Summary
Cet article introduit des méthodes de préparation d’échantillons pour une méthode d’analyse unique en temps réel basée sur la spectrométrie de masse ambiante. Cette méthode nous permet d’effectuer une analyse en temps réel des molécules biologiques in vivo sans aucun prétraitement spécial.
Abstract
La spectrométrie de masse (MS) est un outil puissant en chimie analytique parce qu’elle fournit des informations très précises sur les molécules, telles que les rapports masse-charge (m/z), qui sont utiles pour déduire les poids moléculaires et les structures. Bien qu’il s’agit essentiellement d’une méthode d’analyse destructrice, les progrès récents dans la technique d’ionisation ambiante nous ont permis d’acquérir des données tout en laissant le tissu dans un état relativement intact en termes d’intégrité. L’ionisation par électrospray (PESI) est une méthode dite directe parce qu’elle ne nécessite pas de prétraitement complexe et long des échantillons. Une aiguille fine sert de cueilleur d’échantillons, ainsi qu’un émetteur d’ionisation. Basé sur la propriété très forte et fine de l’extrémité de la sonde, la destruction des échantillons est minime, ce qui nous permet d’acquérir l’information moléculaire en temps réel des êtres vivants in situ. Ici, nous introduisons trois applications de la technique PESI-MS qui seront utiles pour la recherche et le développement biomédicaux. L’une concerne l’application aux tissus solides, qui est l’application de base de cette technique pour le diagnostic médical. Comme cette technique ne nécessite que 10 mg de l’échantillon, elle peut être très utile dans les milieux cliniques de routine. La deuxième application est pour le diagnostic médical in vitro où le sérum de sang humain est mesuré. La capacité de mesurer des échantillons de fluides est également utile dans diverses expériences biologiques où un volume suffisant d’échantillons pour les techniques analytiques conventionnelles ne peut pas être fourni. La troisième application penche vers l’application directe d’aiguilles de sonde chez les animaux vivants, où nous pouvons obtenir une dynamique en temps réel de métabolites ou de médicaments dans des organes spécifiques. Dans chaque application, nous pouvons déduire les molécules qui ont été détectées par la SP ou utiliser l’intelligence artificielle pour obtenir un diagnostic médical.
Introduction
La spectrométrie de masse (MS) est une réalisation technologique du réductionnisme; il réduit l’objet de l’analyse à une unité qui peut être interprétée sur la base d’espèces moléculaires ou de cascades. Il s’agit donc d’une méthode représentative de chimie analytique. Il est composé de quatre processus : l’ionisation, l’analyse, la détection et l’acquisition spectrale. Parce que l’ionisation de la molécule est le premier processus de spectrométrie de masse, elle limite généralement la forme des analytes à traiter. La plupart des procédures d’ionisation exigent la destruction de la structure, de la morphologie et des processus biologiques en temps réel des échantillons organiques. Par exemple, l’ionisation par électrospray (ESI) MS exige que les échantillons soient dans un état liquide pour une ionisation efficace1. Les échantillons doivent donc passer par une préparation biochimique complexe, qui modifie la composition des molécules. Alternativement, tandis que l’ionisation de desorption laser matricielle-assistée (MALDI) MS peut reconstruire des cartes moléculaires du tissu sectionné mince2,3, son efficacité d’ionisation est trop basse pour détecter toutes les molécules dans les échantillons, et il est particulièrement pauvre en analysant des acides gras. Compte tenu de ces limitations, l’ionisation de l’électrospray de sonde (PESI)4 peut être employée pour observer les changements en temps réel dans les systèmes biologiques in situ sans détruire l’intégrité structurale5,alors que l’organisme biologique observé est techniquement dans un état vivant. Une aiguille très fine est utilisée dans ce cas qui sert simultanément de cueilleur d’échantillons et d’émetteur d’ions. Cela signifie que les séquences complexes de prétraitement de l’échantillon peuvent être contournées pour obtenir des spectres de masse qui reflètent les composants moléculaires du système vivant in situ.
Il existe plusieurs autres méthodes d’ionisation qui rivalisent avec PESI-MS. L’un est la spectrométrie de masse d’ionisation par évaporation rapide (REIMS)6. Cette technique fonctionne bien pendant la chirurgie car elle est assemblée avec un couteau électrique et recueille le panache d’ion généré pendant l’incision. Bien que REIMS soit très utile pour la chirurgie, il s’agit essentiellement d’une méthode destructrice qui nécessite l’ablation électrique du tissu. Par conséquent, il n’est pas utile pour l’analyse détaillée des cellules et des tissus dans un échantillon de préparatif ou dans des analyses de laboratoire. En outre, parce qu’il recueille une grande quantité de panache contenant des débris de tissu, il nécessite un entretien prolongé des dispositifs après chaque utilisation, limitant ainsi l’utilisation de cette machine à des procédures chirurgicales spéciales. Une méthode similaire, appelée spectrométrie de masse d’ionisation de desorption au laser (LDI-MS)7, est une autre technique qui est non invasive et utile pour l’analyse de surface. Parce que cette technique est bonne à la numérisation de la surface d’un spécimen, il réalise une analyse bidimensionnelle complète comme la spectrométrie de masse d’imagerie MALDI8,9. Cependant, comme le LDI-MS ne s’applique qu’à l’analyse de surface, PESI-MS est avantageux pour analyser les échantillons, par exemple, dans le tissu. Une autre technique, le MasSpec Pen10, a été rapporté pour atteindre une grande spécificité et sensibilité dans le diagnostic du cancer de la thyroïde, mais le diamètre de la sonde est de l’ordre de mm et il est spécifique pour l’analyse de surface, ce qui signifie qu’il ne peut pas détecter de petites nodules de cancer ou des lésions profondément localisées. De plus, comme cette méthode utilise un canal d’écoulement microcapillaire encastré dans le stylo de la sonde, la contamination croisée doit être prise en considération, semblable à l’IDL-MS. D’autres techniques existent qui ont été appliquées aux milieux cliniques, tels que la sonde de flux et l’écouvillon de forme d’ionisation11,mais elles ne sont pas répandues.
PESI est une miniaturisation extrême de l’ESI, dans laquelle le capillaire du nano-électrospray converge vers une aiguille solide avec un rayon de courbure de pointe de plusieurs centaines de nm. L’ionisation a lieu dans la zone extrêmement restreinte de la pointe de l’aiguille en formant un cône Taylor, sur lequel les échantillons restent jusqu’à ce que l’ionisation de tout le liquide sur la pointe est terminée12. Si l’analyte reste sur la pointe de l’aiguille métallique, la charge excédentaire est générée en permanence à l’interface entre l’aiguille métallique et les analytes. Par conséquent, l’ionisation séquentielle des molécules se produit en fonction de leur activité de surface. Cette propriété fait de la pointe de l’aiguille une sorte de chromatogramme, séparant les analytes en fonction de leur activité de surface. Plus techniquement, les molécules avec l’activité de surface plus forte viennent à la surface du cône de Taylor et sont ionisées plus tôt que ceux avec l’activité de surface plus faible, qui adhèrent à la surface de l’aiguille jusqu’à la fin du processus d’ionisation. Ainsi, l’ionisation complète de toutes les molécules captées par l’aiguille est atteint13. En outre, parce que cette technique n’implique pas l’ajout de solvant superflu à l’échantillon, plusieurs centaines de femtolitres sont suffisants pour obtenir des spectres de masse assez forts pour une analyse plus approfondie14. Ces propriétés sont avantageuses pour l’analyse d’échantillons biologiques intacts. Cependant, un inconvénient majeur de PESI-MS réside dans la discontinuité dans l’ionisation en raison du mouvement de réciprocité de l’aiguille le long de l’axe vertical, semblable à une machine à scier. L’ionisation n’a lieu que lorsque la pointe de la sonde atteint le point le plus élevé lorsque la hauteur de l’ion orifice est alignée sur l’axe horizontal. L’ionisation cesse pendant que l’aiguille ramasse des échantillons, de sorte que la stabilité de l’ionisation n’est pas égale à celle de l’ESI classique. Par conséquent, PESI-MS n’est pas une méthode idéale pour la protéomique.
À ce jour, PESI-MS a été appliqué principalement à l’analyse des systèmes biologiques, couvrant un large éventail de domaines allant de la recherche fondamentale aux milieux cliniques. Par exemple, l’analyse directe des tissus humains préparés pendant la chirurgie a pu révéler l’accumulation de triacylglycérol dans le carcinome rénal15 et le carcinome squamous pharyngé16. Cette méthode peut également mesurer des échantillons liquides, tels que le sang, pour se concentrer sur le profil lipidique. Par exemple, certaines molécules ont été délimitées lors de changements alimentaires chez les lapins; il a été rapporté que certaines de ces molécules ont diminué aux stades très tôt des expériences, indiquant la sensibilité élevée et l’utilité de ce système pour le diagnostic clinique17. En outre, l’application directe à un animal vivant a permis la détection des changements biochimiques du foie après seulement une nuit de jeûne5. Zaitsu et coll.18 ont revisité cette expérience5 et analysé les profils métaboliques du foie de la même manière, avec des résultats qui ont renforcé la stabilité et la reproductibilité de notre méthode originale. En outre, nous avons pu discriminer le tissu cancéreux du foie non cancéreux environnant chez les souris utilisant cette technique19. Il s’agit donc d’une technique polyvalente de spectrométrie de masse qui est utile dans divers milieux, in vivo et in vitro. D’un autre point de vue, le module PESI peut être fait pour s’adapter à divers spectromètres de masse en ajustant l’attachement de montage. Dans ce court article, nous introduisons les bases et les exemples d’applications (Figure 1), y compris les applications avec des animaux vivants5.
Selon les règlements et les lois de chaque pays, certaines parties de ce protocole devront être révisées pour répondre aux critères de chaque institution. L’application à l’organisme vivant est la plus intéressante et la plus difficile, car elle peut fournir des changements biochimiques ou métaboliques dans les tissus ou les organes chez les animaux vivants in situ. Bien que cette demande ait été approuvée par le comité institutionnel des soins aux animaux de l’Université de Yamanashi, en 20135, une autre ronde d’approbation sera maintenant nécessaire en raison des changements récents dans la réglementation pour les expériences animales. Plusieurs modifications du régime expérimental sont donc recommandées. En ce qui concerne les spectres de masse obtenus dans les expériences, en tenant compte des fluctuations des spectres de masse entre chaque mesure, il n’existe aucun système de partage d’informations spectrales commun à la communauté de séquençage des nucléotides. Il faut faire attention lorsque l’opérateur manipule l’aiguille pour éviter les accidents de bâton d’aiguille, en particulier lorsqu’il retire l’aiguille du porte-aiguille. Un dispositif spécial pour détacher l’aiguille est très utile à cet effet. Étant donné que le compartiment du module PESI est une chambre fermée hermétique, la fuite du panache d’ion ne se produit pas si le spectromètre de masse est actionné selon les instructions.
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Protocol
Le comité institutionnel pour les soins aux animaux de l’Université de Yamanashi a approuvé tous les protocoles et l’utilisation d’animaux expérimentaux énoncés dans les présentes. L’utilisation d’échantillons humains a été approuvée par le comité d’éthique institutionnelle de l’Université de Yamanashi.
1. Préparation des tissus solides
REMARQUE : Les échantillons doivent être conservés sur la glace après leur retrait du corps animal ou humain afin de préserver la fraîcheur des tissus. Si les mesures ne suivent pas immédiatement la dissection, il est recommandé de stocker les tissus à -80 oC. Il n’est pas conseillé de placer le tissu dans n’importe quel type de tampon ou salin, car ils peuvent extraire certains contenus du tissu. Les tissus qui ont été fixés avec des aldéhydes ou incorporés dans la paraffine/cire ou le cryogel ne conviennent pas aux mesures de la SP.
- Couper le spécimen de tissu à environ 2 x 2 x 2 mm à l’aide d’un scalpel ou d’un couteau. Alternativement, percer l’échantillon avec un trepan (un poinçon de biopsie jetable, taille de forage 3 mm) utilisé pour l’examen de la peau. Dans ce cas, réduire la longueur de la colonne à 2 mm.
REMARQUE : N’importe quel tissu peut être analysé à l’aide de cette méthode. Dans cette expérience, le foie15 et le rein19,ont été analysés avec succès pour obtenir des spectres de masse. En général, les organes parenchymes donnent de bons spectres de masse, tandis que ceux qui ont des composants fibreux ne le font pas. - Si le tissu est contaminé par le sang, lavez-le brièvement avec de la saline tamponnée de phosphate glacée.
REMARQUE : Pour minimiser les lésions tissulaires post mortem, terminez cette étape, dès que possible, à température ambiante. Si les mesures ne sont pas effectuées immédiatement, congelez le tissu dans de l’azote liquide et entreposez-les à -80 oC. - Placer l’échantillon coupé ou perforé (environ 10 mg) dans un microtube en plastique et ajouter 100 l d’éthanol à 50 %.
REMARQUE : Le poids exact des échantillons n’est pas déterminé parce que la spectrométrie de masse utilisée dans ce système ne fournit pas de données quantitatives. Environ 10 mg est optimal pour le tissu parenchymal. - Homogénéiser l’échantillon à l’aide d’un micropestle.
- Placer 10 l de l’homogénéisme dans le puits de la cartouche (Figure 2).
- Placez la cartouche dans la chambre d’ionisation du spectromètre de masse et installez la sonde à aiguille s’inox qui sera utilisée pour l’ionisation de l’échantillon (figure 2).
REMARQUE : Les aiguilles de sonde sont fournies par le fabricant. Ils sont en acier inoxydable et ont un rayon de courbure d’environ 400 nm. - Fermez fermement le couvercle de la chambre pour activer automatiquement le dispositif de sécurité.
- Démarrez l’ordinateur de bord en cliquant sur l’icône Démarrer pour l’analyser. À l’aide des panneaux à l’écran, appliquer une tension de 2,3 kV sur l’aiguille pour générer l’électrospray et s’assurer que la fréquence de l’aiguille est de 3 Hz.
- Attendez 30 s pour que la mesure soit terminée.
REMARQUE : La session cesse automatiquement lorsque l’acquisition de données est terminée. La qualité de l’analyse est surveillée par un chromatogramme ionique total (TIC). Le temps de mesure est défini pour obtenir les spectres de masse représentatifs et peut être raccourci ou prolongé. - Disposer de la cartouche et de l’aiguille dans un système de biorisque après avoir mesuré chaque échantillon.
REMARQUE : Un seul échantillon peut être mesuré à la fois. Il n’est pas nécessaire de calibrer la machine avant chaque mesure; l’étalonnage dépend de l’examen régulier par le fournisseur une fois tous les six mois. - Analyser les spectres de masse et exporter les données de texte spectral de masse à l’aide du logiciel associé au spectromètre de masse (voir tableau des matériaux) comme indiqué dans les étapes ci-dessous (Figure 3).
- Cliquez sur le fichier lcd dans la fenêtre du navigateur de fichiers de données du logiciel.
- Choisissez et cliquez sur un seul pic sur la fenêtre du spectre de masse et de représenter automatiquement un chromatogramme d’ion extrait (EIC).
- Vérifiez le TIC et l’EIC et cliquez sur l’icône du spectre moyen pour sélectionner la fenêtre de plage de temps pour générer le spectre de masse.
REMARQUE : Dans cette analyse, les molécules cibles apparaissent dans la fenêtre de masse-charge (m/z) (Figure 3). En outre, parce que la durée de l’ionisation par seul coup de mouvement d’aiguille est très courte, tous les spectres de masse obtenus sont essentiellement des spectres moyens sur 10 s (300 scans). - Générez un fichier texte contenant l’intensité m/z et ion en cliquant sur l’onglet Export pour une analyse plus approfondie. Ce fichier texte peut être stocké dans n’importe quel dossier.
REMARQUE : Tout agent de conservation de l’ARN affectera le modèle spectral indigène des échantillons. En outre, il est conseillé de manipuler et de stocker des tissus sans liquide (comme la saline tamponnée de phosphate) pour empêcher l’élution des composants moléculaires du tissu dans le liquide pendant le stockage. Idéalement, des échantillons congelés frais ou frais sans aucun traitement sont utilisés.
2. Préparation des fluides corporels (sérum)
REMARQUE: Cette procédure entière est presque identique à celle utilisée pour les tissus solides. La cartouche pour l’échantillon de liquide est disponible auprès du fabricant. Étant donné que la contamination par les globules rouges (RBC) peut considérablement diminuer l’efficacité de l’acquisition spectrale du composant prévu (plasma ou sérum), assurez-vous d’éliminer tous les RBC en centrifuge avant les mesures.
- Prenez 10 ll de l’échantillon de sérum et mettez-le dans un microtube de 1,5 ml.
REMARQUE : Le sérum frais et stocké peut être utilisé. - Ajouter 190 l d’éthanol à 50 % dans le tube de 1,5 ml, puis vortexr pendant 2 min à température ambiante.
- Centrifuger le liquide à 15 000 x g pendant 1 à 5 min à 4 oC.
- Transférer 10 lde de supernatant dans le puits de la cartouche.
- Placez la cartouche dans la chambre d’ionisation de la machine et installez la sonde à aiguilles en acier inoxydable qui sera utilisée pour l’ionisation de l’échantillon (figure 2).
- Fermez fermement le couvercle de la chambre pour activer automatiquement le dispositif de sécurité.
- Démarrez l’ordinateur de bord en cliquant sur l’icône Démarrer pour ioniser.
- Jetez la cartouche et l’aiguille de l’échantillon décrites dans 1.10 une fois que les mesures ont été prises.
- Analyser les ensembles obtenus d’EIC tels qu’indiqués ci-dessous (figure 3).
- Ouvrez le fichier lcd sur le navigateur de données.
- Cliquez sur un seul pic pour afficher le TIC et l’EIC.
- Sélectionnez la fenêtre de plage de temps pour générer des spectres de masse à l’aide de l’icône de spectre moyenne.
- Exporter le fichier généré contenant à la fois l’intensité m/z et ion d’un pic correspondant en cliquant sur l’onglet exportation sur le moniteur.
REMARQUE: Cette procédure peut être appliquée à la salive, l’urine, et d’autres fluides corporels ainsi.
3. Préparation pour PESI-MS in vivo dans l’organisme vivant
REMARQUE: Dans cette section, une application pour surveiller le profil métabolique de 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) dans un modèle de souris vivante est introduite. Utilisez des conditions aseptiques partout.
- Infuser 100 l de 100 mM 5-FdU dans la veine de la queue d’une souris de 2 mois (poids d’environ 20 g).
REMARQUE : Il n’y a pas de préférence pour le sexe, l’âge ou la souche de souris. Bien que ce protocole ait été approuvé au moment où nous avons effectué l’expérience5, la faisabilité de cette expérience dépend des restrictions éthiques du pays dans lequel elle sera effectuée. - Anesthésiez la souris selon votre protocole de soins aux animaux approuvé. Évaluer la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement de la queue.
REMARQUE : Si l’utilisation du pentobarbital de sodium n’est pas autorisée par le comité d’éthique pour les expériences animales, d’autres méthodes peuvent être utilisées, comme l’hydrochlorure de kétamine. - Raser la cavité abdominale à l’aide d’un rasoir électrique et appliquer une pommade vétérinaire sur les yeux.
- Placez la souris anesthésié en position de supine et fixez les pattes sur la plaque en plastique à l’aide d’un ruban adhésif de réparation. Frotter le site chirurgical avec des gommages de 70% d’alcool trois fois.
- Couper la cavité abdominale à l’aide de ciseaux. Tout d’abord, couper la peau latéralement (10 mm) juste au-dessus du diaphragme. Coupez latéralement le muscle de la paroi abdominale et du péritoine (environ 7 mm) et maintenez la plaie ouverte à l’aide de fil inoxydable pour exposer la surface du foie.
REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de perfuser la surface du foie. - Appliquer la pointe de l’aiguille de la sonde à la surface du foie. Ajuster la profondeur de l’aiguille à environ 0,5 mm de profondeur pour optimiser l’efficacité de l’ionisation, en vérifiant simultanément les TIC et les motifs spectrals. Définir la haute tension à 2,3 kV et la fréquence à 3 Hz sur l’écran du panneau de commande.
- Retirer l’animal de la plaque en plastique.
- Suturer la plaie à l’aide d’une suture intestinale chirurgicale et retourner la souris à la cage. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris conscience pour maintenir la charge sévère. Ne retournez pas la souris à la compagnie d’autres animaux jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie.
- Effectuer le cours du temps de l’intensité ionique dans EIC et la procédure de la représentation EIC comme dans 1.11.1 à 1.11.4.
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Representative Results
Comme le montre la figure 3, les données obtenues par la technique PESI-MS sont les spectres de masse, dont le m/z varie de 10 à 1 200 dans ce système. Alors que l’on peut détecter des molécules jusqu’à m/z 2000, il y avait peu de pics obtenus en utilisant cette technique sur la gamme de masse de m/z 1200. Par conséquent, nous avons analysé les pics de m/z 10 à 1200. Il y avait des groupes visibles de pics autour de m/z 800 et 900; le premier représente des composants de membrane cellulaire, tels que des espèces de choline de phosphatidyl (PC), et le second représente le glycérol triacyl (TAG). La figure 4 montre les spectres de masse d’un rein humain normal et d’un carcinome rénal de cellules (RCC). Les spectres de masse ont été obtenus en utilisant la méthode de tissu direct expliquée dans le protocole 1. Parce que le type de cellule claire RCC accumule TAG dans le cytoplasme, un groupe de spectres autour de m/z 900 est très prononcé. Le résultat de la figure 4 a été obtenu par la méthode d’extraction introduite à la figure 1 pour les échantillons solides.
Puisque le métabolisme de lipide du carcinome hépatocellulaire change pendant la progression de la maladie20,il est possible de surveiller les étapes de la maladie par biopsie courante combinée avec PESI-MS. Le résultat de la figure 5 illustre les différences de modèle spectral entre le tissu hépatique normal et le HCC. Surtout, il ya plusieurs spectres remarquables de TAG dans HCC. Si la résolution du spectromètre de masse est supérieure, il est possible que l’annotation moléculaire de chaque spectre permette l’élucidation du mécanisme moléculaire du cancer, ainsi que la physiologie cellulaire normale.
Une surveillance en temps réel du métabolisme des médicaments peut être effectuée à l’aide de PESI. Dans nos expériences, la pharmacodynamique de l’agent anti-oncotique 5-FdU a été surveillée au-dessus de 10 s après avoir été injectée par la veine de queue d’une souris. La détection très rapide des spectres n’a été observée que quelques secondes après l’injection du médicament (Figure 6), ce qui implique le transport rapide de la drogue par la circulation sanguine vers le foie. L’intensité des adducts de sodium de 5-FdU a diminué avec un bref défaut du signal d’ion dans l’enregistrement à environ 6-7 s après avoir commencé la mesure. C’était en raison de la profondeur variable de l’aiguille PESI dans le parenchyme de foie, qui était le résultat des mouvements de corps de la souris anesthésié. Par conséquent, il faut prendre soin d’ajuster la profondeur de l’aiguille PESI pour la mesure en temps réel des animaux vivants. Il n’y a aucun moyen recommandé de trouver la profondeur optimale de l’aiguille, mais il devient évident avec la pratique.
Des échantillons de sang de trois individus ont été analysés par PESI-MS. Dans ce cas-ci, 10 L de sérum ont été mélangés avec 190 l d’éthanol de 50% et ont ensuite été utilisés pour l’analyse PESI-MS. Bien que les modèles spectrals globaux semblent partager plusieurs pics communs (Figure 7), il existe de nombreuses différences infime dans les spectres de ces trois personnes. Ils sont une empreinte digitale de chaque personne en termes d’activités métaboliques. Pour des informations détaillées sur les identités moléculaires, il est nécessaire d’utiliser une machine haut de gamme. Le spectromètre de masse utilisé dans les expériences n’a pas fourni une résolution assez élevée pour identifier les molécules.
S’il y a contamination par des composés polymères, les spectres d’origine de la figure 4 donnent lieu à des pics périodiques et ostentatoires superposés qui brouillent les spectres de l’échantillon d’origine (Figure 8). Pour démontrer cela expérimentalement, nous avons ajouté le triol de polypropylène glycérol (PPGT) à 2,5% pour reproduire un cas de contamination. Presque tous les spectres spécifiques observés à la figure 8 ont été masqués par l’ajout de PPGT.
Figure 1 : Aperçu schématique d’un flux de préparation d’échantillons. Pour les échantillons, une cartouche d’échantillon spécialisée est idéale pour l’acquisition de données stables. L’analyse d’échantillons liquides est le moyen le plus simple d’effectuer PESI-MS, en plaçant simplement la solution dans la cartouche. Il existe deux méthodes pour appliquer cette méthode aux tissus solides. L’application directe de PESI au tissu est très facile et rapide, tandis que la méthode d’extraction permet d’obtenir une acquisition beaucoup plus stable des spectres en fonction de l’espèce échantillonnée. Dans cette procédure, un petit morceau de l’échantillon de tissu est mis dans un microtube avec 100 L d’éthanol de 50% et homogénéisé avec un micropestle. 10 L de l’homogénéisme résultant est ensuite utilisé pour la spectrométrie de masse. Dans le cas de l’analyse d’un animal vivant, 30 L d’éthanol à 50 % sont placés sur la surface sérolelle de l’organe cible, suivi s’agit d’une mesure. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Aperçu et composantes de base du PESI-MS. Un spectromètre de masse équipé d’un module PESI. La partie d’ionisation est installée dans une chambre fermée où sont placés l’inlet d’ion, le support d’aiguille et le support d’échantillon. L’aiguille est prête à l’emploi, et l’aiguille jetable en acier inoxydable est fixée au support de l’aiguille. Il est placé dans le spectromètre de masse juste après avoir placé la cartouche d’échantillon dans la chambre. L’angle de courbure moyen de l’aiguille est de 400 nm. La cartouche pour placer l’échantillon est jetable et faite de polymères en plastique. Il a un petit puits pour placer l’échantillon liquide (flèche rouge). Après avoir mis l’échantillon solide dans le puits, la cassette est pliée pour pincer l’échantillon et sceller le puits. Pour une cartouche d’échantillon liquide, une autre est utilisée qui ne nécessite pas de pliage, et il s’agit d’une version recommandée qui est supérieure aux échantillons solides. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Interface utilisateur graphique (GUI) pour PESI-MS. Toutes les procédures de génération de spectres de masse à partir du chromatogramme total d’ion (TIC) peuvent être exécutées avec le logiciel associé. Après l’ouverture du fichier lcd dans le navigateur de données, le TIC peut être affiché, et la plage de temps peut être sélectionnée pour générer des spectres de masse. Les spectres de masse générés peuvent être exportés sous forme de données textuelles contenant à la fois le rapport masse/charge (m/z) et l’intensité ionique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Le carcinome rénal humain de cellules montre des crêtes caractéristiques des lipides neutres. Il y avait des pics relativement forts dans les spectres du tissu rénal humain de carcinome (RCC) qui n’ont pas été identifiés dans le tissu non cancéreux environnant. Ces pics représentent principalement le triacylglycérol (TAG) à environ le rapport masse-charge (m/z) 900. L’acquisition de Spectral a été réalisée en utilisant le mode ion positif par analyse directe. La haute tension a été fixée à 2,3 kV. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Exemple de données acquises dans les tissus hépatiques normaux et le carcinome hépatocellulaire humain (HCC). Le panneau supérieur dépeint les spectres d’un tissu humain de foie où une lésion néoplastique n’était pas présente, mais d’un patient présentant l’hépatite chronique et la cirrhose de foie. Le panneau inférieur montre les spectres moyens de HCC du même patient. En un coup d’œil, bien que ces deux ont des modèles spectrals très similaires, il ya beaucoup de petites différences dans le modèle spectral. L’abscissa montre le rapport masse-charge (m/z) et la coordination représente l’intensité relative de chaque spectre. L’acquisition de spectres a été effectuée en utilisant le mode ion positif après l’extraction du tissu, tel que représenté dans la figure 2C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Mesures en temps réel du métabolisme des médicaments. Changements métaboliques dans 5-FdU injectés par voie intraveineuse dans le vaisseau arrière d’une souris. La détection très rapide et sensible de 5-FdU avec l’adduct de sodium a été réalisée dans le foie in situ. En raison de l’ionisation instable pendant la mesure, la cessation du signal peut être notéà environ 6-7 s. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7 : Exemples de données provenant de trois personnes. Le sérum humain de trois individus a été analysé utilisant PESI-MS. Il y avait des différences claires dans les modèles spectrals entre les individus. Les données ont été obtenues en utilisant le mode ion positif. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 : Les composés polymères interfèrent avec l’acquisition précise de données. En raison de l’émergence périodique de pics spectraux superposés sur le spécimen original, il devient difficile d’interpréter les données avec précision. Dans ce cas, les spectres dérivés du glycérol triol de polypropylène (PPGT) apparaissent comme une superpose bruyante. Ces composés, habituellement utilisés pour l’étalonnage, masquent les spectres d’origine du foie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Bien que PESI soit un dérivé de l’ESI pour la spectrométrie de masse4, il est plus avantageux pour la surveillance de la métabolomique en temps réel, ainsi que pour l’analyse des réactions biochimiques sans effectuer de prétraitements complexes ou longs5,14,15,17. Il s’agit d’une technique de spectrométrie de masse facile et instantanée qui peut être appliquée à l’état intégré des organismes vivants. Comme il n’est pas nécessaire de cascades complexes de prétraitements d’échantillons, il y a une possibilité beaucoup plus grande d’évaluer la composition moléculaire de l’ensemble du spécimen, car nous évitons toute perte possible de spécimen qui peut se produire dans l’ESI classique, ce qui nécessite des étapes complexes de prétraitements d’échantillons utilisant de grandes quantités de solvants organiques. Par conséquent, PESI nous permet d’obtenir beaucoup plus d’informations de l’échantillon si toutes les conditions sont correctement contrôlées.
Nous devons d’abord mentionner certains des aspects techniques nécessaires pour obtenir de bons résultats lors de l’examen de l’analyse PESI-MS. Le facteur le plus critique dans PESI est le maintien de l’efficacité d’ionisation pendant l’analyse. Pour ce faire, il est conseillé d’ajuster et d’optimiser la distance entre le bout de l’aiguille et la surface de l’échantillon, pour générer une TIC stable en se référant au moniteur de l’ordinateur pendant l’analyse. Pour ce faire, il est nécessaire de changer la profondeur de l’aiguille d’une manière progressive pour atteindre le TIC maximal. Étant donné que la durée de l’ionisation est relativement courte par rapport à l’ISE, PESI n’est pas idéal pour la reproductibilité ou la quantification. Deuxièmement, parce que la forme de la pointe de l’aiguille joue un rôle très important dans l’ionisation en formant un cône Taylor idéal qui sert de source d’ion, il faut prendre soin de ne pas déformer la pointe de l’aiguille. La déformation de la pointe peut entraîner une baisse de l’efficacité de l’ionisation.
Bien que PESI est avantageux parce qu’il peut être appliqué directement à des échantillons frais (par exemple le foie, les reins et le cerveau) et l’organisme vivant sans traitement spécial, il est relativement sensible à d’autres contaminants exogènes, car il peut ioniser presque tous les composants contenus dans un fluide21,22,23. Autrement dit, l’inconvénient de l’avantage de sauter le prétraitement de l’échantillon signifie que PESI-MS est désavantagé dans plusieurs situations qui sont souvent rencontrées dans les expériences biologiques. Comme expliqué dans la section protocole, PESI est sensible à la contamination par les agents de conservation de l’ARN, les aldéhydes et les composés polymères tels que les cryogels souvent utilisés pour la préparation histologique. Les caillots de sang peuvent adhérer à l’aiguille PESI et souvent masquer les spectres prévus. En outre, l’hémolyse des RBC libère l’hémoglobine, et l’ion ferrique dissocié donne lieu à des spectres beaucoup plus forts que ceux dérivés des analytes prévus. Les composés polymères donnent également des pics spectrals périodiques qui recensent les spectres dérivés des analytes prévus, ce qui rend beaucoup plus difficile l’interprétation des données réelles en raison du bruit (Figure 8). Pour éviter tout problème dans l’acquisition de spectres de masse, il est conseillé de suivre notre protocole, en prenant note des références spéciales à la contamination. À cet égard, l’application de l’IEP est limitée dans certains cas.
Un autre inconvénient de PESI réside dans son processus d’ionisation relativement instable, qui nous oblige à ajuster la profondeur de l’aiguille de la sonde aux analytes. En outre, cette technique peut couvrir une zone très restreinte en une seule analyse. En raison de la très petite taille de la pointe de l’aiguille qui est directement appliquée sur le tissu, l’analyse PESI-MS n’est pas aussi complète que l’analyse 2D qui peut être réalisée avec une spectrométrie de masse d’imagerie mS MALDI-TOF ou l’imagerie À base de DESI7,8. PESI peut, cependant, reconstruire une image de la formation hippocampique, bien qu’il prenne plusieurs heures23 parce que la numérisation 2D d’un échantillon prend beaucoup de temps, principalement en raison de l’efficacité instable de cette technique d’ionisation. En tenant compte de cela, l’imagerie spectrale de masse par PESI-MS n’est pas une application précieuse.
En ce qui concerne les propriétés électrochimiques de PESI, le volume et la concentration de l’échantillon qui adhère à la pointe de l’aiguille est critique18, car l’effet de suppression est quelque peu atténué par la réduction de la taille de l’électrospray. Considérant que PESI est la miniaturisation de l’ESI, les échantillons doivent idéalement être dilués pour éviter de former une boue sur la pointe. Par conséquent, l’ajout d’environ 30 L d’éthanol à 50 % est nécessaire pour obtenir une ionisation efficace lorsque la méthode des tissus directs est utilisée (figure 2B). Ceci maximise l’efficacité d’ionisation et réalise l’ionisation presque complète des molécules attachées à la pointe de l’aiguille.
Choisir la méthode la plus appropriée de traitement des données est très important lors de l’utilisation de ce système24. En ce qui concerne la mise en œuvre de l’apprentissage automatique pour tout diagnostic de maladie, la construction d’une base de données est nécessaire pour établir une référence pour classer ou classer les maladies7. Par exemple, nous avons utilisé la machine vectorielle de soutien ou la régression logistique pour faire un diagnostic des malignités primaires de foie25.
PESI-MS est une technique polyvalente et facile qui a un grand potentiel pour le dépistage des drogues, des tests de dopage, des tests de sécurité alimentaire des produits agricoles26, et certains tests environnementaux. Étant donné que cette unité d’ionisation est compatible avec d’autres spectromètres en préparant une pièce jointe pour chaque instrument spécifique, PESI peut être appliquée à diverses fins.
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Disclosures
L’auteur correspondant a été financé par Shimadzu, un fabricant et fournisseur d’instrument PESI-MS.
Acknowledgments
Nous remercions Ayumi Iizuka d’avoir exploité le PESI-MS et Kazuko Sawa-nobori pour son aide au secrétariat. Nous remercions Bronwen Gardner, Ph.D., d’Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) d’avoir édité une ébauche de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
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