğne tutucunun ve numune tutucunun yerleştirildiği kapalı bir odaya yerleştirilir. İğne hazırdır ve tek kullanımlık paslanmaz çelik iğne iğne tutucuya sabitlenir. Numune kartuşunu hazneye yerleştirdikten hemen sonra kütle spektrometresinde ayarlanır. İğnenin ortalama eğrilik açısı 400 nm'dir. Numunenin yerleştirilmesi için kartuş tek kullanımlıktır ve plastik polimerlerden yapılmıştır. Bu sıvı örnek (kırmızı ok) yerleştirmek için küçük bir kuyu vardır. Katı numuneyi kuyuya koyduktan sonra, kaset numuneyi çimdiklemek ve kuyuyu kapatmak için katlanır. Sıvı numune kartuşları için, katlama gerektirmeyen farklı bir kartuş kullanılır ve bu, katı numunelerden üstün olan önerilen bir sürümdür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PESI-MS için grafik kullanıcı arabirimi (GUI). Toplam iyon kromatogramından (TIC) kütle spektrumları oluşturmaya yönelik tüm işlemler ilgili yazılım la gerçekleştirilebilir. Veri tarayıcısında lcd dosyaaçıldıktan sonra, TIC görüntülenebilir ve kütle spektrumları oluşturmak için zaman aralığı seçilebilir. Oluşturulan kütle spektrumları hem kütle-yük oranı(m/z)hem de iyon yoğunluğunu içeren metin verileri olarak dışlanabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İnsan renal hücreli karsinom nötr lipidlerin karakteristik zirvelerini gösterir. İnsan renal hücreli karsinom dokusundan (RCC) spektrumlarda kanser olmayan dokuda tanımlanmamış nispeten güçlü zirveler vardı. Bu zirveler esas olarak tinasilgliserini temsil eder (TAG) etrafında kütle-şarj oranı(m/z) 900. Spektral kazanım pozitif iyon modu kullanılarak doğrudan analiz ile gerçekleştirilmiştir. Yüksek gerilim 2.3 kV olarak ayarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Normal karaciğer dokularında ve insan hepatosellüler karsinomlarında (HCC) elde edilen veri örneği. Üst panel, neoplastik lezyonun mevcut olmadığı bir insan karaciğer dokusundan değil, kronik hepatit ve karaciğer sirozu olan bir hastadan spektrumları betimlemesidir. Alt panel aynı hastadan HCC ortalama spektrumgösterir. Bir bakışta, bu ikisi çok benzer spektral desenlere sahip ken, spektral desen birçok küçük farklılıklar vardır. Abscissa kütle-şarj oranını(m/z)gösterir ve ordinat her spektrumun göreceli yoğunluğunu gösterir. Şekil 2C'detasvir edildiği gibi, doku çıkarıldıktan sonra pozitif iyon modu kullanılarak spektrum elde edilmesi gerçekleştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İlaç metabolizmasının gerçek zamanlı ölçümleri. 5-FdU'daki metabolik değişiklikler bir farenin kuyruk kabına intravenöz olarak enjekte edilir. 5-FdU'nun sodyum adduct ile çok hızlı ve hassas tespiti karaciğerde yerinde sağlandı. Ölçüm sırasında kararsız iyonizasyon nedeniyle, sinyalin kesilmesi 6-7 s civarında belirtilebilir.
Şekil 7: Üç kişiden veri örnekleri. Üç kişiden alınan insan serumu PESI-MS kullanılarak incelendi. Bireyler arasında spektral desenlerde açık farklılıklar vardı. Veriler pozitif iyon modu kullanılarak elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Polimer bileşikleri kesin veri toplama ile müdahale. Orijinal numunenin üzerine konmuş spektral zirvelerin periyodik olarak ortaya çıkması nedeniyle, verileri tam olarak yorumlamak zorlaşır. Bu durumda, polipropilen triol gliserol türetilen spektrumlar (PPGT) gürültülü bir bindirme olarak görünür. Genellikle kalibrasyon için kullanılan bu bileşikler, karaciğerden orijinal spektrumları maskeler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PESI kütle spektrometresi için ESI bir türevi olmasına rağmen4, gerçek zamanlı metabolomik izleme için en avantajlı, yanı sıra herhangi bir karmaşık veya zaman alıcı ön işlemler gerçekleştirmeden biyokimyasal reaksiyonları analiz etmek için5,14,15,17. Canlıorganizmaların entegre durumuna uygulanabilen kolay ve anlık kütle spektrometresi tekniğidir. Numune önlatlarının karmaşık basamaklarını gerektirmediğinden, tüm numunenin moleküler bileşimini değerlendirmek çok daha büyük bir olasılıktır, çünkü büyük miktarlarda organik çözücüler kullanarak numune ön işlemlerin karmaşık adımlarını gerektiren geleneksel ESI'de oluşabilecek numune kayıplarını önlüyoruz. Bu nedenle PESI, tüm koşullar uygun şekilde kontrol edilirse numuneden çok daha fazla bilgi almamızı sağlar.
Pesi-MS analizini değerlendirirken öncelikle iyi sonuçlar elde etmek için gereken bazı teknik hususlardan bahsetmemiz gerekmektedir. PESI'deki en kritik faktör analiz sırasında iyonizasyon verimliliğinin korunmasıdır. Bunu başarmak için, analiz sırasında bilgisayar monitörüne atıfta bulunarak kararlı bir TIC oluşturmak için iğneucu ile numune yüzeyi arasındaki mesafeyi ayarlamak ve optimize etmek tavsiye edilir. Bunu yapmak için, maksimal TIC elde etmek için adım adım bir şekilde iğne derinliğini değiştirmek için gereklidir. Iyonizasyon süresi ESI ile karşılaştırıldığında nispeten kısa olduğundan, PESI tekrarlanabilirlik veya nicelleştirme için ideal değildir. İkinci olarak, iğne ucunun şekli iyonizasyonda çok önemli bir rol oynadığından, iyon kaynağı olarak hizmet veren ideal bir Taylor konisi oluşturarak, iğne ucunude deforme etmemeye özen verilmelidir. İpucunun deformasyonu iyonizasyon veriminin düşmesine neden olabilir.
PESI, özel tedavi olmaksızın doğrudan taze numunelere (örneğin karaciğer, böbrek ve beyin) ve canlı organizmaya uygulanabildiği için avantajlı olsa da, sıvı 21,22,23'tebulunan hemen hemen tüm bileşenleri iyonize edebileceği nden diğer ekzojen kirleticilere nispeten hassastır. Diğer bir deyişle, örnek ön işlem atlama avantajı dezavantajı PESI-MS genellikle biyolojik deneylerde karşılaşılan çeşitli durumlarda bir dezavantaj olduğu anlamına gelir. Protokol bölümünde açıklandığı gibi PESI, rna koruyucular, aldehitler ve genellikle histolojik preparat için kullanılan kriyojeller gibi polimer bileşikler tarafından kontaminasyona duyarlıdır. Kan pıhtıları PESI iğne yapışabilir ve genellikle amaçlanan spektrumları maskeleyebilir. Ayrıca, RBC'lerin hemoliz hemoglobin ilerler, ve ayrıştırılmış ferrik iyon amaçlanan analitlerden elde edilenlerden çok daha güçlü spektrumlara yol açar. Polimer bileşikleri de amaçlanan analitlerden elde edilen spektrumları kaplamak periyodik spektral zirveler vermek, gürültü nedeniyle gerçek verileri yorumlamak çok daha zor hale(Şekil 8). Kütle spektrumlarının ediniminde herhangi bir sorun yaşamamak için, kontaminasyona özel referanslar alarak protokolümüzü izlememiz tavsiye edilir. Bu bağlamda, PESI uygulaması bazı durumlarda sınırlıdır.
PESI'nin bir diğer dezavantajı da, sonda iğnesinin derinliğini analitlere göre ayarlamamızı gerektiren nispeten kararsız iyonizasyon sürecinde yatmaktadır. Buna ek olarak, bu teknik tek bir analizde çok sınırlı bir alanı kapsayabilir. Doğrudan dokuya uygulanan iğne ucu çok küçük boyutu nedeniyle, PESI-MS analizi bir MALDI-TOF MS tabanlı görüntüleme kitle spektrometresi veya DESI tabanlı görüntüleme7ile elde edilebilir 2D analizi kadar kapsamlı değildir 7,8. PESI, ancak, hipokampal oluşumunun bir görüntü yeniden olabilir, bir örnek 2D tarama uzun zaman alır, çünkü birkaç saat23 sürer rağmen, bu tekniğin kararsız iyonizasyon verimliliği nedeniyle esas. Bunu göz önünde bulundurarak PESI-MS ile kitle spektral görüntüleme değerli bir uygulama değildir.
PESI elektrokimyasal özellikleri ile ilgili olarak, hacim ve iğne ucu yapışır örneğin konsantrasyonu kritik18, bastırma etkisi biraz elektrosprey boyutu küçültülerek zayıflatılır gibi. PESI'nin ESI'nin minyatürleştirilmesi olduğu göz önünde bulundurulduğunda, numunelerin uçta bulamaç oluşmasını önlemek için ideal olarak seyreltilmesi gerekir. Bu nedenle, doğrudan doku yöntemi kullanılırken verimli iyonizasyon elde etmek için yaklaşık 30 μL%50 etanol eklenmesi gerekmektedir (Şekil 2B). Bu iyonlaşma verimliliğini en üst düzeye çıkarır ve iğne ucuna bağlı moleküllerin neredeyse tam iyonizasyon sağlar.
Bu sistemi kullanırken veri işleme en uygun yöntem seçimi çok önemlidir24. Herhangi bir hastalık tanısı için makine öğrenimi uygulanması ile ilgili olarak, bir veritabanı nın oluşturulması hastalıkları sınıflandırmak veya kategorize etmek için bir referans oluşturmak için gereklidir7. Örneğin, birincil karaciğer maligniteleri tanısı25yapmak için destek vektör makinesi veya lojistik regresyon kullandık.
PESI-MS ilaç tarama, doping testleri, tarım ürünleri26gıda güvenliği testleri ve bazı çevresel testler için büyük bir potansiyele sahip çok yönlü ve kolay bir tekniktir. Bu iyonizasyon ünitesi her bir alet için bir eki hazırlayarak diğer spektrometrelerle uyumlu olduğundan, PESI çeşitli amaçlara uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
İlgili yazar Shimadzu, bir üretici ve PESI-MS enstrüman tedarikçisi tarafından finanse edilmiştir.
Acknowledgments
Ayumi Iizuka'ya, SEKretarya yardımı için PESI-MS ve Kazuko Sawa-nobori'yi işlettiği için teşekkür ederiz. Edanz Group'tan (www.edanzediting.com/ac) Bronwen Gardner'a bu makalenin taslağını düzenlediği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
