Summary
En este artículo se presentan métodos de preparación de muestras para un método analítico único en tiempo real basado en la espectrometría de masas ambientales. Este método nos permite realizar análisis en tiempo real de las moléculas biológicas in vivo sin ningún pretratamiento especial.
Abstract
La espectrometría de masas (MS) es una herramienta poderosa en la química analítica porque proporciona información muy precisa sobre moléculas, como las relaciones masa-carga(m/z),que son útiles para deducir pesos y estructuras moleculares. Si bien es esencialmente un método analítico destructivo, los recientes avances en la técnica de ionización ambiental nos han permitido adquirir datos mientras demos el tejido en un estado relativamente intacto en términos de integridad. La ionización por electrospray de sonda (PESI) es un método llamado directo porque no requiere un pretratamiento complejo y lento de las muestras. Una aguja fina sirve como un selector de muestras, así como un emisor de ionización. Sobre la base de la propiedad muy afilada y fina de la punta de la sonda, la destrucción de las muestras es mínima, lo que nos permite adquirir la información molecular en tiempo real de los seres vivos in situ. En este documento, presentamos tres aplicaciones de la técnica PESI-MS que serán útiles para la investigación y el desarrollo biomédicos. Se trata de la aplicación al tejido sólido, que es la aplicación básica de esta técnica para el diagnóstico médico. Como esta técnica requiere sólo 10 mg de la muestra, puede ser muy útil en los entornos clínicos de rutina. La segunda aplicación es para el diagnóstico médico in vitro donde se mide el suero sanguíneo humano. La capacidad de medir muestras de fluidos también es valiosa en varios experimentos biológicos en los que no se puede proporcionar un volumen suficiente de muestras para técnicas analíticas convencionales. La tercera aplicación se inclina hacia la aplicación directa de agujas de sonda en animales vivos, donde podemos obtener dinámica sin tiempo de metabolitos o fármacos en órganos específicos. En cada aplicación, podemos inferir las moléculas que han sido detectadas por la EP o utilizar inteligencia artificial para obtener un diagnóstico médico.
Introduction
La espectrometría de masas (Em) es una realización tecnológica del reduccionismo; reduce el objeto de análisis a una unidad que puede interpretarse sobre la base de especies moleculares o cascadas. Por lo tanto, es un método representativo de química analítica. Se compone de cuatro procesos: ionización, análisis, detección y adquisición espectral. Debido a que la ionización de la molécula es el primer proceso en espectrometría de masas, generalmente restringe la forma de los analitos a procesar. La mayoría de los procedimientos de ionización requieren la destrucción de la estructura, morfología y procesos biológicos en tiempo real de muestras orgánicas. Por ejemplo, la ionización por electrospray (ESI) MS requiere que las muestras estén en estado líquido para una ionización eficiente1. Las muestras, por lo tanto, deben pasar por una compleja preparación bioquímica, que altera la composición de las moléculas. Alternativamente, mientras que la ionización de desorción láser asistida por matriz (MALDI) MS puede reconstruir mapas moleculares de tejido seccionado delgado2,3, su eficiencia de ionización es demasiado baja para detectar todas las moléculas en las muestras, y es particularmente pobre en el análisis de ácidos grasos. Teniendo en cuenta estas limitaciones, la ionización de electrospray de sonda (PESI)4 se puede utilizar para observar los cambios en tiempo real en los sistemas biológicos in situ sin destruir la integridad estructural5,mientras que el organismo biológico que se observa está técnicamente en un estado vivo. Una aguja muy fina se utiliza en este caso que sirve simultáneamente como un selector de muestras y un emisor de iones. Esto significa que las complejas secuencias de pretratamiento de muestras se pueden omitir para obtener espectros de masa que reflejen los componentes moleculares del sistema vivo in situ.
Hay varios otros métodos de ionización que rivalizan con PESI-MS. Una es la espectrometría de masas de ionización evaporativa rápida (REIMS)6. Esta técnica funciona bien durante la cirugía porque se ensambla con un cuchillo eléctrico y recoge el penacho iónico generado durante la incisión. Si bien REIMS es muy útil para la cirugía, es esencialmente un método destructivo que requiere la ablación eléctrica del tejido. Por lo tanto, no es útil para el análisis detallado de células y tejidos en una muestra preparatoria o en análisis de laboratorio. Además, debido a que recoge una gran cantidad de residuos de tejido que contienen penacho, requiere un largo mantenimiento de los dispositivos después de cada uso, limitando así el uso de esta máquina a procedimientos quirúrgicos especiales. Un método similar, llamado espectrometría de masas de ionización láser (LDI-MS)7, es otra técnica que no es invasiva y útil para el análisis de superficie. Debido a que esta técnica es buena para escanear la superficie de una muestra, logra un análisis bidimensional integral como espectrometría de masas de imágenes MALDI8,9. Sin embargo, debido a que LDI-MS sólo es aplicable al análisis de superficie, PESI-MS es ventajoso para analizar las muestras, por ejemplo, dentro del tejido. Otra técnica, la MasSpec Pen10,se informó para lograr una alta especificidad y sensibilidad en el diagnóstico del cáncer de tiroides, pero el diámetro de la sonda está en el orden de mm y es específico para el análisis de la superficie, lo que significa que no puede detectar pequeños nódulos de cáncer o lesiones profundamente localizadas. Además, dado que este método utiliza un canal de flujo microcapilar incrustado en la pluma de la sonda, debe tenerse en cuenta la contaminación cruzada, similar a LDI-MS. Existen otras técnicas que se han aplicado a entornos clínicos, como la sonda de flujo y la forma de ionización del hisopo11,pero no están muy extendidas.
PESI es una miniaturización extrema de ESI, donde el capilar del nanoelectrospray converge en una aguja sólida con un radio de curvatura de la punta de varios cientos de nm. La ionización tiene lugar en el área extremadamente restringida de la punta de la aguja mediante la formación de un cono Taylor, en el que quedan muestras hasta la ionización de todo el líquido en la punta se completa12. Si el analito permanece en la punta de la aguja de metal, el exceso de carga se genera continuamente en la interfaz entre la aguja de metal y los analitos. Por lo tanto, la ionización secuencial de moléculas ocurre dependiendo de su actividad superficial. Esta propiedad hace que la punta de la aguja sea una especie de cromatograma, separando los analitos dependiendo de su actividad superficial. Más técnicamente, las moléculas con la actividad superficial más fuerte llegan a la superficie del cono Taylor y se ionizan antes que aquellas con una actividad superficial más débil, que se adhieren a la superficie de la aguja hasta el final del proceso de ionización. Por lo tanto, la ionización completa de todas las moléculas recogidas por la aguja se logra13. Además, debido a que esta técnica no implica la adición de disolvente superfluo a la muestra, varios cientos de femtolitros son suficientes para obtener espectros de masa lo suficientemente fuertes para un análisis posterior14. Estas propiedades son ventajosas para el análisis de muestras biológicas intactas. Sin embargo, una desventaja importante de PESI-MS radica en la discontinuidad de la ionización debido al movimiento recíproco de la aguja a lo largo del eje vertical, similar a una máquina de aserrado. La ionización sólo tiene lugar cuando la punta de la sonda alcanza el punto más alto cuando la altura del orificio iónico está alineada en el eje horizontal. La ionización cesa mientras la aguja recoge muestras, por lo que la estabilidad de la ionización no es igual a la de la ESI convencional. Por lo tanto, PESI-MS no es un método ideal para la proteómica.
Hasta la fecha, PESI-MS se ha aplicado principalmente al análisis de sistemas biológicos, cubriendo una amplia gama de campos, desde la investigación básica hasta los entornos clínicos. Por ejemplo, el análisis directo del tejido humano preparado durante la cirugía fue capaz de revelar la acumulación de triacilglycerol tanto en el carcinoma de células renales15 como en el carcinoma escamoso faríngeo16. Este método también puede medir muestras líquidas, como la sangre, para centrarse en el perfil lipídico. Por ejemplo, algunas moléculas se han delineado durante los cambios en la dieta en los conejos; se informó que algunas de estas moléculas disminuyeron en etapas muy tempranas de los experimentos, lo que indica la alta sensibilidad y utilidad de este sistema para el diagnóstico clínico17. Además, la aplicación directa a un animal vivo permitió la detección de cambios bioquímicos del hígado después de sólo una noche de ayuno5. 18 revisitó este experimento5 y analizó los perfiles metabólicos del hígado de casi la misma manera, con resultados que reforzaron la estabilidad y reproducibilidad de nuestro método original. Además, pudimos discriminar el tejido canceroso del hígado no canceroso circundante en ratones utilizando esta técnica19. Por lo tanto, esta es una técnica de espectrometría de masas versátil que es útil en varios entornos, tanto in vivo como in vitro. Desde otro punto de vista, el módulo PESI se puede hacer para adaptarse a varios espectrómetros de masa ajustando el accesorio de montaje. En este breve artículo, presentamos los conceptos básicos y ejemplos de aplicaciones(Figura 1), incluidas las aplicaciones con animales vivos5.
De acuerdo con las regulaciones y leyes de cada país, algunas partes de este protocolo tendrán que ser revisadas para cumplir con los criterios de cada institución. La aplicación al organismo vivo es la más interesante y desafiante porque puede proporcionar cambios bioquímicos o metabólicos en tejidos u órganos en animales vivos in situ. Si bien esta solicitud fue aprobada por el comité institucional para el cuidado de animales en la Universidad de Yamanashi, en 20135, otra ronda de aprobación será ahora necesaria debido a los recientes cambios en las regulaciones para los experimentos con animales. Por lo tanto, son aconsejables varias modificaciones en el esquema experimental. En cuanto a los espectros de masa obtenidos en experimentos, teniendo en cuenta las fluctuaciones de los espectros de masa entre cada medición, no existe un sistema de intercambio de información espectral que sea común a la comunidad de secuenciación de nucleótidos. Se debe tener cuidado cuando el operador manihace la aguja para evitar accidentes con aguja, especialmente cuando se retira la aguja del soporte de la aguja. Un dispositivo especial para desmontar la aguja es muy útil para este propósito. Dado que el compartimiento del módulo PESI es una cámara hermética y cerrada, la fuga del penacho iónico no se produce si el espectrómetro de masas funciona de acuerdo con las instrucciones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
El comité institucional para el cuidado de animales de la Universidad de Yamanashi aprobó todos los protocolos y el uso de animales experimentales aquí indicados. El uso de muestras humanas fue aprobado por la junta de ética institucional de la Universidad de Yamanashi.
1. Preparación de tejidos sólidos
NOTA: Las muestras deben mantenerse en hielo después de su eliminación del cuerpo animal o humano para preservar la frescura del tejido. Si las mediciones no siguen inmediatamente a la disección, se recomienda almacenar tejido a -80 oC. No es aconsejable colocar el tejido en cualquier tipo de tampón o solución salina, ya que pueden extraer ciertos contenidos del tejido. El tejido que se ha fijado con aldehídos o incrustado en parafina/cera o criogel no es adecuado para las mediciones de EM.
- Corte la muestra de tejido a aproximadamente 2 x 2 x 2 mm usando un bisturí o un cuchillo. Alternativamente, perforar la muestra con un trepan (un punzón de biopsia desechable, diámetro de 3 mm) utilizado para el examen de la piel. En este caso, recorte la longitud de la columna a 2 mm.
NOTA: Cualquier tejido se puede analizar utilizando este método. En este experimento, el hígado15 y el riñón19,se han analizado con éxito para obtener espectros de masa. Generalmente, los órganos parénquimales dan buenos espectros de masa, mientras que los que tienen componentes fibrosos no lo hacen. - Si el tejido está contaminado con sangre, lave brevemente con solución salina tamponada con fosfato helado.
NOTA: Para minimizar el daño del tejido postmortem, complete este paso, tan pronto como sea posible, a temperatura ambiente. Si las mediciones no se realizan inmediatamente, congele el tejido en nitrógeno líquido y guárdelo a -80 oC. - Coloque la muestra cortada o perforada (aproximadamente 10 mg) en un microtubo de plástico y agregue 100 ml de etanol al 50%.
NOTA: El peso exacto de las muestras no se determina porque la espectrometría de masas utilizada en este sistema no proporciona datos cuantitativos. Aproximadamente 10 mg es óptimo para el tejido parénquimal. - Homogeneizar la muestra utilizando un micropsto.
- Coloque 10 s de homogeneato en el pozo del cartucho(Figura 2).
- Coloque el cartucho en la cámara de ionización del espectrómetro de masas e instale la sonda de aguja de acero inoxidable que se utilizará para la ionización de la muestra(Figura 2).
NOTA: El fabricante suministra agujas de sonda. Están hechas de acero inoxidable y tienen un radio de curvatura de aproximadamente 400 nm. - Cierre firmemente la tapa de la cámara para activar automáticamente el dispositivo de seguridad.
- Inicie el equipo de a bordo haciendo clic en el icono Inicio para analizar. Usando los paneles en pantalla, aplique una tensión de 2,3 kV a la aguja para generar el electrospray y asegurarse de que la frecuencia de la aguja es de 3 Hz.
- Espere 30 s para que se complete la medición.
NOTA: La sesión finaliza automáticamente cuando se completa la adquisición de datos. La calidad del análisis es monitoreada por un cromatograma iónico total (TIC). El tiempo de medición se define para obtener los espectros de masa representativos y se puede acortar o ampliar. - Deseche el cartucho y la aguja en un eliminador de riesgo biológico después de medir cada muestra.
NOTA: Solo se puede medir una muestra a la vez. No es necesario calibrar la máquina antes de cada medición; calibración depende del chequeo regular por parte del proveedor una vez cada seis meses. - Analizar los espectros de masa y exportar los datos de texto espectral de masa utilizando el software asociado con el espectrómetro de masas (ver Tabla de Materiales) como se indica en los pasos a continuación (Figura 3).
- Haga clic en el archivo lcd en la ventana del navegador de archivos de datos del software.
- Elija y haga clic en un solo pico en la ventana de espectro de masas y para representar automáticamente un cromatograma de iones extraído (EIC).
- Marque el TIC y el EIC y haga clic en el icono de espectro promedio para seleccionar la ventana del rango de tiempo para generar el espectro de masa.
NOTA: En este análisis, las moléculas diana aparecen en la ventana relación masa-carga (m/z) (Figura 3). Además, debido a que la duración de la ionización por un solo golpe de movimiento de la aguja es muy corta, todos los espectros de masa obtenidos son esencialmente espectros promediados de más de 10 s (300 escaneos). - Genere un archivo de texto que contenga m/z e intensidad ion haciendo clic en la pestaña Exportar para su análisis posterior. Este archivo de texto se puede almacenar en cualquier carpeta.
NOTA: Cualquier preservativo de ARN afectará el patrón espectral nativo de las muestras. Además, es aconsejable manipular y almacenar tejido sin ningún líquido (como solución salina tamponada con fosfato) para evitar la elución de los componentes moleculares del tejido en el líquido durante el almacenamiento. Idealmente, se utilizan muestras congeladas frescas o frescas sin ningún tratamiento.
2. Preparación de fluidos corporales (suero)
NOTA: Todo este procedimiento es casi idéntico al utilizado para el tejido sólido. El cartucho para la muestra de fluido sacable está disponible en el fabricante. Debido a que la contaminación por glóbulos rojos (RBR) puede disminuir en gran medida la eficiencia de la adquisición espectral del componente previsto (plasma o suero), asegúrese de eliminar todos los glóbulos rojos centrifugando antes de las mediciones.
- Tomar 10 ml de la muestra de suero y ponerla en un microtubo de 1,5 ml.
NOTA: Se puede utilizar tanto suero fresco como almacenado. - Añadir 190 l de etanol al tubo de 1,5 ml y, a continuación, vórtice durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Centrifugar el líquido a 15.000 x g durante 1-5 min a 4oC.
- Transfiera 10 ml de sobrenadante al pozo del cartucho.
- Coloque el cartucho en la cámara de ionización de la máquina e instale la sonda de aguja de acero inoxidable que se utilizará para la ionización de muestras(Figura 2).
- Cierre firmemente la tapa de la cámara para activar automáticamente el dispositivo de seguridad.
- Inicie el equipo de a bordo haciendo clic en el icono Inicio para ionizar.
- Deseche el cartucho de muestra y la aguja como se describe en 1.10 una vez que se hayan tomado las mediciones.
- Analice los conjuntos obtenidos de EIC como se indica a continuación(Figura 3).
- Abra el archivo lcd en el navegador de datos.
- Haga clic en un solo pico para mostrar el TIC y el EIC.
- Seleccione la ventana de rango de tiempo para generar espectros de masa utilizando el icono de espectro promedio.
- Exporte el archivo generado que contiene la intensidad m/z e ion de un pico correspondiente haciendo clic en la pestaña de exportación del monitor.
NOTA: Este procedimiento también se puede aplicar a la saliva, la orina y otros fluidos corporales.
3. Preparación para el PESI-MS in vivo en el organismo vivo
NOTA: En esta sección, se introduce una aplicación para controlar el perfil metabólico de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (5-FdU) en un modelo de ratón vivo. Use condiciones asépticas en todas las instalaciones.
- Infundir 100 ml de solución de 100 mM 5-Fdu en la vena de la cola de un ratón de 2 meses de edad (aproximadamente 20 g de peso).
NOTA: No hay preferencia por el sexo, la edad o la tensión del ratón. Si bien este protocolo fue aprobado en el momento en que llevamos a cabo el experimento5,la viabilidad de este experimento depende de las restricciones éticas del país en el que se realizará. - Anestetiza el ratón siguiendo tu protocolo de cuidado animal aprobado. Evaluar la profundidad de la anestesia por la falta de respuesta al pellizco de cola.
NOTA: Si el comité ético no permite el uso de pentobarbital sódico para experimentos con animales, se pueden utilizar métodos alternativos, como el clorhidrato de ketamina. - Afeitar la cavidad abdominal con una maquinilla de afeitar eléctrica y aplicar pomada de ternera en los ojos.
- Coloque el ratón anestesiado en una posición supina y fije las patas en la placa de plástico usando cinta de reparación. Frote el sitio quirúrgico con exfoliantes de 70% de alcohol tres veces.
- Abre la cavidad abdominal con tijeras. Primero, corte la piel lateralmente (10 mm) desde justo por encima del diafragma. Corte lateralmente el músculo de la pared abdominal del cuerpo y el peritoneo (ca. 7 mm) y mantenga la herida abierta usando alambre inoxidable para exponer la superficie hepática.
NOTA: No es necesario perfumar la superficie del hígado. - Aplique la punta de la aguja de la sonda sobre la superficie del hígado. Ajuste la profundidad de la aguja a aproximadamente 0,5 mm de profundidad para optimizar la eficiencia de ionización, comprobando el TIC y el patrón espectral simultáneamente. Ajuste el alto voltaje a 2,3 kV y la frecuencia a 3 Hz en la pantalla del panel de control.
- Retire el animal de la placa de plástico.
- Sutura restar la herida usando una sutura quirúrgica del intestino y devolver el ratón a la jaula. No deje el ratón desatendido hasta que haya recobrado la conciencia para mantener la recumbencia esternal. No devuelva el ratón a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo.
- Realice el curso de tiempo de intensidad de iones en EIC y el procedimiento de representación EIC como en 1.11.1 a 1.11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Como se muestra en la Figura 3,los datos obtenidos por la técnica PESI-MS son los espectros de masa, cuyo rango m/z de 10 a 1.200 en este sistema. Mientras que uno puede detectar moléculas de hasta m/z 2,000, hubo pocos picos obtenidos utilizando esta técnica en el rango de masa de m/z 1,200. Por lo tanto, analizamos picos de m/z 10 a 1.200. Había grupos visibles de picos alrededor de m/z 800 y 900; el primero representa componentes de membrana celular, tales como especies de fosfatidil colina (PC), y el segundo representa triacilo glicerol (TAG). La Figura 4 muestra los espectros de masa de un riñón humano normal y un carcinoma de células renales (CCR). Los espectros de masa se obtuvieron utilizando el método de tejido directo explicado en el protocolo 1. Debido a que el tipo de celda transparente RCC acumula TAG en el citoplasma, un grupo de espectros alrededor de m/z 900 es muy pronunciado. El resultado en la Figura 4 se obtuvo mediante el método de extracción introducido en la Figura 1 para muestras sólidas.
Debido a que el metabolismo lipídico del carcinoma hepatocelular cambia durante la progresión de la enfermedad20,es posible controlar las etapas de la enfermedad mediante biopsia de rutina combinada con PESI-MS. El resultado en la Figura 5 representa las diferencias en el patrón espectral entre el tejido hepático normal y HCC. Especialmente, hay varios espectros notables de TAG en HCC. Si la resolución del espectrómetro de masas es superior, es posible que la anotación molecular de cada espectro permita el esclarecimiento del mecanismo molecular del cáncer, así como la fisiología celular normal.
El monitoreo en tiempo real del metabolismo de los fármacos se puede realizar usando PESI. En nuestros experimentos, la farmacodinámica del agente antioncótico 5-Fdu fue monitoreada a lo largo de 10 s después de ser inyectada a través de la vena de la cola de un ratón. Se observó una detección muy rápida de espectros sólo unos segundos después de inyectar el medicamento(Figura 6),lo que implica el transporte rápido de la droga a través del torrente sanguíneo al hígado. La intensidad de los aductos de sodio de 5-Fdu disminuyó con un breve defecto de la señal iónial en la grabación en alrededor de 6-7 s después de iniciar la medición. Esto fue debido a la diferente profundidad de la aguja PESI en el parénquima hepático, que fue el resultado de los movimientos corporales del ratón anestesiado. Por lo tanto, se debe tener cuidado de ajustar la profundidad de la aguja PESI para la medición en tiempo real de los animales vivos. No hay ninguna manera recomendada de encontrar la profundidad óptima de la aguja, pero se hace evidente con la práctica.
Las muestras de sangre de tres individuos fueron analizadas por PESI-MS. En este caso, se mezclaron 10 ml de suero con 190 ml de etanol al 50% y luego se utilizó para el análisis PESI-MS. Mientras que los patrones espectrales generales parecen compartir varios picos comunes(Figura 7),hay muchas diferencias de minutos en los espectros de estas tres personas. Son una huella dactilar de cada persona en términos de actividades metabólicas. Para obtener información detallada sobre las identidades moleculares, es necesario utilizar una máquina de gama alta. El espectrómetro de masas utilizado en los experimentos no proporcionó una resolución lo suficientemente alta como para identificar las moléculas.
Si hay contaminación por compuestos poliméricos, los espectros originales de la Figura 4 dan lugar a picos periódicos y visibles superpuestos que difuminan los espectros de la muestra original(Figura 8). Para demostrarlo experimentalmente, añadimos triol de glicerol de polipropileno (PPGT) al 2,5% para reproducir un caso de contaminación. Casi todos los espectros específicos vistos en la Figura 8 fueron enmascarados por la adición de PPGT.
Figura 1: Visión general esquemática de un flujo de preparación de muestra. Para las muestras, un cartucho de muestra especializado es ideal para la adquisición de datos estable. El análisis de muestras líquidas es la forma más fácil de realizar PESI-MS, simplemente colocando la solución en el cartucho. Existen dos métodos para aplicar este método al tejido sólido. La aplicación directa de PESI al tejido es muy fácil y rápida, mientras que el método de extracción permite lograr una adquisición mucho más estable de espectros dependiendo de la especie de muestra. En este procedimiento, una pequeña parte de la muestra de tejido se coloca en un microtubo con 100 ml de etanol al 50% y se homogeneiza con un micropeno. A continuación, se utiliza 10 l del homogeneato resultante para la espectrometría de masas. En el caso de analizar un animal vivo, se coloca 30 ml de etanol al 50% en la superficie serosal del órgano objetivo, seguido de la medición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visión general y componentes básicos de PESI-MS. Un espectrómetro de masas equipado con un módulo PESI. La parte de ionización se instala en una cámara cerrada donde se colocan la entrada de iones, el soporte de la aguja y el soporte de la muestra. La aguja está lista y la aguja desechable de acero inoxidable se fija al soporte de la aguja. Se coloca en el espectrómetro de masas justo después de colocar el cartucho de muestra en la cámara. El ángulo de curvatura promedio de la aguja es de 400 nm. El cartucho para colocar la muestra es desechable y está hecho de polímeros plásticos. Tiene un pequeño pozo para colocar la muestra líquida (flecha roja). Después de poner la muestra sólida en el pozo, el cassette se dobla para pellizcar la muestra y sellar el pozo. Para un cartucho de muestra líquida, se utiliza uno diferente que no requiere plegado, y esta es una versión recomendada que es superior a las muestras sólidas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Interfaz gráfica de usuario (GUI) para PESI-MS. Todos los procedimientos para generar espectros de masa a partir del cromatograma iónico total (TIC) se pueden realizar con el software asociado. Después de abrir el archivo lcd en el navegador de datos, se puede mostrar el TIC y se puede seleccionar el intervalo de tiempo para generar espectros de masa. Los espectros de masa generados se pueden exportar como datos de texto que contienen tanto la relación masa-carga (m/z)como la intensidad del ion. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El carcinoma humano de células renales muestra picos característicos de lípidos neutros. Hubo picos relativamente fuertes en los espectros del tejido del carcinoma de células renales humanas (CCR) que no se identificaron en el tejido no canceroso circundante. Estos picos representan principalmente triacilglycerol (TAG) en torno a la relación masa-carga (m/z) 900. La adquisición espectral se realizó utilizando el modo iónico positivo mediante análisis directo. Alta tensión se estableció en 2,3 kV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplo de datos adquiridos en tejidos hepáticos normales y carcinoma hepatocelular humano (HCC). El panel superior representa los espectros de un tejido hepático humano donde no había una lesión neoplásica, sino de un paciente con hepatitis crónica y cirrosis hepática. El panel inferior muestra los espectros promediados de HCC del mismo paciente. A simple vista, mientras que estos dos tienen patrones espectrales muy similares, hay muchas pequeñas diferencias en el patrón espectral. La abscisa muestra la relación masa-carga (m/z) y la coordenada representa la intensidad relativa de cada espectro. La adquisición de espectros se realizó utilizando el modo iónico positivo después de extraer el tejido, como se muestra en la Figura 2C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Mediciones en tiempo real del metabolismo de los fármacos. Cambios metabólicos en 5-FdU inyectados por vía intravenosa en el vaso de la cola de un ratón. Se logró una detección muy rápida y sensible de 5-FDU con aducto de sodio en el hígado in situ. Debido a la ionización inestable durante la medición, el cese de la señal se puede observar alrededor de 6-7 s. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Ejemplos de datos de tres individuos. El suero humano de tres individuos se analizó utilizando PESI-MS. Había claras diferencias en los patrones espectrales entre los individuos. Los datos se obtuvieron utilizando el modo iónico positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Los compuestos de polímeros interfieren con la adquisición precisa de datos. Debido a la aparición periódica de picos espectrales superpuestos en el espécimen original, se hace difícil interpretar los datos con precisión. En este caso, los espectros derivados del poliglicerol de triol de polipropileno (PPGT) aparecen como una superposición ruidoso. Esos compuestos, generalmente utilizados para la calibración, enmascaran los espectros originales del hígado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aunque PESI es un derivado de ESI para espectrometría de masas4, es más ventajoso para el seguimiento de metabolómica en tiempo real, así como para el análisis de reacciones bioquímicas sin realizar ningún pretratamiento complejo o lento5,14,15,17. Es una técnica de espectrometría de masas fácil e instantánea que se puede aplicar al estado integrado de los organismos vivos. Dado que no requiere cascadas complejas de pretratamiento de muestras, existe una posibilidad mucho mayor de evaluar la composición molecular de toda la muestra, ya que evitamos cualquier posible pérdida de muestra que pueda producirse en esI convencional, que requiere pasos complejos de pretratamiento de muestras utilizando grandes cantidades de disolventes orgánicos. Por lo tanto, PESI nos permite obtener mucha más información del espécimen si todas las condiciones están adecuadamente controladas.
En primer lugar, debemos mencionar algunos de los aspectos técnicos necesarios para obtener buenos resultados al considerar el análisis PESI-MS. El factor más crítico en PESI es el mantenimiento de la eficiencia de ionización durante el análisis. Para ello, es aconsejable ajustar y optimizar la distancia entre la punta de la aguja y la superficie de la muestra, para generar un TIC estable refiriéndose al monitor de ordenador durante el análisis. Para ello, es necesario cambiar la profundidad de la aguja de una manera escalonada para lograr el TIC máximo. Debido a que la duración de la ionización es relativamente corta en comparación con ESI, PESI no es ideal para la reproducibilidad o cuantificación. En segundo lugar, debido a que la forma de la punta de la aguja juega un papel muy importante en la ionización mediante la formación de un cono Taylor ideal que sirve como fuente de iones, se debe tener cuidado de no deformar la punta de la aguja. La deformación de la punta puede conducir a una menor eficiencia de ionización.
Si bien PESI es ventajoso porque se puede aplicar directamente a muestras frescas (por ejemplo, hígado, riñón y cerebro) y organismo vivo sin tratamiento especial, es relativamente sensible a otros contaminantes exógenos porque puede ionizar casi todos los componentes contenidos en un fluido21,22,23. Es decir, la desventaja de la ventaja de omitir el pretratamiento de muestras significa que PESI-MS está en desventaja en varias situaciones que a menudo se encuentran en experimentos biológicos. Como se explica en la sección de protocolo, PESI es sensible a la contaminación por conservantes de ARN, aldehídos y compuestos poliméricos como los criogeles que a menudo se utilizan para la preparación histológica. Los coágulos sanguíneos pueden adherirse a la aguja PESI y a menudo enmascarar los espectros previstos. Además, la hemólisis de los glóbulos rojos libera la hemoglobina, y el ion férrico disociado da lugar a espectros mucho más fuertes que los derivados de los analitos previstos. Los compuestos de polímeros también proporcionan picos espectrales periódicos que superponen los espectros derivados de los analitos previstos, lo que hace mucho más difícil interpretar los datos reales debido al ruido(Figura 8). Para evitar cualquier problema en la adquisición de espectros de masas, es aconsejable seguir nuestro protocolo, tomando nota especial de las referencias a la contaminación. A este respecto, la aplicación de PESI es limitada en algunos casos.
Otra desventaja de PESI reside en su proceso de ionización relativamente inestable, que nos obliga a ajustar la profundidad de la aguja de la sonda a los analitos. Además, esta técnica puede cubrir un área muy restringida en un solo análisis. Debido al tamaño muy pequeño de la punta de la aguja que se aplica directamente al tejido, el análisis PESI-MS no es tan completo como el análisis 2D que se puede lograr con una espectrometría de masas de imágenes basada en MS MALDI-TOF o imágenes basadas en DESI7,8. PESI puede, sin embargo, reconstruir una imagen de la formación del hipocampo, aunque toma varias horas23 porque el escaneo 2D de una muestra toma mucho tiempo, principalmente debido a la inestable eficiencia de ionización de esta técnica. Teniendo esto en cuenta, las imágenes espectrales de masa según PESI-MS no son una aplicación valiosa.
En cuanto a las propiedades electroquímicas de PESI, el volumen y la concentración de la muestra que se adhiere a la punta de la aguja es crítico18,ya que el efecto de supresión se atenúa un poco al reducir el tamaño del electrospray. Teniendo en cuenta que PESI es la miniaturización de ESI, las muestras deben diluirse idealmente para evitar formar un purines en la punta. Por lo tanto, la adición de aproximadamente 30 l de etanol al 50% es necesaria para lograr una ionización eficiente cuando se emplea el método de tejido directo(Figura 2B). Esto maximiza la eficiencia de la ionización y logra la ionización casi completa de las moléculas unidas a la punta de la aguja.
Elegir el método más adecuado de procesamiento de datos es muy importante cuando se utiliza este sistema24. En cuanto a la implementación del aprendizaje automático para cualquier diagnóstico de enfermedad, la construcción de una base de datos es necesaria para establecer una referencia para clasificar o categorizar enfermedades7. Por ejemplo, hemos utilizado la máquina de vectores de soporte o la regresión logística para hacer un diagnóstico de neoplasias malignas hepáticas primarias25.
PESI-MS es una técnica versátil y fácil que tiene un gran potencial para la detección de drogas, pruebas de dopaje, pruebas de inocuidad de los alimentos de productos agrícolas26,y algunas pruebas ambientales. Debido a que esta unidad de ionización es compatible con otros espectrómetros mediante la preparación de un accesorio para cada instrumento específico, PESI se puede aplicar a varios propósitos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
El autor correspondiente fue financiado por Shimadzu, un fabricante y proveedor de instrumentope PESI-MS.
Acknowledgments
Agradecemos a Ayumi Iizuka por operar el PESI-MS y Kazuko Sawa-nobori por su asistencia de secretaría. Agradecemos a Bronwen Gardner, Ph.D., del Grupo Edanz (www.edanzediting.com/ac) por editar un borrador de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
