Summary
מאמר זה מציג שיטות הכנה לדוגמה עבור שיטה אנליטית ייחודית בזמן אמת המבוססת על ספקטרומטר מסה סביבתי. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע ניתוח בזמן אמת של המולקולות הביולוגית בvivo ללא כל טיפול מיוחד.
Abstract
ספקטרומטר מסה (MS) הוא כלי רב עוצמה בכימיה אנליטית משום שהוא מספק מידע מדויק מאוד על מולקולות, כגון יחס מסה-לתשלום (m/z), אשר שימושיים להסיק משקולות ומבנים מולקולריים. בעוד שזוהי ביסודו שיטה אנליטית הרסנית, הפיתוחים האחרונים בטכניקת הסביבה הסביבתית אפשרו לנו לרכוש נתונים תוך השארת רקמות במצב שאינו שלם יחסית במונחים של יושרה. (PESI) הוא שיטה ישירה שנקראת כביכול, משום שהיא אינה דורשת טיפול מורכב וארוך-זמן של דגימות. מחט עדינה משמשת כבוחר לדוגמא, כמו גם פולט אינון. בהתבסס על המאפיין החריף והעדין של המכשיר, השמדת הדגימות היא מינימלית, המאפשרת לנו לרכוש מידע מולקולרי בזמן אמת מיצורים חיים באתרו. בזאת, אנו מציגים שלושה יישומים של טכניקת PESI-MS שיהיה שימושי עבור מחקר ופיתוח ביו-רפואי. אדם כרוך ביישום לרקמה מוצקה, שהיא היישום הבסיסי של טכניקה זו לאבחנה הרפואית. כמו טכניקה זו דורשת רק 10 מ"ג של המדגם, זה עשוי להיות מאוד שימושי הגדרות קליניות שגרתית. היישום השני הוא לאבחון רפואי מתורבת שבו סרום דם אנושי נמדד. היכולת למדוד דגימות נוזלים הוא גם בעל ערך בניסויים ביולוגיים שונים בהם נפח מספיק של מדגם עבור טכניקות אנליטיות קונבנציונאלי לא ניתן לספק. האפליקציה השלישית נשענת לעבר היישום הישיר של מחטי המחקר בבעלי חיים חיים, שם נוכל להשיג דינמיקה בזמן אמת של מטבוליטים או סמים באיברים ספציפיים. בכל יישום, אנו יכולים להסיק את המולקולות שזוהו על ידי MS או להשתמש באינטליגנציה מלאכותית כדי לקבל אבחנה רפואית.
Introduction
ספקטרומטר מסה (MS) הוא מימוש טכנולוגי של הרדונות; היא מקטינה את מטרת הניתוח ליחידה שניתן לפרש על בסיס מינים מולקולריים או מפלים. לכן, זוהי שיטה ייצוגית לכימיה אנליטית. הוא מורכב מארבעה תהליכים: אינון, ניתוח, גילוי ורכישה ספקטרלית. מכיוון שיינון של המולקולה הוא התהליך הראשון בספקטרומטר מסה, הוא בדרך כלל מגביל את צורת האנליטים שיעובדו. רוב ההליכים האינון דורשים השמדת מבנה, מורפולוגיה ותהליכים ביולוגיים בזמן אמת של דגימות אורגניות. לדוגמה, בתרסיס אלקטרונון (ESI) MS דורש כי הדגימות יהיו במצב נוזלי עבור אינון יעיל1. לפיכך, יש לעבור דוגמאות להכנה ביוכימית מורכבת, המשנה את הרכב המולקולות. לחילופין, בעוד באמצעות מטריקס באמצעות לייזר באמצעות desorption (maldi) MS יכול לשחזר מפות מולקולריות דקה רקמות מנות2,3, יעילות יינון שלה הוא נמוך מדי כדי לזהות את כל המולקולות בדגימות, והוא עני במיוחד בניתוח חומצות שומן. בהתחשב מגבלות אלה, בדיקת אלקטרונון בדיקה (PESI)4 ניתן להשתמש כדי להתבונן בזמן אמת שינויים במערכות ביולוגיות באתרו מבלי להרוס את השלמות המבנית5, בעוד האורגניזם הביולוגי להיות נצפתה הוא מבחינה טכנית במצב חי. מחט נאה מאוד משמשת במקרה זה, המשמש בו זמנית כבוחר לדוגמה ופולט יונים. משמעות הדבר היא כי המדגם מורכבים רצפים טרום טיפול ניתן עקף כדי לקבל ספקטרום מסה המשקפים את הרכיבים המולקולריים של מערכת החיים באתרו.
ישנן מספר שיטות אינון אחרות היריבות PESI-MS. האחד הוא מהיר הסלע אינון ספקטרומטר המסה (ריימס)6. טכניקה זו פועלת היטב במהלך הניתוח משום שהוא מורכב עם סכין חשמלי אוספת את הפלומה יון שנוצר במהלך החיתוך. בעוד ריימס הוא מאוד שימושי עבור הניתוח, זה ביסודו שיטה הרסנית הדורשת אבלציה חשמלי של הרקמה. לפיכך, היא אינה שימושית לניתוח מפורט של תאים ורקמות במדגם מוכן או בניתוחי מעבדה. יתר על כן, משום שהיא אוספת כמות גדולה של פלומה המכילה פסולת רקמות, זה דורש תחזוקה ממושכת של המכשירים לאחר כל שימוש, ובכך להגביל את השימוש במכונה זו הליכים כירורגיים מיוחדים. שיטה דומה, הנקראת לייזר הספקטרומטר המסה (LDI-MS)7, היא טכניקה נוספת שאינה פולשנית ושימושית עבור ניתוח פני השטח. מכיוון שטכניקה זו טובה בסריקת פני השטח של הדגימה, היא משיגה ניתוח דו מימדי כולל כגון הדמיה מלדית מיסה מאסיבית8,9. עם זאת, מכיוון LDI-MS חל רק על ניתוח פני השטח, PESI-MS הוא יתרון עבור ניתוח דגימות למשל, בתוך הרקמה. טכניקה נוספת, מספרט עט10, דווחה כדי להשיג ספציפיות ורגישות באבחון סרטן בלוטת התריס, אבל קוטרו של החללית הוא בסדר mm והוא ספציפי עבור ניתוח פני השטח, כלומר זה לא יכול לזהות גושים קטנים של סרטן או נגעים מקומי עמוק. כמו-כן, מאחר ששיטה זו משתמשת בתעלת זרימה מיקרוקפילר המוטבעת בעט המקדח, הזיהום הצולב חייב להילקח בחשבון, בדומה ל-LDI-MS. טכניקות אחרות קיימות שהוחלו על הגדרות קליניות, כגון בדיקת זרימה וטופס יינון בספוגית11, אבל הם לא נפוצים.
PESI הוא המזעור הקיצוני של ESI, שבו הנימים של הננו-electrospray ממיר על מחט מוצק עם עקמומיות טיפ רדיוס של כמה מאות ננומטר. אינון מתרחש באזור המוגבל ביותר של קצה המחט על ידי יצירת חרוט טיילור, על אילו דגימות להישאר עד אינון של כל הנוזלים על הקצה הוא השלים12. אם האנליטה נשאר על קצה המחט מתכת, עודף מטען הוא שנוצר ברציפות בממשק בין מחט מתכת לבין האנליטים. לכן, אינון סדרתי של מולקולות מתרחשת בהתאם לפעילות המשטח שלהם. מאפיין זה הופך את המחט טיפ סוג של chromatogram, הפרדת האנליטים בהתאם לפעילות המשטח שלהם. יותר מבחינה טכנית, מולקולות עם פעילות המשטח חזקה לבוא אל פני השטח של החרוט טיילור והם מוהים מוקדם יותר מאשר אלה עם פעילות משטח חלש, אשר לדבוק פני השטח של המחט עד סוף תהליך יונן. כך, אינון מלאה של כל המולקולות שנאספו על ידי המחט מושגת13. יתר על כן, כי טכניקה זו אינה כרוכה בתוספת של הממס המיותר למדגם, כמה מאות של ליטרים של נשים מספיקות כדי לקבל ספקטרום מסה חזק מספיק לניתוח נוסף14. מאפיינים אלה הם יתרון לניתוח של דגימות ביולוגיות שלמות. עם זאת, החיסרון העיקרי של PESI-MS טמון הרציפות באינון בגלל התנועה המעברת של המחט לאורך הציר האנכי, דומה מכונת ניסור. היינון מתרחש רק כאשר קצה הגשוש מגיע לנקודה הגבוהה ביותר כאשר גובה פתח היונים מיושר על הציר האופקי. אינון מפסיק בזמן שהמחט מרימה דגימות, ולכן היציבות של אינון אינה שווה לזו ב-ESI המקובלת. לכן, PESI-MS אינה שיטה אידיאלית עבור פרוטאומניקס.
עד היום, PESI-MS הוחל בעיקר על ניתוח של מערכות ביולוגיות, כיסוי מגוון רחב של שדות ממחקר בסיסי הגדרות קליניות. לדוגמה, הניתוח הישיר של רקמת האדם שהוכנו במהלך הניתוח היה מסוגל לחשוף את הצטברות של triacylglycerol הן קרצינומה של תאי הכליה15 ו קרצינומה של הלוע הלבן16. שיטה זו יכולה גם למדוד דגימות נוזל, כגון דם, כדי להתמקד בפרופיל השומנים. לדוגמה, מולקולות מסוימות כללו במהלך שינויים תזונתיים בארנבים; זה דווח כי כמה מולקולות אלה ירדו בשלבים מוקדמים מאוד של הניסויים, המציין את רגישות גבוהה והתועלת של מערכת זו עבור אבחון קליני17. יתרה מזאת, בקשה ישירה לבעלי חיים חיה אפשרה גילוי של שינויים ביוכימיים של הכבד לאחר לילה אחד של צום5. Zaitsu et al.18 בקרה זה ניסוי5 וניתח את פרופילי חילוף החומרים של הכבד כמעט באותו האופן, עם תוצאות שחיזקו את היציבות והתוכעות של השיטה המקורית שלנו. יתר על כן, הצלחנו להפלות את רקמת סרטן מתוך הכבד שמסביב סרטניים בעכברים באמצעות טכניקה זו19. לכן, זוהי טכניקה מגוונת של ספקטרומטר המסה השימושית בקביעות שונות, הן בvivo והן במבחנה. מנקודת מבט אחרת, ניתן להכניס את מודול PESI להתאמת מספר גדול של ספקטרומטר מסה על-ידי התאמת הקובץ המצורף הגובר. במאמר קצר זה, אנו מציגים את היסודות ודוגמאות של יישומים (איור 1), כולל יישומים עם חיות חיים5.
על פי התקנות והחוקים בכל מדינה, יש לסדר חלקים מפרוטוקול זה כדי לעמוד בקריטריונים של כל מוסד. היישום לאורגניזם החי הוא המעניין והמאתגר ביותר משום שהוא יכול לספק שינויים ביוכימיים או מטבוליים ברקמות או באיברים בבעלי חיים באתרו. בעוד שיישום זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יאמאנאשי, בשנת 20135, סיבוב נוסף של אישור יהיה כעת הכרחי בגלל השינויים האחרונים בתקנות עבור ניסויים בבעלי חיים. לכן, מספר שינויים במזימה הניסיונית, מומלץ. לגבי הספקטרום ההמוני שהושג בניסויים, לקיחת תנודות של ספקטרום מסה בין כל מדידה לחשבון, אין מערכת שיתוף מידע ספקטרלי כי הוא משותף הקהילה הרצף נוקלאוטיד. הטיפול חייב להילקח כאשר המפעיל מטפל במחט כדי למנוע תאונות מקל המחט, במיוחד בעת הסרת המחט ממחזיק המחט. מכשיר מיוחד לניתוק המחט הוא מאוד שימושי למטרה זו. מאחר שהתא של מודול PESI הוא תא אטום, סגור, דליפה של הפלומה יון לא מתרחש אם ספקטרומטר המסה מופעל על פי ההוראות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יאמאנאשי אישרה את כל הפרוטוקולים והשימוש בבעלי חיים ניסיוניים המובאים להלן. השימוש במדגם האנושי אושר על ידי מועצת האתיקה המוסדית באוניברסיטת יאמאנאשי.
1. הכנת רקמה מוצקה
הערה: יש לשמור את הדגימות על הקרח לאחר הסרתו מהחיה או מהגוף האנושי כדי לשמר את רעננות הרקמה. אם המדידות אינן מפנות מיד לאחר הניתוח, מומלץ לאחסן את הרקמה ב-80 ° c. זה לא מומלץ להניח את הרקמה בכל סוג של מאגר או תמיסת מלח, כי הם עשויים לחלץ תוכן מסוים מן הרקמה. רקמה שתוקנה עם אלהידס או מוטבע פרפין/שעווה או קריוג'ל אינו מתאים למדידות MS.
- חותכים את דוגמית הרקמה כ 2 x 2 x 2 מ"מ באמצעות אזמל או סכין. לחילופין, להכות את המדגם עם trepan (אגרוף ביופסיה חד פעמיות, נשא בגודל 3 מ"מ) משמש לבדיקת העור. במקרה זה, קצץ את אורך העמודה ל-2 מ"מ.
הערה: ניתן לנתח כל רקמה באמצעות שיטה זו. בניסוי זה, כבד15 וכליה19, נותחו בהצלחה כדי להשיג ספקטרום המוני. באופן כללי, איברים מסוימים מעניקים ספקטרום מסה טוב, בעוד אלה שיש להם רכיבים סיבי לא. - אם הרקמה מזוהמת בדם, יש לשטוף את העור בקצרה עם תמיסת מלח באגירה קרה.
הערה: כדי למזער את הנזק לרקמות שלאחר המוות, השלימו שלב זה, בהקדם האפשרי, בטמפרטורת החדר. אם לא נעשים מדידות מיידית, הקפא את הרקמה בחנקן נוזלי והחנות ב-80 ° c. - מניחים את חתך או מנוקב החוצה מדגם (כ 10 מ"ג) לתוך מיקרוצינורית פלסטיק ולהוסיף 100 μL של 50% אתנול.
הערה: המשקל המדויק של הדגימות אינו נקבע מכיוון שספקטרומטר המסה המשמש במערכת זו אינו מספק נתונים כמותיים. כ 10 מ"ג הוא אופטימלי עבור רקמת הכמצ'ראל. - הומוגון המדגם באמצעות מיקרופסל.
- מקום 10 μL של המגון המאכלת לתוך הבאר של המחסנית (איור 2).
- הניחו את המחסנית בחדר היינון של ספקטרומטר המסה והתקינו את המחט מפלדת אל-חלד שישמשו לדגימה (איור 2).
הערה: מחטים בדיקה מסופקים על ידי היצרן. הם עשויים פלדה אל חלד יש עקמומיות רדיוס של כ 400 ננומטר. - סגור את מכסה החדר בחוזקה כדי להפעיל באופן אוטומטי את מכשיר הבטיחות.
- הפעל את מחשב הלוח על-ידי לחיצה על סמל ההתחלה כדי לנתח. באמצעות הפאנלים על המסך, להחיל מתח של 2.3 kV אל המחט כדי לייצר את התרסיס אלקטרו ולהבטיח כי תדירות המחט היא 3 Hz.
- המתן 30 עבור המדידה להסתיים.
הערה: ההפעלה נפסקת באופן אוטומטי בעת השלמת רכישת הנתונים. איכות הניתוח מפוקחת על-ידי כרומטוגרם יונים כולל (TIC). זמן המדידה מוגדר להשגת ספקטרום המסה של הנציג וניתן לתקצר או להאריך אותו. - היפטר ממיכל הדיו והמחט בתוך הרגשנות לאחר מדידת כל מדגם.
הערה: ניתן למדוד דגימה אחת בלבד בכל פעם. אין צורך לכייל את המכונה לפני כל מדידה; כיול תלוי בבדיקה הרגילה של הספק פעם בשישה חודשים. - לנתח את ספקטרום מסה ולייצא את נתוני הטקסט הספקטרלי ההמוני באמצעות התוכנה המשויכת ספקטרומטר המסה (ראה טבלת חומרים) כאמור בשלבים הבאים (איור 3).
- לחץ על קובץ ה- lcd בחלון דפדפן קובץ הנתונים של התוכנה.
- בחר ולחץ על הפסגה בודדת על החלון ספקטרום המסה לתאר באופן אוטומטי כרומטוגרם יון מחולץ (eic).
- בדוק את ה-TIC ו-EIC ולחץ על סמל הספקטרום הממוצע כדי לבחור בחלון טווח הזמן ליצירת הספקטרום ההמוני.
הערה: בניתוח זה, מולקולות היעד מופיעות ביחס מסה-לתשלום (m/z) (איור 3). יתר על כן, כי משך הזמן של יינון לשבץ בודד של תנועת המחט הוא קצר מאוד, כל ספקטרום המסה המתקבל הם בעצם ספקטרום הממוצע מעל 10 s (300 סריקות). - צור קובץ טקסט המכיל את עוצמת ה- m/z ואת העוצמה על-ידי לחיצה על לשונית הייצוא לניתוח נוסף. ניתן לאחסן קובץ טקסט זה בכל תיקיה.
הערה: כל חומרים משמרים של RNA ישפיעו על תבנית ספקטרלית טבעית של דגימות. בנוסף, מומלץ לטפל ולאחסן רקמות ללא כל נוזל (כגון מלוחים באגירה מפוספז) כדי למנוע מהרקמת הרקמה המולקולרית לתוך הנוזל במהלך האחסון. באופן אידיאלי, טריים או טריים מוקפאים ללא כל טיפול משמשים.
2. הכנת נוזלי גוף (סרום)
הערה: כל הליך זה כמעט זהה לזה המשמש רקמה מוצקה. המחסנית עבור דגימת הנוזל זמינה מהיצרן. בגלל הזיהום על ידי כדוריות הדם האדומות (RBCs) יכול במידה ניכרת לצמצם את היעילות של רכישת ספקטרלי של המרכיב המיועד (פלזמה או סרום), הקפד לחסל את כל RBCs על ידי תפרידו לפני המידות.
- לקחת 10 μL של דגימת הסרום ולשים אותו לתוך מיקרושפופרת 1.5 mL.
הערה: ניתן להשתמש גם בסרום טרי ומאוחסן. - הוסף 190 μL של 50% אתנול לתוך שפופרת ה1.5 mL, ואז מערבולת עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
- צנטריפוגה את הנוזל ב 15,000 x g עבור 1-5 דקות ב 4 ° c.
- העבר 10 μL של סופרנטאנט לתוך הבאר של המחסנית.
- מניחים את המחסנית בחדר יינון של המכונה ולהתקין את המחט מפלדת אל-חלד שישמשו עבור אינון לדוגמה (איור 2).
- סגור את מכסה החדר בחוזקה כדי להפעיל באופן אוטומטי את מכשיר הבטיחות.
- הפעל את מחשב הלוח על-ידי לחיצה על סמל ההתחלה כדי לחשב את המחשב.
- מחק את המחסנית לדוגמה ואת המחט כפי שמתואר ב 1.10 פעם מדידות נלקחו.
- לנתח את הסדרות המתקבלות של EIC כאמור להלן (איור 3).
- פתח את קובץ ה-lcd בדפדפן הנתונים.
- לחץ על שיא בודד כדי להציג את TIC ו-eic.
- בחר בחלון טווח הזמן ליצירת ספקטרום מסה באמצעות סמל הספקטרום הממוצע .
- יצא את הקובץ שנוצר המכיל הן את עוצמת ה- m/z והן את אינטנסיביות היונים של שיא מקביל על-ידי לחיצה על הכרטיסייה ' ייצוא ' שעל הצג.
הערה: ניתן להחיל הליך זה על רוק, שתן ונוזלי גוף אחרים גם כן.
3. הכנה לvivo PESI-MS באורגניזם חי
הערה: בסעיף זה, יישום לניטור פרופיל מטבולית של 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) במודל עכבר חי הוא הציג. השתמש בתנאים אספטי ברחבי.
- להחדיר 100 μL של 100 מ"מ 5-FdU פתרון לתוך וריד הזנב של עכבר בן 2 חודשים (כ 20 גרם משקל).
הערה: אין העדפה למין, לגיל או למתח העכבר. למרות שפרוטוקול זה אושר בזמן שאנו ביצעו את הניסוי5, הכדאיות של ניסוי זה תלויה בהגבלות המוסריות של המדינה שבה היא תתבצע. - השלך את העכבר בעקבות הפרוטוקול המאושר שלך לטיפול בחיות. להעריך את עומק ההרדמה על ידי חוסר התגובה צובט הזנב.
הערה: אם השימוש בנתרן פנטוברביטל אינו מותר על ידי הוועדה האתית לניסויים בבעלי חיים, ניתן להשתמש בשיטות חלופיות, כגון קטמין הידרוכלוריד. - לגלח את חלל הבטן באמצעות תער חשמלי ולהחיל משחה וטרינר לעיניים.
- לשים את העכבר מורדם במצב פרקדן ולתקן את הכפות על צלחת הפלסטיק באמצעות קלטת תיקון. לקרצף את האתר כירורגי עם מדים של 70% אלכוהול שלוש פעמים.
- לחתוך לפתוח את חלל הבטן באמצעות מספריים. ראשית, חותכים את העור מעבר לפני (10 מ"מ) מדיוק מעל הסרעפת. לחתוך את השריר של הקיר גוף הבטן ואת צפק (ca. 7 מ"מ) ולהחזיק את הפצע פתוח באמצעות חוט נירוסטה כדי לחשוף את משטח הכבד.
הערה: אין צורך לשים את פני השטח של הכבד. - להחיל את קצה המחט בדיקה על פני השטח של הכבד. להתאים את עומק המחט כ 0.5 מ"מ עמוק כדי לייעל את היעילות יינון, בדיקת הדפוס TIC ו ספקטרלי בו זמנית. הגדר את המתח הגבוה ל-2.3 kV ולתדר של 3 Hz על המסך של לוח הבקרה.
- . תסיר את החיה מלוחית הפלסטיק
- תפר את הפצע באמצעות תפר כירורגי ולהחזיר את העכבר לכלוב. אין להשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה כדי לשמור על שכיבה משנית. אל תחזיר את העכבר לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש באופן מלא.
- לבצע את קורס הזמן של עוצמת יון ב EIC ואת ההליך של תיאור EIC כמו 1.11.1 to 1.11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שתואר באיור 3, הנתונים המתקבלים מטכניקת PESI-MS הם הספקטרום ההמוני, שטווח ה- m/z שלו נע בין 10 ל-1,200 במערכת זו. בעוד אחד יכול לזהות מולקולות עד m/z 2,000, היו כמה פסגות שהתקבלו באמצעות טכניקה זו על הטווח ההמוני של m/z 1,200. לכן ניתחנו את הפסגות מ- m/z 10 עד 1,200. היו קבוצות בולטות של פסגות סביב m/z 800 ו 900; הראשון מייצג את הרכיבים קרום התא, כגון כולין זרחן (PC) מינים, והשני מייצג triacyl גלירול (תג). איור 4 מראה את הספקטרום ההמוני מתוך כליה אנושית נורמלית וקרצינומה של תאי הכליה (rcc). ספקטרום מסה הושגו באמצעות שיטת הרקמה הישירה הסביר בפרוטוקול 1. מכיוון סוג תא ברור RCC מצטבר תג בציטופלסמה, קבוצה של ספקטרום סביב m/z 900 מבוטא מאוד. התוצאה באיור 4 הושגה על ידי שיטת החילוץ שהוצגה באיור 1 עבור דגימות מוצקות.
בגלל חילוף החומרים לשומנים של סרטן hepatocellular שינויים במהלך התקדמות המחלה20, ניתן לנטר את שלבי המחלה על ידי ביופסיה שגרתית בשילוב עם pesi-MS. התוצאה באיור 5 מתארת את ההבדלים בדפוס ספקטרלי בין רקמת הכבד הרגילה HCC. במיוחד, ישנם מספר ספקטרום מדהים של תג ב HCC. אם הרזולוציה של ספקטרומטר המסה הוא עליון, ייתכן כי הביאור המולקולרי של כל ספקטרום יאפשר להבהיר את המנגנון המולקולרי של סרטן, כמו גם פיזיולוגיה הסלולר נורמלי.
ניטור בזמן אמת של חילוף חומרים של סמים ניתן לבצע באמצעות PESI. בניסויים שלנו, הפרמקודינמיקה של הסוכן אנטי אונאוטיק 5-FdU היה פיקוח על 10 s לאחר הזריקו דרך הווריד הזנב של העכבר. גילוי מהיר מאוד של ספקטרום נצפתה רק כמה שניות לאחר הזרקת הסם (איור 6), רומז את התחבורה המהירה של התרופה דרך מחזור הדם אל הכבד. עוצמת הנתרן של הסודיום של 5-FdU דעכה בפגם קצר של אות היונים בהקלטה בסביבות 6-7 s לאחר התחלת המדידה. זה היה בגלל העומק המשתנה של מחט PESI בכבד כימומה, שהיה תוצאה של תנועות הגוף של העכבר מורדם. לכן, צריך לנקוט כדי להתאים את עומק המחט PESI למדידת זמן אמת של בעלי חיים חיים. אין דרך מומלצת למצוא את העומק האופטימלי של המחט, אבל הוא הופך להיות גלוי עם התרגול.
דגימות דם משלושה אנשים נותחו על ידי PESI-MS. במקרה זה, 10 μL של סרום היה מעורב עם 190 μL של 50% אתנול ולאחר מכן משמש ניתוח PESI-MS. בעוד דפוסי ספקטרלי כללית נראה לשתף כמה פסגות משותף (איור 7), יש הבדלים הדקה הרבה בספקטרום של שלושת האנשים האלה. הם טביעת אצבע של כל אדם. במונחים של פעילות מטבולית למידע מפורט על זהויות מולקולריות, יש להשתמש במכונת high-end. ספקטרומטר המסה המשמש בניסויים לא סיפק החלטה גבוהה מספיק כדי לזהות את המולקולות.
אם יש זיהום על ידי תרכובות פולימריות, הספקטרום המקורי באיור 4 להצמיח מצופה פסגות תקופתי ובולט לטשטש את הספקטרום מן המדגם המקורי (איור 8). כדי להדגים זה ניסויים, הוספנו פוליפרופילן גלירול triol (PPGT) כדי 2.5% כדי לשכפל מקרה של זיהום. כמעט כל הספקטרום הספציפי לראות באיור 8 היו רעולי פנים על ידי תוספת של ppgt.
איור 1: סקירה סכימטית של תזרים הכנה לדוגמה. עבור דגימות, מחסנית דוגמה מיוחדת אידיאלית עבור רכישת נתונים יציבים. ניתוח לדוגמה נוזלית הוא הדרך הקלה ביותר לביצוע PESI-MS, על-ידי הצבת הפתרון במחסנית. קיימות שתי שיטות להחלת שיטה זו על רקמה מוצקה. היישום הישיר של PESI לרקמה הוא קל מאוד ומהיר, בעוד שיטת החילוץ מאפשרת להשיג רכישה יציבה הרבה יותר של ספקטרום בהתאם מינים לדוגמה. בהליך זה, חתיכה קטנה של דגימת הרקמה היא לשים במיקרוצינורית עם 100 μL של 50% אתנול ו הומוגניים עם מיקרופסל. 10 μL של הומומטר שנוצר משמש לאחר מכן עבור ספקטרומטר מסה. במקרה של ניתוח חיה חיה, 30 μL של 50% אתנול ממוקם על פני השטח serosal של האיבר היעד, ואחריו מדידה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סקירה ורכיבים בסיסיים של PESI-MS. ספקטרומטר מסה מצויד במודול PESI. החלק האינון מותקן בתא סגור שבו היונים, מחזיק המחט, ומחזיק המדגם ממוקמים. המחט היא מוכנה מוכן, ואת המחט נירוסטה חד פעמי מחזיק המחט. זה מוגדר בספקטרומטר מסה רק לאחר הצבת מחסנית לדוגמה בתא. עקמומיות הממוצע זווית של המחט היא 400 ננומטר. מיכל הדיו להנחה המדגם הוא חד פעמי ועשוי פולימרים פלסטיים. יש לו באר קטנה להנחה של דגימת נוזל (חץ אדום). לאחר שהכנסת את הדגימה המוצק לבאר, הקלטת מקופלת כדי לצבוט את המדגם ולאטום את הבאר. עבור מחסנית דגימה נוזלית, נעשה שימוש באחד שונה שאינו דורש קיפול, וזוהי גירסה מומלצת העדיפה על דגימות מוצקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ממשק משתמש גרפי (GUI) עבור PESI-MS. כל ההליכים להפקת ספקטרום המסה מן הכולל יון chromatogram (TIC) ניתן לבצע עם התוכנה המשויכת. לאחר פתיחת קובץ ה-lcd בדפדפן הנתונים, ניתן להציג את ה-TIC, וניתן לבחור את טווח הזמן ליצירת ספקטרום מסה. ניתן לייצא את הספקטרום ההמוני שנוצר כנתוני טקסט המכילים יחס מסה-לחיוב (m/z) ועוצמת יון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: קרצינומה של תאי הכליה האנושית מראה פסגות אופייני של שומנים ניטרליים. היו פסגות חזק יחסית בספקטרום של רקמת קרצינומה של תאי הכליה האנושית (RCC) שלא זוהו ברקמה המקיפה שאינם סרטניים. הפסגות הללו מייצגות בעיקר טריקלגליצרול (תג) בסביבות יחס מסה-לגובה (m/z) 900. רכישה ספקטרלית בוצעה תוך שימוש במצב יון חיובי באמצעות ניתוח ישיר. מתח גבוה הוגדר ל 2.3 kV. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: דוגמה של נתונים שנרכשו ברקמות הכבד נורמלי סרטן hepatocellular (HCC). הפאנל העליון מתאר את הספקטרום של רקמת הכבד האנושית שבו נגע נאופלסטי לא היה נוכח, אלא מחולה עם צהבת כרונית שחמת הכבד. הלוח התחתון מציג את הספקטרום הממוצע של HCC מאותו החולה. במבט חטוף, בעוד שני אלה יש דפוסים ספקטרלי דומים מאוד, ישנם הבדלים קטנים רבים בתבנית ספקטרלית. הabscissa מראה את היחס של מסה לתשלום (m/z) והתאם מתאר את האינטנסיביות היחסית של כל קשת. רכישת ספקטרום בוצעה באמצעות מצב יון חיובי לאחר חילוץ הרקמה, כפי שתוארה באיור 2ג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: מדידות בזמן אמת של חילוף חומרים של סמים. שינויים מטבוליים ב-5-FdU הוזרק באופן מבוקר לתוך כלי הזנב של העכבר. זיהוי מהיר ורגיש מאוד של 5-fdu עם סודיום קרוב הושג בכבד באתרו. בשל אינון לא יציב במהלך המדידה, ניתן לציין את הפסקת האות בסביבות 6-7 s. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: דוגמאות של נתונים משלושה אנשים. סרום אנושי משלושה אנשים נותח באמצעות PESI-MS. היו חילוקי דעות ברורים. בדפוסים הספקטרליות בקרב האנשים הנתונים הושגו באמצעות מצב יון חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: תרכובות פולימריות מפריעות לרכישת נתונים מדויקת. בגלל הופעתה התקופתיים של פסגות ספקטרליות מצופה על הדגימה המקורית, זה הופך להיות קשה לפרש את הנתונים בדיוק. במקרה זה, הספקטרום שנגזר פוליפרופילן triol גלירול (PPGT) מופיעים ככיסוי רועש. תרכובות אלה, המשמשות בדרך כלל עבור כיול, מסכה הספקטרום המקורי מהכבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות pesi הוא נגזרת של ESI עבור ספקטרומטר המסה4, זה היתרון ביותר עבור ניטור טבולומיקס בזמן אמת, כמו גם לניתוח התגובות הביוכימי מבלי לבצע כל הטיפולים מורכבים או הזמן לצרוך מראש5,14,15,17. זוהי טכניקה פשוטה ומיידית ספקטרומטר מסה שניתן להחיל על המצב המשולב של אורגניזמים חיים. כיוון שהוא אינו דורש מפלים מורכבים של טיפולים לדוגמה, יש אפשרות גדולה הרבה יותר להעריך את ההרכב המולקולרי של המדגם כולו, כי אנחנו נמנעים כל אובדן אפשרי של המדגם שיכול להתרחש באופן קונבנציונלי, אשר דורש צעדים מורכבים של מדגם טרום טיפולים באמצעות כמויות גדולות של ממיסים אורגניים. לכן, PESI מאפשר לנו להשיג מידע רב יותר מן הדגימה אם כל התנאים מבוקרים כראוי.
ראשית עלינו להזכיר כמה מההיבטים הטכניים הנדרשים לקבלת תוצאות טובות בהתחשב בניתוח PESI-MS. הגורם הקריטי ביותר ב-PESI הוא התחזוקה של יעילות היינון במהלך הניתוח. כדי להשיג זאת, מומלץ להתאים ולמטב את המרחק בין קצה המחט לבין משטח המדגם, כדי ליצור TIC יציב על-ידי פנייה לצג המחשב במהלך הניתוח. כדי לעשות זאת, יש צורך לשנות את עומק המחט בצורה החורגת כדי להשיג TIC מקסימלי. מכיוון שמשך האינון קצר יחסית לעומת ESI, PESI אינו אידיאלי עבור הזדהות או כימות. שנית, מכיוון שהצורה של עצת המחט ממלאת תפקיד חשוב מאוד ב-יינון על-ידי יצירת החרוט האידיאלי טיילור המשמש כמקור יון, טיפול חייב להילקח לא כדי עוות את קצה המחט. הדפורמציה של העצה עלולה לגרום לצריכת אינון נמוכה יותר.
בעוד pesi הוא יתרון כי זה יכול להיות מיושם ישירות דגימות טריות (למשל כבד, כליות ומוח) ואורגניזם חי ללא טיפול מיוחד, הוא רגיש יחסית מזהמים אקסוגני אחרים, כי זה יכול להפוך כמעט את כל הרכיבים הכלולים בנוזל21,22,23. כלומר, החיסרון של היתרון של דילוג מראש לדוגמה פירושו כי PESI-MS הוא בחיסרון בכמה מצבים שנתקלים לעתים קרובות בניסויים ביולוגיים. כפי שהוסבר בסעיף הפרוטוקול, PESI רגיש לזיהום על ידי משמרים RNA, אלדהודס, תרכובות פולימריות כגון קריוג'ל לעתים קרובות משמש הכנה היסטולוגית. קרישי דם יכולים לדבוק מחט PESI ולעתים קרובות מסכה הספקטרום המיועד. יתר על כן, המוליזה של RBCs משחררת המוגלובין, ואת יון ferric הנתק מעניקה ספקטרום חזק יותר מאשר אלה שמקורם האנליטים המיועדים. תרכובות פולימריות גם לתת הפסגות ספקטרליות תקופתיות כי שכבת הספקטרום הנגזר של האנליטים מיועדים, מה שהופך את זה הרבה יותר קשה לפרש את הנתונים האמיתיים בגלל הרעש (איור 8). כדי למנוע בעיות ברכישת ספקטרום מסה, מומלץ לעקוב אחר הפרוטוקול שלנו, ולקבל התייחסות מיוחדת לזיהום. בהקשר זה, היישום של PESI מוגבל במקרים מסוימים.
חיסרון נוסף של PESI טמון בתהליך האינון הבלתי יציב יחסית, המחייב אותנו לכוונן את העומק של המחט המקדח אל האנליטים. בנוסף, טכניקה זו יכולה לכסות שטח מוגבל מאוד בניתוח אחד. בגלל הגודל הקטן מאוד של המחט המוחלת ישירות על הרקמה, ניתוח pesi-MS אינו מקיף כמו ניתוח דו-ממדי שניתן להשיג עם הדמיה מבוססי maldi-תוף MS מבוסס הדמיית מבוסס על הדמיה או דזי מבוססי ההדמיה7,8. עם זאת, PESI יכול לשחזר תמונה של היווצרות ההיפוקמפוס, למרות שזה לוקח מספר שעות23 , כי הסריקה 2d של מדגם לוקח זמן רב, בעיקר בגלל היעילות הבלתי יציבה של טכניקה זו. לקחת את זה בחשבון, דימות ספקטרלי המוני על ידי PESI-MS אינו יישום בעל ערך.
בנוגע לתכונות האלקטרוכימיות של PESI, אמצעי האחסון והריכוז של המדגם הדבק בתיאור המחט הוא קריטי18, מכיוון שאפקט הדיכוי מחליש במידה מסוימת על-ידי צמצום גודל הריסוס האלקטרוכימי. בהתחשב בעובדה כי PESI הוא מזעור של ESI, הדגימות חייב להיות מדולל באופן אידיאלי כדי להימנע מיצירת שעמום על הקצה. לכן, תוספת של כ 30 μL של 50% אתנול הוא הכרחי כדי להשיג אינון יעיל כאשר שיטת הרקמה הישירה מועסק (איור 2B). הדבר מגדיל את יעילות היינון ומשיג אינון כמעט מוחלט של המולקולות המחוברות לקצה המחט.
בחירת השיטה המתאימה ביותר לעיבוד נתונים חשובה מאוד בעת שימוש במערכת זו24. בנוגע ליישום של למידה ממוחשבת של אבחון מחלות, בניית מסד נתונים נחוצה כדי ליצור התייחסות לסיווג או סיווג מחלות7. לדוגמה, השתמשנו מכונת וקטור תמיכה או רגרסיה לוגיסטית לבצע אבחון של ממאירות הכבד העיקרי25.
PESI-MS היא טכניקה רב-תכליתית וקלה שיש לה פוטנציאל רב לסינון סמים, בדיקות סמים, בדיקות בטיחות מזון של מוצרים חקלאיים26, וכמה בדיקות סביבתיות. מכיוון שיחידת היינון זו תואמת לספקטרומטרים אחרים על-ידי הכנת קובץ מצורף לכל מכשיר ספציפי, ניתן להחיל את PESI על מטרות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר המקביל מומן על ידי Shimadzu, יצרנית וספקית של כלי PESI-MS.
Acknowledgments
אנו מודים לאיימי איאיזוקא על הפעלת ה-PESI-MS וקזוקו סאווה-נובורי לקבלת סיוע במזכירות. אנו מודים לברוון גרדנר, Ph.D., מקבוצת אדז (www.edanzediting.com/ac) לעריכת טיוטה של כתב יד זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
