Summary
Здесь мы представляем хирургический протокол у кроликов с целью оценки костного замещения материалов с точки зрения способности к регенерации костей. С помощью цилиндров PEEK, закрепленных на черепах кроликов, остеопроводлении, остеоиндукции, остеогенеза и васкулогенеза, индуцированных материалами, можно оценивать либо на живых, либо на эвтаназии животных.
Abstract
Основной принцип кроличьей модели кролика заключается в том, чтобы выращивать новую костную ткань вертикально поверх корковой части черепа. Эта модель позволяет оценить материалы замены костей для пероральной и черепно-мозговой регенерации костей с точки зрения роста костей и поддержки неоваскуляризации. После того, как животные обезболиваются и проветриваются (эндотрахеальная интубация), четыре цилиндра из полиэтилеера эфира кетона (PEEK) привинчиваются на череп, по обе стороны от средних и корональных швов. Пять интрамедуллярных отверстий пробурены в костной области, делимитированных каждым цилиндром, что позволяет приток клеток костного мозга. Образцы материала помещаются в цилиндры, которые затем закрываются. Наконец, хирургическое место зашивается, и животные пробуждаются. Рост костей можно оценить на живых животных с помощью микротомографии. После эвтаназии животных рост костей и неоваскуляризация могут быть оценены с помощью микротомографии, иммуногистологии и иммунофлуоресценции. Поскольку оценка материала требует максимальной стандартизации и калибровки, клизменная модель выглядит идеальной. Доступ очень прост, калибровка и стандартизация облегчаются использованием определенных цилиндров и четыре образца могут быть оценены одновременно. Кроме того, можно использовать живую томографию, и в конечном итоге можно ожидать значительного сокращения числа животных, которые должны быть усыплены.
Introduction
Кальвариальная модель увеличения костей была разработана в 90-х годах с целью оптимизации концепции управляемой регенерации костей (GBR) в устной и черепно-мозговой хирургической области. Основной принцип этой модели заключается в том, чтобы выращивать новую костную ткань вертикально поверх корковой части черепа. Для этого реактор (например, титан-купол, цилиндр или клетка) фиксируется на черепе для защиты регенерации костей, проводимой трансплантатом (например, гидрогелем, заменителем костей и т.д.). С помощью этой модели, титанаили керамических клеток 1, 2,3,4,5,6, GBR мембраны7,8,9 ,10, остеогенные факторы11,12,13,14,15,16,17,новая кость заменители12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 или механизм неоваскуляризации в процессе регенерации костей30 были оценены.
С переводческой точки зрения, кальвариальная модель представляет собой одностенный дефект, который можно сравнить с дефектом класса IV в челюсти31. Цель состоит в том, чтобы вырастить новую кость над корковой областью, без какой-либо боковой поддержки эндогенных костных стенок. Таким образом, модель является чрезвычайно жесткой и оценивает реальный потенциал вертикальной остеопроводимости над корковой частью кости. Если описанная в настоящем случае модель в первую очередь посвящена оценке остеопроводимости у заменителей костей, то также может быть оценен авеогенез и/или остеоиндукция, а также васкулогенез1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.
По существу по этическим, практическим и экономическим причинам, кальвариальная модель была разработана в кролика, в котором метаболизм костей и структура весьма актуальны по сравнению с человеком32. Из 30 приведенных выше ссылок 80% использоваликроличья кальвариальная модель 1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, таким образом демонстрируя актуальность этой модели животных. В 2008 году группа Busenlechner перенесла клизменную модель свиньи, чтобы позволить сравнение восьми заменителей костей одновременно20 (по сравнению с двумя заменителями кости с кроликом). С другой стороны, наша группа передала кролика calvarial модели овец. Короче говоря, титановые купола были размещены на черепах овец, чтобы охарактеризовать остеопроводцию нового 3D-печатного костного заменителя. Эти исследования позволили нам разработать и освоить кальвариальную модель и ее анализ16,21.
В последних трех исследованиях приводится16,20,21, вместе с рядом других исследований12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, подтвердил большой потенциал кальвариантной модели в качестве скрининга и характеристики Модели. Однако, несмотря на то, что полученные результаты были вполне удовлетворительными, они также указали на некоторые ограничения: (1) Использование титановых куполов, которые предотвращали рентгеновское диффузию и, в свою очередь, живило использование микроКТ. Они не могут быть удалены до гистологической обработки, заставляя исследователей вставлять образцы в поли (метил-метакрилат) мели (PMMA). Таким образом, полученный анализ в значительной степени ограничивался топографией. (2) Высокие финансовые затраты, особенно из-за стоимости животных, и расходы, связанные с логистикой, обслуживанием и хирургии животных. (3) Трудности для получения этических разрешений для крупных животных.
Недавнее исследование Polo, et al.26 в значительной степени улучшило модель на кролика. Титановые купола были заменены замкнутыми цилиндрами, которые могли быть заполнены постоянным объемом материала. Четыре из этих цилиндров были помещены на черепа кролика. По завершении строительства цилиндры можно было бы удалить таким образом, чтобы биопсия была без металла, что вводило гораздо большую гибкость в отношении обработки образцов. Модель кроличьего калибра стала привлекательной для одновременного тестирования с меньшими затратами, легкой обработкой животных и упрощением обработки образцов. Воспользовавшись этими последними разработками, мы еще больше усовершенствовали модель, заменив титан на PEEK для производства цилиндров, тем самым позволяя рентгеновскую диффузию и использование микротомографии на живых животных.
В этой статье мы описаем анестезию и хирургические процессы и покажем примеры выходов, которые могут быть получены с помощью этого протокола, т.е. (иммуно-) гистологии, гистоморфографии, живой и экс-виво микротомографии для оценки механизмов костей регенерации и количественно нового синтеза костей поддерживается костной заменителя материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В соответствии с требованиями швейцарского законодательства протокол был одобрен академическим комитетом и контролируется кантональными и федеральными ветеринарными учреждениями (разрешения n' GE/165/16 и GE/100/18).
1. Специальные устройства и животные
-
Цилиндров
- Машинные цилиндры с боковыми стабилизирующими вкладками из PEEK имеют внутренний диаметр 5 мм, внешний диаметр 8 мм и высоту 5 мм(рисунок1).
- Машина PEEK крышки с дизайном позволяет клип точно на верхней части цилиндра (толщина 1 мм).
- Стерилизовать цилиндры peeK и колпачки путем автоматического автоматического перед операцией.
-
Винты
- Используйте самобуруемые микровинты (из коммерческого чистого титана (класс 5)) для фиксации цилиндров (1,2 мм в диаметре, 4 мм в длину). Стерилизовать путем автоклавирования перед операцией.
-
Животных
- Приобретите трехмесячных новозеландских белых кроликов (мужчин ы мужчины или женщины), весом 2,5 кг каждый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы получили кроликов путем разведения в Университете
- Приобретите трехмесячных новозеландских белых кроликов (мужчин ы мужчины или женщины), весом 2,5 кг каждый.
2. Хирургия
- Хирургический лоток
- Держите скальпели, ножницы, два щипца, периосталь лифта, шприцы (1, 2, 5, 50 мл), хирургический двигатель, круглые хирургические burs (0,8 мм в диаметре), иглы, стерильные соливые, четыре цилиндра, восемь винтов, и отвертка готовы.
- Доклиническое лечение
- Акклиматизировать животных за неделю до операции.
- Обеспечить профилактический антибиотик ежедневно (5-10 мг/кг в рот (PO)), начиная с 2 ч до операции до 3 дней после операции.
- Анестезия и интубация
- Седативные животные путем внутримышечной (ИМ) инъекции кетамина (25 мг/кг, 50 мг/мл, 0,5 мл/кг) и ксилазин (3 мг/кг, 20 мг/мл, 0,15 мл/кг). Подождите 20 минут, пока животные спят
глубоко (полное мышечное атонизм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это премедикация позволит простой, быстрый и безболезненный процесс интубации. Глубокая анестезия и анестезия индуцируется как описано в шаге 2.3.8. - Поместите внутривенную (IV) канюли в маргинальную вену из уха и держите ее закрытой до завершения интубации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта IV линия будет служить для профиза фентанила и пропофола для глубокой анальгезии и анестезии, соответственно (см. шаг 2.3.8). - Поддерживайте анестезию, поставляя 5% севофлуран в чистом кислороде до интубации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только в том случае, если животное проявляет признаки пробуждения (движения глаз, мышечные сокращения). - Анестезируя трахею локально, распыляя 10% лидокаина. Поместите кролика в положение лежа и поддерживать его голову в вертикальном расширении.
- Сдвиньте первую эндотрахеальную трубку малого диаметра (2,5 мм) в трахею кролика до тех пор, пока в трубке не будет слышен поток воздуха. Это откроет гортань и облегчит вставку окончательной трубки.
- Вставьте направляющий (интубционный катетер) в трубку, чтобы зафиксировать положение трубки в трахею. Удалите трубку малого диаметра и сдвиньте окончательную эндотрахеальной трубки (4,9 мм) на направляющей.
- Снимите направляющий и надувайте шарик в конце эндотрахеялкой трубки, чтобы запечатать и заблокировать устройство в трахею. Трубка будет оставаться на месте, но она может быть обеспечена с помощью кружева связаны вокруг лба. Немедленно проветривайте (7 мл/кг, частота 40/мин) животное с 3% севофлураном в чистом кислороде.
- Непрерывно пронзительный (уховенная вена) фентанил (0,01 мг/мл, 2-4 мл/ч) для вызвать анальгезию, 2-4 мг/кг (2%) пропофол (20 мг/мл, 4-8 мл/ч) для индуцирования анестезии и 4 мл/кг ацетата Ринджера для поддержания изо-объемных состояний.
- Поместите ректальный зонд температуры. Также следите за функцией сердца, температурой и насыщением кислорода в течение всего процесса.
- Контролировать глубину анестезии путем мониторинга автономного дыхания; если животное проявляет признаки автономного дыхания, обойтись небольшой болюс пропофол и фентанил.
- Седативные животные путем внутримышечной (ИМ) инъекции кетамина (25 мг/кг, 50 мг/мл, 0,5 мл/кг) и ксилазин (3 мг/кг, 20 мг/мл, 0,15 мл/кг). Подождите 20 минут, пока животные спят
- Подготовка сайта
- Поместите кролика на подогревом (39 градусов по Цельсию), покрытую матрасной подушкой (во избежание ожогов) на хирургический стол. Побрить кожу головы.
- Нанесите смазочный гель на глаза, чтобы избежать раздражения и сухости. Дезинфекция сайта путем очистки кожи с помощью повидона йода (10%). Затем драпировать кролика стерильной хирургической драпировки и вырезать области доступа для черепа.
- Дезинфицировать хирургическое место с помощью повидона йода (10%) во второй раз. Нанесите смазочный гель на глаза, чтобы избежать раздражения и сухости.
- Подготовьте драпированный стол (стерильная драпировка), на которой можно разместить полный хирургический лоток.
- Открытие хирургического участка
- Анестезия локально с подкожной (SC) инъекции лидокаина 2% (1 мл) на черепе.
- Прорезывайтесь по коже (скальпелем) вдоль кальварианной сагиттальной линии, от орбит до внешнего затылочной протеуранса (длина 4 см). Убедитесь, что периостеум вырезка.
- Аккуратно поднимите периостеум (с периостальным лифтом) по обе стороны от разреза. Промыть участок стерильным сольным раствором.
- Размещение цилиндров
- Найдите средние и корональные швы на черепе(рисунок 2A, B). Обратите внимание, что эти анатомические линии образуют крест. Цилиндры будут размещены в каждом из квадрантов, определенных крестом, гарантируя, что край цилиндра не над швом(рисунок 2C).
- Поместите первый цилиндр на левый верхний квадрант (левая лобная кость) и попытайтесь заложить устройство плоским. Закрепите в положении с сильным давлением руки и винт микровинт, пока сопротивление не ощущается. Убедитесь, что головка винта заподлицо с поверхностью вкладки цилиндра.
- Повторите ту же процедуру на другой вкладке, чтобы зафиксировать цилиндр плотно на череп. Убедитесь, что цилиндр герметично крепится к кости.
- Повторите процедуру на правой верхней четверти (правая лобная кость), левой нижней четверти (левая теменной кости) и правой нижней четверти (правая теменной кости).
- Кость бурения 5 интрамедуллярных отверстий в области, ограниченной цилиндрами(рисунок 1)
- Просверлите интрамедуллярное отверстие под сольственным орошением (0,8 мм в диаметре, 1 мм в глубину) с круглым буром на кости, в центре области, ограниченной цилиндром. Убедитесь, что кровотечение появляется.
- Просверлите еще два интрамедуллярных отверстия вдоль оси, проходящих через два винта вкладки, по внутренним краям цилиндра. Вдоль перпендикулярного топора просверлите еще два интрамедуллярных отверстия на внутренних краях цилиндра. Убедитесь, что кровотечение появляется.
- Повторите операцию в трех других цилиндрах.
- Заполнение цилиндров образцами материалов и укупорки (рисунок 3)
- Подготовьте желаемый материал заменителя кости в соответствии с инструкциями производителя или спецификациями материала.
- Заполните первый цилиндр до краев материалом образца и закройте цилиндр, подогнав крышку. Повторите процесс в 3 других цилиндрах.
- Закрытие хирургического участка
- Закройте кожу над цилиндрами с прерывистым не-ремогативным швом.
- Нанесите распыляемый соус на рану.
3. Послеоперационное лечение
- Остановить анальгезию и анестезию (пропофол и фентанил перфузии арест) поставки и проверить восстановление автономного дыхания.
- Остановите вентиляцию после того, как животное восстановило автономное дыхание. Поддерживайте животное под чистым кислородом перед полным пробуждением.
- Вводят бупренорфин гидрохлорид Sc (0,02 мг/кг, 0,03 мг/мл, 0,67 мл/кг) и повторяйте инъекцию каждые 6 ч в течение 3 дней в качестве послеоперационной анальгезии.
- Перенесите животное в обычное жилище с водой и полным кормлением.
- Удалите швы примерно через 10 дней после заживления ран.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Описанная в настоящем году модель посвящена оценке остеопроводимости в костных заменителях. Также может быть оценена остеогенез и остеоиндукция заменителей костей (предварительно) клетчатых или загруженных биоактивнымимолекулами, а также васкулогенез 1,2,3,4 5 , 6 , 7 (г. , 8 , 9 До 9 , 10 Лет , 11 Год , 12 Лет , 13 Год , 14 Год , 15 лет , 16 Год , 17 Лет , 18 лет , 19 лет , 20 , 21 год , 22 Г. , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. Кинетическое исследование может быть использовано, от 3 дней до 3 месяцев после операции в зависимости от механизмов и выходов, которые будут проанализированы. Классическая шкала времени, позволяющая описания в начале и середине времени: 2, 4, 6, 8 и 12 недель. Обратите внимание, что как минимум 6 образцов в точку времени является обязательным для получения значительных результатов. Каждый образец для тестирования должен быть помещен по крайней мере один раз в каждой позиции на череп на точку времени (случайное распределение). Наконец, фиктивные образцы (например, цилиндры, заполненные свернутой кровью) должны быть включены в протокол34.
После завершения операции, рост костей может контролироваться в разные временные моменты с помощью костной томографии на живых животных. Пример показан на рисунке 4A,B. Дополнительный анализ требует, чтобы животные были принесены в жертву (смертельная внутривенная инъекция 150 мг/кг пентобарбитала (100 мг/мл). После эвтаназии образцы секционируются, а цилиндры тщательно удаляются(рисунок5). Биопсия фиксируется раствором фосфатно-буферного солей и 4% формальдегида. Рост костей может быть оценен с помощью микротомографии(Рисунок 4 C,D). Образцы также могут быть обработаны для (иммунно-) гистологического окрашивания. Гистоморфеорный анализ и специфические окрашивания затем можно завершить анализ более конкретно(рисунок 6).
Рисунок 1: Спецификации цилиндров PEEK. Два отверстия (0,8 мм в диаметре) были просверлены на боковых стабилизирующих вкладках для завинчивания. Позиции 5 интрамедуллярных отверстий (0,8 мм в диаметре), которые должны быть просверлены на черепе в пределах области, делимитированной цилиндром, обозначены красными кругами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативное изображение черепа кролика и размещение цилиндров. Фотографии, показывающие средний и корональный швы на черепе кролика, очерчивающие лево-правые теменные и лобные кости (A,B). Размещение цилиндров по обе стороны отшвов (C ). Шкала баров 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Репрезентативное изображение цилиндров фиксированной, заполненной и обложеной. Изображение, показывающее четыре цилиндра, закрепленные на черепе кролика с титановыми винтами. В пределах области, делимитироватой каждым цилиндром, 5 интрамедуллярных отверстий (0,8 мм в диаметре, 1 мм в глубину) были пробурены под орошением с круглым буром, чтобы позволить миграцию костных клеток. Цилиндры были заполнены различными образцами заменителя костей (калиброванные объемы) перед укупоркой (показан только один закрытый цилиндр). Шкала бар 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Репрезентативные изображения с микротомографического (микро-КТ) анализа. С конечной целью для оценки роста костей, проводимых заменителей костей, 4 цилиндра были закреплены на череп кролика с титановыми винтами и заполнены костными замещающих материалов. (A) Live изображения: двумерное поперечное сканирование (14 мин, 99 кВ/88 ЗА с разрешением 20 мкм) цилиндра на 12 недель. (B) трехмерная (3D) реконструкция из живого микро-КТ-анализа на 4 недели (красные круги: заменители костей в цилиндрах; красная стрелка: контроль, в котором цилиндр наполнен свернутой кровью). (C,D) После эвтаназии (12 недель) цилиндры удалялись перед фиксацией и микроКТ-анализом. (C) 2D поперечное сканирование (57 мин, 99 кВ/88 ЗА с разрешением 10 мкм) цилиндра и 3D-реконструкция общей новой кости в цилиндре (D ). Показаны частицы заменителя костей (красные), новые кости (зеленые) и костяные ложенные (желтые). Шкала баров 2 мм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Репрезентативные изображения биопсии на 4 недели. После эвтаназии (4 недели), образцы были блок-секции и цилиндры были удалены до фиксации в 4% формалин, микро-КТ анализа и гистологической обработки. Шкала бар 5 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Представитель фотографии (иммунно-)гистологических разделов. С конечной целью оценки роста костей и неоваскуляризации, проводимой заменителями костей, 4 цилиндра были закреплены на черепе кролика с титановыми винтами и заполнены костными заменителями. После эвтаназии (12 недель) цилиндры удалялись перед фиксацией и гистологической обработкой. (A) Массон-Голднер окрашивания (50x): заменитель кости появляется как лиловые частицы окружены новой кости в зеленом цвете. (B) Ломтики были отсканированы и обработаны для цифровой добычи костного замещающего материала, так что новая кость (красный) может быть количественно легко. (C) Иммуносточинг CD31 (стрелки), типичный маркер эндотелиальных клеток и неоваскуляризации процесса. (D) Иммунофлуоресцентное окрашивание (зеленый) высоко неоваскулярной зоны, в которой некоторые новые капилляры высоко экспресс CD31 (стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанная в настоящем случае модель проста и должна быть разработана довольно легко до тех пор, пока все шаги следуют и оборудование подходит. Поскольку описанный протокол является хирургическим методом, все шаги кажутся критическими и должны соблюдаться должным образом. Очень важно, чтобы быть обучены для экспериментов на животных, особенно в обработке кроликов и анестезии. Не стесняйтесь обратиться за профессиональной анестезией и ветеринарной помощью. Очень важно настаивать на ежедневном визуальном мониторинге животных до и после удаления шва. Даже если кожа черепа толстая, обильная и рыхлая, фиксация цилиндров вызывает большое напряжение. Если швы будут удалены слишком рано, рана может вновь открыть и потребует еще одну неделю зашивания и нового лечения антибиотиками. В случае несоответствия раневой линии, хирург должен будет рассмотреть, если зашивание возможно или нет. В противом случае необходимо будет рассмотреть вопрос об отказе от выборок.
В дополнение к критическим шагам, описанным в разделе протокола, приведенные ниже детали могут быть полезны при надлежащем осуществлении этого протокола. С технической точки зрения, так как используемые кролики молоды и малы, важно использовать двухступенчатую интубацию, как описано в протоколе. Вторая (и последняя) трубка слишком велика, чтобы использоваться в первой интубеации, и существует реальный риск "неправильный путь", который может быть вредным или даже смертельным исходом.
В зависимости от проверенных материалов, это может быть интересно взять свежий образец крови из уха IV линии, которая уже размещена. Это может обеспечить хороший метод для предварительного влить костной заместительитель материала с естественными клетками и факторами роста. Свежесвернутая кровь может также обеспечить идеальный фиктивный образец.
Способ бурения интрамедуллярных отверстий должен быть очень полезным для будущей гистологической обработки и гистоморфетритического анализа. По сути, до тех пор, пока отверстия (i) в одном и том же месте, (ii) биопсия одинаково ориентирована и (iii) процесс резки стандартизируется (т.е. та же толщина, тот же уровень разреза), поля, которые оцениваются, эквивалентны, и их сравнение является высоко Соответствующие. Что касается стандартизации, то может представлятьь реальный интерес откалибровка объема и количества материала для заполнения цилиндра и заранее, стерильным способом, его подготовить.
С научной точки зрения, в зависимости от продуктов или гипотезы испытания, это может быть важно, чтобы избежать размещения цилиндров на костные швы. Некоторые специфические стволовые клетки присутствуют в этих структурах35, отличающихся от мезенхимальных стволовых клеток кости, которые участвуют в механизмах интраимбранной околификации, т.е. процесс регенерации костей, встречающихся в орофациальной области. Таким образом, реальная предвзятость может возникнуть в случае неуместности.
Одним из основных преимуществ кальвариальной модели является использование живой микротомографии, с помощью которой рост костей может следовать на одном животном в качестве продольного исследования. Эта стратегия может в значительной степени уменьшить количество эвтанированных животных и, следовательно, уважать "правило 3R"36. В зависимости от используемого микротомографа (разрешение, пространство доступно для животного), изменения будут происходить с точки зрения стратегии анестезии (IV, газа и т.д.), а также в разрешении изображения и актуальности результирующего анализа.
Мы регулярно используем микротомограф, посвященный экспериментам на животных (например, Квантовая GX) для плановых проверок. Типичный эксперимент начинается с седации, как описано в шаге 2.3.1. Анестезия затем поддерживается с 2% изолюран в чистом кислороде. Это позволяет животному дышать спокойно во время сканирования около 14 мин (99 кВ/88 ЗА с разрешением 20 мкм); этого достаточно для проверки основных параметров (прививка, фиксация цилиндров, полуколичественный анализ роста костей и т.д.). При поиске точного качественного и количественного анализа потребуется очень тонкая настройка времени сканирования, разрешения, анестезии и позиционирования животных.
Существующие модели, разработанные для оценки остеопроводимости, остеогенеза, остеоиндукции, а также васкулогенеза, многочисленны, особенно в орофациальной области. Из-за этических и экономических соображений, наша цель будет ограничена кролика или мелких животных. Помимо черепа, места, в которых материал может быть проверен являются mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, диастема48 или острые розетки (после извлечения зубов)49,50,51. Крысы, мыши, морские свинки и кролики могут быть использованы для каждой из моделей, описанных ниже. Кратко, критический дефект просверливается (или гнездо создается в результате проницательной экстракции), заполнены образцом материала, а затем покрыты мембраной. Помимо очевидного факта, что только два образца могут быть проверены в каждом из этих мест (один образец на нижней челюсти или на острый гнездо), хирургические процедуры также в значительной степени более трудным и инвазивным. Доступ к сайту ограничен, и если человек использует крыс или мышей, сложность еще больше увеличивается на размер животных. Наконец, критический размер дефектов (т.е. размеры, которые не позволяют спонтанной регенерации костей) не четко определен ы и варьируется от одного животного к другому.
Помимо этих общих черт, могут возникать конкретные ограничения в зависимости от анатомического расположения, подверженного дефекту, и последующего анализа. Например, в мандибулярной модели корни зубов присутствуют в дефекте. Это может помешать материалу и изменить процесс регенерации костей. Дефект может быть помещен более дистически на рамус, но в этом случае, кость будет очень тонкой (два кортиков, прикрепленных с очень тонким медуллярным пространством) и в результате объем дефекта может быть слишком мал45,46, 47. С учетом этих примеров ограничений и в зависимости от модели можно ожидать больших отклонений с точки зрения объема материала, который будет проверен, качества и количества собранных данных.
Поскольку оценка материала требует максимума стандартизации и калибровки, клизменная модель выглядит идеальной. Доступ очень прост, калибровка и стандартизация облегчаются использованием определенных цилиндров и 4 образца могут быть оценены одновременно. Кроме того, можно использовать живую томографию, и, наконец, можно ожидать значительного сокращения числа животных, которые должны быть усыплены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы в долгу перед Geistlich AG (Wolhusen, CH) и Фондом остеологии (Lucerne, CH) (грант n-18-049) за их поддержку, а также Global D (Brignais, FR) за предоставление винтов. Особая благодарность д-р Б. Шефер из Geistlich. Мы также благодарны Элиане Дюбуа и Клэр Херрманн за их отличную гистологическую обработку и их драгоценные советы. Наконец, мы тепло признаем Ксавье Белин, Сильви Руле и вся команда Pr Валид Хабре, "экспериментальная хирургия Dpt", за их замечательную техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Enrofloxacine Baytril 10% | Bayer | Antibiotic | |
| Fentanyl | Bischel | For analgesia | |
| Ketalar 50mg/ml | Pfizer | Ketamine for anesthesia | |
| Lidohex | Bichsel | Lubricating gel for the eyes | |
| Opsite | Smith and Nephew | 66004978 | Sprayable dressing |
| Povidone iodine 10%, Betadine | Mundipharma | anti-infective agent | |
| Propofol 2% | Braun | 3538710 | For anesthesia |
| Rapidocain 2% | sintetica | Local anesthesia | |
| Ringer-acetate | Fresenius Kabi | Volume compensation | |
| Rompun 2% | Bayer | Xylazin for anesthesia | |
| Sevoflurane 5% | Abbvie | For anesthesia | |
| Sterile saline | Sintetica | ||
| Temgesic | Reckitt Benckiser | Buprenorphine hydrochloride, analgesia | |
| Thiopental Inresa | Ospediala | For anesthesia | |
| Xylocaine 10% spray | Astra Zeneca | For intubation | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fresenius Vial pilot C | Imexmed | Infusion pump | |
| Heated pad | Harvard Apparatus | ||
| Suction dominant 50 | Medela | ||
| Suction tubing Optimus | Promedical | 80342.2 | |
| Surgical motor | Schick dental | Qube | Drilling of intramedullary holes |
| Ventilation | Maquet Servo1 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Cylinders and caps | Boutyplast | Customized | composition: PEEK (poly ether ether ketone) |
| Manual self-retaining shaft | GlobalD | ACT1K | |
| Mobile handle for self-retaining shaft | GlobalD | MTM | |
| Self- drilling screws | GlobalD | VA1.2KL4 | cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tray | |||
| Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm | Covidien | 86233 | For intubation |
| Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm | Covidien | 107-35G | For intubation |
| Ethicon prolene 4-0 | Ehticon | 8581H | Non-resorbable suture |
| Forceps | Marcel Blanc | BD027R | 145 mm |
| Intubation catheter | Cook medical | Guide for intubation | |
| Needlle holder | Marcel Blanc | BM008R | |
| Needles BD Microlance3 | Becton Dickinson | 300300/304622 | 26G; 18G |
| Periosteal | HU-Friedy | P9X | |
| Round surgical burs | Patterson | 78000 | 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes |
| Scalpel | Swann-Morton | n°10 and n°15 | |
| Scissors | Marcel Blanc | 00657 | 180 mm |
| Syringes Omnifix | Braun | 4616057V | 5ml, 10ml and 50ml |
| Venflon G22 | Braun | 42690985-01 | Vasofix safety for the ear iv line |
References
- Anderud, J., et al. Guided bone augmentation using a ceramic space-maintaining device. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology and Oral Radiology. 118 (5), 532-538 (2014).
- Lundgren, A. K., Lundgren, D., Hammerle, C. H., Nyman, S., Sennerby, L. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clinical Oral Implants Research. 11 (2), 99-106 (2000).
- Lundgren, D., Lundgren, A. K., Sennerby, L., Nyman, S. Augmentation of intramembraneous bone beyond the skeletal envelope using an occlusive titanium barrier. An experimental study in the rabbit. Clinical Oral Implants Research. 6 (2), 67-72 (1995).
- Slotte, C., Lundgren, D. Impact of cortical perforations of contiguous donor bone in a guided bone augmentation procedure: an experimental study in the rabbit skull. Clinical Implant Dentistry and Relat Research. 4 (1), 1-10 (2002).
- Tamura, T., et al. Three-dimensional evaluation for augmented bone using guided bone regeneration. Journal of Periodontal Research. 40 (3), 269-276 (2005).
- Yamada, Y., et al. Correlation in the densities of augmented and existing bone in guided bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 23 (7), 837-845 (2012).
- Chierico, A., et al. Electrically charged GTAM membranes stimulate osteogenesis in rabbit calvarial defects. Clinical Oral Implants Research. 10 (5), 415-424 (1999).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of the permeability of shields with autologous bone grafts on bone augmentation. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (6), e386-e392 (2013).
- Ito, K., Nanba, K., Murai, S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. Journal of Periodontology. 69 (11), 1229-1237 (1998).
- Lee, Y. M., et al. Enhanced bone augmentation by controlled release of recombinant human bone morphogenetic protein-2 from bioabsorbable membranes. Journal of Periodontology. 74 (6), 865-872 (2003).
- Fugl, A., et al. S-nitroso albumin enhances bone formation in a rabbit calvaria model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 43 (3), 381-386 (2014).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of self-assembling peptide hydrogel scaffold on bone regeneration with recombinant human bone morphogenetic protein-2. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (5), e283-e289 (2013).
- Ito, K., et al. Effects of ipriflavone on augmented bone using a guided bone regeneration procedure. Clinical Oral Implants Research. 18 (1), 60-68 (2007).
- Jung, R. E., Hammerle, C. H., Kokovic, V., Weber, F. E. Bone regeneration using a synthetic matrix containing a parathyroid hormone peptide combined with a grafting material. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 22 (2), 258-266 (2007).
- Minegishi, T., et al. Effects of ipriflavone on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvaria. Journal of Oral Science. 44 (1), 7-11 (2002).
- Moussa, M., et al. Medium-Term Function of a 3D Printed TCP/HA Structure as a New Osteoconductive Scaffold for Vertical Bone Augmentation: A Simulation by BMP-2 Activation. Materials. 8 (5), 2174-2190 (2015).
- Thoma, D. S., Kruse, A., Ghayor, C., Jung, R. E., Weber, F. E. Bone augmentation using a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute materials with and without recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clinical Oral Implants Research. 26 (5), 592-598 (2014).
- Busenlechner, D., et al. Resorption of deproteinized bovine bone mineral in a porcine calvaria augmentation model. Clinical Oral Implants Research. 23 (1), 95-99 (2012).
- Busenlechner, D., et al. Paste-like inorganic bone matrix: preclinical testing of a prototype preparation in the porcine calvaria. Clinical Oral Implants Research. 20 (10), 1099-1104 (2009).
- Busenlechner, D., et al. Simultaneous in vivo comparison of bone substitutes in a guided bone regeneration model. Biomaterials. 29 (22), 3195-3200 (2008).
- Carrel, J. P., et al. A 3D printed TCP/HA structure as a new osteoconductive scaffold for vertical bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 55-62 (2016).
- Murai, M., et al. Effects of different sizes of beta-tricalcium phosphate particles on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Dental Materials Journal. 25 (1), 87-96 (2006).
- Nishida, T., et al. Effects of bioactive glass on bone augmentation within a titanium cap in rabbit parietal bone. Journal of Periodontology. 77 (6), 983-989 (2006).
- Nyan, M., et al. Feasibility of alpha tricalcium phosphate for vertical bone augmentation. Journal of Investigating and Clinical Dentistry. 5 (2), 109-116 (2012).
- Polimeni, G., et al. Histopathological observations of a polylactic acid-based device intended for guided bone/tissue regeneration. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 99-105 (2008).
- Polo, C. I., et al. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 2 associated with a variety of bone substitutes on vertical guided bone regeneration in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 84 (3), 360-370 (2013).
- Slotte, C., Lundgren, D., Burgos, P. M. Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 18 (6), 795-806 (2003).
- Tamimi, F. M., et al. Bone augmentation in rabbit calvariae: comparative study between Bio-Oss and a novel beta-TCP/DCPD granulate. Journal of Clinical Periodontology. 33 (12), 922-928 (2006).
- Torres, J., et al. Effect of solely applied platelet-rich plasma on osseous regeneration compared to Bio-Oss: a morphometric and densitometric study on rabbit calvaria. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 106-112 (2008).
- Yamada, Y., et al. Angiogenesis in newly augmented bone observed in rabbit calvarium using a titanium cap. Clinical Oral Implants Research. 19 (10), 1003-1009 (2008).
- Cordaro, L., Terheyden, H. ITI Treatment Guide. Wismeijer, D., Chen, S., Buser, D. 7, Quintessence. (2014).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
- Min, S., et al. Effects of marrow penetration on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 78 (10), 1978-1984 (2007).
- Braun, T. M. Ch. 4. Osteology guidelines for oral and maxillofacial regeneration Preclinical models for translational research. Giannobile, W. V., Nevins, M. , Quintessence publishing. 31-43 (2011).
- Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial Suture-Derived Stem Cells and Their Contribution to Cranial Bone Repair. Frontiers in Physiology. 8, 956 (2017).
- Russel, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. , Universities Federation for Animal Welfare. (1959).
- Asvanund, P., Chunhabundit, P. Alveolar bone regeneration by implantation of nacre and B-tricalcium phosphate in guinea pig. Implant Dentistry. 21 (3), 248-253 (2012).
- Gielkens, P. F., et al. Gore-Tex as barrier membranes in rat mandibular defects: an evaluation by microradiography and micro-CT. Clinical Oral Implants Research. 19 (5), 516-521 (2008).
- Lioubavina, N., Kostopoulos, L., Wenzel, A., Karring, T. Long-term stability of jaw bone tuberosities formed by "guided tissue regeneration". Clinical Oral Implants Research. 10 (6), 477-486 (1999).
- Mardas, N., Kostopoulos, L., Stavropoulos, A., Karring, T. Osteogenesis by guided tissue regeneration and demineralized bone matrix. Journal of Clinical Periodontology. 30 (3), 176-183 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Mardas, N., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone used as an adjunct to guided bone augmentation: an experimental study in the rat. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 3 (3), 156-165 (2001).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone (Bio-Oss) and bioactive glass (Biogran) arrest bone formation when used as an adjunct to guided tissue regeneration (GTR): an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 30 (7), 636-643 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Fate of bone formed by guided tissue regeneration with or without grafting of Bio-Oss or Biogran. An experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 31 (1), 30-39 (2004).
- Stavropoulos, A., Nyengaard, J. R., Kostopoulos, L., Karring, T. Implant placement in bone formed beyond the skeletal envelope by means of guided tissue regeneration: an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 32 (10), 1108-1115 (2005).
- Thomaidis, V., et al. Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size. Medical Science Monitor. 14 (4), (2008).
- Zhang, J. C., et al. The repair of critical-size defects with porous hydroxyapatite/polyamide nanocomposite: an experimental study in rabbit mandibles. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 39 (5), 469-477 (2010).
- Zhang, X., et al. Osteoconductive effectiveness of bone graft derived from antler cancellous bone: an experimental study in the rabbit mandible defect model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 41 (11), 1330-1337 (2012).
- Bronoosh, P., et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on healing of mandibular bone defects: an experimental study in rabbits. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 277-284 (2015).
- Gomes, F. V., et al. Low-level laser therapy improves peri-implant bone formation: resonance frequency, electron microscopy, and stereology findings in a rabbit model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 245-251 (2014).
- Lalani, Z., et al. Spatial and temporal localization of secretory IgA in healing tooth extraction sockets in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 62 (4), 466-472 (2004).
- Osorio, L. B., et al. Post-extraction evaluation of sockets with one plate loss--a microtomographic and histological study. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 31-38 (2014).
