Summary
Vi beskriver en tilnærming til pålitelig generering av chimeric antigen reseptor (CAR) T-celler og teste deres differensiering og funksjon in vitro og in vivo.
Abstract
Adoptiv immunterapi holder løftet for behandling av kreft og smittsomme sykdommer. Vi beskriver en enkel tilnærming til overfører primære menneskelige T-celler med chimeric antigen reseptor (CAR) og utvide sin avkom ex vivo. Vi inkluderer analyser for å måle CAR-uttrykk, i tillegg til differensiering, proliferativ kapasitet og cytolytisk aktivitet. Vi beskriver analysene for å måle effektor cytokin produksjon og inflammatorisk cytokin sekresjon i CAR T-celler. Vår tilnærming gir en pålitelig og omfattende metode til kultur CAR T-celler for prekliniske modeller av adoptiv immunterapi.
Introduction
Chimeric antigen reseptorer (CARs) gir en lovende tilnærming til å omdirigere T celler mot distinkte tumor antigener. Biler er syntetiske reseptorer som binder et antigen mål. Mens deres eksakte sammensetning er variabel, biler vanligvis inneholder 3 forskjellige domener. Ekstracellulære domenet dirigerer binding til et mål antigen og består vanligvis av ett enkelt kjede antistoff fragment knyttet til bilen via en ekstracellulære hengsel. Den andre domene, som vanligvis stammer fra CD3ζ kjeden av T celle reseptor (TCR) komplekse, fremmer T celle aktivering følgende CAR engasjement. En tredje costimulatory domene er inkludert for å forbedre T celle funksjon, engraftment, metabolisme, og utholdenhet. Suksessen til bil T Cell Therapy i ulike blodkreft ondartet inkludert B Cell akutt lymfatisk leukemi (alle), kronisk lymfatisk leukemi (CLL) og flere myelom fremhever den terapeutiske løftet om denne tilnærmingen1,2,3,4,5,6. De siste Food and Drug Administration (FDA) godkjenninger for to CD19-spesifikke CAR T celle terapier, tisagenlecleucel for pediatric og unge voksne alle og axicabtagene ciloleucel for diffuse store B-celle lymfom, forsterker translational fortjeneste av CAR T celle terapi.
BIL T-baserte tilnærminger innebære isolering av T-celler fra perifert blod, aktivering, genetisk modifisering, og ekspansjon ex vivo. Differensiering er en viktig parameter som regulerer CAR T-celle effekt. Følgelig, begrenser T celle differensiering under ex vivo kultur forbedrer evnen til tilført produktet for å engraft, utvide, og vedvarer, gir lang tids immunosurveillance etter adoptiv overføring2,7,8,9. T-celler består av flere forskjellige delsett, inkludert: naive T-celler (TN), sentral minne (TCM), effektor minne (TEM), effektor differensiert (tte) og Stamcelle minne (TSCM). Effektor differensiert T-celler har potent cytolytisk evne; men de er korte levd og engraft dårlig10,11,12. I kontrast T celler med en mindre differensiert fenotype inkludert naiv T celler og TCM utstillingen overlegen engraftment og proliferativ evner etter adoptiv celle overføring13,14,15,16,17,18. Sammensetningen av de innsamlede T-cellene i det premanufactured produktet kan variere mellom pasienter og samsvarer med det terapeutiske potensialet til CAR T-celler. Andelen T-celler med en naiv-lignende immunophenotype i Start aferese produktet er svært korrelert med både engraftment og klinisk respons19.
Kultur varighet er en viktig parameter som påvirker differensiering i CAR T-celler forberedt for adoptiv overføring. Vi har nylig utviklet en tilnærming til å generere overlegen kvalitet CAR T-celler ved hjelp av en forkortet kultur paradigme20. Ved hjelp av vår tilnærming, viste vi at begrenset kultur gir opphav til CAR T-celler med overlegen effektor funksjon og utholdenhet etter adoptiv overføring i xenograft modeller av leukemi. Her presenterer vi tilnærminger til pålitelig generere CART19 celler (autologous T-celler konstruert for å uttrykke anti-CD19 scFv knyttet til CD3ζ og 4-1BB signalering domener) og inkluderer en detaljert beskrivelse av analysene som gir innsikt i CAR T-bioactivity og effekt før adoptiv overføring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrestudier er godkjent av den institusjonelle Animal Care og bruk komité ved University of Pennsylvania.
1. T Cell aktivisering, Transduction, og ekspansjon
- Aktiver fersk eller embryo primære menneskelige T-celler ved å blande med anti CD3/CD28 magnetiske perler (f. eks, dynabeads) i forholdet 3 perler per T celle i 6-brønn cellekultur retter. Kultur T-celler i X-VIVO 15 medium supplert med 5% normal Human AB serum, 2 mM L-glutamin, 20 mM HEPES og IL2 (100 enheter/mL). Oppretthold T-celler ved en konsentrasjon på 106 T celler/ml under ekspansjon. Kultur T celler ved 37 ° c, 20% O2, og 95% fuktighet med 5% co2.
- Etter over natten stimulering, tilsett lentiviral supernatanten til aktiverte T-celler. Beregn volumet av supernatanten som er nødvendig for å oppnå et mangfold av infeksjoner (MOI) på 3 − 5.
Merk: Den CD19-BBζ CAR lentivirus plasmider består av et CD8 hengsel, 4-1BB costimulatory domene, og CD3ζ signalering domene21. CD19-BBζ lentiviral supernatanten ble generert som tidligere beskrevet21. - På dag 3, samle en representativ alikvot av celler for kryonisk bevaring. Før kryonisk bevaring, Fjern de magnetiske perlene ved skånsom pipettering og magnetisk separasjon. Forbered frysing medium som inneholder fosfat-bufret saltvann (PBS) med 0,5% dimethyl sulfoxide (DMSO) og oppbevares i 4 ° c til bruk.
- Sentrifuger T-celler ved 300 x g i 5 min. kast supernatanten og tilsett 5 ml PBS. Sentrifuger celler på 300 x g i 5 min og forkaste PBS.
- Resuspend celle pellet i 1 mL kaldt kryonisk bevaring medium. Frys T-cellene i en avkjølt fryse beholder og oppbevar ved-80 ° c for 48 h. Overfør de frosne cellene til flytende nitrogen.
- Vask resten av T-cellene én gang i 5 mL PBS for å eliminere gjenværende vektor. Sentrifuger på 300 x g i 5 min. Dekanter PBS og resuspend cellen pellet i T cellekultur medium ved en konsentrasjon av 0,5 x 106 celler/ml.
- Del T-cellene i to kulturer, utpekt for dag 5 og dag 9. Count T celler ved flyt flowcytometri bruker telling perler (tabell av materialer) og monoklonale antistoffer mot menneskelig CD4 og CD8, samt en levedyktighet fargestoff (tabell av materialer).
- For å måle T celle konsentrasjon, utarbeide en Master Mix inneholdende 500 μL av PBS, 5 μL av telle perler, 10 μL av 7-amino-actinomycin D celle levedyktighet løsning, 4 μL av CD4-FITC og 4 μL av CD8-APC. Legg til 40 μL av T-celler til Master mix og måle celle konsentrasjon av Flow flowcytometri basert på antall Live T celler/perle teller. Refeed å opprettholde kulturer ved en konsentrasjon av 0,5 x 106 celler/ml annenhver dag.
- På dag 5, antall og lagre nedfryste dag 5 kulturer som beskrevet i trinn 1,3 og 1,5.
- På dag 7, vask 0,5 x 106 T celler i PBS og resuspend i 100 μL av fluorescens aktivert celle sortering (FACS) buffer. Oppdage bil overflaten protein uttrykk ved immunostaining med en fluorescensmerkete-bøyd anti-CAR19 idiotype ved flyt flowcytometri.
- På dag 9, Tell dag 9 kulturer og lagre nedfryste som beskrevet i trinn 1,3.
2. fenotypiske vurdering av T celle differensiering
- Forbered en Master Mix inneholder pre-titrert antistoffer for anti-CD3-BV605 (klone OKT3), anti-CD14-Pacific Blue (PB) (klone HCD14), anti-CD19-PB (klone HIB19), anti-CD4-BV510 (klone OKT4), anti-CD8-H7APC (klone SK1), anti-CCR7-FITC (klone 150503), anti-CD45RO – PE (Klon UCHL1), anti-CD27 – PE-Cy7 (Klon 1A4CD27), anti-CD95 – PerCP-CY 5.5 (Klon DX2), og anti-CAR19-APC.
- Forbered individuelle fluorescens minus en (FMO) kontroller for anti-CD45RO-PE, anti-CCR7-FITC, anti-CD27-PE-Cy7 og anti-CD95-PerCP-CY 5.5 å skille positivt farget celler fra bakgrunnen.
- Forbered død celle farging løsning ved å fortynne Live/Dead Stock reagens (tabell av materialer) 1:10000 i PBS.
- Tin dag 3, dag 5, og dag 9 T-celler som tidligere var embryo. Sentrifuger 1 x 106 T celler fra hver gruppe på 300 x g i 3 min. kast supernatanten. Vask cellene en gang med PBS. Sentrifuger på 300 x g for 3 min og forkaste PBS.
- Bland T-celler med død farge løsning i 15 minutter ved romtemperatur (RT), beskyttet mot lyset.
- Tilsett 1 mL FACS buffer for å slukke den døde cellen farging fargestoff. Sentrifuger på 300 x g i 3 min, kast supernatanten og resuspend celle pellet i 100 ΜL av FACS-buffer som inneholder antistoff-cocktail beskrevet i trinn 2,1 og 2,2. Ruge for 1 t ved 4 ° c.
- Tilsett 1 mL FACS buffer og sentrifuger ved 300 x g i 3 min for å vaske av ubundet antistoff. Gjenta tre ganger med FACS buffer.
- Resuspend celler i 1% paraformaldehyde (PFA) og oppbevares ved 4 ° c.
- Som CD45RO uttrykket synker etter fiksering, analysere prøvene ved flyt flowcytometri etter immunostaining. For å vurdere differensiering, gate i følgende rekkefølge: singleter (FSC-H vs FSC-A), Live CD3+ T celler (dump [Live-Dead VIOLET, CD14-PB og CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). I CD4+ og CD8+ DELSETT, gate på CD45RO-PE vs CCR7-FITC å definere naive-lignende T celler (CD45RO-CCR7+), TCM (CD45RO+CCR7+), tem (CD45RO+CCR7-), og tte (CD45RO-CCR7-). For å identifisere TSCM, gate på CD27+ T celler i naiv-som T celler befolkning. I dette rommet, TSCM er CD95+ og TN er CD95-.
3. funksjonell analyse i vitro
- BIL T celle spredning og cytokin sekresjon
- Kontroller bil uttrykk i tillegg til celle levedyktighet som beskrevet i trinn 1,5 og 1,7, ved flyt flowcytometri.
- Vask 5 x 106 T celler fra hver gruppe (dag 3, dag 5 og dag 9) med PBS og resuspend i en 1 μM løsning av carboxyfluorescein diacetate succinimidyl Ester (CFSE) i PBS for 3,5 min ved RT.
- Umiddelbart legge 10 mL av PBS inneholder 10% fosterets storfe serum (FBS) for å slukke reaksjonen.
- Sentrifuger oppløsningen ved 300 x g i 3 min. kast supernatanten og gjenta dette vaske trinnet tre ganger. Tell cellene ved avslutningen av CFSE farging ved hjelp av en Coulter-teller (tabell med materialer).
- Harvest CFSE-fargede celler (unstimulated), resuspend i 1% PFA og oppbevares ved 4 ° c for analyse ved flyt flowcytometri.
- Ruge ønsket antall CFSE-farget CAR T-celler med bestrålt K562-CD19 (target) samt K562-Wild type (kontroll) celler i forholdet 1:1 for 120 h i cytokin fri kultur medium og kultur forhold som beskrevet i trinn 1,1.
- Etter 24 h, sentrifuger kulturen fartøyet på 300 x g i 5 min. samle 120 μL av cellulære supernatanten. Vurdere aktiverings avhengig produksjon av IL2, IFNγ, TNFα, GM-CSF og andre inflammatoriske cytokiner (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8 og IL10) av Luminex analyser i samsvar med produsentens anbefalinger.
- Erstatt volumet av supernatanten som ble samlet i trinn 3.1.7 med et tilsvarende volum (120 μL) av friskt medium.
- På dag 3 (dvs. etter 96 h), Tell og re-feed ved en konsentrasjon på 0,5 x 106 celler/ml ved hjelp av perle-baserte Flow flowcytometri som tidligere i trinn 1,5.
- På dag 5, telle Live CD3+ celler og beregne fold endring av Live t-celler i forhold til live t celle teller på dag 0.
- Utfør en omfattende analyse av CFSE fortynning i å dele CAR T-celler ved hjelp av FlowJo programvare for å markere påfølgende runder av celledeling.
Merk: sprednings analysene er godt beskrevet i FlowJo-manualen.
- Cytotoksisitet analysen
Merk: Evnen til CART19 celler til å drepe målceller uttrykker CD19 er evaluert ved hjelp av en 51CR Release-analysen.- Merk målcellene ved å blande 5 x 105 K562-CD19, K562-Wild type kontroll celler, eller NALM6 leukemi celler med 50 ΜL av Na251CrO4 og 0,5 mL RPMI supplert med 10% FBS for 90 min i inkubator ved 37 ° c.
- Sentrifuge celler ved 300 x g for 2,5 min. kast den radioaktive supernatanten i egnede Avfallsbeholdere og vask målcellene i 5 ml PBS. Gjenta vaske trinnene to ganger.
- Resuspend målcellene med rødt fritt medium i fenol, som inneholder 5% FBS. Bruk dette mediet for resten av prosedyren for å redusere bakgrunnen.
- Etter å ha evaluert bil uttrykk og celle levedyktighet ved Flow flowcytometri (som beskrevet i avsnitt 5,1), bland CAR T-celler med merket målceller på effektor: Target (E:T) prosenter av 10:1, 3:1 og 1:1, i tre eksemplarer. Overføring til en 96-brønn U bunnplate.
- Parallelt, ta med målceller alene, og målrette celler med 1% natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS), for å bestemme spontan (S) og maksimum (M) 51CR Release, henholdsvis.
- Sentrifuger celler ved 300 x g i 5 min og ruge for 4 t eller 20 timer i en 37 ° c inkubator med 5% co2.
- Etter den angitte tiden, sentrifuger kulturen fartøyet på 300 x g i 5 min. samle 35 μL av mobilnettet supernatanten og overføre til en leser plate. Unngå bobler. La tallerkenen tørke over natten.
- Forsegle platen med en standard plate sel og telle med en flytende scintillation teller. Krom overflod i supernatanten gir en proxy av målet celle drap. Beregn prosentandelen av spesifikke lyse Rings som følger: 100 x (teller per minutt [CPM] eksperimentelle utgivelse-CPM S utgivelse)/(CPM M Release-CPM S release).
4. i vivo funksjonell analyse
- Skaff 6 − 10-ukers-gamle Nod-SCID γc–/– (nsg) mus, som mangler et adaptiv immunforsvar, og Tildel dem til behandling/kontrollgruppe tilfeldig.
- Injiser dyr intravenøst via hale vene med 1 x 106 NALM6 celler i 0,1 ml steril PBS.
- Etter 5 − 7 dager, Bekreft tumor engraftment ved bioluminesens Imaging (BLI). Injiser 150 mg/kg D-luciferin til mus som har blitt anesthetized med isoflurane (volum er avhengig av kroppsmassen).
- Mål bioluminesens verdier ved hjelp av et bildesystem. Kvantifisere total Flux bruker tilsvarende programvare ved å tegne rektangler av identiske området rundt mus, nå fra hode til 50% av halen lengde. Trekk bakgrunnen for hvert bilde individuelt.
- Etter å etablere leukemi, injisere 3 x 106 dag 9 CART19 celler, 0,5 x 106 dag 3 bil t celler, eller tilsvarende ikke-transduced (NTD) menneskelige T-celler via hale blodåre i et volum på 100 μL av steril PBS/ca2 +.
Merk: Som bioactivity av celler høstes ved ulike intervaller i løpet av kultur prosessen er forskjellig, er den valgte konsentrasjonen av dag 3 celler lavere enn dag 9. - For å fastslå sykdomsprogresjon, mål bioluminesens verdiene to ganger i uken som beskrevet ovenfor i trinn 4,3.
- For å bestemme CAR T-celle engraftment, samle 75 μL blod via retro-orbital blødning i en EDTA-belagt tube. Overfør 50 μL av blod til absolutte telle slanger.
- Stain blod med antistoffer mot CD45, CD4, CD8 og CAR i 30 min ved RT. Tilsett 400 μL av 1x FACS lysering løsning på rørene og Vortex grundig. Etter farging, analysere overflaten markør uttrykk ved flyt flowcytometri.
Merk: Andre overflate markører kan brukes til å vurdere differensiering og utmattelse status for T-cellene i blodet. - For å måle cytokiner nivåer i blod, sentrifuger blod ved 1 200 x g i 30 min ved 4 ° c til Skill serum fra det øvre laget av blod.
- Samle serum og måle cytokiner med en utpekt leser plate i henhold til produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av metodene beskrevet ovenfor, vi stimulert og utvidet T-celler for enten 3 eller 9 dager (figur 1A, B). Vi har også analysert deres differensiering profil, som indikert av gating strategien skissert i figur 1C, ved å måle overflod av distinkte glykoproteiner uttrykt på celleoverflaten. Vi viser en progressiv forskyvning mot effektor differensiering over tid under ex vivo kultur (figur 1D). Vi vurderte effektor funksjon og proliferativ kapasitet på CAR T-cellen som svar på antigen. Vi viser at celler som ble utvidet mindre (høstet tidligere) var funksjonelt overlegen i forhold til cellene omfattende kultivert over en lengre varighet. Dag 3 CART19 celler har forbedret proliferativ og cytolytisk evne ved re-stimulering med sine beslektet ligand i forhold til dag 9 (figur 2A, B).
I en menneskelig xenograft moue modell av alle, sammenlignet vi styrken på CAR T-celler høstet på 3 dager versus 9 dager (Figur 3a). Vi viste en dose avhengig anti Leukemic respons for CART19 celler generert for 9 dager med en komplett respons for høy dose av 3 x 106 og et tap av effekt for den lave dosen av 0,5 x 106. Dagen 3 CART19 celler viste vedvarende tumor kontroll i både høye og lave doser av CART19 celler (Figur 3B). Dette svaret ble assosiert med den absolutte greven av CART19 i perifert blod av mus (Figur 3C) som ble analysert basert på protokollen beskrevet ovenfor. Disse resultatene Hentet fra vår omfattende vurdering av CAR T-funksjonen gir bevis for at at CAR T-celler høstet tidligere (dag 3) overgå CAR T-celler høstes på dag 9.
Figur 1: representative spredning og differensiering profil av Car T-celler. (A) CART19 celle ekspansjon etter stimulering med anti-CD3/CD28 magnetiske perler. (B) Cellestørrelse ble vurdert av Coulter analyse gjennom hele kulturen. (C) representant gating strategi for fenotypiske analyse av T-celler. (D) Temporal analyse av T celle differensiering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: dag 3 CART19 celler viser forbedret effektor funksjon og spredning i forhold til dag 9-celler. (A) CART19 celler ble høstet på dag 3 og 9 og co-kultivert ved indikerte E:T ratio med CD19-uttrykker K562 celler (K562-19) eller vill-type K562 (K562-Wild type). Spesifikke cytotoksisitet ble målt ved 51CR Release etter 4 h. (B) CSFE-merket CART19 celler var co-kultivert med K562-19, K562-Wild-type, eller medium bare for 120 h på et 1:1 E:T ratio. Celler ble høstet på indikert tidspunkter. Absolutte tellinger ble vurdert av strømnings flowcytometri. Relativ fold endringer av Live T celle telling normalisert til T celle telling på dag 0 vises. Data tegnes som gjennomsnittet ± standardavvik (SD). P < 0,001 sammenligne dag 3 versus dag 9. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: dag 3 CART19 celler er mer potente i vivo enn dag 9 celler. (A) skjematisk av xenograft modell og CART19 celle behandling. Dag 3 og 9 CART19 celler eller kontroll T-celler (UTD) ble IV-injisert i mus 5 − 7 dager etter NALM6 injeksjon. (B) kvantifisering av tumor byrde ved bioluminesens Imaging på dag 38 i mus behandlet med CART19 celler høstet på dag 3 og dag 9. Symbolene representerer én mus hver. Horisontal svart linje: gjennomsnittet av hver gruppe. (C) absolutt PERIFERT blod CD45+ T celle antall ble målt annenhver uke etter CART19 celle injeksjon og på slutten av eksperimentet ved en hensiktsmessig tellemetode (for eksempel TruCount) sammenkoblet mann-Whitney-test, tosidig ble brukt. * * P < 0,01, * * * P < 0,001, * * * * P < 0,0001. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi tilnærminger for å målefunksjonen og effekten av CAR T-celler høstes med varierende intervaller gjennom ex vivo kultur. Våre metoder gir omfattende innsikt i analyser som er utformet for å vurdere proliferativ kapasitet så vel som effektor funksjon in vitro. Vi beskriver hvordan du måler CAR T celle aktivitet etter stimulering gjennom bilen og detalj xenograft modeller av leukemi bruker CAR T celler høstet på dag 3 vs dag 9 av deres logaritmisk ekspansjons fase.
Det er iboende utfordringer i å sammenligne effekten av CAR T-celler høstes på ulike tidspunkt-poeng under ex vivo ekspansjon. Ettersom antallet T-celler som genereres over en 3-dagers kultur varighet er lav, kan det være for lite tall til å utføre en omfattende vurdering av funksjonen. Dette forverres i sammenheng med pasienten T-celler som proliferativ evne er ofte redusert på grunn av ytre og iboende faktorer20.
Hvor mange CAR T-celler bør tilført gitt at dag 3 celler utstillingen forbedret metabolsk og proliferativ evne i forhold til deres dag 9 kolleger som er spennende sin logaritmisk proliferativ fase? Vi anslått hvilke antall dag 3 CAR T-celler ville nå 3 x 106 hvis de ble utvidet for ytterligere 6 dager i kultur. Vi brukte dette anslaget for å informere hvor mange dag 3 CAR T-celler skal være tilført (0,5 x 106) for å sammenligne ekvivalent til dag 9. Følgelig bruker vi "stress test" tilnærming for å sammenligne bioactivity, effekt og utholdenhet av tilført CAR T-celler. Redusere antall tilført CAR T-celler fra 3 x 106 til 0,5 x 106 avslører forskjeller som ellers ville være maskert av metning av tall. Mechanistically, tumor kontroll er avhengig av akkumulering av tilstrekkelige Effektor celler for å lyse deres tilsvarende målceller. Ved høye antall infusjon har både dag 3 og dag 9 CAR T-celler funksjonell kompetanse.
En annen utfordring i arbeidet med dag 3 CAR T-celler er deres faste feste til stimulerende overflaten. Fortrenge dem fra magnetiske perler krever repeterende pipettering å mekanisk distansere dem og forbedre deres utvinning fra kultur. I kontrast, dag 9 celler har 1) allerede løsrevet fra perlene, og 2) fortynnet perlene i en slik grad at de kan høstes med relativ letthet.
En annen viktig variabel i CAR T-cellen produksjonsprosessen er valget av cellekultur medium. RPMI-basert medium som har blitt supplert med FBS brukes vanligvis for eksperimentelle formål. I kontrast, enten X-VIVO 15 eller OpTmizer, supplert med humant serum foretrekkes i kliniske anvendelser. Selv om disse er mindre preget, kan de inneholde komponenter som letter T celle ekspansjon i en kortere periode. Deres innvirkning på differensiering er ukjent. I tillegg, tillegg av cytokiner påvirker vekst, overlevelse, og fenotype. Mens Il-2 stasjoner rask spredning og differensiering i Effektor celler, Il-7 og Il-15, som kommer i lymfe noden og har kjente roller i homøostatisk utholdenhet, forbedrer utvidelse av T-celler og fremme et minne stammen/sentrale minne fenotype22,23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis gjennom finansiering levert av Novartis Pharmaceuticals gjennom en forsknings allianse med University of Pennsylvania (Michael C. Milone) samt St. Baldrick ' s Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
