Summary
Dit artikel introduceert monsterbereidingsmethoden voor een unieke real-time analytische methode op basis van de omgevingsmassaspectrometrie. Deze methode stelt ons in staat om real-time analyses uit te voeren van de biologische moleculen in vivo zonder speciale voorbehandelingen.
Abstract
Massaspectrometrie (MS) is een krachtig instrument in de analytische chemie omdat het zeer nauwkeurige informatie biedt over moleculen, zoals massa-ladingsverhoudingen(m/z),die nuttig zijn om moleculaire gewichten en structuren af te leiden. Hoewel het in wezen een destructieve analytische methode, recente vooruitgang in de ambient ionisatie techniek hebben ons in staat gesteld om gegevens te verwerven, terwijl het verlaten van weefsel in een relatief intacte toestand in termen van integriteit. Probe elektrospray ionisatie (PESI) is een zogenaamde directe methode omdat het geen complexe en tijdrovende voorbehandeling van monsters vereist. Een fijne naald dient als monsterpicker, evenals een ionisatiezender. Op basis van de zeer scherpe en fijne eigenschap van de sonde tip, vernietiging van de monsters is minimaal, waardoor we de real-time moleculaire informatie te verwerven van levende dingen in situ. Hierin introduceren we drie toepassingen van PESI-MS techniek die nuttig zullen zijn voor biomedisch onderzoek en ontwikkeling. Een daarvan omvat de toepassing op vast weefsel, dat is de fundamentele toepassing van deze techniek voor de medische diagnose. Aangezien deze techniek vereist slechts 10 mg van het monster, het kan zeer nuttig zijn in de routine klinische instellingen. De tweede toepassing is voor in vitro medische diagnostiek waarbij menselijk bloedserum wordt gemeten. Het vermogen om vloeistofmonsters te meten is ook waardevol in verschillende biologische experimenten waarbij een voldoende hoeveelheid monster voor conventionele analytische technieken niet kan worden verstrekt. De derde toepassing leunt naar de directe toepassing van sondenaalden bij levende dieren, waar we real-time dynamiek van metabolieten of drugs in specifieke organen kunnen verkrijgen. In elke toepassing kunnen we de moleculen afleiden die door MS zijn gedetecteerd of kunstmatige intelligentie gebruiken om een medische diagnose te krijgen.
Introduction
Massaspectrometrie (MS) is een technologische realisatie van reductionisme; het reduceert het analyseobject tot een eenheid die kan worden geïnterpreteerd op basis van moleculaire soorten of cascades. Daarom is het een representatieve methode van analytische chemie. Het bestaat uit vier processen: ionisatie, analyse, detectie en spectrale acquisitie. Omdat ionisatie van het molecuul het eerste proces in massaspectrometrie is, beperkt het over het algemeen de vorm van de te verwerken analyten. De meeste ionisatieprocedures vereisen de vernietiging van de structuur, morfologie en real-time biologische processen van organische monsters. Bijvoorbeeld, elektrospray ionisatie (ESI) MS vereist dat de monsters in een vloeibare toestand voor efficiënte ionisatie1. Monsters moeten daarom door een complex biochemisch preparaat gaan, dat de samenstelling van moleculen verandert. Als alternatief, terwijl matrix-assisted laser desorptie ionisatie (MALDI) MS moleculaire kaarten van dun gesectioneerd weefsel2,3kan reconstrueren, is de ionisatie-efficiëntie te laag om alle moleculen in de monsters te detecteren, en het is bijzonder slecht in het analyseren van vetzuren. Gezien deze beperkingen kan sondeelektrosprayionisatie (PESI)4 worden gebruikt om de real-time veranderingen in biologische systemen in situ waar te nemen zonder de structurele integriteit te vernietigen5, terwijl het biologische organisme dat wordt waargenomen technisch in levende staat is. Een zeer fijne naald wordt gebruikt in dit geval die gelijktijdig dient als een monster picker en een ionenzender. Dit betekent dat de complexe monstervoorbehandelingssequenties kunnen worden omzeild om massaspectra te verkrijgen die de moleculaire componenten van het levende systeem in situ weerspiegelen.
Er zijn verschillende andere ionisatiemethoden die wedijveren met PESI-MS. Een daarvan is snelle verdampingsionisatie massaspectrometrie (REIMS)6. Deze techniek werkt goed tijdens de operatie, omdat het is gemonteerd met een elektrisch mes en verzamelt de ionenpluim gegenereerd tijdens incisie. Terwijl REIMS is zeer nuttig voor de operatie, het is in wezen een destructieve methode die de elektrische ablatie van het weefsel vereist. Daarom is het niet nuttig voor de gedetailleerde analyse van cellen en weefsels in een preparatief monster of in laboratoriumanalyses. Bovendien, omdat het verzamelt een grote hoeveelheid pluim met weefselpuin, het vereist langdurig onderhoud van de apparaten na elk gebruik, waardoor het gebruik van deze machine te beperken tot speciale chirurgische ingrepen. Een soortgelijke methode, genaamd laser desorptie ionisatie massaspectrometrie (LDI-MS)7, is een andere techniek die niet-invasief en nuttig voor het oppervlak analyse. Omdat deze techniek goed is in het scannen van het oppervlak van een monster, bereikt het uitgebreide tweedimensionale analyse zoals MALDI imaging massaspectrometrie8,9. Omdat LDI-MS echter alleen van toepassing is op de oppervlakteanalyse, is PESI-MS voordelig voor het analyseren van de monsters, bijvoorbeeld binnen het weefsel. Een andere techniek, de MasSpec Pen10, werd gemeld om een hoge specificiteit en gevoeligheid te bereiken bij de diagnose van schildklierkanker, maar de diameter van de sonde is in de orde van mm en het is specifiek voor de oppervlakte-analyse, wat betekent dat het niet kan detecteren kleine knobbeltjes van kanker of diep gelokaliseerde laesies. Aangezien deze methode gebruik maakt van een microcapillary flow canal ingebed in de sondepen, moet bovendien rekening worden gehouden met kruisbesmetting, vergelijkbaar met LDI-MS. Andere technieken bestaan die zijn toegepast op klinische instellingen, zoals de stroom sonde en ionisatie vorm swab11, maar ze zijn niet wijdverbreid.
PESI is extreme miniaturisatie van ESI, waarin de capillaire van de nano-elektrospray convergeert op een vaste naald met een tip kromming straal van enkele honderden nm. Ionisatie vindt plaats in het uiterst beperkte gebied van de naaldtip door een Taylor-kegel te vormen, waarop monsters blijven totdat de ionisatie van alle vloeistof op de punt is voltooid12. Als de analyt op de punt van de metalen naald blijft, wordt de overbelasting continu gegenereerd op de interface tussen de metalen naald en de analyten. Daarom vindt sequentiële ionisatie van moleculen plaats, afhankelijk van hun oppervlakteactiviteit. Deze eigenschap maakt de naald tip een soort chromatogram, het scheiden van de analyten, afhankelijk van hun oppervlakteactiviteit. Meer technisch, moleculen met de sterkere oppervlakteactiviteit komen aan het oppervlak van de Taylor kegel en worden geïoniseerd eerder dan die met een zwakkere oppervlakteactiviteit, die zich hechten aan het oppervlak van de naald tot het einde van het ionisatieproces. Zo wordt volledige ionisatie van alle moleculen die door de naald worden opgepikt bereikt13. Bovendien, omdat deze techniek niet de toevoeging van overbodig oplosmiddel aan het monster impliceert, volstaan enkele honderden femtoliters om massaspectra sterk genoeg te krijgen voor verdere analyse14. Deze eigenschappen zijn gunstig voor de analyse van intacte biologische monsters. Een groot nadeel van PESI-MS ligt echter in de discontinuïteit in ionisatie vanwege de wederkerige beweging van de naald langs de verticale as, vergelijkbaar met een zaagmachine. Ionisatie vindt alleen plaats wanneer de punt van de sonde het hoogste punt bereikt wanneer de hoogte van de ionenopening op de horizontale as is uitgelijnd. Ionisatie stopt terwijl de naald monsters oppikt, en dus is de stabiliteit van ionisatie niet gelijk aan die in conventionele ESI. Daarom is PESI-MS geen ideale methode voor proteomics.
Tot op heden is PESI-MS voornamelijk toegepast op de analyse van biologische systemen, die een breed scala aan gebieden bestrijken, van fundamenteel onderzoek tot klinische instellingen. Bijvoorbeeld, de directe analyse van menselijk weefsel voorbereid tijdens de operatie was in staat om de accumulatie van triacylglycerol onthullen in zowel niercel carcinoom15 en faryngeal plaveiselcarcinoom16. Deze methode kan ook vloeibare monsters, zoals bloed, meten om zich te concentreren op het lipideprofiel. Sommige moleculen zijn bijvoorbeeld afgebakend tijdens veranderingen in het dieet bij konijnen; er werd gemeld dat sommige van deze moleculen in zeer vroeg stadium van de experimenten afdaalden, wat wijst op de hoge gevoeligheid en het nut van dit systeem voor klinische diagnose17. Bovendien, directe toepassing op een levend dier toegestaan de detectie van biochemische veranderingen van de lever na slechts een nacht van vasten5. Zaitsu et al.18 revisited dit experiment5 en analyseerde de metabole profielen van de lever op bijna dezelfde manier, met resultaten die de stabiliteit en reproduceerbaarheid van onze oorspronkelijke methode versterkt. Bovendien waren we in staat om het kankerweefsel te discrimineren van omliggende niet-kankerlever bij muizen met behulp van deze techniek19. Daarom is dit een veelzijdige massaspectrometrietechniek die nuttig is in verschillende omgevingen, zowel in vivo als in vitro. Vanuit een ander oogpunt kan de PESI-module worden gemaakt om verschillende massaspectrometers te passen door de montagebevestiging aan te passen. In dit korte artikel introduceren we de basisprincipes en voorbeelden van toepassingen (figuur 1),inclusief toepassingen met levende dieren5.
Volgens de verordeningen en wetten in elk land moeten delen van dit protocol worden herzien om aan de criteria van elke instelling te voldoen. Toepassing op het levende organisme is de meest interessante en uitdagende omdat het biochemische of metabole veranderingen in weefsels of organen in levende dieren in situ kan bieden. Hoewel deze aanvraag werd goedgekeurd door het institutioneel comité voor dierverzorging aan de Universiteit van Yamanashi, zal in 20135,een nieuwe goedkeuringsronde nodig zijn vanwege recente wijzigingen in de regelgeving voor de dierproeven. Verschillende wijzigingen in de experimentele regeling zijn daarom aan te raden. Met betrekking tot de massaspectra verkregen in experimenten, rekening houdend met de schommelingen van massaspectra tussen elke meting, is er geen spectrale informatie-uitwisseling systeem dat gemeenschappelijk is voor de nucleotide sequencing gemeenschap. Er moet voor worden gezorgd wanneer de bediener de naald hanteert om ongevallen met de naaldprik te voorkomen, vooral bij het verwijderen van de naaldhouder. Een speciaal apparaat voor het losmaken van de naald is hiervoor zeer nuttig. Aangezien het compartiment van de PESI-module een luchtdichte, gesloten kamer is, treedt lekkage van de ionenpluim niet op als de massaspectrometer volgens de instructies wordt bediend.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het institutioneel comité voor dierverzorging aan de Universiteit van Yamanashi keurde alle protocollen en het gebruik van proefdieren goed die hierin worden vermeld. Menselijk monster gebruik werd goedgekeurd door de institutionele ethiek raad van de Universiteit van Yamanashi.
1. Vaste weefselbereiding
OPMERKING: Monsters moeten na verwijdering uit het dier of het menselijk lichaam op ijs worden gehouden om de versheid van het weefsel te behouden. Als metingen niet onmiddellijk volgen op dissectie, wordt het aanbevolen om weefsel op -80 °C op te slaan. Het is niet raadzaam om het weefsel in enige vorm van buffer of zout, omdat ze bepaalde inhoud uit het weefsel kunnen extraheren. Weefsel dat is vastgesteld met aldehyden of ingebed in paraffine/wax of cryogel is niet geschikt voor MS-metingen.
- Snijd het weefselmonster tot ongeveer 2 x 2 x 2 mm met behulp van een scalpel of mes. U ook het monster eruit slaan met een trepan (een wegwerpbiopsiestoot, boring smet 3 mm) die wordt gebruikt voor het huidonderzoek. Knip in dit geval de lengte van de kolom tot 2 mm.
OPMERKING: Elk weefsel kan worden geanalyseerd met behulp van deze methode. In dit experiment, lever15 en nier19, zijn met succes geanalyseerd om massaspectra te verkrijgen. Over het algemeen geven parenchymale organen goede massaspectra, terwijl die vezelige componenten niet hebben. - Als het weefsel is besmet met bloed, was kort met ijskoude fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
OPMERKING: Om de postmortem weefselschade te minimaliseren, voltooit u deze stap zo snel mogelijk bij kamertemperatuur. Als metingen niet onmiddellijk worden uitgevoerd, u het weefsel invloeibare stikstof bevriezen en opslaan bij -80 °C. - Plaats het gesneden of uitgeponsde monster (ongeveer 10 mg) in een plastic microbuis en voeg 100 μL van 50% ethanol toe.
OPMERKING: Het exacte gewicht van de monsters wordt niet bepaald omdat de massaspectrometrie die in dit systeem wordt gebruikt geen kwantitatieve gegevens levert. Ongeveer 10 mg is optimaal voor het parenchymale weefsel. - Homogeniseren van het monster met behulp van een micropestle.
- Plaats 10 μL van het homogenalaat in de put van de cartridge (figuur 2).
- Plaats de cartridge in de ionisatiekamer van de massaspectrometer en installeer de roestvrijstalen naaldsonde die zal worden gebruikt voor de monsterionisatie (figuur 2).
LET OP: Sondenaalden worden geleverd door de fabrikant. Ze zijn gemaakt van roestvrij staal en hebben een krommingsstraal van ongeveer 400 nm. - Sluit het deksel stevig om de veiligheidsvoorziening automatisch te activeren.
- Start de boordcomputer door op het pictogram Start te klikken om te analyseren. Breng met behulp van de panelen op het scherm een spanning van 2,3 kV aan op de naald om de elektrospray te genereren en zorg ervoor dat de frequentie van de naald 3 Hz is.
- Wacht tot 30 s voor de meting is voltooid.
OPMERKING: De sessie wordt automatisch beëindigd wanneer de gegevensacquisitie is voltooid. De kwaliteit van de analyse wordt bewaakt door een totaal ionchromatogram (TIC). De meettijd wordt gedefinieerd om de representatieve massaspectra te verkrijgen en kan worden verkort of verlengd. - Gooi de cartridge en naald in een biohazard disposer na het meten van elk monster.
OPMERKING: Er kan slechts één monster tegelijk worden gemeten. Het is niet nodig om de machine vóór elke meting te kalibreren; kalibratie is afhankelijk van de regelmatige controle door de leverancier eens in de zes maanden. - Analyseer de massaspectra en exporteer de massaspectrale tekstgegevens met behulp van de software die is gekoppeld aan de massaspectrometer (zie Tabel met materialen)zoals vermeld in de onderstaande stappen (figuur 3).
- Klik op het lcd-bestand in het browservenster van het gegevensbestand van de software.
- Kies en klik op een enkele piek op het massaspectrumvenster en om automatisch een geëxtraheerd ionchromatogram (EIC) weer te geven.
- Controleer de TIC en EIC en klik op het gemiddelde spectrumpictogram om het tijdbereikvenster te selecteren voor het genereren van het massaspectrum.
OPMERKING: In deze analyse worden de doelmoleculen weergegeven in het venster mass-to-charge(m/z)(figuur 3). Bovendien, omdat de duur van de ionisatie per enkele naaldbeweging zeer kort is, zijn alle verkregen massaspectra in wezen gemiddeld spectra over 10 s (300 scans). - Een tekstbestand genereren met m/z- en ionenintensiteit door op het tabblad Exporteren te klikken voor verdere analyse. Dit tekstbestand kan in elke map worden opgeslagen.
OPMERKING: Alle RNA-conserveermiddelen hebben invloed op het oorspronkelijke spectrale patroon van monsters. Bovendien is het raadzaam om weefsel zonder vloeistof (zoals fosfaatgebufferde zoutoplossing) te hanteren en op te slaan om de elutie van moleculaire componenten uit het weefsel in de vloeistof tijdens de opslag te voorkomen. Idealiter worden verse of verse bevroren monsters zonder enige behandeling gebruikt.
2. Lichaamsvloeistoffen (serum) bereiding
OPMERKING: Deze hele procedure is bijna identiek aan die gebruikt voor vast weefsel. De cartridge voor het vloeistofmonster is verkrijgbaar bij de fabrikant. Omdat de besmetting door rode bloedcellen (RBC's) de efficiëntie van de spectrale verwerving van de beoogde component (plasma of serum) sterk kan verminderen, moet u alle RBC's elimineren door vóór metingen te centrifugeren.
- Neem 10 μL van het serummonster en stop het in een microbuis van 1,5 mL.
LET OP: Zowel vers als opgeslagen serum kunnen worden gebruikt. - Voeg 190 μL van 50% ethanol toe aan de 1,5 mL buis en vortex gedurende 2 min bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de vloeistof op 15.000 x g gedurende 1-5 min bij 4 °C.
- Breng 10 μL supernatant over in de put van de cartridge.
- Plaats de cartridge in de ionisatiekamer van de machine en installeer de roestvrijstalen naaldsonde die zal worden gebruikt voor monsterionisatie (figuur 2).
- Sluit het deksel stevig om de veiligheidsvoorziening automatisch te activeren.
- Start de boordcomputer door op het pictogram Start te klikken om te ioniseren.
- Gooi de monsterpatroon en -naald zoals beschreven in 1.10 weg zodra metingen zijn verricht.
- Analyseer de verkregen sets EIC zoals hieronder vermeld (figuur 3).
- Open het lcd-bestand in de gegevensbrowser.
- Klik op een enkele piek om de TIC en EIC weer te geven.
- Selecteer het tijdsbereikvenster voor het genereren van massaspectra met behulp van het gemiddelde spectrumpictogram.
- Exporteer het gegenereerde bestand met zowel de m/z- als de ionenintensiteit van een overeenkomstige piek door op het tabblad Exporteren op de monitor te klikken.
OPMERKING: Deze procedure kan worden toegepast op speeksel, urine, en andere lichaamsvloeistoffen ook.
3. Bereiding van in vivo PESI-MS in levend organisme
OPMERKING: In deze sectie wordt een aanvraag geïntroduceerd om het metabolische profiel van 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) in een levend muismodel te monitoren. Gebruik aseptische aandoeningen overal.
- Breng 100 μL van 100 mM 5-FdU-oplossing in de staartader van een 2 maanden oude muis (ongeveer 20 g gewicht).
OPMERKING: Er is geen voorkeur voor geslacht, leeftijd of muisstam. Hoewel dit protocol werd goedgekeurd op het moment dat we het experiment5hebben uitgevoerd, hangt de haalbaarheid van dit experiment af van de ethische beperkingen van het land waar het zal worden uitgevoerd. - Verdoven de muis volgens uw goedgekeurde dierverzorgingprotocol. Beoordeel de diepte van anesthesie door het gebrek aan reactie op staartknijpen.
OPMERKING: Als het gebruik van natriumpentobarbital niet is toegestaan door het ethische comité voor dierproeven, kunnen alternatieve methoden worden gebruikt, zoals ketaminehydrochloride. - Scheer de buikholte met behulp van een elektrisch scheermes en breng vetzalf aan op de ogen.
- Zet de verdoofde muis in een supine positie en bevestig de poten op de plastic plaat met behulp van herstellentape. Scrub de chirurgische site met scrubs van 70% alcohol drie keer.
- Snijd de buikholte open met een schaar. Snijd eerst de huid zijdenaal (10 mm) van net boven het middenrif. Lateraal snijd de spier van de buikwand en buikvlies (ca. 7 mm) en houd de wond open met behulp van roestvrije draad om het leveroppervlak bloot te leggen.
LET OP: Het is niet nodig om het oppervlak van de lever te bezielen. - Breng de punt van de sondenaald aan op het oppervlak van de lever. Pas de diepte van de naald aan op ongeveer 0,5 mm diep om de ionisatie-efficiëntie te optimaliseren en tegelijkertijd het TIC- en spectrale patroon te controleren. Stel de hoogspanning in op 2,3 kV en frequentie op 3 Hz op het scherm van het bedieningspaneel.
- Haal het dier van de plastic plaat.
- Hecht de wond met behulp van een chirurgische darmhechting en breng de muis terug naar de kooi. Laat de muis niet onbeheerd achter totdat hij weer bij bewustzijn is gekomen om de strengheid te behouden. Breng de muis pas terug naar het gezelschap van andere dieren als hij volledig is hersteld.
- Voer de tijdscursus ionenintensiteit uit in EIC en de procedure van EIC-weergave als in 1.11.1 tot 1.11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals afgebeeld in figuur 3, zijn de gegevens verkregen door pesi-ms-techniek de massaspectra, waarvan de m/z in dit systeem varieert van 10 tot 1.200. Terwijl men moleculen tot m/z 2.000 kan ontdekken, waren er weinig pieken verkregen met behulp van deze techniek over het massabereik van m/z 1.200. Daarom analyseerden we pieken van m/z 10 tot 1.200. Er waren opvallende groepen pieken rond m/z 800 en 900; de eerste vertegenwoordigt celmembraan componenten, zoals fosphatidyl choline (PC) soorten, en de laatste vertegenwoordigt triacyl glycerol (TAG). Figuur 4 toont de massaspectra van een normale menselijke nier en een niercelcareloom (RCC). De massaspectra werden verkregen met behulp van de directe weefselmethode uitgelegd in protocol 1. Omdat het duidelijke celtype RCC TAG in het cytoplasma accumuleert, is een groep spectra rond m/z 900 zeer uitgesproken. Het resultaat in figuur 4 werd verkregen door de extractiemethode die in figuur 1 voor vaste monsters werd ingevoerd.
Omdat het lipidemetabolisme van hepatocellulair carcinoma verandert tijdens de ziekteprogressie20,is het mogelijk om de stadia van de ziekte te controleren door routinematige biopsie in combinatie met PESI-MS. Het resultaat in figuur 5 toont de verschillen in spectrale patroon tussen normaal leverweefsel en HCC. Vooral zijn er verschillende opmerkelijke spectra van TAG in HCC. Als de resolutie van de massaspectrometer superieur is, is het mogelijk dat de moleculaire annotatie van elk spectrum de opheldering van het moleculaire mechanisme van kanker en de normale cellulaire fysiologie mogelijk maakt.
Real-time monitoring van de drug metabolisme kan worden uitgevoerd met behulp van PESI. In onze experimenten werd de farmacodynamica van het anti-oncotische middel 5-FdU gedurende 10 s gecontroleerd nadat ze door de staartader van een muis waren geïnjecteerd. Zeer snelle detectie van spectra werd waargenomen slechts een paar seconden na het injecteren van de drug (Figuur 6), wat impliceert het snelle vervoer van het geneesmiddel via de bloedbaan naar de lever. De intensiteit van de natriumadducten van 5-FdU nam af met een kort defect van het ionensignaal in de opname rond 6-7 na het starten van de meting. Dit was vanwege de variërende diepte van de PESI naald in de lever parenchyma, die het resultaat was van bewegingen van het lichaam van de verdoofde muis. Daarom moet ervoor worden gezorgd dat de diepte van de PESI-naald wordt aangepast voor de real-time meting van levende dieren. Er is geen aanbevolen manier om de optimale diepte van de naald te vinden, maar het wordt duidelijk met de praktijk.
Bloedmonsters van drie personen werden geanalyseerd door PESI-MS. In dit geval werd 10 μL serum gemengd met 190 μL van 50% ethanol en vervolgens gebruikt voor PESI-MS-analyse. Hoewel de algemene spectrale patronen een aantal gemeenschappelijke pieken lijken te delen(figuur 7),zijn er veel minieme verschillen in de spectra van deze drie mensen. Ze zijn een vingerafdruk van elke persoon in termen van metabole activiteiten. Voor gedetailleerde informatie over moleculaire identiteiten is het noodzakelijk om een high-end machine te gebruiken. De massaspectrometer die in de experimenten werd gebruikt, leverde geen hoge resolutie op om de moleculen te identificeren.
Als er sprake is van verontreiniging door polymeerverbindingen, geven de oorspronkelijke spectra in figuur 4 aanleiding tot bedekte periodieke en opvallende pieken die de spectra uit het oorspronkelijke monster vervagen (figuur 8). Om dit experimenteel aan te tonen, hebben we polypropyleen glycerol triol (PPGT) toegevoegd aan 2,5% om een geval van besmetting te reproduceren. Bijna alle specifieke spectra in figuur 8 werden gemaskeerd door de toevoeging van PPGT.
Figuur 1: Schematisch overzicht van een monstervoorbereidingsstroom. Voor monsters is een gespecialiseerde monstercartridge ideaal voor stabiele gegevensverwerving. Vloeibare monsteranalyse is de eenvoudigste manier om PESI-MS uit te voeren, door simpelweg de oplossing in de cartridge te plaatsen. Er zijn twee methoden voor het toepassen van deze methode op vast weefsel. De directe toepassing van PESI op het weefsel is zeer eenvoudig en snel, terwijl de extractiemethode het mogelijk maakt om een veel stabielere verwerving van spectra te bereiken, afhankelijk van de monstersoort. In deze procedure wordt een klein stukje van het weefselmonster in een microbuis met 100 μL van 50% ethanol geplaatst en gehomogeniseerd met een micropesterij. 10 μL van het resulterende homogenalaat wordt vervolgens gebruikt voor massaspectrometrie. Bij het analyseren van een levend dier wordt 30 μL ethanol van 50% ethanol op het serosale oppervlak van het doelorgaan geplaatst, gevolgd door meting. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Overzicht en basiscomponenten van PESI-MS. Een massaspectrometer uitgerust met een PESI module. Het ionisatiegedeelte is geïnstalleerd in een gesloten kamer waar de ioneninlaat, naaldhouder en monsterhouder worden geplaatst. De naald is kant-en-klaar en de wegwerp roestvrijstalen naald is bevestigd aan de naaldhouder. Het is ingesteld in de massaspectrometer net na het plaatsen van de monstercartridge in de kamer. De gemiddelde krommingshoek van de naald is 400 nm. De cartridge voor het plaatsen van het monster is wegwerpbaar en gemaakt van plastic polymeren. Het heeft een kleine put voor het plaatsen van het vloeibare monster (rode pijl). Na het in de put zetten van het vaste monster wordt de cassette gevouwen om het monster te knijpen en de put af te sluiten. Voor een vloeibare monstercartridge wordt een andere gebruikt die niet hoeft te worden gevouwen, en dit is een aanbevolen versie die superieur is aan vaste monsters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Grafische gebruikersinterface (GUI) voor PESI-MS. Alle procedures voor het genereren van massaspectra uit het totale ionchromatogram (TIC) kunnen worden uitgevoerd met de bijbehorende software. Na het openen van het lcd-bestand in de gegevensbrowser kan de TIC worden weergegeven en kan het tijdsbereik worden geselecteerd voor het genereren van massaspectra. De gegenereerde massaspectra kunnen worden geëxporteerd als tekstgegevens die zowel de massa-ladingverhouding(m/z)als de ionenintensiteit bevatten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Menselijk niercelcareloom vertoont karakteristieke pieken van neutrale lipiden. Er waren relatief sterke pieken in de spectra van menselijk niercelcareloomweefsel (RCC) die niet werden geïdentificeerd in het omringende niet-kankerweefsel. Deze pieken vertegenwoordigen voornamelijk triacylglycerol (TAG) rond mass-to-charge ratio(m/z) 900. Spectrale acquisitie werd uitgevoerd met behulp van de positieve ionenmodus door middel van directe analyse. De spanning werd ingesteld op 2,3 kV. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Voorbeeld van gegevens verkregen in normale leverweefsels en menselijke hepatocellulair carcinoma (HCC). Het bovenste paneel toont de spectra van een menselijk leverweefsel waar een neoplastische laesie niet aanwezig was, maar van een patiënt met chronische hepatitis en levercirrose. Het onderste paneel toont de gemiddelde spectra van HCC van dezelfde patiënt. In één oogopslag, terwijl deze twee zeer vergelijkbare spectrale patronen hebben, zijn er veel kleine verschillen in spectrale patroon. De abscissa toont de mass-to-charge ratio(m/z)en de ordinate toont de relatieve intensiteit van elk spectrum. De verwerving van spectra werd uitgevoerd met behulp van de positieve ionenmodus na het extraheren van het weefsel, zoals afgebeeld in figuur 2C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Real-time metingen van de drugsstofwisseling. Metabole veranderingen in 5-FdU geïnjecteerd intraveneus in het staartvat van een muis. Zeer snelle en gevoelige detectie van 5-FdU met natriumadduct werd bereikt in de lever in situ. Vanwege onstabiele ionisatie tijdens de meting, stopzetting van het signaal kan worden opgemerkt op ongeveer 6-7 s. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: Voorbeelden van gegevens van drie personen. Menselijk serum van drie individuen werd geanalyseerd met BEHULP van PESI-MS. Er waren duidelijke verschillen in de spectrale patronen onder de individuen. Gegevens werden verkregen met behulp van de positieve ionenmodus. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: Polymeerverbindingen verstoren nauwkeurige gegevensverwerving. Door de periodieke opkomst van spectrale pieken die op het oorspronkelijke exemplaar zijn bedekt, wordt het moeilijk om de gegevens nauwkeurig te interpreteren. In dit geval verschijnen de spectra afkomstig van polypropyleen triol glycerol (PPGT) als een luidruchtige overlay. Die verbindingen, meestal gebruikt voor kalibratie, maskeren de originele spectra uit de lever. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel PESI een afgeleide is van ESI voor massaspectrometrie4, is het het meest voordelig voor het monitoren van real-time metabolomica, evenals voor het analyseren van biochemische reacties zonder complexe of tijdrovende voorbehandelingenuit tevoeren 5,14,15,17. Het is een eenvoudige en onmiddellijke massaspectrometrie techniek die kan worden toegepast op de geïntegreerde toestand van levende organismen. Aangezien er geen complexe cascades van voorbehandelingen van monsters nodig zijn, is er een veel grotere mogelijkheid om de moleculaire samenstelling van het gehele monster te beoordelen, omdat we mogelijk verlies van specimen voorkomen dat kan optreden in conventionele ESI, wat complexe stappen van monstervoorbehandelingen met grote hoeveelheden organische oplosmiddelen vereist. Daarom stelt PESI ons in staat om veel meer informatie uit het monster te verkrijgen als alle omstandigheden op de juiste manier worden gecontroleerd.
We moeten eerst enkele van de technische aspecten vermelden die nodig zijn om goede resultaten te behalen bij het overwegen van pesi-ms-analyses. De meest kritische factor in PESI is het behoud van ionisatie-efficiëntie tijdens de analyse. Om dit te bereiken, is het raadzaam om de afstand tussen de punt van de naald en het monsteroppervlak aan te passen en te optimaliseren, om een stabiele TIC te genereren door tijdens de analyse naar de computermonitor te verwijzen. Om dit te doen, is het noodzakelijk om de diepte van de naald op een stapsgewijze manier te veranderen om maximale TIC te bereiken. Omdat de duur van ionisatie relatief kort is in vergelijking met ESI, is PESI niet ideaal voor reproduceerbaarheid of kwantificering. Ten tweede, omdat de vorm van de naaldtip een zeer belangrijke rol speelt in de ionisatie door een ideale Taylor-kegel te vormen die als ionenbron dient, moet ervoor worden gezorgd dat de naaldpunt niet wordt vervormen. Vervorming van de tip kan leiden tot een lagere ionisatie-efficiëntie.
Hoewel PESI voordelig is omdat het direct kan worden toegepast op verse monsters (bijvoorbeeld lever, nieren en hersenen) en levend organisme zonder speciale behandeling, is het relatief gevoelig voor andere exogene verontreinigingen omdat het bijna alle componenten in een vloeistof21,22,23kan ioniseren. Dat wil zeggen, de keerzijde van het voordeel van het overslaan van monster voorbehandeling betekent dat PESI-MS is in het nadeel in verschillende situaties die vaak worden aangetroffen in biologische experimenten. Zoals uitgelegd in de protocolsectie is PESI gevoelig voor besmetting door RNA-conserveringsmiddelen, aldehyden en polymeerverbindingen zoals de cryogels die vaak worden gebruikt voor histologische bereiding. Bloedstolsels kunnen zich hechten aan de PESI naald en vaak maskeren de beoogde spectra. Bovendien bevrijdt hemolyse van RBCs hemoglobine, en de gescheiden fretion geeft aanleiding tot veel sterkere spectra dan die welke zijn afgeleid van de beoogde analyten. Polymeerverbindingen geven ook periodieke spectrale pieken die de spectra bedekken die afkomstig zijn van de beoogde analyten, waardoor het veel moeilijker wordt om de werkelijke gegevens te interpreteren vanwege het geluid (figuur 8). Om problemen bij de aanschaf van massaspectra te voorkomen, is het raadzaam om ons protocol te volgen en speciale aandacht te besteden aan verwijzingen naar de besmetting. In dit verband is de toepassing van PESI in sommige gevallen beperkt.
Een ander nadeel van PESI ligt in het relatief onstabiele ionisatieproces, dat ons vereist om de diepte van de sondenaald aan de analyten aan te passen. Bovendien kan deze techniek een zeer beperkt gebied in één analyse bestrijken. Vanwege de zeer kleine omvang van de naaldpunt die direct op het weefsel wordt aangebracht, is pesi-MS-analyse niet zo uitgebreid als de 2D-analyse die kan worden bereikt met een MALDI-TOF MS-gebaseerde beeldvormingsmassaspectrometrie of DESI-gebaseerde beeldvorming7,8. PESI kan echter een beeld van de hippocampalformatie reconstrueren, hoewel het enkele uren23 duurt omdat het 2D-scannen van een monster lang duurt, vooral vanwege de onstabiele ionisatie-efficiëntie van deze techniek. Rekening houdend met dit, massa spectrale beeldvorming door PESI-MS is niet een waardevolle toepassing.
Met betrekking tot de elektrochemische eigenschappen van PESI, het volume en de concentratie van het monster dat zich aan de naald tip hecht is kritiek18, als de onderdrukking effect is enigszins verzwakt door inkrimping van de elektrospray grootte. Gezien het feit dat PESI is miniaturisatie van ESI, monsters moeten idealiter worden verdund om te voorkomen dat de vorming van een drijfmest op de tip. Daarom is de toevoeging van ongeveer 30 μL van 50% ethanol noodzakelijk om een efficiënte ionisatie te bereiken wanneer de directe weefselmethode wordt gebruikt (figuur 2B). Dit maximaliseert de ionisatie-efficiëntie en bereikt bijna volledige ionisatie van de moleculen die aan de punt van de naald zijn bevestigd.
Het kiezen van de meest geschikte methode voor gegevensverwerking is erg belangrijk bij het gebruik van dit systeem24. Wat de toepassing van machine learning voor een ziektediagnose betreft, is de bouw van een databank noodzakelijk om een referentie vast te stellen voor het classificeren of categoriseren van ziekten7. We hebben bijvoorbeeld de ondersteuningsvectormachine of logistieke regressie gebruikt om een diagnose te stellen van primaire leververguisme25.
PESI-MS is een veelzijdige en eenvoudige techniek die een groot potentieel heeft voor drugsscreening, dopingtests, voedselveiligheidstests van landbouwproducten26en sommige milieutests. Omdat deze ionisatie-eenheid compatibel is met andere spectrometers door een bevestiging voor elk specifiek instrument voor te bereiden, kan PESI op verschillende doeleinden worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De overeenkomstige auteur werd gefinancierd door Shimadzu, een fabrikant en leverancier van PESI-MS instrument.
Acknowledgments
Wij danken Ayumi Iizuka voor de exploitatie van de PESI-MS en Kazuko Sawa-nobori voor haar secretariële hulp. Wij danken Bronwen Gardner, Ph.D., van Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) voor het bewerken van een ontwerp van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
