Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Published: February 19, 2020 doi: 10.3791/59942
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Yamanashi School of Medicine, 2Shimadzu Corporation

Summary

Denne artikkelen introduserer eksempelforberedelsesmetoder for en unik sanntidsanalytisk metode basert på omgivelsesmassespektrometriet. Denne metoden lar oss utføre sanntidsanalyse av de biologiske molekylene in vivo uten spesielle forbehandlinger.

Abstract

Massespektrometri (MS) er et kraftig verktøy i analytisk kjemi fordi det gir svært nøyaktig informasjon om molekyler, for eksempel masse-til-lade-forhold (m / z), som er nyttige for å utlede molekylvekter og strukturer. Selv om det i hovedsak er en destruktiv analytisk metode, har nylige fremskritt i omgivelsesteknikken gjort oss i stand til å skaffe data samtidig som vev i relativt intakt tilstand når det gjelder integritet. Probe elektrospray ionisering (PESI) er en såkalt direkte metode fordi det ikke krever kompleks og tidkrevende forbehandling av prøver. En fin nål fungerer som en prøveplukker, samt en ioniseringsemitter. Basert på den svært skarpe og fine egenskapen til sondespissen, er ødeleggelse av prøvene minimal, slik at vi kan skaffe oss sanntidsmolekylær informasjon fra levende ting in situ. Her i dette introduserer vi tre anvendelser av PESI-MS-teknikk som vil være nyttig for biomedisinsk forskning og utvikling. Man innebærer anvendelsen til solid vev, som er den grunnleggende anvendelsen av denne teknikken for medisinsk diagnose. Da denne teknikken bare krever 10 mg av prøven, kan det være svært nyttig i de rutinemessige kliniske innstillingene. Den andre applikasjonen er for in vitro medisinsk diagnostikk hvor humant blodserum måles. Evnen til å måle væskeprøver er også verdifull i ulike biologiske eksperimenter der et tilstrekkelig utvalgsvolum for konvensjonelle analytiske teknikker ikke kan gis. Den tredje applikasjonen lener seg mot direkte påføring av sondenåler hos levende dyr, hvor vi kan oppnå sanntidsdynamikk av metabolitter eller narkotika i bestemte organer. I hvert program kan vi utlede molekylene som har blitt oppdaget av MS eller bruke kunstig intelligens for å få en medisinsk diagnose.

Introduction

Massespektrometri (MS) er en teknologisk realisering av reduksjonisme; det reduserer gjenstand for analyse til en enhet som kan tolkes på grunnlag av molekylære arter eller kaskader. Derfor er det en representativ metode for analytisk kjemi. Den består av fire prosesser: ionisering, analyse, deteksjon og spektraloppkjøp. Fordi ionisering av molekylet er den første prosessen i massespektrometri, begrenser det vanligvis form av analytter som skal behandles. De fleste ioniseringsprosedyrer krever ødeleggelse av strukturen, morfologien og sanntids biologiske prosesser av organiske prøver. For eksempel krever elektrosprayionisering (ESI) MS at prøvene er i flytende tilstand for effektiv ionisering1. Prøver må derfor gå gjennom et komplekst biokjemisk preparat, som endrer sammensetningen av molekyler. Alternativt, mens matriseassistert laser desorpsjon ionisering (MALDI) MS kan rekonstruere molekylære kart over tynt snittet vev2,3,er ioniseringseffektiviteten for lav til å oppdage alle molekyler i prøvene, og det er spesielt dårlig til å analysere fettsyrer. Tatt i betraktning disse begrensningene, kan sonde elektrosprayionisering (PESI)4 brukes til å observere sanntidsendringene i biologiske systemer in situ uten å ødelegge den strukturelle integriteten5, mens den biologiske organismen som observeres er teknisk i en levende tilstand. En veldig fin nål brukes i dette tilfellet som fungerer samtidig som en prøvevelger og en ion emitter. Dette betyr at de komplekse prøveforbehandlingssekvensene kan omgås for å oppnå massespektra som gjenspeiler de molekylære komponentene i levende systemet in situ.

Det finnes flere andre ioniseringsmetoder som rivaliserer PESI-MS. En er rask fordampende ionisering massespektrometri (REIMS)6. Denne teknikken fungerer bra under operasjonen fordi den er montert med en elektrisk kniv og samler ionplume generert under snitt. Mens REIMS er svært nyttig for operasjonen, er det i hovedsak en destruktiv metode som krever elektrisk ablasjon av vevet. Derfor er det ikke nyttig for detaljert analyse av celler og vev i en forberedende prøve eller i laboratorieanalyser. Videre, fordi det samler en stor mengde plume som inneholder vevrusk, krever det langvarig vedlikehold av enhetene etter hver bruk, og dermed begrense bruken av denne maskinen til spesielle kirurgiske prosedyrer. En lignende metode, kalt laser desorpsjon serrometri (LDI-MS)7, er en annen teknikk som er ikke-invasiv og nyttig for overflateanalysen. Fordi denne teknikken er god til å skanne overflaten av en prøve, oppnår den omfattende todimensjonal analyse som MALDI imaging mass spectrometry8,9. Men fordi LDI-MS bare gjelder for overflateanalysen, er PESI-MS fordelaktig for å analysere prøvene, for eksempel i vevet. En annen teknikk, MasSpec Pen10, ble rapportert å oppnå høy spesifisitet og følsomhet i diagnostisering av skjoldbruskkjertelkreft, men diameteren på sonden er i rekkefølge av mm og det er spesifikt for overflateanalysen, noe som betyr at den ikke kan oppdage små knuter av kreft eller dypt lokaliserte lesjoner. Videre, da denne metoden bruker en mikrokapillær strømningskanal innebygd i probepennen, må krysskontaminering tas i betraktning, lik LDI-MS. Andre teknikker finnes som har blitt brukt på kliniske innstillinger, for eksempel flytsonde og ioniseringsform vattpinne11, men de er ikke utbredt.

PESI er ekstrem miniatyrisering av ESI, karakterisert ved at kapillæren til nanoelektrosprayen konvergerer på en solid nål med en tipkrumningsradius på flere hundre nm. Ionisering finner sted i det ekstremt begrensede området av nålespissen ved å danne en Taylor kjegle, hvor prøvene forblir til ionisering av all væsken på spissen er fullført12. Hvis analyten forblir på tuppen av metallnålen, genereres overflødig ladning kontinuerlig i grensesnittet mellom metallnålen og analytter. Derfor oppstår sekvensiell ionisering av molekyler avhengig av overflateaktiviteten. Denne egenskapen gjør nålen spissen en slags kromatogram, skille analytter avhengig av deres overflateaktivitet. Mer teknisk, molekyler med sterkere overflateaktivitet kommer til overflaten av Taylor kjegle og er ionisert tidligere enn de med svakere overflateaktivitet, som holder seg til overflaten av nålen til slutten av ioniseringsprosessen. Dermed oppnås fullstendig ionisering av alle molekyler plukket opp av nålen13. Videre, fordi denne teknikken ikke involverer tillegg av overflødig løsningsmiddel til prøven, er flere hundre femtoliter tilstrekkelig til å få massespektra sterk nok til videre analyse14. Disse egenskapene er fordelaktige for analyse av intakte biologiske prøver. Men en stor ulempe med PESI-MS ligger i diskontinuiteten i ionisering på grunn av den gjensidige bevegelsen av nålen langs den vertikale aksen, lik en sagingmaskin. Ionisering skjer bare når spissen på sonden når det høyeste punktet når høyden på ionåpningen er justert på den horisontale aksen. Ionisering opphører mens nålen plukker opp prøver, og så stabiliteten av ionisering er ikke lik det i konvensjonell ESI. Pesi-MS er derfor ikke en ideell metode for proteomikk.

Til dags dato har PESI-MS blitt brukt hovedsakelig til analyse av biologiske systemer, som dekker et bredt spekter av felt fra grunnleggende forskning til kliniske innstillinger. For eksempel var den direkte analysen av menneskelig vev utarbeidet under operasjonen i stand til å avsløre akkumulering av triacylglycerol i både nyrecellekarsinom15 og faryngeal plateepitelkarsinom16. Denne metoden kan også måle flytende prøver, for eksempel blod, for å fokusere på lipidprofilen. For eksempel har noen molekyler blitt avgrenset under kostholdsendringer i kaniner; Det ble rapportert at noen av disse molekylene redusert i svært tidlige stadier av forsøkene, noe som indikerer høy følsomhet og nytten av dette systemet for klinisk diagnose17. Videre tillot direkte søknad til et levende dyr påvisning av biokjemiske endringer i leveren etter bare en natt med faste5. Zaitsu et al.18 revisited dette eksperimentet5 og analysert metabolske profiler av leveren på nesten samme måte, med resultater som forsterket stabilitetog reproduserbarhet av vår opprinnelige metode. Videre var vi i stand til å diskriminere kreftvevet fra omkringliggende ikke-kreftlever hos mus ved hjelp av denne teknikken19. Derfor er dette en allsidig massespektrometriteknikk som er nyttig i ulike innstillinger, både in vivo og in vitro. Fra et annet synspunkt kan PESI-modulen gjøres for å passe ulike massespektrometre ved å justere monteringstilbehøret. I denne korte artikkelen introduserer vi det grunnleggende og eksemplene på applikasjoner (Figur 1), inkludert applikasjoner med levende dyr5.

I henhold til forskriftene og lovene i hvert land må deler av denne protokollen revideres for å oppfylle kriteriene for hver institusjon. Anvendelse på levende organisme er den mest interessante og utfordrende fordi det kan gi biokjemiske eller metabolske endringer i vev eller organer hos levende dyr in situ. Mens denne søknaden ble godkjent av institusjonellkomité for dyrepleie ved Universitetet i Yamanashi, i 20135,vil en annen runde med godkjenning nå være nødvendig på grunn av nylige endringer i regelverket for dyreforsøkene. Flere modifikasjoner i eksperimentell ordningen er derfor tilrådelig. Når det gjelder massespektra oppnådd i eksperimenter, tar svingninger i massespektra mellom hver måling i betraktning, er det ingen spektral informasjonsdelingssystem som er felles for nukleotidsekvenseringssamfunnet. Må utvises når operatøren håndterer kanylen for å unngå kanylestikkulykker, spesielt når nålen fjernes fra nåleholderen. En spesiell enhet for å løsne nålen er svært nyttig for dette formålet. Siden rommet på PESI-modulen er et lufttett, lukket kammer, oppstår ikke lekkasje av ion-plommen hvis massespektrometeret betjenes i henhold til instruksjonene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den institusjonelle komiteen for dyreomsorg ved Universitetet i Yamanashi godkjente alle protokollene og bruken av eksperimentelle dyr som er oppgitt her. Bruk av menneskelig utvalg ble godkjent av det institusjonelle etikkrådet ved Universitetet i Yamanashi.

1. Solid vev forberedelse

MERK: Prøver må holdes på is etter fjerning fra dyret eller menneskekroppen for å bevare vevsfriskheten. Hvis målingene ikke umiddelbart følger disseksjon, anbefales det å lagre vev ved -80 °C. Det er ikke tilrådelig å plassere vevet i noen form for buffer eller saltvann, fordi de kan trekke ut bestemt innhold fra vevet. Vev som er festet med aldehyder eller innebygd i parafin /voks eller kryogel er ikke egnet for MS-målinger.

  1. Skjær vevsprøven til ca. 2 x 2 x 2 mm ved hjelp av en skalpell eller kniv. Alternativt, slå ut prøven med en trepan (en engangs biopsi punch, bore størrelse 3 mm) brukes til hudundersøkelse. I dette tilfellet, trim lengden på kolonnen til 2 mm.
    MERK: Vev kan analyseres ved hjelp av denne metoden. I dette eksperimentet, lever15 og nyre19, har blitt vellykket analysert for å få masse spektra. Generelt gir parenchymale organer god massespektra, mens de som har fibrøse komponenter ikke gjør det.
  2. Hvis vevet er forurenset med blod, vask kort med iskald fosfatbufret saltvann.
    MERK: For å minimere skaden av postmortemvev, fullfør dette trinnet, så snart som mulig, ved romtemperatur. Hvis målinger ikke gjøres umiddelbart, trykk fryse vevet i flytende nitrogen og lagre ved -80 °C.
  3. Plasser kuttet eller stemplet ut prøve (ca. 10 mg) i et mikrorør i plast og tilsett 100 μL 50 % etanol.
    MERK: Den nøyaktige vekten av prøver bestemmes ikke fordi massespektrometriet som brukes i dette systemet, ikke gir kvantitative data. Omtrent 10 mg er optimalt for parenchymalvevet.
  4. Homogeniser prøven ved hjelp av en mikropestle.
  5. Plasser 10 μL av homogenatet i brønnen på sylinderampullen (figur 2).
  6. Plasser patronen i ioniseringskammeret på massespektrometeret og monter kanylesonden i rustfritt stål som skal brukes til prøveionisering (figur 2).
    MERK: Probenåler leveres av produsenten. De er laget av rustfritt stål og har en krumningradius på ca 400 nm.
  7. Lukk kammerlokket godt for å aktivere sikkerhetsanordningen automatisk.
  8. Start den innebygde datamaskinen ved å klikke Start-ikonet for å analysere. Bruk skjermpanelene til å påføre en spenning på 2,3 kV på nålen for å generere elektrosprayen og sørge for at nålens frekvens er 3 Hz.
  9. Vent til 30 s for at målingen skal fullføres.
    MERK: Økten opphører automatisk når datainnhenting en fullført. Kvaliteten på analysen overvåkes av et totalt ionkromagram (TIC). Måletiden er definert for å oppnå den representative massespektra og kan forkortes eller utvides.
  10. Kast sylinderampullen og kanylen i en biologisk tilfeldig avhendes etter måling av hver prøve.
    MERK: Bare én prøve kan måles om gangen. Det er ikke nødvendig å kalibrere maskinen før hver måling; kalibreringen avhenger av den vanlige kontrollen fra leverandøren én gang hver sjette måned.
  11. Analyser massespektra og eksporter massespektrale tekstdata ved hjelp av programvaren forbundet med massespektrometeret (se Materialtabell)som angitt i trinnene nedenfor (Figur 3).
    1. Klikk på lcd-filen i datafilnettleservinduet i programvaren.
    2. Velg og klikk på en enkelt topp på massespektrumvinduet og for å automatisk skildre et ekstrahert ionkromagram (EIC).
    3. Sjekk TIC og EIC og klikk på det gjennomsnittlige spektrumikonet for å velge tidsområdet for å generere massespekteret.
      MERK: I denne analysen vises målmolekylene i masse-til-lade-forholdet (m/z) vinduet (figur 3). Videre, fordi varigheten av ionisering per enkelt slag nål bevegelse er svært kort, alle masse spektra oppnådd er i hovedsak gjennomsnittlig spectra over 10 s (300 skanner).
    4. Generer en tekstfil som inneholder m/z- og ionintensitet ved å klikke kategorien Eksporter for videre analyse. Denne tekstfilen kan lagres i en hvilken som helst mappe.
      MERK: Eventuelle RNA-konserveringsmidler vil påvirke det opprinnelige spektrale mønsteret av prøver. I tillegg er det tilrådelig å håndtere og lagre vev uten væske (som fosfatbufret saltvann) for å forhindre elution av molekylære komponenter fra vevet inn i væsken under lagring. Ideelt sett brukes friske eller friske frosne prøver uten behandling.

2. Kroppsvæsker (serum) forberedelse

MERK: Hele denne prosedyren er nesten identisk med den som brukes til fast vev. Sylinderampullen for væskeprøven er tilgjengelig fra produsenten. Fordi forurensning av røde blodlegemer (RBC) kan i stor grad redusere effektiviteten av spektral oppkjøp av den tiltenkte komponenten (plasma eller serum), sørg for å eliminere alle RbCs ved sentrifugering før målinger.

  1. Ta 10 μL av serumprøven og legg den i et mikrorør på 1,5 ml.
    MERK: Både friskt og lagret serum kan brukes.
  2. Tilsett 190 μL 50% etanol til 1,5 ml røret, og virvl i 2 min ved romtemperatur.
  3. Sentrifuge væsken ved 15.000 x g i 1-5 min ved 4 °C.
  4. Overfør 10 μL supernatant til brønnen på sylinderampullen.
  5. Plasser patronen i ioniseringskammeret på maskinen og monter kanylesonden i rustfritt stål som skal brukes til prøveionisering (figur 2).
  6. Lukk kammerlokket godt for å aktivere sikkerhetsanordningen automatisk.
  7. Start den innebygde datamaskinen ved å klikke startikonet for å ionisere.
  8. Kast prøvekassetten og kanylen som beskrevet i 1,10 når målingene er tatt.
  9. Analyser de oppnådde settene med EIC som angitt nedenfor (figur 3).
    1. Åpne LCD-filen i nettleseren.
    2. Klikk på en enkelt topp for å vise TIC og EIC.
    3. Velg tidsintervallet for generering av massespektra ved hjelp av det gjennomsnittlige spektrumikonet.
    4. Eksporter den genererte filen som inneholder både m/z- og ionintensiteten til en tilsvarende topp ved å klikke på eksportfanen på skjermen.
      MERK: Denne prosedyren kan også påføres spytt, urin og andre kroppsvæsker.

3. Forberedelse til in vivo PESI-MS i levende organisme

MERK: I denne delen introduseres et program for å overvåke den metabolske profilen til 5-Fluoro-2'-deoksysuridin (5-FdU) i en levende musemodell. Bruk aseptiske forhold i hele.

  1. Infuse 100 μL av 100 mM 5-FdU oppløsning i halevenen til en 2 måneder gammel mus (ca 20 g vekt).
    MERK: Det er ingen preferanse for kjønn, alder eller musbelastning. Mens denne protokollen ble godkjent på den tiden vi utførte eksperimentet5,avhenger gjennomførbarheten av dette eksperimentet av de etiske restriksjonene i landet der det vil bli utført.
  2. Bedøve musen etter godkjent dyrepleieprotokoll. Vurder dybden av anestesi ved mangel på respons på haleklemming.
    MERK: Hvis bruk av natriumpentobarbital ikke er tillatt av etisk komité for dyreforsøk, kan alternative metoder brukes, for eksempel ketaminhydroklorid.
  3. Barber bukhulen ved hjelp av en elektrisk barberhøvel og påfør veterinærsalve til øynene.
  4. Sett den bedøvede musen i en supine posisjon og fest potene på plastplaten ved hjelp av mending tape. Skrubb operasjonsstedet med skrubbpå70% alkohol tre ganger.
  5. Klipp opp bukhulen ved hjelp av saks. Først kutt huden sidelengs (10 mm) fra like over membranen. Kutt muskelen i buklegemet og bukhinnen (ca. 7 mm) og hold såret åpent ved hjelp av rustfritt ledning for å eksponere leveroverflaten.
    MERK: Det er ikke nødvendig å fylle leverens overflate.
  6. Påfør spissen av probenålen på overflaten av leveren. Juster nålens dybde til ca. 0,5 mm dyp for å optimalisere ioniseringseffektiviteten, og kontroller TIC- og spektralmønsteret samtidig. Sett høyspenningen på 2,3 kV og frekvens til 3 Hz på skjermen på kontrollpanelet.
  7. Fjern dyret fra plastplaten.
  8. Sutur såret ved hjelp av en kirurgisk tarm sutur og returnere musen til buret. Ikke la musen stå uten tilsyn før den har gjenvunnet bevissthet for å opprettholde streng avskummen. Ikke returner musen til selskap med andre dyr før den er helt restituert.
  9. Utfør tidsforløpet av ionintensitet i EIC og prosedyren for EIC-skildring som i 1.11.1 til 1.11.4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som avbildet i figur 3,er dataene innhentet av PESI-MS-teknikken massespektra, hvis m / z varierer fra 10 til 1200 i dette systemet. Mens man kan oppdage molekyler opp til m / z 2000, var det få topper oppnådd ved hjelp av denne teknikken over masseområdet m / z 1200. Derfor analyserte vi topper fra m / z 10 til 1200. Det var iøynefallende grupper av topper rundt m / z 800 og 900; den tidligere representerer cellemembrankomponenter, for eksempel phosphatidyl kolin (PC) arter, og sistnevnte representerer triacyl glyserol (TAG). Figur 4 viser massespektra fra en normal human nyre og et nyrecellekarsinom (RCC). Massespektra ble oppnådd ved hjelp av direkte vevsmetode forklart i protokoll 1. Fordi den klare celletypen RCC akkumulerer TAG i cytoplasma, er en gruppe spektra rundt m/z 900 svært uttalt. Resultatet i figur 4 ble oppnådd ved utvinningsmetoden introdusert i figur 1 for solide prøver.

Fordi lipidmetabolismen av hepatocellulært karsinom endres under sykdomsprogresjonen20,er det mulig å overvåke sykdomsstadiene ved rutinemessig biopsi kombinert med PESI-MS. Resultatet i figur 5 viser forskjellene i spektralmønster mellom normalt levervev og HCC. Spesielt er det flere bemerkelsesverdige spektra av TAG i HCC. Hvis oppløsningen av massespektrometeret er overlegent, er det mulig at den molekylære merknaden til hvert spektrum vil tillate oppklaring av kreftens molekylære mekanisme, samt normal cellulær fysiologi.

Sanntidsovervåking av stoffskiftet kan utføres ved hjelp av PESI. I våre eksperimenter ble farmakodynamikken til det anti-onkotiske middelet 5-FdU overvåket over 10 s etter å ha blitt injisert gjennom halevenen til en mus. Svært rask påvisning av spektra ble observert bare noen få sekunder etter injeksjon av stoffet (Figur 6), noe som innebærer rask transport av stoffet via blodet til leveren. Intensiteten av natriumadduktene på 5-FdU avtok med en kort defekt av ionsignalet i opptaket på rundt 6-7 s etter å ha startet målingen. Dette var på grunn av den varierende dybden av PESI nålen i leverparenchyma, som var et resultat av kroppsbevegelser av den bedøvede musen. Derfor må det utvises forsiktighet for å justere dybden på PESI-nålen for sanntidsmåling av levende dyr. Det er ingen anbefalt måte å finne den optimale dybden på nålen, men det blir tydelig med praksis.

Blodprøver fra tre personer ble analysert av PESI-MS. I dette tilfellet ble 10 μL serum blandet med 190 μL 50% etanol og deretter brukt til PESI-MS-analyse. Mens de generelle spektrale mønstrene ser ut til å dele flere felles topper (figur 7),er det mange små forskjeller i spektrasen fra disse tre personene. De er et fingeravtrykk av hver person når det gjelder metabolske aktiviteter. For detaljert informasjon om molekylære identiteter, er det nødvendig å bruke en high-end maskin. Massespektrometeret som ble brukt i forsøkene ga ikke en høy nok oppløsning til å identifisere molekylene.

Hvis det er forurensning av polymerforbindelser, gir den opprinnelige spektra i figur 4 opphav til overlaid periodiske og iøynefallende topper som visker ut spektra fra den opprinnelige prøven (Figur 8). For å demonstrere dette eksperimentelt, la vi til polypropylen glyserol triol (PPGT) til 2,5% for å reprodusere et tilfelle av forurensning. Nesten alle de spesifikke spektra sett i figur 8 ble maskert ved tillegg av PPGT.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over en prøveforberedelsesflyt. For eksempler er en spesialisert prøvekassett ideell for stabil datainnsamling. Væskeprøveanalyse er den enkleste måten å utføre PESI-MS på, ved ganske enkelt å plassere løsningen i kassetten. Det finnes to metoder for å bruke denne metoden til solid vev. Direkte påføring av PESI til vevet er veldig enkelt og raskt, mens utvinningsmetoden gjør det mulig å oppnå et mye mer stabilt oppkjøp av spektra avhengig av prøveartene. I denne prosedyren settes et lite stykke vevsprøve i et mikrorør med 100 μL 50% etanol og homogenisert med et mikropestle. 10 μL av den resulterende homogenatbrukes deretter til massespektrometri. Ved analyse av et levende dyr er 30 μL 50% etanol plassert på målorgelets serosaloverflate, etterfulgt av måling. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Oversikt og grunnleggende komponenter i PESI-MS. Et massespektrometer utstyrt med en PESI-modul. Ioniseringsdelen er installert i et lukket kammer hvor ioninntaket, nåleholderen og prøveholderen er plassert. Nålen er ferdiglaget, og engangskanylen i rustfritt stål er festet til nåleholderen. Den er satt i massespektrometeret like etter å ha plassert prøvekassetten i kammeret. Den gjennomsnittlige krumningsvinkelen på nålen er 400 nm. Sylinderampullen for å plassere prøven er disponibel og laget av plastpolymerer. Den har en liten brønn for å plassere væskeprøven (rød pil). Etter å ha satt den solide prøven i brønnen, brettes kassetten for å klemme prøven og forsegle brønnen. For en flytende prøvekassett brukes en annen som ikke krever bretting, og dette er en anbefalt versjon som er bedre enn faste prøver. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Grafisk brukergrensesnitt (GUI) for PESI-MS. Alle prosedyrene for å generere massespektrom fra det totale ionkromagramet (TIC) kan utføres med den tilhørende programvaren. Etter å ha åpnet lcd-filen i nettleseren, kan TIC vises, og tidsperioden kan velges for å generere massespektra. Den genererte massespektrasen kan eksporteres som tekstdata som inneholder både masse-til-lade-forhold (m/z)og ionintensitet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Humant nyrecellekarsinom viser karakteristiske topper av nøytrale lipider. Det var relativt sterke topper i spektra fra humant nyrecellekarsinomvev (RCC) som ikke ble identifisert i det omkringliggende ikke-kreftvev. Disse toppene representerer hovedsakelig triacylglycerol (TAG) på rundt masse-til-lade-forhold(m / z) 900. Spektraloppkjøp ble utført ved hjelp av den positive ionmodusen ved direkte analyse. Høy spenning ble satt til 2,3 kV. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Eksempel på data innhentet i normalt levervev og humant hepatocellulært karsinom (HCC). Det øvre panelet viser spektra fra et humant levervev hvor en neoplastisk lesjon ikke var tilstede, men fra en pasient med kronisk hepatitt og levercirrhose. Det nedre panelet viser den gjennomsnittlige spektra av HCC fra samme pasient. På et øyeblikk, mens disse to har svært like spektrale mønstre, er det mange små forskjeller i spektralmønster. Abscissa viser masse-til-lade-forholdet (m / z) og ordinaten viser den relative intensiteten til hvert spektrum. Oppkjøp av spektra ble utført ved hjelp av den positive ionmodus etter å ha hentet ut vevet, som avbildet i figur 2C. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Sanntidsmålinger av stoffskiftet. Metabolske endringer i 5-FdU injisert intravenøst inn i halen fartøyet av en mus. Svært rask og følsom påvisning av 5-FdU med natriumadukti ble oppnådd i leveren in situ. På grunn av ustabil ionisering under måling, kan opphør av signalet noteres på rundt 6-7 s. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Eksempler på data fra tre personer. Humant serum fra tre personer ble analysert ved hjelp av PESI-MS. Det var klare forskjeller i spektrale mønstre blant individene. Data ble innhentet ved hjelp av den positive ionmodus. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: Polymerforbindelser forstyrrer nøyaktig datainnsamling. På grunn av den periodiske fremveksten av spektrale topper lagt over på den opprinnelige prøven, blir det vanskelig å tolke dataene nøyaktig. I dette tilfellet vises spektra avledet fra polypropylen triol glyserol (PPGT) som et støyende overlegg. Disse forbindelsene, vanligvis brukes til kalibrering, maskere den opprinnelige spektra fra leveren. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om PESI er et derivat av ESI for massespektrometri4,er det mest fordelaktig for overvåking av metabolomikk i sanntid, samt for å analysere biokjemiske reaksjoner uten å utføre komplekse eller tidkrevende forbehandling5,14,15,17. Det er en enkel og øyeblikkelig massespektrometri teknikk som kan brukes på den integrerte tilstanden til levende organismer. Siden det ikke krever komplekse kaskader av prøveforbehandling, er det en mye større mulighet til å vurdere den molekylære sammensetningen av hele prøven, fordi vi unngår mulig tap av prøvsom kan forekomme i konvensjonell ESI, noe som krever komplekse trinn av prøveforbehandling ved hjelp av store mengder organiske løsemidler. Derfor tillater PESI oss å få mye mer informasjon fra prøven hvis alle forhold er hensiktsmessig kontrollert.

Vi må først nevne noen av de tekniske aspektene som kreves for å oppnå gode resultater når vi vurderer PESI-MS-analyse. Den mest kritiske faktoren i PESI er vedlikehold av ioniseringseffektivitet under analyse. For å oppnå dette er det tilrådelig å justere og optimalisere avstanden mellom nålens spiss og prøveoverflaten, for å generere en stabil TIC ved å referere til datamonitoren under analysen. For å gjøre dette er det nødvendig å endre dybden på nålen på en trinnvis måte for å oppnå maksimal TIC. Fordi varigheten av ionisering er relativt kort sammenlignet med ESI, pesi er ikke ideell for reproduserbarhet eller kvantifisering. For det andre, fordi formen på nålespissen spiller en svært viktig rolle i ioniseringen ved å danne en ideell Taylor-kjegle som fungerer som ionkilde, må det tas hensyn til ikke å deformere nålespissen. Deformasjon av spissen kan føre til lavere ioniseringseffektivitet.

Mens PESI er fordelaktig fordi det kan brukes direkte på friske prøver (f.eks lever, nyre og hjerne) og levende organisme uten spesiell behandling, er det relativt følsomt for andre eksogene forurensninger fordi det kan ionisere nesten alle komponenter som finnes i en væske21,22,23. Det vil si ulempen med fordelen med å hoppe over prøvebehandling betyr at PESI-MS har en ulempe i flere situasjoner som ofte oppstår i biologiske eksperimenter. Som forklart i protokolldelen er PESI følsom for forurensning av RNA-konserveringsmidler, aldehyder og polymerforbindelser som kryogelene som ofte brukes til histologisk preparat. Blodpropper kan holde seg til PESI nålen og ofte maskere den tiltenkte spektra. Videre frigjør hemolysis av RbCs hemoglobin, og den dissosierte ferric ion gir opphav til mye sterkere spektra enn de avledet fra de tiltenkte analytene. Polymerforbindelser gir også periodiske spektrale topper som overlegger spektra avledet fra de tiltenkte analytene, noe som gjør det mye vanskeligere å tolke de virkelige dataene på grunn av støyen (Figur 8). For å unngå problemer i oppkjøpet av massespektra, er det tilrådelig å følge vår protokoll, og ta spesielle notat av referanser til forurensningen. I denne forbindelse er anvendelsen av PESI begrenset i noen tilfeller.

En annen ulempe med PESI ligger i sin relativt ustabile ioniseringsprosess, noe som krever at vi justerer dybden av sondenålen til analytterne. I tillegg kan denne teknikken dekke et svært begrenset område i en enkelt analyse. På grunn av den svært lille størrelsen på nålespissen som er direkte påført vevet, pesi-MS analyse er ikke så omfattende som 2D-analyse som kan oppnås med en MALDI-TOF MS-basert bildemasse spektrometri eller DESI-basert bildebehandling7,8. PESI kan imidlertid rekonstruere et bilde av hippocampal formasjonen, selv om det tar flere timer23 fordi 2D-skanningen av en prøve tar lang tid, hovedsakelig på grunn av denne teknikkens ustabile ioniseringseffektivitet. Tatt i betraktning, masse spektral avbildning av PESI-MS er ikke en verdifull applikasjon.

Når det gjelder de elektrokjemiske egenskapene til PESI, er volumet og konsentrasjonen av prøven som fester seg til nålespissen kritisk18, da undertrykkelseseffekten er noe dempet ved å nedbemanne elektrospraystørrelsen. Tatt i betraktning at PESI minimerer ESI, må prøvene ideelt sett fortynnes for å unngå å danne en slurry på spissen. Derfor er tillegg av ca 30 μL 50% etanol nødvendig for å oppnå effektiv ionisering når direkte vevsmetoden brukes (figur 2B). Dette maksimerer ioniseringseffektiviteten og oppnår nesten fullstendig ionisering av molekylene festet til nålens spiss.

Å velge den mest hensiktsmessige metoden for databehandling er svært viktig når du bruker dette systemet24. Når det gjelder implementering av maskinlæring for enhver sykdomsdiagnose, er bygging av en database nødvendig for å etablere en referanse for klassifisering eller kategorisering av sykdommer7. For eksempel har vi brukt støttevektormaskinen eller logistisk regresjon for å gjøre en diagnose av primære levermaligniteter25.

PESI-MS er en allsidig og enkel teknikk som har stort potensial for narkotikascreening, dopingtester, matsikkerhetstester av landbruksprodukter26, og noen miljøtester. Fordi denne ioniseringsenheten er kompatibel med andre spektrometre ved å forberede et vedlegg for hvert enkelt instrument, kan PESI brukes på ulike formål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Den tilsvarende forfatteren ble finansiert av Shimadzu, en produsent og leverandør av PESI-MS-instrument.

Acknowledgments

Vi takker Ayumi Iizuka for å ha operert PESI-MS og Kazuko Sawa-nobori for hennes sekretærhjelp. Vi takker Bronwen Gardner, Ph.D., fra Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) for å ha redigert et utkast til dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) Sigma-Aldrich F8791-25MG 25mg
disposable biposy punch (Trepan) kai Europa GmbH BP-30F bore size 3mm
ethanol nacalai tesque 14710-25 extra pure reagent
LabSolutions Shimadzu ver. 5.96, Data analyzer
micropestle United Scientific Supplies S13091
microtube Treff 982855 0.5 mL clear
PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) Shimadzu DPiMS-2020 Mass spectrometer equipped with PESI
PPGT solition Shimadzu ND Attached to DPiMS-2020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
  2. Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  3. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
  4. Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
  5. Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
  6. Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
  7. Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
  8. Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
  9. Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
  10. Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
  11. Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
  12. Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
  13. Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
  14. Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
  15. Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
  16. Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
  17. Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
  18. Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
  19. Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
  20. Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
  21. Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
  22. Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
  23. Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
  24. Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
  25. Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
  26. Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).

Tags

Biokjemi Utgave 156 Massespektrometri Ambient Sanntid Kreft Serum Probe Electrospray Ionisering Diagnose
Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Takeda, S., Yoshimura, K., Tanihata, … More

Takeda, S., Yoshimura, K., Tanihata, H. Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (156), e59942, doi:10.3791/59942 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter