制造用于采用免疫疗法的奇美抗原受体（CAR）T细胞

Summary

我们描述了一种可靠地生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并测试其体外和体内的分化和功能。

Abstract

采用免疫疗法对治疗癌症和传染病有希望。我们描述了一种用嵌合抗原受体（CAR）转导原发人类T细胞并扩展其后代前体的简单方法。我们包括检测，以测量CAR表达以及分化，增殖能力和细胞解细胞活性。我们描述检测，以测量在CAR T细胞中产生效应细胞因子和炎症细胞因子分泌物。该方法为采用免疫治疗的临床前模型培养CAR T细胞提供了可靠、全面的方法。

Introduction

奇美抗原受体（CARs）提供了一种有希望的方法，可以针对不同的肿瘤抗原重定向T细胞。CARs 是结合抗原靶点的合成受体。虽然其精确组成是可变的，但 CA 通常包含 3 个不同的域。细胞外域直接结合到靶抗原，通常由通过细胞外铰链与CAR相连的单链抗体片段组成。第二个域，通常来自T细胞受体（TCR）复合物的CD3*链，促进CAR参与后的T细胞激活。包括第三个成本领域，以增强T细胞功能，移植，代谢和持久性。CAR T细胞治疗在各种造血恶性肿瘤中的成功，包括B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和多发性骨髓瘤，凸显了这种方法^{1、2、3、4、5、6}的治疗前景。最近美国食品和药物管理局 （FDA） 批准两种 CD19 特异性 CAR T 细胞疗法，针对儿科和年轻成人的 tisagenlecleucel 和用于扩散大 B 细胞淋巴瘤的 axicabagene 胆珠，强化了 CAR T 细胞治疗的转化价值。

基于CAR T的方法包括从外周血分离T细胞、活化、基因改造和外体扩张....

Protocol

所有动物研究都得到宾夕法尼亚大学动物护理和使用委员会的批准。

1. T细胞激活、转导和扩张

1. 与抗CD3/CD28磁珠（例如，dynabet）混合，在6孔细胞培养皿中，以每T细胞3个珠的比例激活新鲜或冷冻保存的初级人类T细胞。X-VIVO 15培养基中的培养T细胞辅以5%正常人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、20 mM HEPES和IL2（100单位/mL）。在扩张过程中将T细胞的浓度保持在10^6T细胞/mL。培养T细胞在37°C，20%O₂和95%湿度与5%CO_2。
2. 隔夜刺激后，向激活的T细胞中加入慢病毒上清液。计算达到3⁄5感染（MOI）多重性所需的上清液体积。
   注:CD19-BB* CAR慢病毒质粒由CD8铰链、4-1BB成本学域和CD3*信令域²¹组成。CD19-BB#慢病毒上清液生成，如前^所述21。
3. 第3天，收集一个有代表性的细胞等分用于冷冻保存。在冷冻保存之前，通过温和的移液和磁分离去除磁珠。制备含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的冷冻介质，含有0.5%的二甲基亚硫酸盐（DMSO），并储存在4°C中，直到使用。
   1. 在300 x g下将T细胞离心5分钟，丢弃上清液，加入5 mL的PBS....

Results

使用上述方法，我们刺激和扩展T细胞3或9天（图1A，B）。我们还通过测量细胞表面表达的独特糖蛋白的丰度，分析了它们的分化特征，如图1C中概述的浇注策略所示。在外体培养过程中，我们显示出一个逐渐向效应器分化的转变（图1D）。我们评估了CAR T细胞对抗原的反应作用和增殖能力。我们表明，与长期广泛培养的细胞相比，扩张较少（早收）的细胞在功能上更优越。第3天CART19细胞在重新刺激时增强了增殖和细胞解致能力，相对于第9天（图2A，B）。

在ALL的人类异种移植模式中，我们比较了3天收获的CAR T细胞与9天（图3A）的效力。.......

Discussion

在这里，我们描述了测量CAR T细胞的功能和功效的方法，这些细胞在整个外体培养过程中以不同的间隔收获。我们的方法提供全面的检测分析，旨在评估增殖能力以及体外效应器功能。我们描述了如何通过CAR刺激测量CAR T细胞活性，并使用在对数扩张阶段的第3天和第9天收获的CAR T细胞进行详细白血病异种移植模型。

在比较在外体扩张期间在不同时间点采集的CAR T细胞的功效存在固有的挑战。由于在 3 天培养持续时间内生成的 T 细胞数量较低，因此可能没有足够的数字来对功能进行全面评估。这在患者T细胞的上下文中会加剧，其增殖能力往往由于外在和内在因素²⁰而减弱。

与即将退出对数增殖阶段的第9天细胞相比，当日3细胞表现出更强的代谢和增殖能力，应注入多少CAR T细胞？我们估计，如果第3天CAR T细胞在培养中再扩展6天，它们的数量将达到3 x 10^6。我们使用此估计值来告知应注入多少天 3 CAR T 细胞（0.5 x 10^6），以便与第 9 天进行比.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗 CD3/CD28 dynabeads	Thermo Fisher	40203D
APC 小鼠抗人 CD8	BD Biosciences	555369	RRID：AB_398595
APC-H7 小鼠抗人 CD8 抗体	BD Biosciences	560179	RRID：AB_1645481
BD FACS 裂解液 10X 浓缩液	BD Biosciences	349202
BD Trucount 绝对计数管	BD Biosciences	340334
Brilliant Violet 510 抗人 CD4 抗体	BioLegend	317444	RRID：AB_2561866
Brilliant Violet 605 抗人 CD3 抗体	BioLegend	317322	RRID：AB_2561911
CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒	Life Technolohgies	C34554
CountBright 绝对计数珠，	Invitrogen	C36950
FITC 抗人 CD197 （CCR7） 抗体	BD Pharmingen	561271	RRID：AB_10561679
FITC 小鼠抗人 CD4	BD Biosciences	555346	RRID：AB_395751
HEPES	Gibco	15630-080
人 AB 血清	Valley Biomedical	HP1022
人 IL-2 IS，高级	Miltenyi	130-097-744
L-谷氨酰胺	Gibco	28030-081
液体闪烁计数器，MicroBeta trilux	Perkin Elmer
LIVE/DEAD 可固定紫色	分子探针	L34964
Multisizer Coulter 计数器	Beckman Coulter
Na251CrO4	Perkin Elmer	NEZ030S001MC
Pacific蓝色抗人CD14抗体	BioLegend	325616	RRID：AB_830689
Pacific Blue抗人CD19抗体	BioLegend	302223
PE抗人CD45RO抗体	BD Biosciences	555493	RRID：AB_395884
PE/Cy5抗人CD95（Fas）抗体	BioLegend	305610	RRID：AB_493652
PE/Cy7抗人CD27抗体	贝克曼Coulter	A54823
无酚红培养基	Gibco	10373-017
UltraPure SDS 溶液，10%	Invitrogen	15553027
Via-Probe	BD Biosciences	555815
X-VIVO 15	Gibco	04-418Q
XenoLight D-荧光素 - K+ 盐	Perkin Elmer	122799