Summary
我们描述了一种可靠地生成嵌合抗原受体（CAR）T细胞的方法，并测试其体外和体内的分化和功能。
Abstract
采用免疫疗法对治疗癌症和传染病有希望。我们描述了一种用嵌合抗原受体（CAR）转导原发人类T细胞并扩展其后代前体的简单方法。我们包括检测，以测量CAR表达以及分化，增殖能力和细胞解细胞活性。我们描述检测，以测量在CAR T细胞中产生效应细胞因子和炎症细胞因子分泌物。该方法为采用免疫治疗的临床前模型培养CAR T细胞提供了可靠、全面的方法。
Introduction
奇美抗原受体（CARs）提供了一种有希望的方法，可以针对不同的肿瘤抗原重定向T细胞。CARs 是结合抗原靶点的合成受体。虽然其精确组成是可变的，但 CA 通常包含 3 个不同的域。细胞外域直接结合到靶抗原，通常由通过细胞外铰链与CAR相连的单链抗体片段组成。第二个域，通常来自T细胞受体（TCR）复合物的CD3*链，促进CAR参与后的T细胞激活。包括第三个成本领域，以增强T细胞功能，移植，代谢和持久性。CAR T细胞治疗在各种造血恶性肿瘤中的成功，包括B细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和多发性骨髓瘤，凸显了这种方法1、2、3、4、5、6的治疗前景。最近美国食品和药物管理局 （FDA） 批准两种 CD19 特异性 CAR T 细胞疗法，针对儿科和年轻成人的 tisagenlecleucel 和用于扩散大 B 细胞淋巴瘤的 axicabagene 胆珠，强化了 CAR T 细胞治疗的转化价值。
基于CAR T的方法包括从外周血分离T细胞、活化、基因改造和外体扩张。分化是调节CAR T细胞疗效的重要参数。因此，在外体培养过程中限制T细胞分化可增强注入产物的移植、扩张和坚持能力，在采用转移2、7、8、9之后提供长期免疫监测。T细胞由几个不同的子集组成，包括：幼稚的T细胞（Tn）、中央记忆（Tcm）、效应器记忆（Tem）、效应器分化（T）和干细胞记忆（Tscm）。效应者分化T细胞具有强效细胞解细胞能力;然而，他们是短暂的和移植差10，11，12。相反，具有较少分化表型的T细胞，包括幼稚的T细胞和Tcm在采用细胞转移13、14、15、16、17、18之后表现出优异的增生和增殖能力。预制造产品中收集的T细胞的组成可能因患者而异，并与CAR T细胞的治疗潜力相关。在起始阿普西斯产品中，具有天真型免疫表型的T细胞比例与移植和临床反应高度相关19。
培养持续时间是影响CAR T细胞分化的重要参数，为采用转移做准备。我们最近开发了一种方法，使用缩写培养范式20生成高质量的CAR T细胞。利用我们的方法，我们表明，有限的培养导致CAR T细胞具有优越的效应功能和持久性后，在白血病的异种移植模型的收养转移。在这里，我们介绍可靠生成CART19细胞的方法（用于表达CD33和4-1BB信令域的抗CD19 scFv的自体T细胞），并包括分析的详细说明，在采用转移之前提供对CAR T生物活性和有效性的洞察。
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Protocol
所有动物研究都得到宾夕法尼亚大学动物护理和使用委员会的批准。
1. T细胞激活、转导和扩张
- 与抗CD3/CD28磁珠（例如，dynabet）混合，在6孔细胞培养皿中，以每T细胞3个珠的比例激活新鲜或冷冻保存的初级人类T细胞。X-VIVO 15培养基中的培养T细胞辅以5%正常人AB血清、2mM L-谷氨酰胺、20 mM HEPES和IL2（100单位/mL）。在扩张过程中将T细胞的浓度保持在106T细胞/mL。培养T细胞在37°C，20%O2和95%湿度与5%CO2。
- 隔夜刺激后，向激活的T细胞中加入慢病毒上清液。计算达到3⁄5感染（MOI）多重性所需的上清液体积。
注：CD19-BB* CAR慢病毒质粒由CD8铰链、4-1BB成本学域和CD3*信令域21组成。CD19-BB#慢病毒上清液生成，如前所述21。 - 第3天，收集一个有代表性的细胞等分用于冷冻保存。在冷冻保存之前，通过温和的移液和磁分离去除磁珠。制备含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的冷冻介质，含有0.5%的二甲基亚硫酸盐（DMSO），并储存在4°C中，直到使用。
- 在300 x g下将T细胞离心5分钟，丢弃上清液，加入5 mL的PBS。在300 x g下离心细胞5分钟，并丢弃PBS。
- 在1 mL的冷冷冻保存培养基中重新悬浮细胞颗粒。冷冻T细胞在冷冻冷冻容器中，储存在-80°C48小时。将冷冻细胞转移到液氮中。
- 在 PBS 的 5 mL 中清洗一次 T 细胞的其余部分，以消除残留载体。在300 x g下离心5分钟，将PBS解压，并在T细胞培养基中以0.5 x 106细胞/mL的浓度重新悬浮细胞颗粒。
- 将 T 细胞分成两个培养物，指定为第 5 天和第 9 天。使用计数珠（材料表）和单克隆抗体对人类CD4和CD8，以及可生存性染料（材料表）按流动细胞测定法对T细胞计数。
- 要测量T细胞浓度，准备含有500μLPBS、5μL计数珠、10μL7-氨基霉素D细胞活力溶液、4μLCD4-FITC和4μLCD8-APC的主混合物。将 40 μL 的 T 细胞添加到主混合物中，并根据活 T 细胞/珠数的数量通过流动细胞测定细胞浓度。重新喂食，使培养物的浓度保持在0.5 x 106细胞/mL每隔一天。
- 第 5 天，如步骤 1.3 和 1.5 中所述，计数和冷冻保存第 5 天区域性。
- 在第7天，在PBS中洗涤0.5 x 106 T细胞，并在100μL荧光活性细胞分拣（FACS）缓冲液中重新悬浮。通过流式细胞仪用荧光结合抗CAR19异型进行免疫染色，检测CAR表面蛋白表达。
- 第 9 天，如步骤 1.3 中所述，计算第 9 天的区域性和低温保存。
2. T细胞分化的质象评估
- 准备含有抗CD3_BV605（克隆OKT3）、抗CD14+太平洋蓝（克隆HCD14）、抗CD19+PB（克隆HIB19）、抗CD4+BV510（克隆OKT4）、抗CD8+H7APC（克隆SK1）、抗CCR7+FITC（克隆150503）的预先定度抗体的主混合物抗 CD45RO_PE（克隆 UCHL1）、抗 CD27_PE-Cy7（克隆 1A4CD27）、抗 CD95_PerCP-Cy5.5（克隆 DX2）和抗 CAR19-APC。
- 为抗CD45RO_PE、抗CCR7_FITC、抗CD27_PE-Cy7和抗CD95_PerCP-Cy5.5准备单独的荧光减1（FMO）对照，以区分正染色细胞与背景。
- 通过稀释活/死库存试剂（材料表）1：10，000在PBS中制备死细胞染色溶液。
- 解冻天3，第5天，第9天T细胞，以前被冷冻保存。从每组300 x g的1 x 106 T细胞中离心3分钟。丢弃上清液。用PBS清洗一次细胞。在 300 x g下离心 3 分钟，然后丢弃 PBS。
- 在室温 （RT） 下将 T 细胞与死染色溶液混合 15 分钟，防止光线照射。
- 加入1mL的FACS缓冲液，以淬火死细胞染色染料。在 300 x g下离心 3 分钟，丢弃上清液，并在包含步骤 2.1 和 2.2 中描述的抗体鸡尾酒的 100 μL FACS 缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。在4°C下孵育1小时。
- 加入1 mL的FACS缓冲液，在300 x g下离心3分钟，洗掉未结合的抗体。使用 FACS 缓冲区重复三次。
- 将细胞重新悬浮在1%的甲醛（PFA）中，并储存在4°C。
- 当CD45RO表达在固定后减少时，在免疫染色后通过流式细胞测定分析样品。要评估分化，门按以下顺序排列：单门（FSC-H vs FSC-A），活CD3+ T细胞（转储[活死紫罗兰，CD14-PB和CD19-PB vs CD3-BV605]，CD4-BV510 vs CD8-APC-H7）。在 CD4+和 CD8+子集中，CD45RO-PE 与 CCR7-FITC 的门，用于定义天真般的 T 细胞 （CD45RO-CCR7+）、中医 （CD45RO+CCR7+Tem）、Tem （CD45RO+CCR7-） 和 Tte （CD45RO-CCR7-）。为了识别Tscm，在CD27和T细胞在天真的T细胞群中的门。在此隔间中，Tscm 为 CD95+和 Tn 是 CD95-。
3. 体外功能分析
- CAR T细胞增殖和细胞因子分泌
- 通过流式细胞测定功能验证 CAR 表达以及细胞活力，如步骤 1.5 和 1.7 中所述。
- 用PBS洗净每组5 x106 T细胞（第3天、第5天和第9天），并在PBS中重新悬浮在1μM溶液中的卡博基氟辛二乙酸二乙酰乙酰酯（CFSE）中，在RT处3.5分钟。
- 立即加入含有10%胎儿牛血清（FBS）的10 mL的PBS来淬火反应。
- 将溶液在300 x g下离心3分钟，丢弃上清液，重复此洗涤步骤三次。使用库尔特计数器（材料表）在CFSE染色结束时计算细胞。
- 收获CFSE染色细胞（未刺激），重新悬浮在1%的PFA中，并储存在4°C，通过流动细胞学进行分析。
- 在步骤 1.1 所述的无细胞因子培养培养基和培养条件下，以 1：1 的比例孵育所需数量的 CFSE 染色 CAR T 细胞，并采用辐照 K562-CD19（目标）和 K562-野生型（控制）细胞。
- 24小时后，在300 x g下将培养容器离心5分钟，收集120 μL的细胞上清液。根据 Luminex 的分析，根据制造商的建议评估 IL2、IFN®、TNF®、GM-CSF 和其他炎症细胞因子（IL1+、IL4、IL5、IL6、IL8 和 IL10）的活化相关生产。
- 将步骤 3.1.7 中收集的上清液体积替换为与新鲜介质的等效体积 （120 μL）。
- 在第 3 天（即 96 小时后），使用基于珠的流式细胞测定，使用步骤 1.5 中之前的基于珠的流式细胞测定，以 0.5 x 106细胞/mL 的浓度计数和重新进料。
- 在第 5 天，计算活 CD3+细胞，并计算活 T 细胞相对于第 0 天活 T 细胞计数的折叠变化。
- 使用 FlowJo 软件对分离 CAR T 细胞中的 CFSE 稀释进行综合分析，以突出显示连续几轮细胞分裂。
注：在 FlowJo 手册中，扩散检测得到了很好的描述。
- 细胞毒性测定
注：使用51Cr释放测定来评估CART19细胞杀死表达CD19的目标细胞的能力。- 通过混合 5 x 105 K562-CD19、K562-野生型控制细胞或 NALM6 白血病细胞，在 37°C 下与 10% FBS 进行 10% FBS 的标记，在培养箱中使用 50 μL 的 Na251CrO4和 0.5 mL RPMI，并辅以 10% FBS 90 分钟。
- 在300 x g下离心细胞2.5分钟。将放射性上清液丢弃在适当的处置箱中，并在5 mL的PBS中清洗目标细胞。重复洗涤步骤两次。
- 在含有5%FBS的苯酚无红培养基中重新悬浮靶细胞。在该过程的其余部分使用此介质来减少背景。
- 通过流式细胞测定评估CAR表达和细胞活力（如第5.1节所述），将CAR T细胞与标记的目标细胞混合在效应器：目标（E：T）比率为10：1、3：1和1：1，三联成。转移到 96 孔 U 底板。
- 同时，单独包括目标细胞，以及目标细胞，分别含有1%的硫酸钠（SDS），以确定自发性（S）和最大（M）51Cr释放。
- 在300 x g下将离心细胞孵育5分钟，在37°C培养箱中孵育4小时或20小时，CO2为5%。
- 指定时间后，在300 x g下将培养容器离心5分钟，收集35μL的细胞上清液并转移到读卡器板。避免气泡。让盘子干一夜。
- 用标准板密封密封板，用液体闪烁计数器计数。上清液中的铬丰度提供了目标细胞杀灭的代理。计算特定解毒的百分比，如下所示：100 x（每分钟计数 [cpm] 实验释放 = cpm S 释放）/（cpm M 释放 = cpm S 释放）。
4. Vivo 功能分析
- 获取6~10周大的NOD-SCID +c+/+（NSG）小鼠，缺乏适应性免疫系统，并随机将其分配到治疗/对照组。
- 在0.1 mL无菌PBS中，用1 x 106 NALM6细胞通过尾静脉注射动物。
- 5~7天后，通过生物发光成像（BLI）确认肿瘤移植。向使用非曲兰麻醉小鼠注射150毫克/千克的D-荧光素（体积取决于身体质量）。
- 使用成像系统测量生物发光值。通过绘制小鼠周围相同区域的矩形，从头到尾长长度的 50%， 使用相应的软件量化总通量。分别减去每个图像的背景。
- 建立白血病后，注射3 x 106天9 CART19细胞，0.5 x 106天3 CAR T细胞，或相应的非转导（NTD）人T细胞通过尾静脉在100μL无菌PBS/Ca2+的体积。
注：由于培养过程中不同间隔收获的细胞的生物活性不同，第3天细胞的选择浓度低于第9天。 - 要确定疾病进展，请测量生物发光值，如步骤 4.3 中所述。
- 要确定CAR T细胞移植，通过EDTA涂层管中的逆轨出血收集75μL血液。将 50 μL 的血液转移到绝对计数管。
- 在RT.在RT处用抗体染色血液对CD45、CD4、CD8和CAR30分钟。 向管和涡旋彻底添加400μL的1xFACS解毒溶液。染色后，通过流式细胞测定法分析表面标记表达。
注：其他表面标记可用于评估血液中T细胞的分化和耗尽状态。 - 为了测量血液中的细胞因子水平，在4°C下以1，200 x g将血液离心30分钟，将血清从上层血液中分离出来。
- 根据制造商的说明，收集血清，用指定的读卡器板测量细胞因子。
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Representative Results
使用上述方法，我们刺激和扩展T细胞3或9天（图1A，B）。我们还通过测量细胞表面表达的独特糖蛋白的丰度，分析了它们的分化特征，如图1C中概述的浇注策略所示。在外体培养过程中，我们显示出一个逐渐向效应器分化的转变（图1D）。我们评估了CAR T细胞对抗原的反应作用和增殖能力。我们表明，与长期广泛培养的细胞相比，扩张较少（早收）的细胞在功能上更优越。第3天CART19细胞在重新刺激时增强了增殖和细胞解致能力，相对于第9天（图2A，B）。
在ALL的人类异种移植模式中，我们比较了3天收获的CAR T细胞与9天（图3A）的效力。我们显示CART19细胞的剂量依赖性抗白血病反应为9天，对高剂量3 x 106的完整反应，低剂量0.5 x 106的疗效丧失。当天3CART19细胞在高剂量和低剂量的CART19细胞中表现出持续性肿瘤控制（图3B）。这种反应与小鼠外周血中CART19的绝对计数（图3C）有关，后者根据上述协议进行分析。这些结果来自我们对CAR T函数的综合评估，证明早收的CAR T细胞（第3天）优于第9天收获的CAR T细胞。
图1：CAR T细胞的代表性增殖和分化概况。（A） CART19 细胞在使用抗CD3/CD28磁珠刺激后扩张。（B） 细胞大小由库尔特分析评估整个培养物。（C） T细胞的表示性门控策略。（D） T细胞分化的时态分析.请点击此处查看此图的较大版本。
图2：第3天CART19细胞显示增强的效应功能和增殖相对于第9天细胞。（A） CART19细胞在第3天和第9天被收获，并在指示的E：T比率与CD19表达K562细胞（K562-19）或野生型K562（K562-野生型）共同培养。在4小时（B）CSFE标记CART19细胞与K562-19、K562-野生型或培养基在1：1 E：T比下仅进行120小时，用51Cr释放进行特定细胞毒性测量。在指定的时间点采集细胞。绝对计数通过流动细胞测定评估。显示第 0 天归化为 T 细胞计数的实时 T 细胞计数的相对折叠变化。数据绘制为均值 = 标准差 （SD）。P < 0.001 比较第 3 天与第 9 天。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：第3天CART19细胞在体内比第9天细胞更有效。（A） 异种移植模型和CART19细胞治疗的原理图.第3天和第9天CART19细胞或对照T细胞（UTD）在NALM6注射后5-7天被静脉注射小鼠。（B） 在使用CART19细胞治疗于第3天和第9天采集的小鼠中，通过生物发光成像对肿瘤负担进行量化。符号表示每个鼠标。水平黑线：每个组的平均值。（C） CART19细胞注射后每两周测量一次绝对外周血CD45+T细胞计数，并在实验结束时采用适当的计数方法（如TruCount）未配对的Mann-Whitney测试，使用双尾。*P < 0.01， #P < 0.001， #P < 0.0001。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们描述了测量CAR T细胞的功能和功效的方法，这些细胞在整个外体培养过程中以不同的间隔收获。我们的方法提供全面的检测分析，旨在评估增殖能力以及体外效应器功能。我们描述了如何通过CAR刺激测量CAR T细胞活性，并使用在对数扩张阶段的第3天和第9天收获的CAR T细胞进行详细白血病异种移植模型。
在比较在外体扩张期间在不同时间点采集的CAR T细胞的功效存在固有的挑战。由于在 3 天培养持续时间内生成的 T 细胞数量较低，因此可能没有足够的数字来对功能进行全面评估。这在患者T细胞的上下文中会加剧，其增殖能力往往由于外在和内在因素20而减弱。
与即将退出对数增殖阶段的第9天细胞相比，当日3细胞表现出更强的代谢和增殖能力，应注入多少CAR T细胞？我们估计，如果第3天CAR T细胞在培养中再扩展6天，它们的数量将达到3 x 106。我们使用此估计值来告知应注入多少天 3 CAR T 细胞（0.5 x 106），以便与第 9 天进行比较。因此，我们应用"压力测试"方法来比较注入CAR T细胞的生物活性、有效性和持久性。将注入的 CAR T 细胞数从 3 x 106减少为 0.5 x 106可揭示出否则会因数字饱和而掩盖的差异。从机制上讲，肿瘤控制依赖于足够的效应细胞的积累来赖化其相应的靶细胞。在大量输注时，第 3 天和第 9 天 CAR T 细胞都表现出功能能力。
使用第 3 天 CAR T 细胞的另一个挑战是它们对刺激表面的坚定依恋。将它们从磁珠中移去需要重复移液，以机械地分离它们，并增强它们从培养的恢复能力。相反，第9天细胞有1）已经脱离珠子，和2）稀释珠子，以致他们可以相对容易地收获。
CAR T细胞制造过程中的另一个重要变量是细胞培养基的选择。以RPMI为基础的介质，补充了FBS，通常用于实验目的。相比之下，在临床应用中，X-VIVO 15 或 OpTmizer（辅以人血清）是首选。虽然这些特征较小，但它们可能包含有助于T细胞在较短时间内扩张的成分。它们对分化的影响是未知的。此外，细胞因子的加入会影响生长、存活和表型。IL-2驱动快速增殖和分化成效应细胞，IL-7和IL-15，它们起源于淋巴结，在静源持久性中具有已知作用，可改善T细胞的扩张，促进记忆干细胞/中央记忆表型22、23、24、25。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作部分得到了诺华制药公司通过与宾夕法尼亚大学（迈克尔·米隆）的研究联盟以及圣巴尔德里克基金会学者奖（萨巴·加塞米）提供的资金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
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