Summary
Biz güvenilir şemerik antijen reseptörü oluşturmak için bir yaklaşım tarif (CAR) T hücreleri ve in vitro ve in vivo onların farklılaşma ve fonksiyon test.
Abstract
Benimseyen immünoterapi kanser ve bulaşıcı hastalıkların tedavisi için umut vaat ediyor. Biz şimerik antijen reseptörü ile birincil insan T hücreleri transduce basit bir yaklaşım tarif (CAR) ve onların singen ynuzlu ex vivo genişletmek. Car ekspresyonunun yanı sıra farklılaşma, proliferatif kapasite ve sitoklitik aktiviteyi ölçmek için tahliller de dahilyiz. CAR T hücrelerinde efektör sitokin üretimini ve inflamatuar sitokin salgısını ölçmek için tahlilleri tanımlıyoruz. Yaklaşımımız, evlat edinen immünoterapinin preklinik modelleri için CAR T hücrelerine güvenilir ve kapsamlı bir yöntem sunmaktadır.
Introduction
Şimerik antijen reseptörleri (CAR) farklı tümör antijenlerine karşı T hücrelerini yönlendirmek için umut verici bir yaklaşım sağlar. CAR bir antijen hedef bağlamak sentetik reseptörleri vardır. Kesin kompozisyonları değişken olmakla birlikte, CAR'lar genellikle 3 farklı etki alanı içerir. Hücre dışı etki alanı bir hedef antijene bağlanır ve genellikle ekstrasellüler menteşe ile CAR'a bağlı tek bir zincirantikor parçasından oluşur. T hücre reseptörü (TCR) kompleksinin CD30 zincirinden elde edilen ikinci etki alanı, CAR etkileşiminden sonra T hücre aktivasyonunu teşvik eder. Üçüncü bir kostimulatör etki T hücre fonksiyonu geliştirmek için dahildir, engraftment, metabolizma, ve kalıcılık. B hücreli akut lenfoblastik lösemi (ALL), kronik lenfositik lösemi (KLL) ve multipl miyelom dahil olmak üzere çeşitli hematopoetik malignitelerde CAR T hücre tedavisinin başarısı bu yaklaşımın terapötik sözünü vurgular1,2,3,4,5,6. Son Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) iki CD19-spesifik CAR T hücre tedavileri için onaylar, pediatrik ve genç erişkin ALL ve diffüz büyük B hücreli lenfoma için aksicabtagene ciloleucel için tisagenlecleucel, CAR T hücre tedavisinin çevirili liyakatini güçlendirir.
CAR T tabanlı yaklaşımlar periferik kan, aktivasyon, genetik modifikasyon ve genişleme ex vivo T hücrelerinin izolasyon içerir. Farklılaşma CAR T hücre etkinliğini düzenleyen önemli bir parametredir. Buna göre, ex vivo kültür sırasında T hücre farklılaşmasını kısıtlayan engraft için aşılanmış ürünün yeteneğini artırır, genişletmek, ve devam, evlat edinme transferi aşağıdaki uzun vadeli immüngözetim sağlayan2,7,8,9. T hücreleri şunlardır: naif T hücreleri (Tn), merkezi bellek (Tcm), efektör bellek (Tem), efektör diferansiye (Tte) ve kök hücre belleği (Tscm). Efektör diferansiye T hücreleri güçlü sitolitik yeteneğe sahiptir; ancak, kısa ömürlü ve engraft kötü10,11,12. Buna karşılık, naif T hücreleri ve Tcm dahil olmak üzere daha az diferansiye fenotip ile T hücreleri üstün engraftment ve proliferatif yetenekleri adoptive hücre transferi aşağıdaki sergiler13,14,15,16,17,18. Önceden üretilen üründe toplanan T hücrelerinin bileşimi hastalar arasında değişebilir ve CAR T hücrelerinin terapötik potansiyeli ile ilişkilidir. Başlangıç aferez ürününde naif benzeri immünhefenotip olan T hücrelerinin oranı hem engreftment hem de klinik yanıt ile son derece ilişkilidir19.
Kültür süresi, evlat edinme transferi için hazırlanan CAR T hücrelerinde farklılaşmayı etkileyen önemli bir parametredir. Biz son zamanlarda kısaltılmış bir kültür paradigması20kullanarak üstün kaliteli CAR T hücreleri oluşturmak için bir yaklaşım geliştirdi. Yaklaşımımızı kullanarak, sınırlı kültürün löseminin ksenogreft modellerinde evlat edinici transferi sonrasında üstün efektör işlevi ve kalıcılığı olan CAR T hücrelerine yol açtığını gösterdik. Burada, CART19 hücrelerini (CD3ţ ve 4-1BB sinyal etki alanlarındaki anti-CD19 scFv'yi ifade etmek üzere tasarlanmış otolog T hücreleri) güvenilir bir şekilde üretmek için yaklaşımları savuruyoruz ve evlat edinmeden önce CAR T biyoaktivite ve etkinliği hakkında bilgi sağlayan tahlillerin ayrıntılı bir açıklamasını da ekleyebiliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları Pennsylvania Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. T Hücre Aktivasyonu, Transdüksiyon ve Genleşme
- 6-iyi hücre kültürü yemeklerinde T hücresi başına 3 boncuk oranında anti CD3/CD28 manyetik boncuklar (örneğin, dinamitler) ile karıştırarak taze veya kriyokorunmuş birincil insan T hücrelerini etkinleştirin. X-VIVO 15 orta kültür T hücreleri% 5 normal insan AB serum, 2 mM L-glutamin, 20 mM HEPES ve IL2 (100 adet / mL) ile desteklenmiştir. Genişleme sırasında T hücrelerini 106 T hücre/mL konsantrasyonda koruyun. Kültür T hücreleri 37 °C, %20 O2ve %95 nem %5 CO2.
- Gece stimülasyon sonra, aktif T hücrelerine lentiviral supernatant ekleyin. 3−5'lik bir enfeksiyon (MOI) çokluğu elde etmek için gerekli supernatant hacmini hesaplayın.
NOT: CD19-Bţ CAR lentivirus plazmid bir CD8 menteşe, 4-1BB costimulatory etki alanı ve CD3ţ sinyal etki alanı21oluşur. CD19-Bţ lentiviral supernatant daha önce açıklandığı gibi oluşturuldu21. - 3. günde, kriyopreservation için hücrelerin temsili bir aliquot toplamak. Kriyopreservation önce, nazik pipetleme ve manyetik ayırma ile manyetik boncukkaldırın. %0,5 dimetil sülfoksit (DMSO) ile fosfat tamponlu salin (PBS) içeren dondurucu ortam hazırlayın ve kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
- 5 dk. 300 x g'daki Centrifuge T hücreleri supernatant'ı atın ve 5 mL PBS ekleyin. 5 dk için 300 x g'lık santrifüj hücreleri ve PBS atın.
- 1 mL soğuk kriyopreservation ortamda hücre peletrerere resuspend. Soğutulmuş bir dondurucu kapta T hücrelerini dondurun ve -80 °C'de 48 saat boyunca saklayın.
- Artık vektörü ortadan kaldırmak için geri kalan T hücrelerini 5 mL PBS'de bir kez yıkayın. 5 dk. PBS için 300 x g santrifüj ve 0.5 x 106 hücre/mL konsantrasyonda T hücre kültürü orta hücre pelet resuspend.
- T hücrelerini 5. Sayma boncukları(Malzeme Tablosu)ve monoklonal antikorlar kullanarak akış sitometrisi ile T hücre sayısını ve insan CD4 ve CD8'e karşı monoklonal antikorların yanı sıra canlılık boyası(Malzeme Tablosu)kullanılır.
- T hücre konsantrasyonu ölçmek için, 500 μL PBS, 5 μL sayma boncuk, 10 μL 7-Amino-aktinomisin D hücre canlılığı çözeltisi, 4 μL CD4-FITC ve 4 μL CD8-APC içeren bir ana karışım hazırlayın. Ana karışıma 40 μL'lik T hücresi ekleyin ve canlı T hücre/boncuk sayısısayısına göre akış sitometrisi ile hücre konsantrasyonu ölçün. Kültürleri her gün 0,5 x 106 hücre/mL konsantrasyonda korumak için yeniden besleyin.
- 5. günde, 1.3 ve 1.5 adımlarında açıklandığı gibi 5.
- 7. günde PBS'de 0.5 x 106 T hücreleri yıkayın ve 100 μL floresan aktif hücre sıralama (FACS) tamponunda yeniden askıya alın. Akış sitometrisi tarafından floresan konjuge anti-CAR19 idiyotipi ile immünoboyama tarafından CAR yüzey protein ekspresyonunu sapta.
- 9. günde, 9.
2. T Hücre Farklılaşmasının Henotipik Değerlendirilmesi
- Anti-CD3-BV605 (klon OKT3), anti-CD14-Pacific Blue (PB) (clone HCD14), anti-CD19–PB (hib19), anti-CD4-BV510 (klon OKT4), anti-CD8-H7APC (klon SK1), anti-CCR7-FITC (klon 150503), anti-CD45RO-PE (klon UCHL1), anti-CD27-PE-Cy7 (klon 1A4CD27), anti-CD95-PerCP-Cy5.5 (Klon DX2) ve anti-CAR19-APC.
- Anti-CD45RO-PE, anti-CCR7-FITC, anti-CD27-PE-Cy7 ve anti-CD95-PerCP-Cy5.5 için arka plandan pozitif lekeli hücreleri ayırt etmek için tek tek floresan eksi (FMO) kontrolleri hazırlayın.
- PBS'de canlı/ölü stok reaktifini(Malzeme Tablosu)1:10.000'i seyrelterek ölü hücre boyama çözeltisi hazırlayın.
- Çözülme gün 3, gün 5, ve gün 9 T hücreleri daha önce cryopreserved edildi. 3 dk. 3 dk. Için 300 x g her gruptan santrifüj 1 x 106 T hücreleri atın. Hücreleri pbs ile bir kez yıkayın. 3 dk için 300 x g santrifüj ve PBS atın.
- T hücrelerini, ışıktan korunan oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca ölü boyama çözeltisi ile karıştırın.
- Ölü hücre boyama boyasını gidermek için 1 mL FACS tampon ekleyin. 3 dk için 300 x g santrifüj, supernatant atın ve adım 2.1 ve 2.2 açıklanan antikor kokteyliçeren FACS tampon 100 μL hücre pelet yeniden askıya. 4 °C'de 1 saat kuluçka.
- 3 dk için 3 00 x g'de 1 mL FACS tampon ve santrifüj ekleyin ve bağlanmamış antikorları temizleyin. FACS arabelleği ile üç kez tekrarlayın.
- Hücreleri %1 paraformaldehitte (PFA) yeniden askıya alır ve 4 °C'de saklayın.
- Fiksasyon sonrası CD45RO ekspresyonu azaldıkça, immünoboyama sonrası akım sitometrisi ile örnekleri analiz edin. Farklılaşmayı değerlendirmek için, aşağıdaki sırayla kapı: singlets (FSC-H vs FSC-A), canlı CD3+ T hücreleri (Dökümü [canlı ölü mor, CD14-PB ve CD19-PB vs CD3-BV605], CD4-BV510 vs CD8-APC-H7). CD4+ ve CD8+ alt kümelerde, NAif T hücrelerini tanımlamak için CD45RO-PE vs CCR7-FITC'de kapı (CD45RO-CCR7+ ),Tcm (CD45RO+CCR7+), Tem (CD45RO+CCR7-) ve Tte (CD45RO - CCR7 - ) ve Tte (CD45RO-CCR7- ). Tscm tanımlamak için, naif gibi T hücreleri popülasyonCD27+ T hücreleri üzerinde kapı. Bu bölmede, Tscm CD95+ ve Tn CD95 vardır-.
3. In Vitro Fonksiyonel Analiz
- CAR T hücre çoğalması ve sitokin salgısı
- Akış sitometrisi tarafından, 1.5 ve 1.7 adımlarında açıklandığı gibi CAR ifadesini ve hücre canlılığını doğrulayın.
- Her gruptan 5 x 106 T hücreleri PBS ile yıkayın (gün 3, gün 5 ve gün 9) ve rt 3,5 dakika pbs karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFSE) bir 1 μM çözeltisi resuspend.
- Reaksiyonu gidermek için hemen %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren 10 mL PBS ekleyin.
- Çözeltiyi 3 dk.3 dk.'da santrifüj edin. Cfse boyama sonunda hücreleri bir Coulter sayacı(Malzeme Tablosu)kullanarak sayın.
- CfSE lekeli hücreleri hasat edin (uyarılmamış), %1 PFA'da yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile analiz için 4 °C'de saklayın.
- Isınıtır K562-CD19 (hedef) ve K562-yabani tip (kontrol) hücreleri ile istenilen sayıda CFSE lekeli CAR T hücrelerini, adım 1.1'de açıklandığı gibi sitokinsiz kültür ortamı ve kültür koşullarında 120 saat için 1:1 oranında kuluçkaya yatırın.
- 24 saat sonra kültür damarını 5 dk. 120 μL hücresel supernatant için 300 x g'da santrifüj edin. IL2, IFNγ, TNFα, GM-CSF ve diğer inflamatuar sitokinlerin (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8 ve IL10) aktivasyona bağlı üretimini üreticinin tavsiyelerine uygun olarak Luminex analizleri ile değerlendirin.
- Adım 3.1.7'de toplanan süpernatant hacmini eşdeğer hacim (120°L) taze ortamla değiştirin.
- Üçüncü günde (yani 96 saat sonra) daha önce 1.5 adımda olduğu gibi boncuk bazlı akış sitometrisini kullanarak 0,5 x 106 hücre/mL konsantrasyonla sayım ve yeniden besleme.
- 5. gün, canlı CD3+ hücreleri sayın ve 0.
- Ardışık hücre bölünmesi turlarını vurgulamak için FlowJo yazılımını kullanarak CAR T hücrelerinin bölünmesinde CFSE seyreltme lerinin kapsamlı bir analizini yapın.
NOT: Proliferasyon tahlilleri FlowJo kılavuzunda iyi tanımlanmıştır.
- Sitotoksisite töz
NOT: CART19 hücrelerinin CD19'u ifade eden hedef hücreleri öldürme yeteneği 51Cr serbest bırakma-teşifi kullanılarak değerlendirilir.- Hedef hücreleri 5 x 105 K562-CD19, K562-yabani tip kontrol hücreleri veya NALM6 lösemi hücrelerini 50 μL Na251CrO4 ve 0,5 mL RPMI ile karıştırarak etiketlendirin ve 37 °C'de 90 dk için %10 FBS ile desteklendi.
- 300 x g'de 2,5 dk. Radyoaktif süpernatantı uygun bertaraf kutularına atın ve hedef hücreleri 5 mL PBS'de yıkayın. Yıkama adımlarını iki kez tekrarlayın.
- % 5 FBS içeren fenol kırmızı-free ortamda hedef hücreleri resuspend. Arka planı azaltmak için yordamın geri kalanı için bu ortamı kullanın.
- CAR ekspresyonunu ve hücre canlılığını akış sitometrisi ile değerlendirdikten sonra (bölüm 5.1'de açıklandığı gibi), CAR T hücrelerini 10:1, 3:1 ve 1:1 oranlarında etiketlenmiş hedef hücrelerle karıştırın. 96-iyi U alt plakasına aktarın.
- Buna paralel olarak, spontan (S) ve maksimum (M) 51Cr salınımı belirlemek için tek başına hedef hücreleri ve%1 sodyum dodeyl sülfat (SDS) içeren hedef hücreleri içerir.
- Santrifüj hücreleri 300 x g 5 dk ve inkübat için 4 saat veya 20 saat için bir 37 °C inkübatör% 5 CO2ile .
- Belirlenen süreden sonra kültür kabını 5 dk. 35 μL hücresel supernatant toplayın ve bir okuyucu plakasına aktarın. Kabarcıklar kaçının. Plakabir gecede kurusun.
- Plakayı standart bir plaka contası ile kapatın ve sıvı bir sintillation sayacı ile sayın. Supernatant krom bolluğu hedef hücre öldürme bir proxy sağlar. Aşağıdaki gibi belirli lysis yüzdesini hesaplayın: 100 x (dakika başına sayar [cpm] deneysel sürüm – cpm S serbest)/ (cpm M serbest – cpm S serbest).
4. In Vivo Fonksiyonel Analiz
- Adaptif bağışıklık sistemi olmayan 6−10 haftalık NOD-SCID γc–/– (NSG) fareleri edinin ve bunları rastgele tedavi/kontrol grubuna atayın.
- 0,1 mL steril PBS 1 x 106 NALM6 hücreleri ile kuyruk damarı ile intravenöz hayvanlar enjekte.
- 5−7 gün sonra, biyolüminesans görüntüleme (BLI) ile tümör engraftment doğrulayın. İzofluran ile anestezi yapılan farelere 150 mg/kg D-luciferin enjekte edin (hacim vücut kütlesine bağlıdır).
- Bir görüntüleme sistemi kullanarak biyolüminesans değerlerini ölçün. Farelerin etrafında aynı alanın dikdörtgenlerini çizerek, kuyruk uzunluğunun %50'sine ulaşarak ilgili yazılımı kullanarak toplam akı ölçün. Her görüntü için arka planı ayrı ayrı çıkarın.
- Lösemi kurduktan sonra, enjekte 3 x 106 gün 9 CART19 hücreleri, 0.5 x 106 gün 3 CAR T hücreleri, ya da karşılık gelen non-transduced (NTD) insan T hücreleri steril PBS / Ca2 +bir hacim kuyruk ven yoluyla .
NOT: Kültür sürecinde çeşitli aralıklarla hasat edilen hücrelerin biyoaktivitesi farklı olduğundan, 3. - Hastalığın ilerlemesini belirlemek için, yukarıda belirtilen 4.3 adımda biyolüminesans değerlerini haftada iki kez ölçün.
- CAR T hücre engraftment belirlemek için, bir EDTA kaplı tüp retro-orbital kanama yoluyla 75 μL kan toplamak. 50 μL'lik kanı mutlak sayma tüplerine aktarın.
- RT'de 30 dk boyunca CD45, CD4, CD8 ve CAR'a karşı antikorlarla kan lekeleyin. Boyama sonra, akış sitometri ile yüzey marker ifade analiz.
NOT: Diğer yüzey belirteçleri kandaki T hücrelerinin farklılaşma ve bitkinlik durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. - Kandaki sitokin düzeylerini ölçmek için, 30 dakika 4 °C'de 1.200 x g'de santrifüj kanı serumu kan üst tabakasından ayırmak için ayırın.
- Serum toplayın ve üreticinin talimatlarına göre belirlenmiş bir okuyucu plakası ile sitokinleri ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan yöntemleri kullanarak, T hücrelerini 3 veya 9 gün boyunca uyardık ve genişlettik(Şekil 1A,B). Ayrıca, şekil 1C'deözetlenen gating stratejisinde belirtildiği gibi, hücre yüzeyinde ifade edilen farklı glikoproteinlerin bolluğunu ölçerek farklılaşma profillerini de analiz ettik. Ex vivo kültür sırasında zaman içinde efektör farklılaşmaya doğru ilerleyici bir kayma gösteririz (Şekil 1D). Car T hücresinin antijene yanıt olarak etkileyici fonksiyonunu ve proliferatif kapasitesini değerlendirdik. Daha az genişletilen (daha önce hasat edilen) hücrelerin, daha uzun bir süre boyunca yaygın olarak kültürlenen hücrelere kıyasla işlevsel olarak üstün olduğunu gösteriyoruz. Gün 3 CART19 hücreleri, 9. güne göre bilantom ligandları ile yeniden uyarma üzerine proliferatif ve sitolitik yeteneği artırmış(Şekil 2A,B).
ALL'ın bir insan ksenogreft moue modelinde, 3 günde hasat edilen CAR T hücrelerinin gücünü 9 güne karşı karşılaştırdık(Şekil 3A). Biz CART19 hücreleri için bir doz bağımlı anti lösemik yanıt gösterdi 9 gün boyunca yüksek doz için tam bir yanıt ile oluşturulan 3 x 106 ve düşük doz için etkinlik kaybı 0.5 x 106. Gün 3 CART19 hücreleri CART19 hücrelerinin hem yüksek hem de düşük dozlarda kalıcı tümör kontrolü gösterdi(Şekil 3B). Bu yanıt, yukarıda açıklanan protokole göre analiz edilen farelerin periferik kanLarında(Şekil 3C)CART19'un mutlak sayısı ile ilişkilendirilmiştir. CAR T fonksiyonunun kapsamlı değerlendirmesinden elde edilen bu sonuçlar, daha önce hasat edilen CAR T hücrelerinin (gün 3) 9.
Şekil 1: CAR T hücrelerinin temsili çoğalma ve farklılaşma profili. (A) ANTI-CD3/CD28 manyetik boncuklar ile stimülasyon sonrasında CART19 hücre genişlemesi. (B) Hücre büyüklüğü kültür boyunca Coulter analizi ile değerlendirildi. (C) T hücrelerinin henotipik analizi için temsili gating stratejisi. (D) T hücre farklılaşmasının zamansal analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Gün 3 CART19 hücreleri, 9. (A) CART19 hücreleri 3 ve 9. Spesifik sitotoksisite 4 saat sonra 51Cr salınımı ile ölçüldü (B) CSFE etiketli CART19 hücreleri K562-19, K562-wild-type veya orta sadece 120 saat için 1:1 E:T oranında eş kültürlü edildi. Hücreler belirtilen zaman noktalarında hasat edildi. Mutlak sayımlar akış sitometrisi ile değerlendirildi. 0. gün deki T hücre sayısına normalleştirilmiş canlı T hücre sayısının göreli kat değişiklikleri gösterilir. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak çizilir. P < 0.001 karşılaştırma gün 3 ile gün 9. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Gün 3 CART19 hücreleri vivo gün 9 hücrelerinden daha güçlüdür. (A) Ksenogreft modelinin şeması ve CART19 hücre tedavisi. Gün 3 ve 9 CART19 hücreleri veya kontrol T hücreleri (UTD) NALM6 enjeksiyonundan 5−7 gün sonra farelere IV enjekte edildi. (B) Cart19 hücreleri ile tedavi edilen farelerde 38. Semboller her biri bir fareyi temsil ediyor. Yatay siyah çizgi: her grubun ortalaması. (C) Cart19 hücre enjeksiyonundan sonra her iki haftada bir mutlak periferik kan CD45+ T hücre sayımları ölçüldü ve deney sonunda uygun bir sayma yöntemi (TruCount gibi) Eşleşmemiş Mann-Whitney testi ile iki kuyruklu kullanıldı. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada ex vivo kültürü boyunca çeşitli aralıklarla hasat edilen CAR T hücrelerinin işlevini ve etkinliğini ölçmek için yaklaşımları açıklıyoruz. Yöntemlerimiz, proliferatif kapasitenin yanı sıra efektör fonksiyonunu in vitro olarak değerlendirmek üzere tasarlanmış tahliller hakkında kapsamlı bir içgörü sağlar. Car ile stimülasyonu takiben CAR T hücre aktivitesinin nasıl ölçültüldüğü ve logaritmik genleşme fazının 3.
Ex vivo genleşme sırasında farklı zaman noktalarında hasat EDILEN CAR T hücrelerinin etkinliğini karşılaştırmada doğal zorluklar vardır. 3 günlük kültür süresi boyunca oluşturulan T hücrelerinin miktarı düşük olduğundan, işlevin kapsamlı bir değerlendirmesini gerçekleştirmek için yeterli sayı olmayabilir. Bu durum, proliferatif yeteneği genellikle ekstrensek ve içsel faktörler nedeniyle azalan hasta T hücreleri bağlamında şiddetlenir20.
O gün 3 hücre, logaritmik proliferatif evrelerinden çıkan 9 günümüz emsallerine göre gelişmiş metabolik ve proliferatif yetenek sergiler: O gün verildiğinde kaç CAR T hücresi aşılanmalıdır? Kültürde 6 gün daha genişletilirse 3 CAR T hücresinin hangi sayıya ulaşacağını tahmin ettik. Bu tahminde, 9. Buna göre, biyoaktivite karşılaştırmak için "stres testi" yaklaşımı uygulamak, etkinliği, ve infüzyon CAR T hücrelerinin kalıcılığı. Aşılanmış CAR T hücrelerinin sayısının 3 x 106'dan 0,5 x 106'ya düşürülmesi, sayıların doygunluğu yla maskelenecek farklılıkları ortaya çıkarır. Mekanistik olarak, tümör kontrolü, karşılık gelen hedef hücreleri lyse için yeterli efektör hücrelerin birikimine dayanır. Yüksek sayıda infüzyonda, hem gün 3 hem de 9 CAR T hücreleri fonksiyonel yetkinlik sergiler.
Gün 3 CAR T hücreleri ile çalışan bir diğer sorun uyarıcı yüzeye sıkı bağlılık. Onları manyetik boncuklardan çıkarmak, mekanik olarak ayrıştırmak ve kültürden iyileşmelerini geliştirmek için tekrarlayan pipetleme gerektirir. Buna karşılık, gün 9 hücreleri var 1) zaten boncuk müstakil, ve 2) onlar göreceli kolaylığı ile hasat edilebilir böyle bir ölçüde boncuk seyreltilmiş.
CAR T hücre üretim sürecinde ki bir diğer önemli değişken de hücre kültürü ortamının seçimidir. FBS ile takviye edilmiştir RPMI tabanlı orta yaygın deneysel amaçlar için kullanılır. Buna karşılık, ya X-VIVO 15 veya OpTmizer, insan serumu ile desteklenen klinik uygulamalarda tercih edilir. Bunlar daha az karakterize olmakla birlikte, daha kısa bir süre içinde T hücresi genişlemesini kolaylaştıran bileşenler içerebilir. Farklılaşma üzerindeki etkileri bilinmemektedir. Ayrıca, sitokinlerin eklenmesi büyüme etkiler, sağkalım, ve fenotip. IL-2 etkili hücrelere hızlı çoğalma ve farklılaşma sürücüler iken, IL-7 ve IL-15, lenf düğümü kökenli ve homeostatik kalıcılık bilinen rolleri var, T hücrelerinin genişlemesini artırır ve bir bellek kök teşvik / merkezi bellek fenotip22,23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Novartis Pharmaceuticals tarafından Pennsylvania Üniversitesi (Michael C. Milone) ve St. Baldrick Vakfı Bursu (Saba Ghassemi) ile bir araştırma ittifakı aracılığıyla sağlanan finansman la desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
