Summary
Este artigo introduz métodos de preparação de amostras para um método analítico único em tempo real baseado na espectrometria de massa ambiente. Este método nos permite realizar a análise em tempo real das moléculas biológicas in vivo sem nenhum pré-tratamento especial.
Abstract
A espectrometria de massa (MS) é uma ferramenta poderosa em química analítica porque fornece informações muito precisas sobre moléculas, como proporções de massa para carga(m/z),que são úteis para deduzir pesos moleculares e estruturas. Embora seja essencialmente um método analítico destrutivo, os recentes avanços na técnica de ionização ambiental nos permitiram adquirir dados, deixando o tecido em um estado relativamente intacto em termos de integridade. A ionização de eletrospray de sonda (PESI) é um método direto chamado porque não requer pré-tratamento complexo e demorado de amostras. Uma agulha fina serve como catador de amostras, bem como um emissor de ionização. Com base na propriedade muito afiada e fina da ponta da sonda, a destruição das amostras é mínima, permitindo-nos adquirir as informações moleculares em tempo real de seres vivos in situ. Aqui, introduzimos três aplicações da técnica PESI-MS que serão úteis para pesquisa e desenvolvimento biomédico. Trata-se da aplicação ao tecido sólido, que é a aplicação básica dessa técnica para o diagnóstico médico. Como esta técnica requer apenas 10 mg da amostra, pode ser muito útil nos ambientes clínicos de rotina. A segunda aplicação é para diagnósticos médicos in vitro onde o soro sanguíneo humano é medido. A capacidade de medir amostras de fluidos também é valiosa em vários experimentos biológicos onde um volume suficiente de amostra para técnicas analíticas convencionais não pode ser fornecido. A terceira aplicação se inclina para a aplicação direta de agulhas de sonda em animais vivos, onde podemos obter dinâmicas em tempo real de metabólitos ou drogas em órgãos específicos. Em cada aplicação, podemos inferir as moléculas que foram detectadas pela ESM ou usar inteligência artificial para obter um diagnóstico médico.
Introduction
Espectrometria de massa (MS) é uma realização tecnológica do reducionismo; reduz o objeto de análise a uma unidade que pode ser interpretada com base em espécies moleculares ou cascatas. Portanto, é um método representativo de química analítica. É composto por quatro processos: ionização, análise, detecção e aquisição espectral. Como a ionização da molécula é o primeiro processo de espectrometria em massa, ela geralmente restringe a forma dos analytes a serem processados. A maioria dos procedimentos de ionização requerem a destruição da estrutura, morfologia e processos biológicos em tempo real de amostras orgânicas. Por exemplo, a ionização de eletrospray (ESI) exige que as amostras estejam em estado líquido para ionização eficiente1. As amostras, portanto, devem passar por uma complexa preparação bioquímica, que altera a composição das moléculas. Alternativamente, enquanto a desorização do laser auxiliado por matriz (MALDI) pode reconstruir mapas moleculares de tecido seccionado fino2,3, sua eficiência de ionização é muito baixa para detectar todas as moléculas nas amostras, e é particularmente ruim em analisar ácidos graxos. Considerando essas limitações, a ionização de eletrospray de sonda (PESI)4 pode ser usada para observar as mudanças em tempo real nos sistemas biológicos in situ sem destruir a integridade estrutural5, enquanto o organismo biológico observado está tecnicamente em um estado vivo. Uma agulha muito fina é usada neste caso que serve simultaneamente como um catador de amostras e um emissor de íons. Isso significa que as complexas sequências de pré-tratamento amostral podem ser contornadas para obter espectros de massa que refletem os componentes moleculares do sistema vivo in situ.
Existem vários outros métodos de ionização que rivalizam com pesi-ms. Um deles é a espectrometria rápida de ionização evaporativa (REIMS)6. Essa técnica funciona bem durante a cirurgia porque é montada com uma faca elétrica e recolhe a pluma de íon gerada durante a incisão. Embora o REIMS seja muito útil para a cirurgia, é essencialmente um método destrutivo que requer a ablação elétrica do tecido. Portanto, não é útil para a análise detalhada de células e tecidos em uma amostra preparatória ou em análises laboratoriais. Além disso, por coletar uma grande quantidade de pluma contendo detritos teciduais, requer uma manutenção longa dos dispositivos após cada uso, limitando assim o uso desta máquina a procedimentos cirúrgicos especiais. Um método semelhante, chamado espectrometria de ionrômetro de ionrização de desorização a laser (LDI-MS)7, é outra técnica que não é invasiva e útil para a análise da superfície. Como essa técnica é boa em escanear a superfície de um espécime, ela alcança uma análise bidimensional abrangente como a espectrometria de massa de imagem MALDI8,9. No entanto, como o LDI-MS só é aplicável à análise da superfície, pesi-MS é vantajoso para analisar as amostras, por exemplo, dentro do tecido. Outra técnica, a MasSpec Pen10,foi relatada para atingir alta especificidade e sensibilidade no diagnóstico de câncer de tireoide, mas o diâmetro da sonda está na ordem do mm e é específico para a análise da superfície, o que significa que não pode detectar pequenos nódulos de câncer ou lesões profundamente localizadas. Além disso, como este método usa um canal de fluxo microcapilar embutido na caneta da sonda, a contaminação cruzada deve ser levada em consideração, semelhante ao LDI-MS. Existem outras técnicas que foram aplicadas a configurações clínicas, como a sonda de fluxo e o cotonete11,mas não são generalizados.
PESI é uma miniaturização extrema do ESI, onde o capilar do nano-eletrospray converge em uma agulha sólida com um raio de curvatura de ponta de várias centenas de nm. A ionização ocorre na área extremamente restrita da ponta da agulha, formando um cone Taylor, no qual as amostras permanecem até que a ionização de todo o fluido na ponta seja concluída12. Se o analyte ficar na ponta da agulha metálica, o excesso de carga é continuamente gerado na interface entre a agulha metálica e os analytes. Portanto, a ionização sequencial de moléculas ocorre dependendo de sua atividade superficial. Esta propriedade faz da ponta da agulha uma espécie de cromatograma, separando os análites dependendo de sua atividade superficial. Mais tecnicamente, moléculas com a atividade superficial mais forte chegam à superfície do cone Taylor e são ionizadas mais cedo do que aquelas com atividade superficial mais fraca, que aderem à superfície da agulha até o final do processo de ionização. Assim, a ionização completa de todas as moléculas captadas pela agulha é alcançada13. Além disso, como essa técnica não envolve a adição de solvente supérfluo à amostra, várias centenas de femtolitros são suficientes para obter espectros de massa fortes o suficiente para análise suplementar14. Essas propriedades são vantajosas para a análise de amostras biológicas intactas. No entanto, uma grande desvantagem do PESI-MS reside na descontinuidade na ionização devido ao movimento recíproco da agulha ao longo do eixo vertical, semelhante a uma máquina de serrar. A ionização só ocorre quando a ponta da sonda atinge o ponto mais alto quando a altura do orifício do íon está alinhada no eixo horizontal. A ionização cessa enquanto a agulha capta amostras, e assim a estabilidade da ionização não é igual à do ESI convencional. Portanto, pesi-ms não é um método ideal para a proteômica.
Até o momento, o PESI-MS tem sido aplicado principalmente à análise de sistemas biológicos, abrangendo uma ampla gama de campos, desde pesquisas básicas até ambientes clínicos. Por exemplo, a análise direta do tecido humano preparado durante a cirurgia foi capaz de revelar o acúmulo de triacylglicerol tanto no carcinoma celular renal15 quanto na carcinoma faringeal16. Este método também pode medir amostras líquidas, como sangue, para se concentrar no perfil lipídico. Por exemplo, algumas moléculas foram delineadas durante mudanças alimentares em coelhos; foi relatado que algumas dessas moléculas diminuíram em estágios muito iniciais dos experimentos, indicando a alta sensibilidade e utilidade deste sistema para diagnóstico clínico17. Além disso, a aplicação direta a um animal vivo permitiu a detecção de alterações bioquímicas do fígado após apenas uma noite dejejum 5. Zaitsu et al.18 revisitaram este experimento5 e analisaram os perfis metabólicos do fígado quase da mesma forma, com resultados que reforçaram a estabilidade e a reprodutibilidade do nosso método original. Além disso, conseguimos discriminar o tecido cancerígeno do fígado não cancerígeno circundante em camundongos usando esta técnica19. Portanto, trata-se de uma técnica versátil de espectrometria de massa que é útil em várias configurações, tanto in vivo quanto in vitro. Do outro ponto de vista, o módulo PESI pode ser feito para caber vários espectrômetros de massa, ajustando o acessório de montagem. Neste pequeno artigo, introduzimos o básico e exemplos de aplicações (Figura 1),incluindo aplicações com animais vivos5.
De acordo com as normas e leis de cada país, partes desse protocolo precisarão ser revistas para atender aos critérios de cada instituição. A aplicação ao organismo vivo é a mais interessante e desafiadora porque pode fornecer alterações bioquímicas ou metabólicas em tecidos ou órgãos em animais vivos in situ. Embora este pedido tenha sido aprovado pelo comitê institucional de cuidados com animais da Universidade de Yamanashi, em 20135, outra rodada de aprovação agora será necessária devido às recentes mudanças nas regulamentações para os experimentos com animais. Várias modificações no esquema experimental são, portanto, aconselháveis. Em relação ao espectro de massa obtido em experimentos, levando em conta as flutuações de espectros de massa entre cada medida, não há um sistema espectral de compartilhamento de informações que seja comum com a comunidade de sequenciamento de nucleotídeos. Deve-se tomar cuidado quando o operador manuseia a agulha para evitar acidentes com agulhas, especialmente quando a retirada da agulha do suporte da agulha. Um dispositivo especial para desprender a agulha é muito útil para este fim. Como o compartimento do módulo PESI é uma câmara hermética e fechada, o vazamento da pluma de íon não ocorre se o espectrômetro de massa for operado de acordo com as instruções.
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Protocol
O comitê institucional de cuidados com animais da Universidade de Yamanashi aprovou todos os protocolos e o uso de animais experimentais aqui declarados. O uso de amostras humanas foi aprovado pelo conselho de ética institucional da Universidade de Yamanashi.
1. Preparação de tecido sólido
NOTA: As amostras devem ser mantidas no gelo após sua remoção do animal ou do corpo humano para preservar o frescor do tecido. Se as medidas não seguirem imediatamente a dissecação, recomenda-se armazenar tecido a -80 °C. Não é aconselhável colocar o tecido em qualquer tipo de tampão ou soro, porque eles podem extrair certos conteúdos do tecido. O tecido que foi fixado com aldeídos ou embutido em parafina/cera ou criogel não é adequado para medições de ESM.
- Corte a amostra de tecido para aproximadamente 2 x 2 x 2 mm usando um bisturi ou faca. Alternativamente, soque a amostra com um trepan (um soco de biópsia descartável, tamanho 3 mm) usado para o exame de pele. Neste caso, corte o comprimento da coluna para 2 mm.
NOTA: Qualquer tecido pode ser analisado usando este método. Neste experimento, fígado15 e rim19, foram analisados com sucesso para obter espectros de massa. Geralmente, órgãos parenchymal dão bons espectros de massa, enquanto aqueles que têm componentes fibrosos não. - Se o tecido estiver contaminado com sangue, lave-se brevemente com soro soro-marinho com fosfato frio.
NOTA: Para minimizar os danos do tecido pós-morte, complete esta etapa, o mais rápido possível, em temperatura ambiente. Se as medidas não forem feitas imediatamente, congele o tecido em nitrogênio líquido e armazene -80 °C. - Coloque a amostra cortada ou perfurada (aproximadamente 10 mgs) em um microtubo plástico e adicione 100 μL de 50% de etanol.
NOTA: O peso exato das amostras não é determinado porque a espectrometria de massa utilizada neste sistema não fornece dados quantitativos. Aproximadamente 10 mgé ótimo para o tecido parenquimal. - Homogeneize a amostra usando um micropestle.
- Coloque 10 μL do homogeneeno no poço do cartucho (Figura 2).
- Coloque o cartucho na câmara de ionização do espectrômetro de massa e instale a sonda de agulha de aço inoxidável que será usada para a ionização amostral(Figura 2).
NOTA: As agulhas de sonda são fornecidas pelo fabricante. Eles são feitos de aço inoxidável e têm um raio de curvatura de aproximadamente 400 nm. - Feche firmemente a tampa da câmara para ativar automaticamente o dispositivo de segurança.
- Inicie o computador de bordo clicando no ícone Iniciar para analisar. Usando os painéis na tela, aplique uma tensão de 2,3 kV à agulha para gerar o eletrospray e certifique-se de que a frequência da agulha seja de 3 Hz.
- Aguarde 30 s para que a medida seja concluída.
NOTA: A sessão cessa automaticamente quando a aquisição de dados é concluída. A qualidade da análise é monitorada por um cromatograma total de íons (TIC). O tempo de medição é definido para obter o espectro de massa representativo e pode ser encurtado ou prorrogado. - Descarte o cartucho e a agulha em um descarte de risco biológico depois de medir cada amostra.
NOTA: Apenas uma amostra pode ser medida de cada vez. Não é necessário calibrar a máquina antes de cada medição; calibração depende do check-up regular pelo fornecedor uma vez a cada seis meses. - Analise o espectro de massa e exporte os dados de texto espectrais em massa utilizando o software associado ao espectrômetro de massa (ver Tabela de Materiais)conforme indicado nas etapas abaixo(Figura 3).
- Clique no arquivo lcd na janela do navegador de arquivos de dados do software.
- Escolha e clique em um único pico na janela de espectro de massa e para retratar automaticamente um cromatograma de íon extraído (EIC).
- Verifique o TIC e o EIC e clique no ícone de espectro médio para selecionar a janela de alcance do tempo para gerar o espectro de massa.
NOTA: Nesta análise, as moléculas-alvo aparecem na relação massa-carga(m/z) janela (Figura 3). Além disso, como a duração da ionização por único golpe de movimento da agulha é muito curta, todos os espectros de massa obtidos são essencialmente espectros médios acima de 10 s (300 scans). - Gere um arquivo de texto contendo intensidade de m/z e íon clicando na guia Export para análise posterior. Este arquivo de texto pode ser armazenado em qualquer pasta.
NOTA: Quaisquer conservantes de RNA afetarão o padrão espectral nativo das amostras. Além disso, é aconselhável manusear e armazenar tecido sem qualquer líquido (como soro soro tampão de fosfato) para evitar a elusão de componentes moleculares do tecido para o líquido durante o armazenamento. Idealmente, amostras congeladas frescas ou frescas sem qualquer tratamento são usadas.
2. Preparação de fluidos corporais (soro)
NOTA: Todo esse procedimento é quase idêntico ao usado para tecido sólido. O cartucho para a amostra de fluido está disponível no fabricante. Como a contaminação por gorinteleiros vermelhos (RBCs) pode diminuir consideravelmente a eficiência da aquisição espectral do componente pretendido (plasma ou soro), certifique-se de eliminar todos os RBCs por centrifuging antes das medições.
- Pegue 10 μL da amostra de soro e coloque-a em um microtubo de 1,5 mL.
NOTA: Tanto o soro fresco quanto o armazenado podem ser usados. - Adicione 190 μL de 50% de etanol ao tubo de 1,5 mL, depois vórtice por 2 min à temperatura ambiente.
- Centrífuga o líquido a 15.000 x g por 1-5 min a 4 °C.
- Transfira 10 μL de supernatante para o poço do cartucho.
- Coloque o cartucho na câmara de ionização da máquina e instale a sonda de agulha de aço inoxidável que será usada para ionização amostral (Figura 2).
- Feche firmemente a tampa da câmara para ativar automaticamente o dispositivo de segurança.
- Inicie o computador de bordo clicando no ícone Iniciar para ionizar.
- Descarte o cartucho de amostra e a agulha descritos em 1,10 depois que as medidas forem tomadas.
- Analise os conjuntos obtidos da EIC conforme indicado abaixo (Figura 3).
- Abra o arquivo lcd no navegador de dados.
- Clique em um único pico para exibir o TIC e o EIC.
- Selecione a janela de intervalo para gerar espectros de massa usando o ícone de espectro médio.
- Exporte o arquivo gerado contendo a intensidade m/z e íon de um pico correspondente clicando na guia de exportação no monitor.
NOTA: Este procedimento pode ser aplicado à saliva, urina e outros fluidos corporais também.
3. Preparação para in vivo PESI-MS em organismo vivo
NOTA: Nesta seção, um aplicativo para monitorar o perfil metabólico de 5-Fluoro-2'-deoxyuridina (5-FdU) em um modelo de rato vivo é introduzido. Use condições assépticas por toda parte.
- Infunda 100 μL de 100 mM solução 5-FdU na veia traseira de um rato de 2 meses de idade (aproximadamente 20 g de peso).
NOTA: Não há preferência por sexo, idade ou tensão de rato. Embora este protocolo tenha sido aprovado no momento em que realizamos o experimento5,a viabilidade deste experimento depende das restrições éticas do país em que será realizado. - Anestesiar o rato seguindo seu protocolo de cuidados com animais aprovado. Avalie a profundidade da anestesia pela falta de resposta à beliscar cauda.
NOTA: Se o uso de pentobarbital de sódio não for permitido pelo comitê ético para experimentos animais, métodos alternativos podem ser utilizados, como cloridrato de cetamina. - Raspe a cavidade abdominal usando uma navalha elétrica e aplique pomada veterinária aos olhos.
- Coloque o mouse anestesiado em uma posição supina e fixe as patas na placa de plástico usando fita de reparação. Esfregue o local cirúrgico com esfregões de 70% de álcool três vezes.
- Corte a cavidade abdominal usando tesouras. Primeiro, corte a pele lateralmente (10 mm) de pouco acima do diafragma. Corte lateralmente o músculo da parede abdominal do corpo e do peritôono (ca. 7 mm) e mantenha a ferida aberta usando fio inoxidável para expor a superfície hepática.
NOTA: Não há necessidade de perfundir a superfície do fígado. - Aplique a ponta da agulha da sonda na superfície do fígado. Ajuste a profundidade da agulha para aproximadamente 0,5 mm de profundidade para otimizar a eficiência da ionização, verificando o padrão TIC e espectral simultaneamente. Defina a alta tensão a 2,3 kV e a frequência a 3 Hz na tela do painel de controle.
- Retire o animal da placa de plástico.
- Sutura a ferida usando uma sutura intestinal cirúrgica e devolve o rato para a gaiola. Não deixe o rato desacompanhado até que tenha recuperado a consciência para manter a rerecência severa. Não devolva o rato para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
- Realize o curso de tempo da intensidade do íon no EIC e o procedimento de representação do EIC como em 1.11.1 a 1.11.4.
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Representative Results
Como retratado na Figura 3,os dados obtidos pela técnica PESI-MS são o espectro de massa, cujo m/z varia de 10 a 1.200 neste sistema. Embora se possa detectar moléculas de até m/z 2.000, houve poucos picos obtidos usando essa técnica ao longo da gama de massas de m/z 1.200. Por isso, analisamos picos de m/z 10 a 1.200. Havia grupos conspícuos de picos em torno de m/z 800 e 900; o primeiro representa componentes da membrana celular, como espécies de colina fosfosdílico (PC), e este último representa glicerol triacyl (TAG). A Figura 4 mostra o espectro de massa de um rim humano normal e um carcinoma de célularenal (RCC). Os espectros de massa foram obtidos utilizando-se o método de tecido direto explicado no protocolo 1. Como o rCC tipo de célula clara acumula TAG no citoplasma, um grupo de espectros em torno de m/z 900 é muito pronunciado. O resultado na Figura 4 foi obtido pelo método de extração introduzido na Figura 1 para amostras sólidas.
Como o metabolismo lipídico do carcinoma hepatocelular muda durante a progressão da doença20,é possível monitorar os estágios da doença por biópsia de rotina combinada com pesi-MS. O resultado na Figura 5 retrata as diferenças no padrão espectral entre tecido hepático normal e HCC. Especialmente, há vários espectros notáveis de TAG no HCC. Se a resolução do espectrômetro de massa for superior, é possível que a anotação molecular de cada espectro permita a elucidação do mecanismo molecular do câncer, bem como a fisiologia celular normal.
O monitoramento em tempo real do metabolismo de medicamentos pode ser realizado usando PESI. Em nossos experimentos, a farmacodinâmica do agente anti-oncotic5-FdU foi monitorada acima de 10 s depois de ser injetada através da veia traseira de um rato. A detecção muito rápida de espectros foi observada apenas alguns segundos após a injeção da droga (Figura 6),implicando o rápido transporte da droga através da corrente sanguínea para o fígado. A intensidade dos adutores de sódio de 5-FdU diminuiu com um breve defeito do sinal de íon na gravação em torno de 6-7 s após iniciar a medição. Isso foi devido à profundidade variável da agulha PESI no parenchyma hepático, que foi o resultado de movimentos corporais do camundongo anestesiado. Portanto, é preciso ter cuidado para ajustar a profundidade da agulha PESI para a medição em tempo real dos animais vivos. Não há uma maneira recomendada de encontrar a profundidade ideal da agulha, mas torna-se aparente com a prática.
Amostras de sangue de três indivíduos foram analisadas pelo PESI-MS. Neste caso, 10 μL de soro foi misturado com 190 μL de 50% de etanol e depois utilizado para análise PESI-MS. Embora os padrões espectrais globais pareçam compartilhar vários picos comuns (Figura 7), há muitas diferenças minúsculas no espectro dessas três pessoas. Eles são uma impressão digital de cada pessoa em termos de atividades metabólicas. Para informações detalhadas sobre identidades moleculares, é necessário usar uma máquina high-end. O espectrômetro de massa usado nos experimentos não forneceu uma resolução alta o suficiente para identificar as moléculas.
Se houver contaminação por compostos polímeros, o espectro original na Figura 4 dá origem a picos periódicos e evidentes sobrepostos que borram o espectro da amostra original (Figura 8). Para demonstrar isso experimentalmente, adicionamos o triol de glicerol de polipropileno (PPGT) a 2,5% para reproduzir um caso de contaminação. Quase todos os espectros específicos vistos na Figura 8 foram mascarados pela adição de PPGT.
Figura 1: Visão geral esquemática de um fluxo de preparação de amostras. Para amostras, um cartucho de amostra especializado é ideal para aquisição estável de dados. A análise da amostra líquida é a maneira mais fácil de realizar PESI-MS, simplesmente colocando a solução no cartucho. Existem dois métodos para aplicar este método ao tecido sólido. A aplicação direta do PESI ao tecido é muito fácil e rápida, enquanto o método de extração permite alcançar uma aquisição muito mais estável de espectros, dependendo da espécie amostral. Neste procedimento, uma pequena amostra de tecido é colocada em um microtubo com 100 μL de 50% de etanol e homogeneizada com um micropestle. 10 μL do homogeneizado resultante é então usado para espectrometria de massa. No caso da análise de um animal vivo, 30 μL de 50% de etanol é colocado na superfície sorosal do órgão-alvo, seguido de medição. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Visão geral e componentes básicos do PESI-MS. Um espectrômetro de massa equipado com um módulo PESI. A parte de ionização é instalada em uma câmara fechada onde a inteiça, o suporte da agulha e o suporte de amostra são colocados. A agulha é pronta, e a agulha descartável de aço inoxidável é fixada no suporte da agulha. Ele é definido no espectrômetro de massa logo após colocar o cartucho de amostra na câmara. O ângulo médio da curvatura da agulha é de 400 nm. O cartucho para colocar a amostra é descartável e feito de polímeros plásticos. Tem um pequeno poço para colocar a amostra líquida (seta vermelha). Depois de colocar a amostra sólida no poço, o é dobrado para beliscar a amostra e selar o poço. Para um cartucho de amostra líquida, um diferente é usado que não requer dobramento, e esta é uma versão recomendada que é superior a amostras sólidas. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Interface gráfica do usuário (GUI) para PESI-MS. Todos os procedimentos para geração de espectros de massa do cromromatograma total de íons (TIC) podem ser realizados com o software associado. Após a abertura do arquivo LCD no navegador de dados, o TIC pode ser exibido, e o intervalo de tempo pode ser selecionado para gerar espectros de massa. O espectro de massa gerado pode ser exportado como dados de texto contendo tanto a relação massa-carga (m/z) quanto a intensidade do íon. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Carcinoma de células renais humanas mostra picos característicos de lipídios neutros. Houve picos relativamente fortes no espectro do tecido carcinoma de células renais humanas (RCC) que não foram identificados no tecido não cancerígeno circundante. Esses picos representam principalmente triacylglicerol (TAG) em torno da relação massa-carga(m/z) 900. A aquisição da Spectral foi realizada utilizando-se o modo íon positivo por análise direta. A alta tensão foi definida para 2,3 kV. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: Exemplo de dados adquiridos em tecidos hepáticos normais e carcinoma hepatocelular humano (CcH). O painel superior retrata o espectro de um tecido hepático humano onde uma lesão neoplásica não estava presente, mas de um paciente com hepatite crônica e cirrose hepática. O painel inferior mostra o espectro médio de HCC do mesmo paciente. De relance, enquanto estes dois têm padrões espectrais muito semelhantes, há muitas pequenas diferenças no padrão espectral. A abscissa mostra a relação massa-carga(m/z)e a ordinação retrata a intensidade relativa de cada espectro. A aquisição do espectro foi realizada utilizando-se o modo íon positivo após a extração do tecido, conforme retratado na Figura 2C. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 6: Medições em tempo real do metabolismo de drogas. Mudanças metabólicas em 5-FdU injetadas por via intravenosa no vaso traseiro de um rato. A detecção muito rápida e sensível de 5-FdU com adutor de sódio foi alcançada no fígado in situ. Devido à ionização instável durante a medição, a cessação do sinal pode ser notada em torno de 6-7 s. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 7: Exemplos de dados de três indivíduos. O soro humano de três indivíduos foi analisado usando PESI-MS. Havia diferenças claras nos padrões espectrais entre os indivíduos. Os dados foram obtidos utilizando-se o modo íon positivo. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 8: Compostos polímeros interferem na aquisição precisa de dados. Devido ao surgimento periódico de picos espectrais sobrepostos no espécime original, torna-se difícil interpretar os dados precisamente. Neste caso, o espectro derivado do glicerol tril de polipropileno (PPGT) aparece como uma sobreposição barulhento. Esses compostos, geralmente usados para calibração, mascaram o espectro original do fígado. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
Embora o PESI seja um derivado do ESI para espectrometria de massa4,é mais vantajoso para monitorar metabolômicas em tempo real, bem como para analisar reações bioquímicas sem realizar nenhum pré-tratamento complexo ou demorado5,14,15,17. É uma técnica de espectrometria de massa fácil e instantânea que pode ser aplicada ao estado integrado dos organismos vivos. Como não requer cascatas complexas de pré-tratamento amostral, há uma possibilidade muito maior de avaliar a composição molecular de todo o espécime, pois evitamos qualquer possível perda de espécime que possa ocorrer no ESI convencional, o que requer etapas complexas de pré-tratamento amostral usando grandes quantidades de solventes orgânicos. Portanto, o PESI nos permite obter muito mais informações do espécime se todas as condições forem adequadamente controladas.
Primeiro precisamos mencionar alguns dos aspectos técnicos necessários para obter bons resultados ao considerar a análise PESI-MS. O fator mais crítico no PESI é a manutenção da eficiência da ionização durante a análise. Para isso, é aconselhável ajustar e otimizar a distância entre a ponta da agulha e a superfície da amostra, para gerar um TIC estável, referindo-se ao monitor do computador durante a análise. Para isso, é necessário mudar a profundidade da agulha de forma stepwise para alcançar tic maximal. Como a duração da ionização é relativamente curta em comparação com o ESI, o PESI não é ideal para reprodutibilidade ou quantificação. Em segundo lugar, porque a forma da ponta da agulha desempenha um papel muito importante na ionização, formando um cone Taylor ideal que serve como fonte de íon, deve-se tomar cuidado para não deformar a ponta da agulha. A deformação da ponta pode levar a menor eficiência de ionização.
Embora o PESI seja vantajoso porque pode ser aplicado diretamente a amostras frescas (por exemplo, fígado, rim e cérebro) e organismo vivo sem tratamento especial, é relativamente sensível a outros contaminantes exógenos porque pode ionizar quase todos os componentes contidos em um fluido21,22,23. Ou seja, a desvantagem da vantagem de pular o pré-tratamento amostral significa que o PESI-MS está em desvantagem em várias situações que muitas vezes são encontradas em experimentos biológicos. Como explicado na seção de protocolo, o PESI é sensível à contaminação por conservantes de RNA, aldeídos e compostos polímeros, como os criogels frequentemente usados para preparação histológica. Coágulos sanguíneos podem aderir à agulha PESI e muitas vezes mascaram o espectro pretendido. Além disso, a hemolise dos RBCs libera a hemoglobina, e o íon furado dissociado dá origem a espectros muito mais fortes do que aqueles derivados dos análites pretendidos. Compostos polímeros também dão picos espectrais periódicos que sobrepõem o espectro derivado dos analytes pretendidos, tornando muito mais difícil interpretar os dados reais por causa do ruído (Figura 8). Para evitar quaisquer problemas na aquisição de espectros de massa, é aconselhável seguir nosso protocolo, tomando nota especial de referências à contaminação. Nesse sentido, a aplicação do PESI é limitada em alguns casos.
Outra desvantagem do PESI está em seu processo de ionização relativamente instável, o que exige que ajustemos a profundidade da agulha da sonda aos análites. Além disso, essa técnica pode cobrir uma área muito restrita em uma única análise. Devido ao tamanho muito pequeno da ponta da agulha que é diretamente aplicada ao tecido, a análise PESI-MS não é tão abrangente quanto a análise 2D que pode ser alcançada com uma espectrometria de massa de imagem baseada em MALDI-TOF MS ou imagem baseada em DESI7,8. O PESI pode, no entanto, reconstruir uma imagem da formação hipocampal, embora leve várias horas23 porque a varredura 2D de uma amostra leva muito tempo, principalmente por causa da eficiência instável de ionização desta técnica. Levando isso em consideração, a imagem espectral em massa pelo PESI-MS não é uma aplicação valiosa.
Em relação às propriedades eletroquímicas do PESI, o volume e concentração da amostra que adere à ponta da agulha é fundamental18,pois o efeito de supressão é um pouco atenuado pela redução do tamanho do eletrospray. Considerando que o PESI é a miniaturização do ESI, as amostras devem ser diluídas idealmente para evitar formar um chorume na ponta. Portanto, é necessária a adição de aproximadamente 30 μL de 50% de etanol para alcançar uma ionização eficiente quando o método de tecido direto é empregado(Figura 2B). Isso maximiza a eficiência da ionização e alcança a ionização quase completa das moléculas presas à ponta da agulha.
Escolher o método mais adequado de processamento de dados é muito importante ao usar este sistema24. Quanto à implementação do aprendizado de máquina para qualquer diagnóstico da doença, a construção de um banco de dados é necessária para estabelecer uma referência para classificar ou categorizar doenças7. Por exemplo, usamos a máquina vetorial de suporte ou a regressão logística para fazer um diagnóstico de malignidades hepáticas primárias25.
Pesi-MS é uma técnica versátil e fácil que tem grande potencial para triagem de medicamentos, exames de doping, testes de segurança alimentar de produtos agrícolas26,e alguns testes ambientais. Como esta unidade de ionização é compatível com outros espectrômetros, preparando um anexo para cada instrumento específico, o PESI pode ser aplicado a vários propósitos.
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Disclosures
O autor correspondente foi financiado por Shimadzu, fabricante e fornecedor de instrumentoPESI-MS.
Acknowledgments
Agradecemos a Ayumi Iizuka por operar o PESI-MS e Kazuko Sawa-nobori por sua assistência de secretariado. Agradecemos bronwen Gardner, Ph.D., do Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) por editar um rascunho deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
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