Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Published: December 17, 2019 doi: 10.3791/59949
Automatic Translation
1, 1
1Center for Cellular Immunotherapies, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania

Summary

Мы описываем подход к надежно генерировать химерные антигенные рецепторы (CAR) Т-клеток и проверить их дифференциации и функции в пробирке и in vivo.

Abstract

Приемная иммунотерапия обещает лечение рака и инфекционных заболеваний. Мы описываем простой подход к преобразовыванию первичных т-клеток человека с химерным рецептором антигена (CAR) и расширить их потомство ex vivo. Мы включаем анализы для измерения экспрессии ЦАР, а также дифференциации, пролиферативной способности и цитолитической активности. Мы описываем анализы для измерения производства цитокинов эффектора и воспалительной секреции цитокинов в т-клеток CAR. Наш подход обеспечивает надежный и комплексный метод культуры Т-клеток CAR для доклинических моделей приемной иммунотерапии.

Introduction

Химерные рецепторы антигена (ЦАР) обеспечивают перспективный подход к перенаправлению Т-клеток против различных опухолевых антигенов. CARs синтетические рецепторы, которые связывают антиген цели. Хотя их точный состав является переменным, CARs обычно содержат 3 различных домена. Внеклеточный домен направляет привязку к целевому антигену и, как правило, состоит из одного фрагмента цепных антител, связанных с CAR через внеклеточный шарнир. Второй домен, обычно полученный из цепочки CD3 и комплекса Рецепторов Т-клеток (TCR), способствует активации Т-клеток после участия в CAR. Третий costimulatory домен включен для повышения функции Т-клеток, прививаемость, метаболизм, и настойчивость. Успех Т-клеточной терапии CAR в различных гематопоитических злокачественных новообразований, включая B-клеток острого лимфобластного лейкоза (ВСЕ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) и множественной миеломы подчеркивает терапевтическое обещание этого подхода1,2,3,4,5,6. Недавнее Управление по контролю за продуктами питания и лекарствами (FDA) утверждения для двух CD19 конкретных CAR T клеточной терапии, tisagenlecleucel для педиатрических и молодых взрослых ВСЕ и axicabtagene ciloleucel для диффузной большой B-клеточной лимфомы, усиливает перевод по заслугам CAR T клеточной терапии.

Подходы, основанные на Т, включают изоляцию Т-клеток от периферической крови, активацию, генетическую модификацию и расширение ex vivo. Дифференциация является важным параметром, регулирующим эффективность CAR Т-клеток. Соответственно, ограничение дифференциации Т-клеток во время культуры ex vivo повышает способность инфляции, расширения и упорства, обеспечивая долгосрочную иммунонадзор после приемной передачи2,7,9. Т-клетки состоят из нескольких различных подмножеств, включая: наивные Т-клетки (Tn), центральную память (Tcm), эм, эффектор дифференцированный (Tte) и память стволовых клеток (Tscm). Эффектор дифференцированных Т-клеток имеют мощные цитолитические способности; однако, они недолговечны и прививают плох10,11,12. В отличие от этого, Т-клетки с менее дифференцированным фенотипом, включая наивные Т-клетки и Ткм, обладают превосходными прививочными и пролиферативными способностями после передачи приемных клеток13,14,15,16,17,18. Состав собранных Т-клеток в предизготовленный продукт может варьироваться в разных пациентах и коррелирует с терапевтическим потенциалом Т-клеток CAR. Доля Т-клеток с наивным иммунофенотипом в стартовом аферезе сильно коррелирует как с прививкой, так и с клинической реакцией19.

Продолжительность культуры является важным параметром, влияющим на дифференциацию в Т-клетках CAR, подготовленных для приемной передачи. Недавно мы разработали подход к созданию высококачественных CAR T-клеток с использованием сокращенной парадигмы культуры20. Используя наш подход, мы показали, что ограниченная культура приводит к CAR Т-клеток с превосходной функцией эффектора и настойчивость после принятия передачи в ксенотрансплантата моделей лейкемии. Здесь мы представляем подходы к надежно генерировать CART19 клеток (автологические Т-клетки инженерии, чтобы выразить анти-CD19 scFv прилагается к CD3 и 4-1BB сигнализации доменов) и включают подробное описание анализов, которые обеспечивают понимание биоактивности CAR T и эффективность до принятия передачи.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования на животных одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Пенсильвании.

1. Активация Т-клеток, трансдукция и расширение

  1. Активируйте свежие или криоконсервированные первичные Т-клетки человека, смешивая с анти-CD3/CD28 магнитными бусинами (например, динабии) в соотношении 3 бусины на Т-клетку в 6-колодских блюдах культуры клеток. Культура Т-клеток в X-VIVO 15 средних дополнен5% нормальной человеческой AB сыворотки, 2 мМ L-глютамин, 20 мМ HEPES, и IL2 (100 единиц /мл). Поддержание Т-клеток в концентрации 106 Т-клеток/мл во время расширения. Культура Т-клеток при 37 градусах Цельсия, 20% O2и 95% влажности с 5% CO2.
  2. После ночной стимуляции добавьте ленцивирусный супернатант в активированные Т-клетки. Рассчитайте объем супернатанта, необходимый для достижения многообразия инфекции (МВД) в 3-5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CD19-BB-CAR лентивирусная плазмида состоит из cd8 шарнир, 4-1BB costimulatory домена, и CD3 "сигнализации домена21. CD19-BB - лентивирусный супернатант был создан, как ранее описано21.
  3. На 3-й день соберите представительный аликот клеток для криоконсервации. Перед криоконсервацией, удалить магнитные бусы путем нежного пипеттинг и магнитного разделения. Подготовка замораживания среды, содержащей фосфат-буферный солевой раствор (PBS) с 0,5% диметил сульфодоксид (DMSO) и хранить в 4 кв КС до использования.
    1. Центрифуга Т-клеток на 300 х г в течение 5 мин. Отбросьте супернатант и добавить 5 мл PBS. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 5 мин и отказаться от PBS.
    2. Приостановите действие клеточной гранулы в 1 мл холодной криоконсервации среды. Заморозить Т-клетки в охлажденный замораживающий контейнер и хранить при -80 градусах по Цельсию в течение 48 ч. Перенесите замороженные клетки в жидкий азот.
  4. Вымойте остальные Т-клетки один раз в 5 мл PBS для устранения остаточного вектора. Центрифуга на 300 х г в течение 5 мин. Декант PBS и resuspend клеточных гранул в Т-клеточной среде культуры в концентрации 0,5 х 106 клеток / мл.
  5. Разделите Т-клетки на две культуры, предназначенные для 5-го дня и 9-го дня. Подсчитайте Т-клетки по цитометрии потока с помощью подсчета шариков(Таблица материалов)и моноклональных антител к человеческому CD4 и CD8, а также красителя жизнеспособности (Таблица материалов).
    1. Для измерения концентрации Т-клеток подготовьте мастер-микс, содержащий 500 л PbS, 5 qL отсчета шариков, 10 зл 7-амино-актиномицин D раствор жизнеспособности клетки, 4 Зл CD4-FITC и 4 Зл CD8-APC. Добавьте 40 КЛ Т-клеток в мастер-микс и измерьте концентрацию клеток цитометрией потока на основе количества живых Т-клеток/бисовых отсчетов. Перекормите для поддержания культур в концентрации 0,5 х 106 клеток/ мл через день.
  6. На 5-й день, отсчет и криоконсервный день 5 культур, как описано в шагах 1.3 и 1.5.
  7. На 7-й день промыть 0,5 х 106 Т-клеток в PBS и повторно приостановить в 100 зл флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) буфера. Обнаружить экспрессию поверхностного белка CAR путем иммуноспотирования с флуоресцентно-конъюгированным анти-CAR19 идиотипом цитометрии потока цитометрии.
  8. На 9-й день, отсчет день 9 культур и криоконсерваваемов, как описано в шаге 1.3.

2. Фенотипическая оценка дифференциации Т-клеток

  1. Подготовка мастер-микс, содержащий предварительно титрованные антитела для анти-CD3-BV605 (клон OKT3), анти-CD14-Pacific Blue (PB) (клон HCD14), анти-CD19-PB (cl ONE HIB19), анти-CD4-BV510 (клон OKT4), анти-CD8-H7APC (клон SK1), анти-CCR7-FITC (клон 150503), анти-CD45RO-PE (клон UCHL1), анти-CD27-PE-Cy7 (клон 1A4CD27), анти-CD95-PerCP-Cy5.5 (Clone DX2) и анти-CAR19-APC.
  2. Подготовьте индивидуальный флуоресценции минус один (FMO) управления для анти-CD45RO-PE, анти-CCR7-FITC, анти-CD27-PE-Cy7 и анти-CD95-PerCP-Cy5.5, чтобы отличить положительно окрашенных клеток от фона.
  3. Подготовка мертвых клеток окрашивая решение путем разбавления живой / мертвый стоковый реагент (Таблица материалов) 1:10,000 в PBS.
  4. Оттепель день 3, день 5, и день 9 Т-клетки, которые ранее были криоконсервированы. Центрифуга 1 х 106 Т-клеток от каждой группы при 300 х г в течение 3 мин. Отбросьте супернатант. Вымойте клетки один раз с PBS. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин и отбрасывайте PBS.
  5. Смешайте Т-клетки с мертвым окрашивающим раствором в течение 15 минут при комнатной температуре (RT), защищенным от света.
  6. Добавьте 1 мл буфера FACS, чтобы утолить окрашивание окрашивания омертвевательных элементов. Центрифуга при 300 х г в течение 3 мин, отбросить супернатант и resuspend клеточной гранулы в 100 злитела хл буфера FACS, содержащий коктейль антитела описаны в шаге 2.1 и 2.2. Инкубировать 1 ч при 4 градусах Цельсия.
  7. Добавьте 1 мл буфера FACS и центрифугу при 300 х г в течение 3 мин, чтобы смыть несвязанные антитела. Повторите три раза с буфером FACS.
  8. Приостанавливать клетки в 1% параформальдегида (PFA) и хранить при 4 градусах Цельсия.
  9. Как CD45RO выражение уменьшается после фиксации, анализировать образцы по течению цитометрии после иммуностоинга. Для оценки дифференциации, ворота в следующем порядке: синглеты (FSC-H против FSC-A), живые CD3и Т-клетки (Dump (Сброс »живой-мертвый фиолетовый, CD14-PB и CD19-PB против CD3-BV605», CD4-BV510 против CD8-APC-H7). ВCD4 иCD8 подмножествах, ворота на CD45RO-PE против CCR7-FITC для определения наивных Т-клеток (CD45RO-CCR7, Tcm (CD45RO-CCR7),Тем (CD45RO-CCR7-и Tte (CD45RO-CCR7-). Для идентификации Tscm, ворота на CD27и Т-клетки в наивных, как Т-клетки населения. В этом отсеке, Tscm являются CD95и Tn являются CD95-.

3. В vitro функциональный анализ

  1. ПРОлиферация т-клеток CAR и секреция цитокинов
    1. Проверить экспрессию CAR, а также жизнеспособность клеток, как описано в шагах 1.5 и 1.7, цитометрией потока.
    2. Вымойте 5 х 106 Т-клеток от каждой группы (день 3, день 5 и день 9) с PBS и resuspend в 1 мкм раствор карбоксифлюоресцеи диацетат succinimidyl эфир (CFSE) в PBS в течение 3,5 мин на RT.
    3. Немедленно добавьте 10 мл PBS, содержащий 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), чтобы утолить реакцию.
    4. Centrifuge раствор на 300 х г в течение 3 мин. Отбросьте супернатант и повторите этот шаг стирки три раза. Подсчитайте клетки в конце CFSE окрашивания с помощью счетчика Coulter (Таблица материалов).
    5. Урожай CFSE окрашенных клеток (нестимулированных), resuspend в 1% PFA и хранить при 4 кВ для анализа по потоку цитометрии.
    6. Инкубировать желаемое количество CFSE окрашенных CAR T-клеток с облученной K562-CD19 (цель), а также K562-дикий тип (контроль) клетки в соотношении 1:1 на 120 ч в цитокинов свободной культуры среды и культурных условий, как описано в шаге 1.1.
    7. После 24 ч центрифуги культуры судна на 300 х г в течение 5 мин. Соберите 120 л клеточного супернатанта. Оцените производство IL2, IFN, TNF, GM-CSF и других воспалительных цитокинов (IL1, IL4, IL5, IL6, IL8 и IL10) по анализу Luminex в соответствии с рекомендациями производителя.
    8. Замените объем супернатанта, который был собран в шаге 3.1.7 с эквивалентным объемом (120 л) свежей среды.
    9. На 3-й день (т.е. после 96 ч) количество и повторное кормление при концентрации 0,5 х 106 клеток/мл с использованием цитометрии потока на основе биса, как ранее в шаге 1.5.
    10. На день 5, подсчитайте живые клетки CD3и вычислите изменение створки в реальном маштабе времени Т-клеток по отношению к реальному отсчету клетки T на день е 0.
    11. Выполните комплексный анализ разбавления CFSE при делении Т-клеток CAR с использованием программного обеспечения FlowJo для выделения последовательных раундов деления клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы распространения хорошо описаны в руководстве FlowJo.
  2. Цитотоксичность асссы
    ПРИМЕЧАНИЕ: Способность клеток CART19 убивать клетки-мишени, выражающие CD19, оценивается с помощью 51Cr-асссе.
    1. Этикетка целевых клеток путем смешивания 5 х 105 K562-CD19, K562-дикий тип контрольных клеток, или NALM6 лейкозных клеток с 50 Л Na251CrO4 и 0,5 мл RPMI дополнил 10% FBS для 90 мин в инкубаторе при 37 градусах Цельсия.
    2. Центрифуги клетки на 300 х г в течение 2,5 мин. Отбросить радиоактивный супернатант в соответствующих бункеров удаления и мыть целевые клетки в 5 мл PBS. Повторите шаги стирки дважды.
    3. Resuspend целевых клеток в фенол красно-свободной среде, содержащей 5% FBS. Используйте эту среду для остальной части процедуры, чтобы уменьшить фон.
    4. После оценки экспрессии ЦАР и жизнеспособности клеток по цитометрии потока (как описано в разделе 5.1), смешайте клетки CAR T с помеченными клетками-мишенями в эффекторе:целевые (E:T) соотношения 10:1, 3:1 и 1:1, в тройном. Передача на 96-пузыжную нижнюю пластину U.
    5. Параллельно, включают целевые клетки в одиночку, и целевые клетки с 1% сульфат атрия dodecyl (SDS), чтобы определить спонтанное (S) и максимальный (M) 51Cr релиз, соответственно.
    6. Клетки центрифуги при 300 х г в течение 5 мин и инкубируют 4 ч или 20 ч в инкубаторе 37 градусов по Цельсию с 5% CO2.
    7. После назначенного времени центрифугия сосуда культуры на 300 х г в течение 5 мин. Соберите 35 зл клеточного супернатанта и перенесите на читательную тарелку. Избегайте пузырьков. Дайте пластине высохнуть на ночь.
    8. Запечатайте тарелку стандартной пластиной и посчитайте жидким счетчиком сцинтилляции. Избыток хрома в супернатанте обеспечивает прокси-убийство клеток-мишеней. Рассчитайте процент конкретного лисиса следующим образом: 100 x (счет в минуту (cpm) экспериментальный релиз - cpm S релиз) / (cpm M релиз - cpm S релиз).

4. В Vivo функциональный анализ

  1. Получить от 6-10-недельных NOD-SCIDc-/- (NSG) мышей, которые не имеют адаптивной иммунной системы, и назначить их для лечения / контроль группы случайным образом.
  2. Впрыскивать животных внутривенно через хвостовую вену с 1 х 106 NALM6 клеток в 0,1 мл стерильных PBS.
  3. После 5–7 дней, подтвердите прививку опухоли с помощью биолюминесценционной визуализации (BLI). Вводят 150 мг/кг D-люциферина мышам, которые были обезболированы изофлураном (объем зависит от массы тела).
  4. Измерьте значения биолюминесценции с помощью системы визуализации. Количественная суммарная часть с помощью соответствующего программного обеспечения путем рисования прямоугольников одинаковой области вокруг мышей, достигая от головы до 50% от длины хвоста. Вычесть фон для каждого изображения в отдельности.
  5. После установления лейкемии, вводить 3 х 106 день 9 CART19 клеток, 0,5 х 106 день 3 CAR Т-клеток, или соответствующие нетрансиндуцированных (NTD) человека Т-клеток через хвост вены в объеме 100 л стерильных PBS / Ca2 "
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку биоактивность клеток, собранных через различные промежутки времени во время процесса культуры, отличается, выбранная концентрация 3-го дня клеток ниже, чем 9-й день.
  6. Чтобы определить прогрессирование заболевания, измерьте значения биолюминесценции два раза в неделю, как описано выше в шаге 4.3.
  7. Чтобы определить прививку CAR T, соберите 75 л крови с помощью ретро-орбитального кровотечения в трубке с покрытием ЭДТА. Перенесите 50 зл крови в абсолютные трубки подсчета.
  8. Пятно крови с антителами против CD45, CD4, CD8 и CAR в течение 30 мин на RT. Добавить 400 зл и 1x FACS лизинируя раствор труб и вихря тщательно. После окрашивания, анализировать выражение поверхностного маркера по течению цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие поверхностные маркеры могут быть использованы для оценки дифференциации и истощения статус Т-клеток в крови.
  9. Для измерения уровня цитокинов в крови, центрифуга крови на 1200 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия, чтобы отделить сыворотку от верхнего слоя крови.
  10. Соберите сыворотку и измерьте цитокины с помощью назначенной читательской тарелки в соответствии с инструкциями производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя описанные выше методы, мы стимулировали и расширяли Т-клетки в течение 3 или 9 дней(рисунок 1A,B). Мы также проанализировали их профиль дифференциации, о чем свидетельствует стратегия gating, изложенная на рисунке 1C,путем измерения изобилия различных гликопротеинов, выраженных на поверхности клетки. Мы показываем прогрессивный сдвиг в сторону дифференциации эффектора с течением времени во время культуры ex vivo(рисунок 1D). Мы оценили функцию эффектора и пролиферативную способность Т-клеток CAR в ответ на антиген. Мы показываем, что клетки, которые были расширены меньше (собранные ранее) были функционально выше по сравнению с клетками широко культивируется в течение более длительного периода. День 3 CART19 клетки имеют повышенную пролиферативную и цитолитическую способность при повторной стимуляции с их коньяк лиганд по отношению к дню 9(Рисунок 2A,B).

В человеческой модели xenograft moue ВСЕХ, мы сравнили потенцию CAR Т-клеток, собранных в 3 дня против 9 дней(рисунок 3A). Мы показали дозу зависимой анти лейкемической реакции для клеток CART19, генерируемых в течение 9 дней с полным ответом на высокую дозу 3 х 106 и потерю эффективности для низкой дозы 0,5 х 106. На следующий день 3 клетки CART19 показали постоянный контроль опухоли как в высоких, так и в низких дозах клеток CART19(рисунок 3B). Этот ответ был связан с абсолютным количеством CART19 в периферической крови мышей(рисунок 3C), который был проанализирован на основе протокола, описанного выше. Эти результаты, полученные в результате нашей комплексной оценки функции CAR T, свидетельствуют о том, что т-клетки CAR, собранные ранее (день 3), превосходят Т-клетки CAR, собранные на 9-й день.

Figure 1
Рисунок 1: Пролиферация представителей и профиль дифференциации Т-клеток ЦАР. (A) расширение клеток CART19 после стимуляции с помощью магнитных бусин оков anti-CD3/CD28. (B) Размер ячейки был оценен анализом Coulter повсеместно в культура. (C) Представитель gating стратегии для фенотипического анализа Т-клеток. (D) Временный анализ дифференциации Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: День 3 CART19 клетки отображают повышенную функцию эффектора и пролиферации по отношению к ячейкам 9 дня. (A) клетки CART19 были собраны на 3 и 9 день и совместно культивированы в указанном соотношении E:T с CD19-выражения K562 клетками (K562-19) или диким типом Дикого типа дикого типа дикого типа . Специфическая цитотоксичность была измерена 51Cr релиз после 4 ч. (B) CSFE помечены CART19 клетки были совместно культивированы с K562-19, K562-дикий тип, или средний только для 120 ч при 1:1 E:T соотношение. Клетки были собраны в указанные временные точки. Абсолютные подсчеты оценивались цитометрией потока. Относительные изменения складок живого числа Т-клеток, нормализованного до т-клеточного количества в день 0, показаны. Данные построены как среднее и стандартное отклонение (SD). P злт; 0,001 сравнения день 3 по сравнению с днем 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: День 3 CART19 клетки являются более мощными in vivo, чем день 9 клеток. (A) Схема модели ксенотрансплантата и лечение клеток CART19. День 3 и 9 CART19 клеток или контроль Т-клеток (UTD) были IV-вводили у мышей 5-7 дней после инъекции NALM6. (B) Количественная оценка бремени опухоли с помощью биолюминесценции изображения на 38-й день у мышей, обработанных CART19 клеток, собранных на 3-й день и день 9. Символы представляют по одной мыши. Горизонтальная черная линия: среднее для каждой группы. (C) Абсолютный периферической крови CD45и Т-клеток рассчитывается каждые две недели после инъекции клетки CART19 и в конце эксперимента соответствующим методом подсчета (например, TruCount) Unpaired Манн-Уитни тест, двуххвостый был использован. Злт; 0,01, ЗП злт; 0,001, ПЗ/л; 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем подходы к измерению функции и эффективности CAR Т-клеток, собранных с разными интервалами всей культуры ex vivo. Наши методы обеспечивают всестороннее понимание анализов, предназначенных для оценки пролиферативной способности, а также функции эффектора in vitro. Мы описываем, как измерить активность CAR T клеток после стимуляции через CAR и подробно ксенотрансплантата модели лейкемии с использованием CAR Т-клеток, собранных в день 3 против 9 их стадии логарифмического расширения.

Есть неотъемлемые проблемы в сравнении эффективности CAR Т-клеток, собранных в разных временных точках во время расширения ex vivo. Поскольку количество Т-клеток, генерируемых в течение 3-дневной продолжительности культуры, является низким, может быть недостаточно ежее число для выполнения всеобъемлющей оценки функции. Это усугубляется в контексте пациента Т-клеток, чьи пролиферативные способности часто уменьшается из-за внутренних и внутренних факторов20.

Сколько CAR Т-клеток должны быть infused учитывая, что день 3 клетки обладают повышенной метаболической и пролиферативной способности по сравнению с их день 9 коллег, которые выходят из их логарифмической пролиферативной фазы? Мы подсчитали, что число дней 3 CAR Т клетки будут достигать 3 х 106, если они были расширены в течение еще 6 дней в культуре. Мы использовали эту оценку, чтобы сообщить, сколько день 3 CAR Т-клетки должны быть настояны (0,5 х 106), чтобы сравнить аналогично на день 9. Соответственно, мы применяем подход «стресс-теста» для сравнения биоактивности, эффективности и стойкости проникнутых т-клеток CAR. Уменьшение числа настояний CAR T-клеток с 3 х 106 до 0,5 х 106 показывает различия, которые в противном случае были бы замаскированы насыщением чисел. Механически, контроль опухоли опирается на накопление достаточного количества клеток-эффекторов для лизиих их соответствующих клеток-мишеней. При большом количестве инфузии, как день 3, так и день 9 CAR Т-клеток обладают функциональной компетентностью.

Еще одной проблемой в работе с 3-й день CAR Т-клеток является их твердая привязанность к стимулирующей поверхности. Вытеснение их из магнитных бусин требует повторяющихся пипеток, чтобы механически разъединить их и повысить их восстановление от культуры. В отличие от дня 9 клеток имеют 1) уже отделены от бисера, и 2) разбавленных бисера до такой степени, что они могут быть собраны с относительной легкостью.

Другой важной переменной в процессе производства т-клеток CAR является выбор среды клеточной культуры. RPMI основе среды, которая была дополнена FBS обычно используется для экспериментальных целей. В отличие от этого, либо X-VIVO 15 или OpTmizer, дополненный человеческой сыворотки являются предпочтительными в клинических приложениях. Хотя они менее характеризуются, они могут содержать компоненты, которые облегчают расширение Т-клеток в более короткий период времени. Их влияние на дифференциацию неизвестно. Кроме того, добавление цитокинов влияет на рост, выживаемость и фенотип. В то время как IL-2 диски быстрого распространения и дифференциации в клетки-эффекторы, IL-7 и IL-15, которые происходят в лимфатических узлов и имеют известные роли в гомеостатической настойчивости, улучшает расширение Т-клеток и содействовать стволовых / центральной памяти фенотип22,23,24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана частично за счет финансирования, предоставляемого Novartis Pharmaceuticals через исследовательский альянс с Университетом Пенсильвании (Майкл К. Милоне), а также Санкт-Болдрик Фонд Стипендиат премии (Саба Ghassemi).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti CD3/CD28 dynabeads Thermo Fisher 40203D
APC Mouse Anti-Human CD8 BD Biosciences 555369 RRID:AB_398595
APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody BD Biosciences 560179 RRID:AB_1645481
BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate BD Biosciences 349202
BD Trucount Absolute Counting Tubes BD Biosciences 340334
Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody BioLegend 317444 RRID:AB_2561866
Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody BioLegend 317322 RRID:AB_2561911
CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Life Technolohgies C34554
CountBright Absolute Counting Beads, Invitrogen C36950
FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody BD Pharmingen 561271 RRID:AB_10561679
FITC Mouse Anti-Human CD4 BD Biosciences 555346 RRID:AB_395751
HEPES Gibco 15630-080
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Human IL-2 IS, premium grade Miltenyi 130-097-744
L-glutamine Gibco 28030-081
Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux Perkin Elmer
LIVE/DEAD Fixable Violet Molecular Probes L34964
Multisizer Coulter Counter Beckman Coulter
Na251CrO4 Perkin Elmer NEZ030S001MC
Pacific Blue anti-human CD14 Antibody BioLegend 325616 RRID:AB_830689
Pacific Blue anti-human CD19 Antibody BioLegend 302223
PE anti-human CD45RO Antibody BD Biosciences 555493 RRID:AB_395884
PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody BioLegend 305610 RRID:AB_493652
PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody Beckman Coulter A54823
Phenol red-free medium Gibco 10373-017
UltraPure SDS Solution, 10% Invitrogen 15553027
Via-Probe BD Biosciences 555815
X-VIVO 15 Gibco 04-418Q
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Perkin Elmer 122799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
  4. Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
  5. Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
  6. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
  7. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
  8. Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
  9. Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
  10. Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
  11. Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
  12. Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
  13. Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
  14. Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
  15. Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
  16. Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
  17. Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
  18. Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
  19. Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
  20. Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
  21. Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
  22. Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
  23. Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
  24. Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
  25. Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).

Tags

Исследования рака Выпуск 154 приемная иммунотерапия химерные рецепторы антигена производство Т-клеток CAR рак Т-клетки дифференциация Т-клеток CAR
Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ghassemi, S., Milone, M. C.… More

Ghassemi, S., Milone, M. C. Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy. J. Vis. Exp. (154), e59949, doi:10.3791/59949 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter