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Cancer Research

दत्तक इम्यूनोथेरेपी के लिए विनिर्माण चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाएं

Published: December 17, 2019 doi: 10.3791/59949
Automatic Translation
1, 1
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

Summary

हम चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) टी कोशिकाओं को मज़बूती से उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं और विट्रो और वीवो में उनके भेदभाव और कार्य का परीक्षण करते हैं।

Abstract

दत्तक इम्यूनोथेरेपी कैंसर और संक्रामक रोग के इलाज के लिए वादा रखती है । हम चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर) के साथ प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं को स्थानांतरित करने और उनकी संतान पूर्व वीवो का विस्तार करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। हम कार अभिव्यक्ति के साथ ही भेदभाव, प्रसार क्षमता और साइटोलिटिक गतिविधि को मापने के लिए परख शामिल हैं । हम कार टी कोशिकाओं में प्रभावक साइटोकिन उत्पादन और भड़काऊ साइटोकिन स्राव को मापने के लिए परखों का वर्णन करते हैं। हमारा दृष्टिकोण दत्तक इम्यूनोथेरेपी के प्रीक्लिनिकल मॉडल के लिए संस्कृति कार टी कोशिकाओं के लिए एक विश्वसनीय और व्यापक विधि प्रदान करता है।

Introduction

चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर्स (सीएआर) अलग ट्यूमर एंटीजन के खिलाफ टी कोशिकाओं को रीडायरेक्ट करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। सीएआर सिंथेटिक रिसेप्टर्स हैं जो एंटीजन लक्ष्य को बांधते हैं। जबकि उनकी सटीक संरचना चर है, CARs आम तौर पर 3 अलग डोमेन होते हैं । एक्सट्रासेल्युलर डोमेन एक लक्ष्य एंटीजन के लिए बाध्यकारी निर्देश देता है और आमतौर पर एक एक्सट्रासेलुलर काज के माध्यम से कार से जुड़े एक एकल श्रृंखला एंटीबॉडी टुकड़े से जुड़ा होता है। दूसरा डोमेन, आमतौर पर टी सेल रिसेप्टर (टीसीआर) परिसर की सीडी 30 श्रृंखला से प्राप्त, कार सगाई के बाद टी सेल सक्रियण को बढ़ावा देता है। टी सेल फ़ंक्शन, एनग्राफमेंट, चयापचय और दृढ़ता को बढ़ाने के लिए एक तीसरा सह-ात्मक डोमेन शामिल है। बी सेल तीव्र लिम्फोब्लास्टिक ल्यूकेमिया (सभी), क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया (सीएएलएल) और मल्टीपल मायलोमा सहित विभिन्न हेमेटोपोइटिक घातक क्षमताओं मेंकार टी सेल थेरेपी की सफलता1,2,3,4,5,6सहित विभिन्न हेमेटोपोइटिक घातक क्षमताओं में कार टी सेल थेरेपी की सफलता इस दृष्टिकोण के चिकित्सीय वादे पर प्रकाश डालती है । हाल ही में खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) दो CD19-विशिष्ट कार टी सेल चिकित्सा, बाल चिकित्सा और युवा वयस्क सभी और फैलाना बड़े बी सेल लिंफोमा के लिए axicabtagenecil के लिए tisagenlecleucel के लिए मंजूरी, कार टी सेल थेरेपी के अनुवाद योग्यता पुष्ट ।

कार टी आधारित दृष्टिकोण परिधीय रक्त, सक्रियण, आनुवंशिक संशोधन, और विस्तार पूर्व वीवो से टी कोशिकाओं के अलगाव शामिल हैं । विभेदन कार टी सेल प्रभावकारिता को विनियमित करने वाला एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। तदनुसार, पूर्व वीवो संस्कृति के दौरान टी सेल भेदभाव को प्रतिबंधित करना संक्रमित उत्पादकी2, 7,8,9के बाद दीर्घकालिक इम्यूनोससर्वेशन प्रदान करने की क्षमता को बढ़ाता है। टी कोशिकाओं सहित कई अलग-अलग सबसेट शामिल हैं: भोली टी कोशिकाएं (टीएन), केंद्रीय स्मृति (टीसीएम), प्रभावक स्मृति (टेम), प्रभावक विभेदित (टीटीई) और स्टेम सेल मेमोरी (टीसीएम)। प्रभावक विभेदित टी कोशिकाओं में शक्तिशाली साइटोलिटिक क्षमता होती है; हालांकि, वे कम रहते थे और खराब10,11,12engraft हैं . इसके विपरीत, भोली टी कोशिकाओं और टीसीएम सहित कम विभेदित फेनोटाइप वाली टी कोशिकाएं दत्तक कोशिका हस्तांतरण13,14,15,16,17,18के बाद बेहतर एनग्राफमेंट और प्रोलिजिरेटिव क्षमताओं का प्रदर्शन करती हैं। पूर्व निर्मित उत्पाद में एकत्र टी कोशिकाओं की संरचना रोगियों में भिन्न हो सकती है और कार टी कोशिकाओं की चिकित्सीय क्षमता के साथ सहसंबंधित है। शुरू करने वाले एफेरेसिस उत्पाद में भोले की तरह इम्यूनोफेनोटाइप वाली टी कोशिकाओं का अनुपात एनग्राफमेंट और नैदानिक प्रतिक्रियादोनोंके साथ अत्यधिक सहसंबद्ध है।

संस्कृति अवधि दत्तक हस्तांतरण के लिए तैयार कार टी कोशिकाओं में भेदभाव को प्रभावित करने वाला एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। हमने हाल ही में एक संक्षिप्त संस्कृति प्रतिमान20का उपयोग करके बेहतर गुणवत्ता वाले कार टी कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया । हमारे दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया कि सीमित संस्कृति ल्यूकेमिया के विद्वेष मॉडलों में दत्तक हस्तांतरण के बाद बेहतर प्रभावक समारोह और दृढ़ता के साथ कार टी कोशिकाओं को जन्म देती है। यहां, हम लेडो19 कोशिकाओं (सीडी 3 और 4-1बीबी सिग्नलिंग डोमेन से जुड़े एंटी-सीडी19 एससीएफवी को व्यक्त करने के लिए इंजीनियर ऑटोलोगस टी कोशिकाओं) को मज़बूती से उत्पन्न करने के दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं और इसमें उन परखों का विस्तृत विवरण शामिल है जो दत्तक हस्तांतरण से पहले कार टी बायोएक्टिविटी और प्रभावकारिता में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं।

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Protocol

सभी पशु अध्ययन पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं ।

1. टी सेल एक्टिवेशन, ट्रांसड्यूक्शन, और विस्तार

  1. 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति व्यंजनों में प्रति टी सेल 3 मोतियों के अनुपात में एंटी सीडी3/सीडी28 चुंबकीय मोती (जैसे, डायनामोज) के साथ मिश्रण करके ताजा या क्रायोपआरक्षित प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं को सक्रिय करें । एक्स-वीवो 15 मीडियम में कल्चर टी सेल 5% नॉर्मल ह्यूमन एबी सीरम, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 20 एमएम हेप्स और आईएल 2 (१०० यूनिट्स/एमएल) के साथ पूरक हैं । विस्तार के दौरान 106 टी कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पर टी कोशिकाओं को बनाए रखें । संस्कृति टी कोशिकाओं पर 37 डिग्री सेल्सियस, 20% O2,और 95% आर्द्रता 5% सीओ2के साथ.
  2. रात भर उत्तेजना के बाद, सक्रिय टी कोशिकाओं में लेंटिवायरल सुपरनेटजोड़ें। 3−5 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता प्राप्त करने के लिए आवश्यक अधिरत्न की मात्रा की गणना करें।
    नोट: सीडी 19-बीबी कार लेंटिवायरस प्लाज्मिड में सीडी 8 काज, 4-1बीबी कोस्टिमुलेटर डोमेन और सीडी 3' सिग्नलिंग डोमेन21शामिल हैं। CD19-BB, lentiviral supernatant के रूप में पहले21वर्णित उत्पन्न किया गया था ।
  3. तीसरे दिन, क्रायोप्रिजर्वेशन के लिए कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि अलीकोट एकत्र करें। क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले, चुंबकीय मोतियों को कोमल पाइपिंग और चुंबकीय पृथक्करण द्वारा हटा दें। 0.5% डिमेथिल सल्फासऑक्साइड (डीएमएसओ) के साथ फॉस्फेट-बफर्ड लवइन (पीबीएस) युक्त फ्रीजिंग माध्यम तैयार करें और उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें।
    1. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज टी कोशिकाएं। सुपरनेटेंट को त्यागें और पीबीएस के 5 mL जोड़ें। 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं और पीबीएस को त्यागदें।
    2. कोल्ड क्रायोप्रिजर्वेशन मीडियम के 1 मिलील में सेल पैलेट को फिर से सस्पेंड करें। एक ठंडा ठंड कंटेनर में टी कोशिकाओं फ्रीज और 48 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। जमे हुए कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
  4. अवशिष्ट वेक्टर को खत्म करने के लिए पीबीएस के 5 एमएल में एक बार बाकी टी कोशिकाओं को धो लें। 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। पीबीएस को डिडेंट करें और टी सेल कल्चर मीडियम में सेल पेलेट को 0.5 x 106 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पर फिर से सस्पेंड करें।
  5. टी कोशिकाओं को दो संस्कृतियों में विभाजित करें, जो 5 दिन और 9 दिन के लिए नामित हैं। मानव सीडी 4 और सीडी 8 के लिए मोतियों की गिनती(सामग्री की तालिका)और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा टी कोशिकाओं की गणना करें, साथ ही एक व्यवहार्यता रंग(सामग्री की तालिका)।
    1. टी सेल एकाग्रता को मापने के लिए, पीबीएस के 500 माइक्रोन युक्त एक मास्टर मिश्रण तैयार करें, मोतियों की गिनती के 5 μL, 7-अमीनो-ऐक्टिनोमाइसिन डी सेल व्यवहार्यता समाधान, सीडी4-एफआईसीसी के 4 माइक्रोन और सीडी 8-एपीसी के 4 माइक्रोन। मास्टर मिक्स में टी कोशिकाओं के 40 माइक्रोन जोड़ें और लाइव टी कोशिकाओं/मनका गिनती की संख्या के आधार पर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सेल एकाग्रता को मापने। हर दूसरे दिन 0.5 x 106 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पर संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए रीफ़ीड करें।
  6. 5 दिन, गिनती और क्रायोसंरक्षित दिन 5 संस्कृतियों के रूप में कदम १.३ और १.५ में वर्णित है ।
  7. 7 दिन, पीबीएस में 0.5 x 106 टी कोशिकाओं को धोएं और फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) बफर के 100 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा फ्लोरोसेंटी-कॉन्जुरेट एंटी-कार्19 मुहावरे के साथ इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा कार सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाएं।
  8. 9 दिन पर, गिनती दिन 9 संस्कृतियों और क्रायोसंरक्षित के रूप में चरण १.३ में वर्णित है ।

2. टी सेल भेदभाव का फेनोटाइपिक मूल्यांकन

  1. एंटी-सीडी3-BV605 (क्लोन OKT3), एंटी सीडी14-पैसिफिक ब्लू (पीबी) (क्लोन एचसीडी14), एंटी-सीडी19-पीबी (क्लोन एचसीडी14), एंटी-सीडी19-पीबी (के लिए प्री-टिटेटेड एंटीबॉडी युक्त मास्टर मिक्स तैयार करें क्लोन HIB19), विरोधी सीडी4-BV510 (क्लोन OKT4), विरोधी सीडी8-H7APC (क्लोन SK1), विरोधी CCR7-FITC (क्लोन 150503), एंटी-सीडी45आरओ-पीई (क्लोन UCHL1), एंटी-सीडी27-पीई-Cy7 (क्लोन 1A4CD27), एंटी-सीडी95-PerCP-Cy5.5 (क्लोन DX2), और एंटी-CAR19-APC।
  2. एंटी-सीडी45आरओ-पीई, एंटी-सीसीआर7-फिईसी, एंटी-सीडी27-पीई-साइ7 और एंटी-सीडी95-परसीपी-Cy5.5 के लिए व्यक्तिगत फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण तैयार करें ताकि पृष्ठभूमि से सकारात्मक दाग कोशिकाओं को अलग किया जा सके।
  3. पीबीएस में लाइव/डेड स्टॉक रिएजेंट(टेबल ऑफ मैटेरियल्स)1:10,000 को कमजोर करके डेड सेल धुंधला समाधान तैयार करें ।
  4. गल दिन 3, दिन 5, और दिन 9 टी कोशिकाओं कि पहले क्रायोपआरक्षित थे । 3 मिन के लिए 300 x ग्राम पर प्रत्येक समूह से 1 x 106 टी कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। कोशिकाओं को एक बार पीबीएस से धोलें। 3 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और पीबीएस को त्यागदें।
  5. कमरे के तापमान (आरटी) पर 15 किमी के लिए मृत धुंधला समाधान के साथ टी कोशिकाओं को मिलाएं, प्रकाश से संरक्षित।
  6. मृत सेल धुंधला रंग बुझाने के लिए FACS बफर के 1 mL जोड़ें । 3 मिन के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, सुपरनेटेंट को त्यागें और चरण 2.1 और 2.2 में वर्णित एंटीबॉडी कॉकटेल युक्त एफएसीएस बफर के 100 माइक्रोन में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  7. अनबाउंड एंटीबॉडी को धोने के लिए 3 मिन के लिए 300 x ग्राम पर एफएसीएस बफर और सेंट्रलाइज के 1 एमएल जोड़ें। FACS बफर के साथ तीन बार दोहराएं।
  8. 1% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. चूंकि सीडी45आरओ अभिव्यक्ति निर्धारण के बाद कम हो जाती है, इसलिए इम्यूनोस्टेनिंग के बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा नमूनों का विश्लेषण करें। भेदभाव का आकलन करने के लिए, निम्नलिखित क्रम में गेट: सिंगल्स (एफएससी-एच बनाम एफएससी-ए), लाइव सीडी 3+ टी कोशिकाएं (डंप [लाइव-डेड वायलेट, सीडी14-पीबी और सीडी19-पीबी बनाम सीडी3-BV605], CD4-BV510 बनाम CD8-APC-H7)। CD4+ और CD8+ सबसेट में, भोली-जैसे टी कोशिकाओं (CD45RO-CCR7+CCR7 + CCR7 +CCR7+), टेम (CD45RO+CCR7) कोपरिभाषित करने के लिए CD45RO-पीई बनाम CCR7-FITC पर गेट - CCR7-) Tscm की पहचान करने के लिए, भोली की तरह टी कोशिकाओं की आबादी में CD27+ टी कोशिकाओं पर गेट । इस डिब्बे में, Tscm CD95+ और टीएन CD95हैं -।

3. इन विट्रो कार्यात्मक विश्लेषण

  1. कार टी सेल प्रसार और साइटोकिन स्राव
    1. कार अभिव्यक्ति के साथ-साथ सेल व्यवहार्यता को सत्यापित करें जैसा कि प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा चरण 1.5 और 1.7 में वर्णित है।
    2. पीबीएस के साथ प्रत्येक समूह (दिन 3, दिन 5 और 9 दिन) से 5 x 106 टी कोशिकाओं को धोएं और आरटी में 3.5 मिन के लिए पीबीएस में कार्बोसिफ्लोरेसिन डायसेसिटिन डायसिमिडिल एस्टर (सीएफएसई) के 1 माइक्रोन समाधान में फिर से निलंबित करें।
    3. प्रतिक्रिया को बुझाने के लिए तुरंत पीबीएस के 10 मिलील जोड़ें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) होता है।
    4. 3 मिन के लिए 300 x ग्राम पर समाधान को केंद्रित करें। सुपरनेटेंट को त्यागें और इस वॉश स्टेप को तीन बार दोहराएं। एक कल्टर काउंटर(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग कर सीएफएसई धुंधला के समापन पर कोशिकाओं की गणना करें।
    5. हार्वेस्ट सीएफएस-दाग कोशिकाओं (अउत्तेजित), 1% पीएफए में फिर से निलंबित और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    6. सीएफएसई-दाग कार टी कोशिकाओं की वांछित संख्या को विकिरणित K562-CD19 (लक्ष्य) के साथ-साथ K562-जंगली प्रकार (नियंत्रण) कोशिकाओं को 1:1 के अनुपात में साइटोकिन मुक्त संस्कृति माध्यम और संस्कृति की स्थिति में 120 घंटे के लिए 1.1 के अनुपात में इनक्यूबेट करें जैसा कि चरण 1.1 में वर्णित है।
    7. 24 घंटे के बाद, 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर संस्कृति पोत को केंद्रित करें। सेलुलर सुपरनेटेंट के 120 माइक्रोन एकत्र करें। निर्माता की सिफारिशों के अनुसार ल्यूमिनेक्स विश्लेषण द्वारा आईएल2, आईएफएन, टीएनएफα, जीएम-सीएसएफ, और अन्य भड़काऊ साइटोकिन्स (आईएल1ए, आईएल4, आईएल5, आईएल6, आईएल8 और आईएल10) के सक्रियण-निर्भर उत्पादन का आकलन करें।
    8. नए माध्यम के समकक्ष मात्रा (120 माइक्रोन) के साथ चरण 3.1.7 में एकत्र की गई सुपरनेटेंट की मात्रा को बदलें।
    9. 3 दिन (यानी, 96 घंटे के बाद), गिनती और फिर से 0.5 x 106 कोशिकाओं की एकाग्रता पर फ़ीड/
    10. 5 दिन पर, लाइव सीडी 3+ कोशिकाओं की गणना करें और 0 दिन में लाइव टी सेल गिनती के सापेक्ष लाइव टी कोशिकाओं के गुना परिवर्तन की गणना करें।
    11. सेल डिवीजन के लगातार दौर को उजागर करने के लिए फ्लोजो सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कार टी कोशिकाओं को विभाजित करने में सीएफएसई कमजोर पड़ने का व्यापक विश्लेषण करें।
      नोट: प्रसार परख अच्छी तरह से FlowJo मैनुअल में वर्णित हैं ।
  2. साइटोटॉक्सिकपरेपन परख
    नोट: CD19 व्यक्त करने वाले लक्ष्य कोशिकाओं को मारने के लिए CART19 कोशिकाओं की क्षमता का मूल्यांकन 51करोड़ रिलीज-परख का उपयोग करके किया जाता है।
    1. एनए251सीआरओ4 के 50 माइक्रोन के साथ 50 माइक्रोन के साथ लक्ष्य कोशिकाओं को 5 x 105 K562-CD19, K562-जंगली प्रकार नियंत्रण कोशिकाओं, या NALM6 ल्यूकेमिया कोशिकाओं को मिलाकर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 90 मिन के लिए 10% एफबीएस के साथ पूरक लेबल करें।
    2. 2.5 टिन के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं। उपयुक्त निपटान डिब्बे में रेडियोधर्मी सुपरनेटेंट को त्यागें और पीबीएस के 5 ग्राम में लक्ष्य कोशिकाओं को धोएं। धोने के चरणों को दो बार दोहराएं।
    3. 5% एफबीएस वाले फिनॉल रेड-फ्री मीडियम में टारगेट सेल को फिर से सस्पेंड करें। पृष्ठभूमि को कम करने के लिए बाकी प्रक्रिया के लिए इस माध्यम का उपयोग करें।
    4. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कार अभिव्यक्ति और सेल व्यवहार्यता का मूल्यांकन करने के बाद (जैसा कि धारा 5.1 में वर्णित है), ट्रिपलिकेट में 10:1, 3:1 और 1:1 के प्रभावक: लक्ष्य (ई:टी) अनुपात पर लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के साथ कार टी कोशिकाओं को मिलाएं। एक 96-अच्छी तरह से यू बॉटम प्लेट में स्थानांतरित करें।
    5. समानांतर में, अकेले लक्ष्य कोशिकाओं को शामिल करें, और क्रमशः सहज (एस) और अधिकतम (एम) 51सीआर रिलीज निर्धारित करने के लिए 1% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) के साथ कोशिकाओं को लक्षित करें।
    6. 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4 घंटे या 20 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    7. निर्धारित समय के बाद, 5 मिन के लिए 300 x ग्राम पर संस्कृति पोत को अपकेंद्रित करें। सेलुलर सुपरनेट ेंट के 35 माइक्रोन एकत्र करें और एक पाठक प्लेट में स्थानांतरित करें। बुलबुले से बचें। रात भर थाली सूखने दें।
    8. प्लेट को एक मानक प्लेट सील के साथ सील करें और तरल प्रस्फुटन काउंटर के साथ गिनें। अधिनेता में क्रोमियम बहुतायत लक्ष्य सेल हत्या का प्रॉक्सी प्रदान करता है। इस प्रकार विशिष्ट lysis के प्रतिशत की गणना करें: 100 x (प्रति मिनट [सीपीएम] प्रायोगिक रिलीज - सीपीएम एस रिलीज) / (सीपीएम एम रिलीज - सीपीएम एस रिलीज)।

4. वीवो कार्यात्मक विश्लेषण में

  1. 6−10 सप्ताह पुराने NOD-SCIDप्राप्तकरें, जो एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी है, और उन्हें बेतरतीब ढंग से उपचार/नियंत्रण समूह को आवंटित करें ।
  2. 0.1 एमएल बाँझ पीबीएस में 1 x 106 NALM6 कोशिकाओं के साथ पूंछ नस के माध्यम से नसों में जानवरों सुई।
  3. 5−7 दिनों के बाद, बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (BLI) द्वारा ट्यूमर एनग्राफमेंट की पुष्टि करें। चूहों को 150 मिलीग्राम/किलो डी-लूसिफ़ेरिन इंजेक्ट करें जिन्हें आइसोफ्लोरीन (मात्रा शरीर द्रव्यमान पर निर्भर है) के साथ एनेस्थेटाइज्ड किया गया है।
  4. इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके बायोल्यूमिनेसेंस मूल्यों को मापें। चूहों के आसपास समान क्षेत्र के आयतों को खींचकर संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कुल प्रवाह की मात्रा निर्धारित करें, जो पूंछ की लंबाई के सिर से 50% तक पहुंचते हैं। प्रत्येक छवि के लिए पृष्ठभूमि को व्यक्तिगत रूप से घटाना।
  5. ल्यूकेमिया की स्थापना के बाद, 3 x 106 दिन 9 CART19 कोशिकाओं, ०.५ x 106 दिन 3 कार टी कोशिकाओं, या इसी गैर ट्रांसड्यूस (NTD) मानव टी कोशिकाओं को पूंछ नस के माध्यम से बाँझ PBS/Ca2 +के १०० μL की मात्रा में इंजेक्ट करें ।
    नोट: चूंकि संस्कृति प्रक्रिया के दौरान विभिन्न अंतरालों पर काटे गए कोशिकाओं की जैव गतिविधि अलग है, इसलिए दिन 3 कोशिकाओं की चुनी हुई एकाग्रता 9 दिन से कम है।
  6. रोग प्रगति का निर्धारण करने के लिए, सप्ताह में दो बार बायोल्यूमिनेसेंस मूल्यों को मापने के लिए, जैसा कि चरण 4.3 में वर्णित है।
  7. कार टी सेल engraftment निर्धारित करने के लिए, एक EDTA-लेपित ट्यूब में रेट्रो कक्षीय रक्तस्राव के माध्यम से ७५ μL रक्त इकट्ठा । पूर्ण गिनती ट्यूबों के लिए रक्त के 50 μL स्थानांतरित करें।
  8. आरटी में 30 मिन के लिए सीडी45, सीडी4, सीडी8 और कार के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रक्त। 1x FACS के 400 माइक्रोन अच्छी तरह से ट्यूब और भंवर के समाधान को जोड़ें। धुंधला करने के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सतह मार्कर अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें।
    नोट: रक्त में टी कोशिकाओं के भेदभाव और थकावट की स्थिति का आकलन करने के लिए अन्य सतह मार्कर का उपयोग किया जा सकता है।
  9. रक्त में साइटोकिन्स के स्तर को मापने के लिए, रक्त की ऊपरी परत से सीरम को अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मीटर के लिए 1,200 x ग्राम पर अपकेंद्री रक्त।
  10. सीरम लीजिए और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक नामित पाठक प्लेट के साथ साइटोकिन्स को मापने।

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Representative Results

ऊपर वर्णित तरीकों का उपयोग करके, हमने 3 या 9 दिनों(चित्रा 1ए, बी)के लिए टी कोशिकाओं को उत्तेजित और विस्तारित किया। हमने कोशिका की सतह पर व्यक्त किए गए विशिष्ट ग्लाइकोप्रोटीन की बहुतायत को मापने के द्वारा चित्रा 1सीमें उल्लिखित गेटिंग रणनीति द्वारा इंगित गेटिंग रणनीति द्वारा इंगित उनके भेदभाव प्रोफ़ाइल का भी विश्लेषण किया। हम पूर्व वीवो संस्कृति(चित्रा 1डी)के दौरान समय के साथ प्रभावक भेदभाव की दिशा में एक प्रगतिशील बदलाव दिखाते हैं । हमने एंटीजन के जवाब में कार टी सेल के प्रभावक समारोह और प्रसार क्षमता का आकलन किया। हम बताते हैं कि जिन कोशिकाओं का विस्तार कम किया गया था (पहले काटा गया) लंबी अवधि में बड़े पैमाने पर सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में कार्यात्मक रूप से बेहतर थे। दिन 3 CART19 कोशिकाओं ने 9 दिन(चित्रा 2ए, बी)के सापेक्ष अपने कॉग्नेट लिगामेंट के साथ फिर से उत्तेजना पर प्रोलिग्नेटिव और साइटोलिटिक क्षमता को बढ़ाया है।

सभी के एक मानव विद्वेष मूमॉडल में, हमने 3 दिनों बनाम 9 दिनों(चित्रा 3ए)में काटा गया कार टी कोशिकाओं की शक्ति की तुलना की। हमने 9 दिनों के लिए उत्पन्न कार्ट19 कोशिकाओं के लिए एक खुराक निर्भर विरोधी ल्यूकीमिक प्रतिक्रिया दिखाई, जिसमें 3 x 106 की उच्च खुराक के लिए पूरी प्रतिक्रिया और 0.5 x 106की कम खुराक के लिए प्रभावकारिता का नुकसान हुआ। दिन 3 CART19 कोशिकाओं को CART19 कोशिकाओं की उच्च और कम खुराक दोनों में लगातार ट्यूमर नियंत्रण दिखाया(चित्रा 3बी)। यह प्रतिक्रिया चूहों के परिधीय रक्त में CART19 की पूर्ण गिनती(चित्रा 3सी)से जुड़ी थी जिसका विश्लेषण ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर किया गया था। कार टी समारोह के हमारे व्यापक आकलन से प्राप्त इन परिणामों सबूत है कि कार टी पहले काटा कोशिकाओं (दिन 3) कार टी 9 दिन पर काटा कोशिकाओं को मात प्रदान करते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: कार टी कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रसार और भेदभाव प्रोफ़ाइल। (A)एंटी-सीडी 3/सीडी28 चुंबकीय मोतियों के साथ उत्तेजना के बाद CART19 सेल विस्तार । (ख)पूरे संस्कृति में कल्टर विश्लेषण द्वारा सेल आकार का आकलन किया गया था । (ग)टी कोशिकाओं के फेनोटाइपिक विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि गेटिंग रणनीति। (D)टी सेल भेदभाव का लौकिक विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: दिन 3 CART19 कोशिकाओं को बढ़ाया प्रभावक समारोह और दिन 9 कोशिकाओं के सापेक्ष प्रसार प्रदर्शित करते हैं । (ए)CART19 कोशिकाओं को 3 और 9 दिन काटा गया था और सीडी 19 के साथ संकेत ित ई: टी अनुपात में सह-संस्कारी-K562 कोशिकाओं (K562-19) या जंगली प्रकार K562 (K562-जंगली प्रकार) व्यक्त किया गया । विशिष्ट साइटोटॉक्सिसिटी को 4 घंटे के बाद 51करोड़ रिलीज करके मापा गया था (बी)CSFE-लेबल वाले CART19 कोशिकाओं को K562-19, K562-जंगली-प्रकार, या मध्यम के साथ सह-संस्कारी किया गया था केवल 1:1 ई:टी अनुपात में 120 घंटे के लिए। कोशिकाओं को संकेत ित समय बिंदुओं पर काटा गया । फ्लो साइटोमेट्री द्वारा निरपेक्ष मामलों का आकलन किया गया था। 0 दिन में टी सेल गिनती के लिए सामान्यीकृत लाइव टी सेल गिनती के सापेक्ष गुना परिवर्तन दिखाए गए हैं। डेटा को मतलब ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्लॉट किया जाता है। पी एंड लेफ्टिनेंट; 0.001 की तुलना दिन 3 बनाम दिन 9। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: दिन 3 CART19 कोशिकाओं दिन 9 कोशिकाओं की तुलना में वीवो में अधिक शक्तिशाली हैं । (ए)विद्वेष मॉडल और CART19 सेल उपचार की योजनाबद्ध । दिन 3 और 9 CART19 कोशिकाओं या नियंत्रण टी कोशिकाओं (यूटीडी) चूहों में चतुर्थ इंजेक्शन थे 5−7 दिन NALM6 इंजेक्शन के बाद । (ख)3 दिन और 9 दिन काटे गए CART19 कोशिकाओं के साथ इलाज चूहों में ३८ दिन बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग द्वारा ट्यूमर के बोझ का परिमाणीकरण । प्रतीक एक-एक माउस का प्रतिनिधित्व करते हैं। क्षैतिज काली रेखा: प्रत्येक समूह का मतलब है। (C)निरपेक्ष परिधीय रक्त CD45+ टी सेल मायने रखता है CART19 सेल इंजेक्शन के बाद हर दो सप्ताह में मापा गया था और प्रयोग के अंत में एक उपयुक्त गिनती विधि (जैसे TruCount) अनपेयर मान-व्हिटनी परीक्षण द्वारा, दो पूंछ का इस्तेमाल किया गया था । **पी एंड एलटी; 0.01, ***पी एंड एलटी;0.001, ****P <0.0001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम पूर्व वीवो संस्कृति में अलग-अलग अंतराल पर काटे गए कार टी कोशिकाओं के कार्य और प्रभावकारिता को मापने के लिए दृष्टिकोणों का वर्णन करते हैं। हमारे तरीके प्रोलिफेरेटिव क्षमता के साथ-साथ विट्रो में प्रभावक कार्य का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किए गए परखों में व्यापक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। हम बताते हैं कि कार के माध्यम से उत्तेजना के बाद कार टी सेल गतिविधि को मापने के तरीके और ल्यूकेमिया के विस्तार विद्वेष मॉडल कार टी कोशिकाओं का उपयोग करके उनके लॉगरिथमिक विस्तार चरण के दिन 3 बनाम दिन 9 पर काटा जाता है।

पूर्व वीवो विस्तार के दौरान विभिन्न समय-बिंदुओं पर काटे गए कार टी कोशिकाओं की प्रभावकारिता की तुलना करने में अंतर्निहित चुनौतियां हैं। चूंकि 3-दिवसीय संस्कृति अवधि में उत्पन्न टी कोशिकाओं की मात्रा कम है, इसलिए कार्य का व्यापक मूल्यांकन करने के लिए अपर्याप्त संख्या हो सकती है। यह रोगी टी कोशिकाओं के संदर्भ में बढ़ा है जिनकी प्रजनन क्षमता अक्सर बाह्य और आंतरिक कारकों20के कारण कम हो जाती है ।

कितने कार टी कोशिकाओं को देखते हुए संचार किया जाना चाहिए कि दिन 3 कोशिकाओं को अपने दिन 9 समकक्षों कि उनके logarithmic प्रसार चरण से बाहर निकल रहे है की तुलना में बढ़ाया चयापचय और प्रसारक्षमता प्रदर्शन? हम अनुमान है कि दिन 3 कार टी कोशिकाओं की संख्या 3 x 106 तक पहुंच जाएगा अगर वे संस्कृति में एक और 6 दिनों के लिए विस्तारित किया गया । हम इस अनुमान का इस्तेमाल किया सूचित करने के लिए कितने दिन 3 कार टी कोशिकाओं का संचार किया जाना चाहिए (०.५ x १०६)के लिए 9 दिन के बराबर तुलना करें । तदनुसार, हम संचार कार टी कोशिकाओं के जैव गतिविधि, प्रभावकारिता और दृढ़ता की तुलना करने के लिए "तनाव परीक्षण" दृष्टिकोण लागू करते हैं। 3 x 106 से 0.5 x 106 संचार कार टी कोशिकाओं की संख्या कम होने से मतभेदों का पता चलता है जो अन्यथा संख्याओं के संतृप्ति द्वारा नकाबपोश होंगे। मशीनी रूप से, ट्यूमर नियंत्रण पर्याप्त प्रभावक कोशिकाओं के संचय पर निर्भर करता है ताकि उनके संबंधित लक्ष्य कोशिकाओं को लाय से किया जा सके। जलसेक की उच्च संख्या में, दिन 3 और दिन 9 कार टी कोशिकाएं कार्यात्मक क्षमता प्रदर्शित करती हैं।

दिन 3 कार टी कोशिकाओं के साथ काम करने में एक और चुनौती उत्तेजक सतह के लिए उनकी फर्म लगाव है । चुंबकीय मोतियों से उन्हें विस्थापित करने के लिए उन्हें यांत्रिक रूप से अलग करने और संस्कृति से उनकी वसूली को बढ़ाने के लिए दोहराव पाइपिंग की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, दिन 9 कोशिकाओं 1) पहले से ही मोतियों से अलग है, और 2) इस हद तक है कि वे सापेक्ष आसानी से काटा जा सकता है मोती पतला ।

कार टी सेल विनिर्माण प्रक्रिया में एक और महत्वपूर्ण चर सेल संस्कृति माध्यम का विकल्प है। आरपीएमआई आधारित माध्यम जिसे एफबीएस के साथ पूरक किया गया है, आमतौर पर प्रयोगात्मक उद्देश्यों के लिए उपयोग किया जाता है। इसके विपरीत, या तो एक्स-वीवो 15 या ऑप्ट्टमिज़र, मानव सीरम के साथ पूरक नैदानिक अनुप्रयोगों में पसंद किए जाते हैं। हालांकि ये कम विशेषता वाले होते हैं, उनमें घटक हो सकते हैं जो कम समय अवधि में टी सेल विस्तार की सुविधा प्रदान करते हैं। भेदभाव पर उनका प्रभाव अज्ञात है । इसके अतिरिक्त, साइटोकिन्स का जोड़ विकास, अस्तित्व और फेनोटाइप को प्रभावित करता है। जबकि आईएल-2 प्रभावक कोशिकाओं, आईएल-7 और आईएल-15 में तेजी से प्रसार और भेदभाव को चलाता है, जो लिम्फ नोड में उत्पन्न होता है और होमोस्टैटिक हठ में भूमिकाएं जानता है, टी कोशिकाओं के विस्तार में सुधार करता है और एक स्मृति स्टेम/केंद्रीय स्मृति फेनोटाइप22,23,24,25को बढ़ावा देता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को पेंसिल्वेनिया विश्वविद्यालय (माइकल सी Milone) के साथ ही सेंट बाल्ड्रिक फाउंडेशन विद्वान पुरस्कार (सबा घोसेमी) के साथ एक अनुसंधान गठबंधन के माध्यम से नोवार्टिस फार्मास्यूटिकल्स द्वारा प्रदान की गई फंडिंग के माध्यम से भाग में समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CD3/CD28 dynabeads Thermo Fisher 40203D
APC Mouse Anti-Human CD8 BD Biosciences 555369 RRID:AB_398595
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody BD Biosciences 560179 RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate BD Biosciences 349202
BD Trucount Absolute Counting Tubes BD Biosciences 340334
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody BioLegend 317444 RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody BioLegend 317322 RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Life Technolohgies C34554
CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen C36950
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody BD Pharmingen 561271 RRID:AB_10561679
FITC Mouse Anti-Human CD4 BD Biosciences 555346 RRID:AB_395751
HEPES Gibco 15630-080
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Human IL-2 IS, premium grade Miltenyi 130-097-744
L-glutamine Gibco 28030-081
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux Perkin Elmer
LIVE/DEAD Fixable Violet Molecular Probes L34964
Multisizer Coulter Counter Beckman Coulter
Na251CrO4 Perkin Elmer NEZ030S001MC
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody BioLegend 325616 RRID:AB_830689
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody BioLegend 302223
PE anti-human CD45RO Antibody BD Biosciences 555493 RRID:AB_395884
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody BioLegend 305610 RRID:AB_493652
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody Beckman Coulter A54823
Phenol red-free medium Gibco 10373-017
UltraPure SDS Solution, 10% Invitrogen 15553027
Via-Probe BD Biosciences 555815
X-VIVO 15 Gibco 04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Perkin Elmer 122799

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References

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Ghassemi, S., Milone, M. C. Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy. J. Vis. Exp. (154), e59949, doi:10.3791/59949 (2019).

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