Summary
We beschrijven een aanpak om betrouwbaar te genereren chimeer antigeen receptor (auto) T cellen en testen hun differentiatie en functie in vitro en in vivo.
Abstract
Adoptie immunotherapie is veelbelovend voor de behandeling van kanker en infectieziekten. We beschrijven een eenvoudige benadering om primaire menselijke T-cellen te leiden met een chimerische antigeen receptor (auto) en hun nageslacht ex vivo uit te breiden. We nemen assays op om auto-expressie te meten, evenals differentiatie, proliferatieve capaciteit en cytolytische activiteit. We beschrijven assays meten Effector cytokine productie en inflammatoire cytokine secretie in auto T-cellen. Onze aanpak biedt een betrouwbare en uitgebreide methode voor cultuur auto T-cellen voor preklinische modellen van adoptie immunotherapie.
Introduction
Chimeric antigeen receptoren (Auto's) bieden een veelbelovende aanpak om te leiden T-cellen tegen verschillende tumor antigenen. Auto's zijn synthetische receptoren die een antigeen doelwit binden. Hoewel hun precieze samenstelling variabel is, bevatten Auto's over het algemeen 3 verschillende domeinen. Het extracellulaire domein leidt binding aan een doel antigeen en bestaat meestal uit een single Chain antilichaam fragment gekoppeld aan de auto via een extracellulaire scharnier. Het tweede domein, vaak afgeleid van de CD3ζ keten van het T Cell receptor (TCR) complex, bevordert de activering van de T-cel na de betrokkenheid van de auto. Een derde costimulatory domein is opgenomen ter verbetering van de functie van de T-cel, engraftment, metabolisme, en persistentie. Het succes van auto T-cel therapie in verschillende hematopoietische maligniteiten, waaronder B-cel acute lymfoblastische leukemie (alle), chronische lymfatische leukemie (CLL) en multipel myeloom wijst op de therapeutische belofte van deze aanpak1,2,3,4,5,6. De recente Food and Drug Administration (FDA) goedkeuringen voor twee CD19-specifieke CAR T Cell therapieën, tisagenlecleucel voor pediatrische en jong volwassen ALL en axicabtagene ciloleucel voor diffuus groot B-cel lymfoom, versterkt de translationele verdienste van auto T-cel therapie.
AUTO T-gebaseerde benaderingen omvatten het isoleren van T-cellen van perifeer bloed, activering, genetische modificatie en expansie ex vivo. Differentiatie is een belangrijke parameter die de werkzaamheid van de CAR T cel regelt. Daarom versterkt het beperken van de celdifferentiatie tijdens de ex vivo-cultuur het vermogen van het geïnfundeerd product om te graveren, uit te breiden en te blijven bestaan, waardoor lange termijn immunosurveillance wordt gegeven na adoptie overdracht2,7,8,9. T-cellen bestaan uit verschillende afzonderlijke subsets, waaronder: naïeve T-cellen (TN), centraal geheugen (TCM), Effector-geheugen (TEM), Effector-gedifferentieerd (TTE) en stamcel geheugen (TSCM). Effector gedifferentieerde T cellen hebben krachtige cytolytische vermogen; ze zijn echter van korte duur en graveren slecht10,11,12. T-cellen met een minder gedifferentieerd fenotype, met inbegrip van naïeve T-cellen en TCM vertonen daarentegen superieure engraftment en proliferatieve vaardigheden na adoptie van celoverdracht13,14,15,16,17,18. De samenstelling van de verzamelde T-cellen in het Voorgefabriceerde product kan variëren tussen patiënten en correleert met het therapeutische potentieel van auto T-cellen. Het aandeel van T-cellen met een naïef immunoffenol type in het startende aferese product is sterk gecorreleerd met zowel engraftment als klinische respons19.
Cultuur duur is een belangrijke parameter die de differentiatie in auto T-cellen voorbereid voor adoptie overdracht beïnvloedt. We hebben onlangs een aanpak ontwikkeld voor het genereren van superieure kwaliteit auto T-cellen met behulp van een verkorte cultuur paradigma20. Met behulp van onze aanpak, we toonden dat beperkte cultuur geeft aanleiding tot auto T cellen met superieure Effector functie en persistentie na adoptie overdracht in xenotransplantaatmodellen is modellen van leukemie. Hier presenteren we de benaderingen om betrouwbaar te genereren CART19 cellen (autologe T cellen ontworpen om uit te drukken anti-CD19 scFv gekoppeld aan CD3ζ en de 4-1BB signalering van domeinen) en bevatten een gedetailleerde beschrijving van de assays die inzicht geven in auto T bioactiviteit en werkzaamheid voorafgaand aan adoptie overdracht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van de Universiteit van Pennsylvania.
1. T celactivering, transductie en uitbreiding
- Activeer verse of cryopreserved primaire menselijke T cellen door te mengen met anti CD3/CD28 magnetische kralen (bijv. dynabeads) in een verhouding van 3 kralen per T cel in 6-well celcultuurgerechten. Kweek T cellen in X-VIVO 15 medium aangevuld met 5% normaal humaan AB serum, 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES en IL2 (100 eenheden/mL). Houd T-cellen bij een concentratie van 106 T cellen/ml tijdens de uitbreiding. Kweek T-cellen bij 37 °C, 20% O2en 95% vochtigheid met 5% Co2.
- Voeg na nachtelijke stimulatie lentivirale supernatant toe aan geactiveerde T-cellen. Bereken het volume van supernatant dat nodig is om een multipliciteit van infectie (MOI) van 3 − 5 te bereiken.
Opmerking: De CD19-Bbzeta CAR lentivirus plasmide bestaat uit een CD8 scharnier, 4-1BB costimulatory domein, en CD3ζ signalering domein21. CD19-Bbzeta lentivirale supernatant werd gegenereerd zoals eerder beschreven21. - Op dag 3 Verzamel je een representatief aliquot van cellen voor cryopreservation. Voordat cryopreservation, verwijder de magnetische kralen door zachte pipetteren en magnetische scheiding. Bereid Vries middel met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met 0,5% dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaar in 4 °C tot het gebruik.
- Centrifugeer T-cellen bij 300 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en voeg 5 ml PBS toe. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten en gooi de PBS weg.
- Respendeer de celpellet in 1 ml koud cryopreservatie medium. Vries T cellen in een gekoelde Vries container en bewaar bij-80 °C voor 48 h. Breng de bevroren cellen over naar vloeibaar stikstof.
- Was de rest van de T-cellen eenmaal in 5 mL PBS om de rest vector te elimineren. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 min. DECANTE de PBS en respendeer de celpellet in T-celkweekmedium met een concentratie van 0,5 x 106 cellen/ml.
- Splits de T-cellen in twee culturen, aangewezen voor dag 5 en dag 9. Count T cellen doorstroming flowcytometrieonderzoeken met behulp van tellen kralen (tabel van de materialen) en monoklonale antilichamen tegen menselijke CD4 en CD8, evenals een levensvatbaarheid kleurstof (tabel van materialen).
- Voor het meten van de celconcentratie, bereidt u een hoofdmix voor met 500 μL PBS, 5 μL telparels, 10 μL 7-amino-actinomycine D-levensvatbaarheid van de cel, 4 μL CD4-FITC en 4 μL CD8-APC. Voeg 40 μL T-cellen toe aan de Master Mix en meet de celconcentratie door Flowcytometrie op basis van het aantal levende T-cellen/kraal tellingen. Refeed om de culturen te behouden in een concentratie van 0,5 x 106 cellen/ml om de andere dag.
- Op dag 5, Count en invriezen dag 5 culturen zoals beschreven in de stappen 1,3 en 1,5.
- Was op dag 7 0,5 x 106 T cellen in PBS en respendeer in 100 μL fluorescentie geactiveerde cel sortering (FACS) buffer. Detecteer de eiwit expressie van het auto-oppervlak door immunokleuring met een fluorescendig geconjugeerde anti-CAR19 idiotype door flow cytometrie.
- Op dag 9, Count Day 9 culturen en invriezen zoals beschreven in stap 1,3.
2. fenotypische beoordeling van T-celdifferentiatie
- Bereid een Master mix met vooraf getitreerde antilichamen voor anti-CD3 – BV605 (kloon OKT3), anti-CD14-Pacific Blue (PB) (kloon HCD14), anti-CD19-PB (kloon HIB19), anti-CD4-BV510 (kloon OKT4), anti-CD8-H7APC (kloon SK1), anti-CCR7-FITC (kloon 150503), anti-CD45RO – PE (kloon UCHL1), anti-CD27 – PE-Cy7 (kloon 1A4CD27), anti-CD95 – PerCP-CY 5.5 (kloon DX2), en anti-CAR19-APC.
- Bereid individuele fluorescentie minus één (FMO) Controls voor anti-CD45RO – PE, anti-CCR7 – FITC, anti-CD27 – PE-Cy7 en anti-CD95 – PerCP-CY 5.5 om positief bevlekt cellen uit de achtergrond te onderscheiden.
- Bereid dode-celkleurings oplossing voor doorverdunten vanlevend/dode voorraad reagens (tabel met materialen) 1:10000 in PBS.
- Ontdooien dag 3, dag 5 en dag 9 T cellen die eerder cryopreserved waren. Centrifugeer 1 x 106 T cellen uit elke groep bij 300 x g gedurende 3 min. Gooi het supernatant weg. Was de cellen eenmaal met PBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten en gooi de PBS weg.
- Meng T-cellen met dode kleurings oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT), beschermd tegen het licht.
- Voeg 1 mL FACS buffer toe om de dode celkleurings kleurstof te bluchen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten, gooi het supernatant weg en breng de celpellet in 100 ΜL FACS buffer met de antilichaam cocktail zoals beschreven in stap 2,1 en 2,2. Incuberen gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Voeg 1 mL FACS buffer toe en centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 minuten om ongebonden antilichamen af te spoelen. Herhaal driemaal met FACS-buffer.
- Respendeer cellen in 1% Paraformaldehyde (PFA) en bewaar ze bij 4 °C.
- Als CD45RO expressie afneemt na fixatie, analyseer de monsters door flow cytometrie na immunokleuring. Om differentiatie te beoordelen, Gate in de volgende volgorde: onderhemden (FSC-H vs FSC-A), Live CD3+ T cellen (dump [Live-Dead Violet, CD14-PB en CD19-PB VS CD3-BV605], CD4-BV510 VS CD8-APC-H7). In CD4+ -en CD8+ -SUBSETS, Gate on CD45RO-PE versus CCR7-FITC om naïeve T-cellen (CD45RO-CCR7+), TCM (CD45RO+CCR7+), tem (CD45RO+CCR7-) en TTE (CD45RO-CCR7-) te definiëren. Om TSCM te identificeren, Gate op CD27+ T cellen in naïeve-achtige t-cellen populatie. In dit compartiment zijn TSCM CD95+ en TN zijn CD95-.
3. functionele analyse in vitro
- AUTO T celproliferatie en cytokine secretie
- Controleer de auto-expressie en de levensvatbaarheid van de cel zoals beschreven in de stappen 1,5 en 1,7, door flow Cytometry.
- Was 5 x 106 T cellen uit elke groep (dag 3, dag 5 en dag 9) met PBS en regenereren in een 1 μM oplossing van carboxyfluorescein DIACETAAT succinimidyl Ester (CFSE) in pbs voor 3,5 min bij RT.
- Voeg onmiddellijk 10 mL PBS met 10% foetaal runderserum (FBS) toe om de reactie te doven.
- Centrifugeer de oplossing bij 300 x g gedurende 3 min. Gooi de supernatant weg en herhaal deze Wash stap drie keer. Tel de cellen aan het einde van de CFSE-kleuring met een Coulter-teller (tabel met materialen).
- Oogst CFSE-gekleurd cellen (ongeprikkeld), regenereren in 1% PFA en bewaren bij 4 °C voor analyse door flow cytometrie.
- Inincuberen van het gewenste aantal CFSE-bevlekt auto T cellen met bestraalde K562-CD19 (target) evenals K562-wild type (controle) cellen in een verhouding van 1:1 voor 120 h in cytokine vrije cultuurmedium en cultuur voorwaarden zoals beschreven in stap 1,1.
- Centrifugeer na 24 uur het kweek vat bij 300 x g gedurende 5 minuten en verzamel 120 μL cellulaire supernatant. Evalueer de activerings afhankelijke productie van IL2, IFNγ, TNFα, GM-CSF en andere inflammatoire cytokines (IL1β, IL4, IL5, IL6, IL8 en IL10) door luminex-analyses in overeenstemming met de aanbevelingen van de fabrikant.
- Vervang het volume van supernatant dat in stap 3.1.7 is verzameld met een equivalent volume (120 μL) vers medium.
- Op dag 3 (d.w.z. na 96 h), tellen en opnieuw voeden met een concentratie van 0,5 x 106 cellen/ml met behulp van op kraal gebaseerde Flowcytometrie zoals eerder in stap 1,5.
- Tel op dag 5 de Live CD3+ -cellen en bereken de vouw verandering van levende t-cellen ten opzichte van het aantal levende t Cells op dag 0.
- Voer een uitgebreide analyse uit van CFSE-verdunning in het verdelen van auto T-cellen met behulp van FlowJo-software om opeenvolgende rondes van celdeling te markeren.
Opmerking: proliferatie testen worden goed beschreven in de FlowJo handleiding.
- Cytotoxiciteits test
Opmerking: Het vermogen van CART19 cellen om doelcellen te doden die CD19 uitdrukken, wordt geëvalueerd met behulp van een 51CR-vrijgave test.- Label de doelcellen door het mengen van 5 x 105 K562-CD19, K562-wild type controle cellen, of NALM6 leukemie cellen met 50 μL Na251Cro4 en 0,5 ml rpmi aangevuld met 10% fbs voor 90 min in de incubator bij 37 °c.
- Centrifuge cellen bij 300 x g gedurende 2,5 min. Gooi de radioactieve supernatant weg in de juiste afvoerbakken en was de doelcellen in 5 ml PBS. Herhaal de wasstappen twee keer.
- Respendeer de doelcellen in fenolrood-vrij medium met 5% FBS. Gebruik dit medium voor de rest van de procedure om de achtergrond te verminderen.
- Na evaluatie van de auto-expressie en de levensvatbaarheid van de cel doorstroming cytometrie (zoals beschreven in paragraaf 5,1), meng auto T cellen met gelabelde doelcellen op Effector: target (E:T) verhoudingen van 10:1, 3:1 en 1:1, in drievuur. Transfer naar een 96-well U bodemplaat.
- Parallel, omvatten alleen doelcellen, en doelcellen met 1% natriumdodecylsulfaat (SDS), voor het bepalen van spontane (S) en maximale (M) 51CR release, respectievelijk.
- Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 minuten en incueren gedurende 4 uur of 20 uur in een incubator van 37 °c met 5% Co2.
- Na de aangewezen tijd, Centrifugeer het kweek vat bij 300 x g gedurende 5 min. Verzamel 35 μL cellulaire supernatant en breng het over naar een lezers bord. Vermijd bubbels. Laat de plaat 's nachts drogen.
- Sluit de plaat af met een standaard plaat afdichting en Tel met een vloeibare Scintillatie teller. Chroom overvloed in de supernatant biedt een proxy van doelcel doden. Bereken het percentage van specifieke lysis als volgt: 100 x (tellingen per minuut [CPM] experimentele release – CPM S-release)/(CPM M-release-CPM S-release).
4. in vivo functionele analyse
- Verkrijg 6 − 10 weken oude NOD-scid γc–/– (NSG) muizen, die een adaptief immuunsysteem missen en ze willekeurig toewijzen aan behandeling/controlegroep.
- Injecteer de dieren intraveneus via een staart ader met 1 x 106 NALM6 cellen in 0,1 ml steriele PBS.
- Na 5 − 7 dagen, bevestig de tumor engraftment door bioluminescentie Imaging (BLI). Injecteer 150 mg/kg D-Luciferin aan muizen die zijn verdoeseerd met Isofluraan (volume is afhankelijk van de lichaamsmassa).
- Meet bioluminescentie waarden met behulp van een beeldvormings systeem. Kwantificeer de totale flux met behulp van de corresponderende software door rechthoeken van identiek gebied rond muizen te tekenen, van hoofd tot 50% van de staartlengte. De achtergrond voor elke afbeelding afzonderlijk aftrekken.
- Na het vaststellen van leukemie, injecteren 3 x 106 dag 9 CART19 cellen, 0,5 x 106 dag 3 auto t cellen, of overeenkomstige niet-transduced (NTD) menselijke t cellen via staart ader in een volume van 100 ΜL van steriele PBS/CA2 +.
Opmerking: Aangezien de bioactiviteit van cellen die tijdens het cultuur proces met verschillende intervallen zijn geoogst, verschilt, is de gekozen concentratie van dag 3-cellen lager dan dag 9. - Om de ziekteprogressie te bepalen, meet u de Bioluminescentie waarden tweemaal per week, zoals hierboven beschreven in stap 4,3.
- Om te bepalen auto T cel engraftment, verzamelen van 75 μL bloed via retro-orbitale bloeden in een EDTA-gecoate buis. Breng 50 μL bloed over naar absolute telbuisjes.
- Beits bloed met antilichamen tegen CD45, CD4, CD8 en auto gedurende 30 min bij RT. Voeg 400 μL 1x FACS lyseren oplossing toe aan de buizen en Vortex grondig. Na kleuring, analyseren oppervlak marker expressie door flow Cytometry.
Opmerking: Andere oppervlakte markeringen kunnen worden gebruikt om de differentiatie en uitputting status van de T-cellen in het bloed te beoordelen. - Voor het meten van cytokines niveaus in het bloed, centrifugeer bloed bij 1.200 x g gedurende 30 minuten bij 4 °c om serum van de bovenste laag van het bloed te scheiden.
- Verzamel serum en meet de cytokines met een aangewezen Lees plaat volgens de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de hierboven beschreven methoden hebben we de T-cellen voor 3 of 9 dagen gestimuleerd en uitgebreid (Figuur 1A, B). We analyseerden ook hun differentiatie profiel, zoals aangegeven door de gating-strategie in Figuur 1C, door het meten van de overvloed aan verschillende glycoproteïnen uitgedrukt op het celoppervlak. We tonen een progressieve verschuiving naar Effector differentiatie in de tijd tijdens de ex vivo cultuur (Figuur 1D). We beoordeelden de Effector functie en de proliferatieve capaciteit van CAR T cell in reactie op antigeen. We laten zien dat cellen die minder werden uitgebreid (eerder geoogst) functioneel superieur waren in vergelijking met de cellen die uitvoerig werden gekweekt over een langere duur. Dag 3 CART19 cellen hebben verhoogde proliferatieve en cytolytische vermogen bij Re-stimulatie met hun verwant ligand ten opzichte van dag 9 (Figuur 2A, B).
In een humaan xenotransplantaatmodellen is moue-model van alle, vergeleken we de potentie van auto T cellen geoogst op 3 dagen versus 9 dagen (Figuur 3a). We toonden een dosisafhankelijke anti leukemische respons voor de CART19 cellen gegenereerd voor 9 dagen met een volledige respons voor hoge dosis van 3 x 106 en een verlies van werkzaamheid voor de lage dosis van 0,5 x 106. De dag 3 CART19 cellen toonde aanhoudende tumor controle in zowel hoge als lage doses van CART19 cellen (Figuur 3B). Deze respons werd geassocieerd met de absolute telling van CART19 in het perifere bloed van muizen (Figuur 3C) die werd geanalyseerd op basis van het hierboven beschreven protocol. Deze resultaten verkregen uit onze uitgebreide beoordeling van CAR T-functie leveren bewijs dat de eerder geoogste auto cellen (dag 3) beter presteren dan de op dag 9 geoogste auto T-cellen.
Figuur 1: representatieve proliferatie en differentiatie Profiel van auto T-cellen. A) CART19 celexpansie na stimulatie met anti-CD3/CD28 magnetische kralen. (B) de celgrootte werd beoordeeld door Coulter analyse in de hele cultuur. C) representatieve gating-strategie voor fenotypische analyse van T-cellen. D) tijdelijke analyse van T-celdifferentiatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: dag 3 CART19 cellen weergeven verbeterde Effector functie en proliferatie ten opzichte van dag 9 cellen. A) CART19 cellen werden geoogst op dag 3 en 9 en gecocultureerd op de aangegeven E:T-verhouding met CD19-uitdrukken K562 cellen (K562-19) of wild-type K562 (K562-wild type). Specifieke cytotoxiciteit werd gemeten met 51CR afgifte na 4 h. (B) csfe-gelabelde CART19 cellen werden co-gekweekt met K562-19, K562-wild-type, of alleen medium voor 120 h bij een 1:1 e:t ratio. Cellen werden geoogst op aangegeven tijdspunten. Absolute tellingen werden beoordeeld door Flowcytometrie. Relatieve vouw wijzigingen van het aantal levende T-cellen genormaliseerd naar het aantal T-cellen op dag 0 worden weergegeven. Gegevens worden uitgezet als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). P < 0,001 vergelijking dag 3 versus dag 9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: dag 3 CART19 cellen zijn krachtiger in vivo dan dag 9 cellen. A) Schematische voorstelling van het xenotransplantaatmodellen is-model en CART19 celbehandeling. Dag 3 en 9 CART19 cellen of controle-T-cellen (UTD) werden IV-geïnjecteerd bij muizen 5 − 7 dagen na NALM6 injectie. B) kwantificering van de tumorlast door bioluminescentie beeldvorming op dag 38 bij muizen behandeld met CART19 cellen die op dag 3 en dag 9 zijn geoogst. Symbolen vertegenwoordigen één muis. Horizontale zwarte lijn: gemiddelde van elke groep. C) het aantal absolute perifere bloed CD45+ T-cellen werd om de twee weken gemeten na CART19 celinjectie en aan het einde van het experiment met een geschikte Telmethode (zoals Trucount) ongepaarde Mann-Whitney-test, werd tweezijdige gebruikt. * * P < 0,01, * * * P < 0,001, * * * * P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier beschrijven we de benaderingen voor het meten van de functie en werkzaamheid van auto-T-cellen die met verschillende intervallen worden geoogst in de ex vivo-cultuur. Onze methoden bieden uitgebreid inzicht in assays die zijn ontworpen om proliferatieve capaciteit en Effector functie in vitro te beoordelen. We beschrijven hoe te meten auto t cel activiteit na stimulatie door de auto en detail xenotransplantaatmodellen is modellen van leukemie met behulp van auto t cellen geoogst op dag 3 vs dag 9 van hun logaritmische expansiefase.
Er zijn inherente uitdagingen bij het vergelijken van de werkzaamheid van auto-T-cellen die op verschillende tijdstippen worden geoogst tijdens de ex vivo-expansie. Aangezien de hoeveelheid T-cellen die gedurende een periode van 3 dagen is gegenereerd, laag is, kunnen er onvoldoende getallen zijn om een uitgebreide beoordeling van de functie uit te voeren. Dit wordt verergerd in de context van patiënt T cellen waarvan proliferatieve vermogen vaak wordt verminderd als gevolg van Extrinsieke en intrinsieke factoren20.
Hoeveel auto T cellen moeten worden geïnfundeerd, gezien het feit dat dag 3 cellen verbeterde metabole en proliferatieve vermogen vertonen in vergelijking met hun dag 9 tegenhangers die hun logaritmische proliferatieve fase verlaten? We schatten welk aantal dag 3 auto T cellen zou bereiken 3 x 106 als ze werden uitgebreid voor nog eens 6 dagen in cultuur. We gebruikten deze raming om te informeren hoeveel dag 3 auto T-cellen moeten worden geïnfundeerd (0,5 x 106) om gelijkwaardig te vergelijken met dag 9. Dienovereenkomstig passen we de "stresstest"-benadering toe om de bioactiviteit, werkzaamheid en persistentie van geïnfundeerde auto T-cellen te vergelijken. Het verminderen van het aantal geïnfundeerde auto T-cellen van 3 x 106 tot 0,5 x 106 onthult verschillen die anders zouden worden gemaskeerd door verzadiging van getallen. Mechanistisch, tumor controle berust op de accumulatie van voldoende Effector cellen te lyse hun overeenkomstige doelcellen. Bij hoge aantallen infusie vertonen zowel dag 3 als dag 9 auto T-cellen functionele competentie.
Een andere uitdaging in het werken met dag 3 auto T cellen is hun stevige gehechtheid aan het stimulerende oppervlak. Het verplaatsen van de magnetische kralen vereist repetitieve pipetteren om ze mechanisch te ontkoppelen en het herstel van de cultuur te verbeteren. In tegenstelling, dag 9 cellen hebben 1) al losgekoppeld van de kralen, en 2) verdund de kralen in een zodanige mate dat ze kunnen worden geoogst met relatief gemak.
Een andere belangrijke variabele in het productieproces van de auto T-cel is de keuze van het celkweekmedium. Het op RPMI gebaseerde medium dat met FBS is aangevuld, wordt vaak gebruikt voor experimentele doeleinden. In de klinische toepassingen daarentegen heeft de voorkeur voor X-VIVO 15 of OpTmizer, aangevuld met humaan serum. Hoewel deze minder worden gekenmerkt, kunnen ze componenten bevatten die T-celuitbreiding in een kortere periode mogelijk maken. Hun impact op differentiatie is onbekend. Bovendien beïnvloedt de toevoeging van cytokines de groei, overleving en fenotype. Terwijl Il-2 drijft snelle proliferatie en differentiatie in effector cellen, Il-7 en Il-15, die afkomstig zijn van de lymfeklier en hebben bekende rollen in homeostatische persistentie, verbetert de uitbreiding van T-cellen en bevordering van een geheugen stam/centrale geheugen fenotype22,23,24,25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels gesteund door middel van financiering door Novartis Pharmaceuticals via een onderzoeksinfrastructuur met de Universiteit van Pennsylvania (Michael C. Milone) en de St. Baldricks Foundation Scholar Award (Saba Ghassemi).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti CD3/CD28 dynabeads | Thermo Fisher | 40203D | |
| APC Mouse Anti-Human CD8 | BD Biosciences | 555369 | RRID:AB_398595 |
| APC-H7 Mouse anti-Human CD8 Antibody | BD Biosciences | 560179 | RRID:AB_1645481 |
| BD FACS Lysing Solution 10X Concentrate | BD Biosciences | 349202 | |
| BD Trucount Absolute Counting Tubes | BD Biosciences | 340334 | |
| Brilliant Violet 510 anti-human CD4 Antibody | BioLegend | 317444 | RRID:AB_2561866 |
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | BioLegend | 317322 | RRID:AB_2561911 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Life Technolohgies | C34554 | |
| CountBright Absolute Counting Beads, | Invitrogen | C36950 | |
| FITC anti-Human CD197 (CCR7) Antibody | BD Pharmingen | 561271 | RRID:AB_10561679 |
| FITC Mouse Anti-Human CD4 | BD Biosciences | 555346 | RRID:AB_395751 |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Human IL-2 IS, premium grade | Miltenyi | 130-097-744 | |
| L-glutamine | Gibco | 28030-081 | |
| Liquid scintillation counter, MicroBeta trilux | Perkin Elmer | ||
| LIVE/DEAD Fixable Violet | Molecular Probes | L34964 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter | ||
| Na251CrO4 | Perkin Elmer | NEZ030S001MC | |
| Pacific Blue anti-human CD14 Antibody | BioLegend | 325616 | RRID:AB_830689 |
| Pacific Blue anti-human CD19 Antibody | BioLegend | 302223 | |
| PE anti-human CD45RO Antibody | BD Biosciences | 555493 | RRID:AB_395884 |
| PE/Cy5 anti-human CD95 (Fas) Antibody | BioLegend | 305610 | RRID:AB_493652 |
| PE/Cy7 anti-human CD27 Antibody | Beckman Coulter | A54823 | |
| Phenol red-free medium | Gibco | 10373-017 | |
| UltraPure SDS Solution, 10% | Invitrogen | 15553027 | |
| Via-Probe | BD Biosciences | 555815 | |
| X-VIVO 15 | Gibco | 04-418Q | |
| XenoLight D-Luciferin - K+ Salt | Perkin Elmer | 122799 |
References
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- Kalos, M., et al. T Cells with Chimeric Antigen Receptors Have Potent Antitumor Effects and Can Establish Memory in Patients with Advanced Leukemia. Science Translational Medicine. 3 (95), 95ra73 (2011).
- Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 10 (5), 267-276 (2013).
- Maude, S. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. The New England Journal of Medicine. 371 (16), 1507-1517 (2014).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. The New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), 303ra139 (2015).
- Maude, S. L., Teachey, D. T., Porter, D. L., Grupp, S. A. CD19-targeted chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Blood. 125 (26), 4017-4023 (2015).
- Kochenderfer, J. N., et al. Lymphoma Remissions Caused by Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor T Cells Are Associated With High Serum Interleukin-15 Levels. Journal of Clinical Oncology. 35 (16), 1803-1813 (2017).
- Bollard, C. M., Rooney, C. M., Heslop, H. E. T-cell therapy in the treatment of post-transplant lymphoproliferative disease. Nature Reviews. Clinical Oncology. 9 (9), 510-519 (2012).
- Brestrich, G., et al. Adoptive T-cell therapy of a lung transplanted patient with severe CMV disease and resistance to antiviral therapy. American Journal of Transplantation. 9 (7), 1679-1684 (2009).
- Savoldo, B., et al. Treatment of solid organ transplant recipients with autologous Epstein Barr virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTLs). Blood. 108 (9), 2942-2949 (2006).
- Berger, C., et al. Adoptive transfer of effector CD8+ T cells derived from central memory cells establishes persistent T cell memory in primates. The Journal of Clinical Investigation. 118 (1), 294-305 (2008).
- Gattinoni, L., et al. A human memory T cell subset with stem cell-like properties. Nature Methods. 17 (10), 1290-1297 (2011).
- Hinrichs, C. S., et al. Adoptively transferred effector cells derived from naive rather than central memory CD8+ T cells mediate superior antitumor immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17469-17474 (2009).
- Klebanoff, C. A., et al. Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).
- Wang, X., et al. Engraftment of human central memory-derived effector CD8+ T cells in immunodeficient mice. Blood. 117 (6), 1888-1898 (2011).
- Wang, X., et al. Comparison of naive and central memory derived CD8+ effector cell engraftment fitness and function following adoptive transfer. Oncoimmunology. 5 (1), e1072671 (2016).
- Fraietta, J., et al. Determinants of response and resistance to CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy of chronic lymphocytic leukemia. Nature Medicine. 24 (5), 563-571 (2018).
- Ghassemi, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Milone, M. C., et al. Chimeric receptors containing CD137 signal transduction domains mediate enhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17 (8), 1453-1464 (2009).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Cui, G., et al. IL-7-Induced Glycerol Transport and TAG Synthesis Promotes Memory CD8 T Cell Longevity. Cell. 161 (4), 750-761 (2015).
- Xu, Y., et al. Closely related T-memory stem cells correlate with in vivo expansion of CAR.CD19-T cells and are preserved by IL-7 and IL-15. Blood. 123 (24), 3750-3759 (2014).
- Singh, N., Perazzelli, J., Grupp, S. A., Barrett, D. M. Early memory phenotypes drive T cell proliferation in patients with pediatric malignancies. Science Translational Medicine. 8 (320), 320ra323 (2016).
