Summary
Hier presenteren we een chirurgisch protocol bij konijnen met als doel om botsubstitutie materialen te beoordelen in termen van botregeneratie capaciteiten. Door het gebruik van PEEK cilinders bevestigd op konijn schedels, osteogelei ding, osteoinductie, osteogenesis en vasculogenese geïnduceerd door de materialen kunnen worden geëvalueerd op levende of geëdoseerde dieren.
Abstract
Het basisprincipe van het konijn calvarial model is het verticaal kweken van nieuw botweefsel bovenop het corticale deel van de schedel. Dit model maakt het mogelijk om botsubstitutie materialen voor orale en craniofaciale botregeneratie te beoordelen in termen van botgroei en neovascularisatie ondersteuning. Zodra dieren zijn verdoving en geventileerd (Endotracheale intubatie), worden vier cilinders gemaakt van polyether ether keton (PEEK) op de schedel geschroefd, aan beide zijden van de mediaan en coronale hechtingen. Vijf intramedullaire gaten worden geboord binnen het door elke cilinder gescheiden botgebied, waardoor de instroom van beenmergcellen mogelijk wordt. De materiaalmonsters worden in de cilinders geplaatst die vervolgens worden gesloten. Ten slotte wordt de operatieplaats gehecht en worden dieren wakker. Botgroei kan worden beoordeeld op levende dieren met behulp van microtomografie. Zodra de dieren worden geëoerd, kunnen botgroei en neovascularisatie worden geëvalueerd met behulp van microtomografie, immuunhistologie en immunofluorescentie. Aangezien de evaluatie van een materiaal een maximale standaardisatie en kalibratie vereist, lijkt het calvarial-model ideaal. De toegang is zeer eenvoudig, kalibratie en standaardisatie worden vergemakkelijkt door het gebruik van gedefinieerde cilinders en vier monsters kunnen tegelijkertijd worden beoordeeld. Bovendien kan Live tomografie worden gebruikt en kan uiteindelijk een grote afname van de te euthande dieren worden verwacht.
Introduction
Het calvariale model van botvergroting werd ontwikkeld in de jaren 90 met als doel het concept van geleide botregeneratie (GBR) in het orale en craniofaciale chirurgische domein te optimaliseren. Het basisprincipe van dit model is het verticaal kweken van nieuw botweefsel bovenop het corticale deel van de schedel. Hiervoor wordt een reactor (bijv. Titanium koepel,-cilinder of-kooi) op de schedel bevestigd om de botregeneratie te beschermen die door een transplantaat wordt uitgevoerd (bijv. hydrogel, botsubstituut, enz.). Met behulp van dit model, Titanium of keramische kooien1,2,3,4,5,6, GbR membranen7,8,9 ,10, osteogenic factoren11,12,13,14,15,16,17, nieuw bot substituten12,16,17,18,19,20,21,22,23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 of het mechanisme van neovascularisatie tijdens het botregeneratie proces30 werden beoordeeld.
Vanuit een translationeel oogpunt vertegenwoordigt het calvariale model een defect van één wand dat kan worden vergeleken met een defect van klasse IV in de kaak31. Het doel is om nieuw bot te kweken boven een corticale gebied, zonder laterale steun van endogene botwanden. Het model is dus uiterst streng en beoordeelt het reële potentieel van verticale osteogelei ding over het corticale deel van het bot. Als het model dat hierin wordt beschreven primair gewijd is aan de beoordeling van osteogelei ding in botsubstituten, kunnen osteogenese en/of osteoinductie ook worden beoordeeld, evenals vasculogenese1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30.
In essentie om ethische, praktische en economische redenen, werd het calvarial-model ontwikkeld in het konijn waarin het botmetabolisme en de structuur heel relevant zijn in vergelijking met humane32. Van de 30 bovengenoemde referenties gebruikte 80% het konijn calvarial model1,2,3,4,5,6,7,8 ,9,10,11,12,13,14,15,17,22, 23,26,27,28,29,30,33, waardoor de relevantie van dit diermodel wordt aangetoond. In 2008, de Busenlechner groep overgedragen de calvarial model naar het varken, om de vergelijking van acht Bot substituten gelijktijdig20 (in vergelijking met twee botvervangers met het konijn). Aan de andere kant heeft onze fractie het konijn calvarial-model overgebracht naar schapen. Kort gezegd werden Titanium koepels op schapen schedels geplaatst om de osteogelei ding van een nieuwe 3D-gedrukte botsubstitutie te karakteriseren. Deze studies lieten ons het calvariale model en de analyse16,21ontwikkelen en beheersen.
De laatste drie studies aangehaald16,20,21, samen met een aantal andereonderzoeken 12,17,18,19,22, 23,24,26,27,28,29, bevestigde het grote potentieel van het calvariale model als een screening en karakterisering Model. Hoewel de behaalde resultaten behoorlijk bevredigend waren, wezen ze er echter ook op enkele beperkingen: (1) het gebruik van titanium koepels, die Röntgen diffusie en op zijn beurt Live micro-CT gebruik voorkomen. Deze kunnen niet worden verwijderd voor histologische verwerking, waardoor de onderzoekers de monsters in poly (methylmethacrylaat) hars (PMMA) insluiten. De daaruit voortvloeiende analyses waren dus grotendeels beperkt tot topografie. (2) hoge financiële kosten, vooral vanwege de kosten van de dieren, en kosten in verband met de logistiek, het onderhoud en de chirurgie van de dieren. (3) moeilijkheden bij het verkrijgen van ethische goedkeuringen voor grote dieren.
Een recente studie van Polo, et al.26 heeft het model op het konijn grotendeels verbeterd. Titanium koepels werden vervangen door afsluitbare cilinders die konden worden gevuld met een constante hoeveelheid materiaal. Vier van deze cilinders werden op konijn schedels geplaatst. Bij voltooiing konden de cilinders worden verwijderd zodat biopsieën Metaalvrij waren, wat veel meer flexibiliteit introduceerde met betrekking tot de monsterverwerking. Het konijn calvarial-model werd aantrekkelijk voor gelijktijdige tests met lagere kosten, gemakkelijke verwerking van dieren en vergemakkelijking van de monsterverwerking. Door gebruik te maken van deze recente ontwikkelingen hebben we het model verder verbeterd door titanium te vervangen door PEEK om cilinders te produceren, waardoor Röntgen diffusie en het gebruik van microtomografie op levende dieren mogelijk worden.
In dit artikel beschrijven we de anesthesie-en operatie processen en laten we voorbeelden zien van outputs die kunnen worden verkregen met behulp van dit protocol, d.w.z. (immuno-) histologie, histomorphometrie, Live en ex vivo microtomografie om de mechanismen van bot te evalueren regeneratie en Kwantificeer de nieuwe botsynthese, ondersteund door botafvervangende materialen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
In overeenstemming met de Zwitserse wettelijke vereisten is het protocol goedgekeurd door een academisch Comité en onder toezicht van de kantonnale en federale veterinaire agentschappen (autorisaties n ° GE/165/16 en GE/100/18).
1. specifieke inrichtingen en dieren
-
Cilinders
- Machine cilinders met laterale stabiliserend tabs uit PEEK hebben een inwendige diameter van 5 mm, een buitendiameter van 8 mm en een hoogte van 5 mm (Figuur 1).
- Machine PEEK caps met een ontwerp dat precies op de bovenkant van de cilinder kan clippen (dikte 1 mm).
- Steriliseren PEEK cilinders en caps door autoclaven voor de operatie.
-
Schroeven
- Gebruik zelf boren micro schroeven (gemaakt van commercieel zuiver titanium (Grade 5)) om de cilinders te fixeren (1,2 mm in diameter, 4 mm lang). Steriliseren door autoclaven voor de operatie.
-
Dieren
- Koop drie maanden oude Nieuw-Zeelandse witte konijnen (mannelijk of vrouwelijk), met een gewicht van ~ 2,5 kg per stuk.
Let op: we hebben konijnen verkregen door te fokken aan de Universiteit van Genève.
- Koop drie maanden oude Nieuw-Zeelandse witte konijnen (mannelijk of vrouwelijk), met een gewicht van ~ 2,5 kg per stuk.
2. chirurgie
- Chirurgische lade
- Houd scalpels, schaar, twee Tang, beenvlies Lift, spuiten (1, 2, 5, 50 ml), chirurgische motor, ronde chirurgische BURS (0,8 mm diameter), naalden, steriele zoutoplossing, vier cilinders, acht schroeven en schroevendraaier klaar.
- Preklinische behandeling
- Acclimate de dieren een week voorafgaand aan de operatie.
- Zorg voor een profylactische antibioticum dagelijks (5 – 10 mg/kg via de mond (PO)) vanaf 2 h voor de operatie tot 3 dagen na de operatie.
- Anesthesie en intubatie
- Sedate de dieren met intramusculaire (IM) injectie van ketamine (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) + xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Wacht ~ 20 min voor de dieren te slapen
diep (volledige spier atony).
Opmerking: deze premedicatie zal een eenvoudig, snel en pijnloos intubatie proces mogelijk maken. Diepe analgesie en anesthesie wordt geïnduceerd zoals beschreven in stap 2.3.8. - Plaats een intraveneuze (IV) canule in de marginale ader van het oor en houd deze gesloten totdat de intubatie is voltooid.
Let op: deze IV lijn zal dienen om te parfuseren fentanyl en propofol voor diepe analgesie en anesthesie, respectievelijk (zie stap 2.3.8). - Onderhoud anesthesie door het leveren van 5% Sevofluraan in zuivere zuurstof tot Intubatie wordt uitgevoerd.
Opmerking: deze stap is alleen nodig als het dier tekenen van ontwaken vertoont (oogbewegingen, spiercontracties). - Anesthetiseer de luchtpijp lokaal door 10% lidocaïne te spuiten. Plaats het konijn in de liggende positie en houd het hoofd in verticale uitbreiding.
- Schuif de eerste endotracheale buis met een kleine diameter (2,5 mm) in de luchtpijp van het konijn totdat het debiet in de buis kan worden gehoord. Dit zal het strottenhoofd openen en het inbrengen van de definitieve buis vergemakkelijken.
- Plaats een geleider (intubatie katheter) in de buis om de positie van de buis in de luchtpijp vast te zetten. Verwijder de kleine diameter buis en schuif de definitieve endotracheale buis (4,9 mm) op de geleider.
- Verwijder de geleider en opblazen de ballon aan het uiteinde van de endotracheale buis te verzegelen en blokkeren van het apparaat in de luchtpijp. De buis zal blijven op zijn plaats, maar het kan worden beveiligd met behulp van een kant gebonden rond het voorhoofd. Onmiddellijk ventileren (7 mL/kg, frequentie van 40/min) het dier met 3% Sevofluraan in zuivere zuurstof.
- Continu parfuseren (oorader) fentanyl (0,01 mg/mL, 2 – 4 mL/h) voor het opwekken van Analgesie, 2 – 4 mg/kg (2%) Propofol (20 mg/mL, 4 – 8 mL/h) voor het opwekken van anesthesie, en 4 mL/kg/h van Ringer acetaat om de ISO-volumetrische condities te behouden.
- Plaats een rectale temperatuursonde. Controleer ook de hartfunctie, temperatuur en zuurstofverzadiging tijdens het hele proces.
- Controle van de diepte van de anesthesie door het monitoren van autonome ademhaling; Als het dier tekenen van autonome ademhaling vertoont, Doseer dan een kleine bolus Propofol en fentanyl.
- Sedate de dieren met intramusculaire (IM) injectie van ketamine (25 mg/kg, 50 mg/mL, 0,5 mL/kg) + xylazin (3 mg/kg, 20 mg/mL, 0,15 mL/kg). Wacht ~ 20 min voor de dieren te slapen
- Voorbereiding van de site
- Plaats het konijn op een verwarmde pad (39 °C) bedekt met een matras kussen (om brandwonden te voorkomen) op de operatietafel. Scheer de hoofdhuid.
- Breng een smeer gel aan op de ogen om irritatie en droogheid te voorkomen. Desinfecteer de plaats door de huid te schrobben met Povidon jodium (10%). Drapeer vervolgens het konijn met een steriele chirurgische draperen en knip een toegangs gebied voor de schedel.
- Desinfecteer de operatieplaats met Povidonjodium (10%) voor een tweede keer. Breng een smeer gel aan op de ogen om irritatie en droogheid te voorkomen.
- Bereid een gedrapeerde tafel (steriele draperen) waarop de volledige chirurgische lade te plaatsen.
- Opening van de chirurgische site
- Anesthetiseer lokaal met een subcutane (SC) injectie van lidocaïne 2% (1 mL) op de schedel.
- Insnijden door de huid (met een scalpel) langs de calvariale sagittale lijn, van de banen tot de externe occipitale knobbel (~ 4 cm in lengte). Zorg ervoor dat het periosteum wordt ingesneden.
- Voorzichtig verheffen van het periosteum (met een beenvlies lift) aan beide zijden van de incisie. Spoel de plaats af met een steriele zoutoplossing.
- Cilinder plaatsing
- Zoek de mediaan en coronale hechtingen op de schedel (Figuur 2a, B). Merk op dat deze anatomische lijnen een kruis vormen. De cilinders zullen in elk van de kwadranten worden geplaatst die door het Kruis worden gedefinieerd, zodat de rand van de cilinder niet over de hechtdraad (figuur 2c) komt.
- Plaats de eerste cilinder op de linker bovenste Kwadrant (linker frontale bot), en probeer het apparaat plat te leggen. Bevestig in de positie met sterke handdruk en schroef een micro-schroef, totdat de weerstand wordt gevoeld. Zorg ervoor dat de schroefkop is uitgelijnd met het oppervlak van de cilinder tab.
- Herhaal dezelfde procedure op het andere tabblad om de cilinder stevig op de schedel te bevestigen. Zorg ervoor dat de cilinder hermetisch vastzit aan het bot.
- Herhaal de procedure op de rechterbovenhoek bovenste kwartaal (rechter frontale bot), linker onderste kwart (linker pariëtale bot) en rechterbenedenhoek (rechter pariëtale bot).
- Botboringen van 5 intramedullaire gaten in het door de cilinders omkaderd gebied (Figuur 1)
- Boor een intramedullaire gat onder zoute irrigatie (0,8 mm in diameter, ~ 1 mm diep) met een ronde Bur op het bot, in het midden van het gebied omkaderd door de cilinder. Zorg ervoor dat er bloedingen verschijnen.
- Boor twee intramedullaire gaten langs de as die door de twee tab-schroeven loopt, aan de binnenranden van de cilinder. Boor langs de loodrechte bijl twee meer intramedullaire gaten aan de binnenranden van de cilinder. Zorg ervoor dat er bloedingen verschijnen.
- Herhaal de bewerking binnen de drie andere cilinders.
- Vulcilinders met materiaalmonsters en capping (figuur 3)
- Bereid het gewenste materiaal van de botsubstituut volgens de instructies van de fabrikant of de materiaal specificaties.
- Vul de eerste cilinder tot de rand met het materiaal monster en sluit de cilinder door de dop te monteren. Herhaal het proces in de 3 andere cilinders.
- Sluiting van de chirurgische site
- Sluit de huid boven de cilinders met een intermitterende niet-resorbable hechtdraad.
- Breng een sprayable dressing aan op de wond.
3. postoperatieve behandeling
- Stop analgesie en anesthesie (Propofol en fentanyl perfusie arrestatie) leveren en controleren van het herstel van autonome ademhaling.
- Stop de ventilatie zodra het dier de autonome ademhaling heeft hersteld. Houd het dier onder zuivere zuurstof voordat u het volledig ontwaakt.
- Injecteer buprenorfine hydrochloride SC (0,02 mg/kg, 0,03 mg/mL, 0,67 mL/kg) en herhaal de injectie elke 6 uur gedurende 3 dagen als postoperatieve analgesie.
- Breng het dier in zijn gebruikelijke huisvesting met water en volledige voeding.
- Verwijder de hechtingen na ongeveer 10 dagen van de wondgenezing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het hierin beschreven model is gewijd aan de beoordeling van osteogelei ding in botsubstituten. Osteogenese en-of osteoinductie van botsubstituten ofwel (pre-) cellularized of geladen met bioactieve moleculen kunnen ook worden beoordeeld, evenals vasculogenese1,2,3,4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30. er kan een kinetische studie worden gebruikt, van 3 dagen tot 3 maanden na de operatie, afhankelijk van de te analyseren mechanismen en uitgangen. Een klassieke tijdlijn die beschrijvingen vroeg en ' mid-time ' toestaat is: 2, 4, 6, 8 en 12 weken. Houd er rekening mee dat minimaal 6 monsters per tijdspunt verplicht zijn om significante resultaten te behalen. Elk te testen monster moet ten minste één keer in elke positie op de schedel worden geplaatst per tijdspunt (willekeurige toewijzing). Tot slot moeten de schijn monsters (bijv. cilinders gevuld met gecoaguleerd bloed) worden opgenomen in het protocol34.
Zodra de operatie voltooid is, kan botgroei op verschillende tijdstippen worden gemonitord met behulp van bottomografie op levende dieren. Een voorbeeld wordt weergegeven in Fig. 4a, B. Aanvullende analyse vereist dat dieren worden opgeofferd (dodelijke intraveneuze injectie van 150 mg/kg pentobarbital (100 mg/mL). Na euthanasie worden de monsters verdeeld en worden de cilinders zorgvuldig verwijderd (Figuur 5). Biopsies worden vastgesteld met een oplossing van fosfaat-gebufferde Saline en 4% formaldehyde. Botgroei kan vervolgens worden beoordeeld met behulp van microtomografie (Figuur 4 C, D). Monsters kunnen ook worden verwerkt voor (immuun-) histologische kleuring. Histomorphometrische analyse en specifieke kleuringen zijn dan mogelijk om de analyse specifieker te voltooien (Figuur 6).
Figuur 1: specificaties van Peek cilinders. Twee gaten (0,8 mm in diameter) werden geboord op de laterale stabiliserend tabs voor het schroeven. De posities van de 5 intramedullaire gaten (0,8 mm in diameter) die op de schedel moeten worden geboord binnen het door de cilinder afgebakende gebied, zijn gemarkeerd met rode cirkels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatief beeld van de schedel van het konijn en de plaatsing van de cilinders. Foto's van de mediaan en coronale hechtingen op de schedel van de konijn die de linker-rechtse pariëtale en frontale botten afbakenen (A,B). Plaatsing van de cilinders aan beide zijden van de hechtingen (C). Schaal staven = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatief beeld van de vaste, gevulde en gekapte cilinders. Afbeelding van vier cilinders die op de schedel van een konijn met titanium schroeven zijn bevestigd. Binnen het door elke cilinder afgebakende gebied werden 5 intramedullaire gaten (0,8 mm in diameter, ~ 1 mm diep) geboord onder irrigatie met een ronde Bur om botcelmigratie mogelijk te maken. Cilinders werden gevuld met verschillende botsubstituten (gekalibreerde volumes) vóór capping (één gesloten cilinder wordt alleen getoond). Schaalbalk = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve beelden van microtomografische (micro-CT) analyse. Met als einddoel de botgroei te beoordelen door middel van botsubstituten, werden 4 cilinders vastgezet op een konijnen schedel met titanium schroeven en gevuld met botafvervangende materialen. A) levende beeldvorming: tweedimensionale dwarse scan (14 min, 99 KV/88 μA met een resolutie van 20 μm) van een cilinder na 12 weken. (B) driedimensionale (3D) reconstructie van Live micro-CT-analyse na 4 weken (rode cirkels: botsubstituten in cilinders; rode pijl: controle waarin de cilinder is gevuld met gecoaguleerd bloed). (C,D) Na euthanasie (12 weken) werden cilinders verwijderd vóór fixatie en micro-CT analyse. C) 2D-dwars scan (57 min, 99 KV/88 μA met een resolutie van 10 μm) van een cilinder en 3D-reconstructie van het totale nieuwe bot in de cilinder (D). Botvervangende deeltjes (rood), nieuw bot (groen) en beender bed (geel) worden weergegeven. Schaal staven = 2 mm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve beelden van een biopsie na 4 weken. Na euthanasie (4 weken) werden de monsters blok verdeeld en werden cilinders verwijderd voor fixatie in 4% formaline, micro-CT analyse en histologische verwerking. Schaalbalk = 5mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: representatieve afbeeldingen van (immuun-) histologische secties. Met het uiteindelijke doel om botgroei en neovascularisatie door botvervangers te beoordelen, werden 4 cilinders bevestigd op een konijnen schedel met titanium schroeven en gevuld met botsubstituten. Na euthanasie (12 weken) werden cilinders verwijderd vóór fixatie en histologische verwerking. A) Masson-Goldner kleuring (50x): botsubstituut verschijnt als mauve deeltjes omgeven door nieuw bot in het groen. B) de schijfjes werden gescand en verwerkt voor digitale extractie van botsubstitueer materiaal, zodat het nieuwe bot (rood) gemakkelijk kon worden gekwantificeerd. C) IMMUNOKLEURING van CD31 (pijlen), een typische marker van endotheliale cellen en het neovascularisatie proces. D) immunofluorescentie kleuring (groen) van een zeer neovascularized zone waarin enkele nieuwe capillairen zeer Express CD31 (Arrow). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het model dat hierin wordt beschreven is eenvoudig en moet vrij gemakkelijk worden ontwikkeld, zolang alle stappen worden gevolgd en de apparatuur geschikt is. Aangezien het beschreven protocol een chirurgische methode is, worden alle stappen kritisch weergegeven en moeten ze goed worden opgevolgd. Het is van cruciaal belang om te worden getraind voor dierproeven, vooral in de behandeling van konijnen en anesthesie. Aarzel niet om professionele anesthesist en veterinaire hulp te vragen. Het is van cruciaal belang om te aandringen op de dagelijkse visuele controle van dieren vóór en na het verwijderen van de hechting. Zelfs als de huid van de schedel dik, overvloedig en los is, induceert de fixatie van de cilinders grote spanningen. Als de hechtingen te vroeg worden verwijderd, kan de wond opnieuw worden geopend en is er nog een week van hechten en een nieuwe antibioticumbehandeling nodig. In het geval van dehiscentie uit de wond lijn, zal de chirurg moeten overwegen of het niet mogelijk is om te sueren. Zo niet, dan moet een monster afwijzing worden overwogen.
Naast de kritieke stappen die worden beschreven in de sectie Protocol, kunnen de onderstaande gegevens nuttig zijn bij de juiste uitvoering van dit protocol. Vanuit technisch oogpunt, aangezien de konijnen jong en klein zijn, is het belangrijk om een intubatie in twee stappen te gebruiken, zoals beschreven in het protocol. De tweede (en laatste) buis is te groot om te worden gebruikt in eerste intubatie, en er is een reëel risico van "verkeerde manier" die kan worden schadelijke of zelfs fataal.
Afhankelijk van de geteste materialen kan het interessant zijn om een vers bloedmonster van de reeds geplaatste ear IV-lijn te nemen. Dit zou een goede methode kunnen zijn om het botsubstituut materiaal met natuurlijke cellen en groeifactoren vooraf te insmelten. Vers gecoaguleerd bloed kan ook een ideaal schijn monster bieden.
De manier waarop de intramedullaire gaten worden geboord moet zeer nuttig zijn voor toekomstige histologische verwerking en histomorphometrical-analyse. In feite, zolang de gaten zijn (i) op dezelfde locatie, (II) de biopsieën zijn vergelijkbaar georiënteerd en (III) het snijproces is gestandaardiseerd (d.w.z. dezelfde dikte, hetzelfde snijniveau), de velden die worden geëvalueerd zijn gelijkwaardig en hun vergelijking is zeer Relevante. Als een kwestie van standaardisatie, kan het van reëel belang zijn om de volume hoeveelheid van het materiaal om de cilinder te vullen te kalibreren, en om het vooraf op een steriele manier voor te bereiden.
Vanuit wetenschappelijk oogpunt, afhankelijk van de producten of hypothese getest, het kan belangrijk zijn om te voorkomen dat het plaatsen van de cilinders op bot hechtingen. Er zijn enkele specifieke stamcellen aanwezig in deze structuren35, verschillend van de mesenchymale stamcel cellen die betrokken zijn bij de mechanismen van intramembraneuze ossificatie, d.w.z. het botregeneratie proces dat zich voordoet in het orofaciaal gebied. Daarom kan een echte bias optreden in geval van misplacement.
Een van de belangrijkste voordelen van het calvarial-model is het gebruik van een levende microtomografie waarmee de botgroei op één dier kan worden gevolgd als een longitudinaal onderzoek. Deze strategie kan het aantal geëraliseerde dieren grotendeels verminderen en respecteert daarom de "3R-regel"36. Afhankelijk van de gebruikte microtomograaf apparaat (resolutie, ruimte beschikbaar voor het dier), variaties zullen optreden in termen van de strategie van de anesthesie (IV, gas, enz.), evenals in de beeldresolutie en de relevantie van de resulterende analyse.
We gebruiken routinematig een microtomograaf gewijd aan dier experimenten (bijv. Quantum GX) voor routinematige controles. Een typisch experiment begint met een sedatie, zoals beschreven in stap 2.3.1. Anesthesie wordt vervolgens onderhouden met 2% Isofluraan in zuivere zuurstof. Hierdoor kan het dier rustig ademen tijdens een scantijd van ongeveer 14 min (99 kV/88 μA met een resolutie van 20 μm); Dit is voldoende voor het controleren van fundamentele parameters (engraftment, cilinder fixatie, semikwantitatieve analyse van de botgroei, enz.). Bij het zoeken naar een precieze kwalitatieve en kwantitatieve analyse, is een zeer fijnafstelling van de scantijd, resolutie, anesthesie en dieren positionering nodig.
Bestaande modellen ontwikkeld voor de groente van osteoconductie, osteogenesis, osteoinductie evenals vasculogenesis, zijn talrijk, vooral in het orofaciale veld. Omwille van ethische en economische overwegingen zal ons doel beperkt zijn tot konijnen of kleinere dieren. Naast de schedel zijn de plaatsen waar het materiaal kan worden getest de mandibulla37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47, de opvulling48 of de incisieve Sockets (na tanden extractie)49,50,51. Voor elk van de hieronder beschreven modellen mogen ratten, muizen, cavia's en konijnen worden gebruikt. Kort, een kritisch defect wordt geboord (of een socket wordt gemaakt door insnijding van de extractie), gevuld met het materiaal monster en vervolgens bedekt met een membraan. Afgezien van het voor de hand liggende feit dat slechts twee monsters op elk van deze locaties kunnen worden getest (één monster per mandibele zijde of per incisieve socket), zijn de chirurgische ingrepen ook grotendeels moeilijker en invasief. Toegangen tot de site zijn beperkt en als men rat of muizen gebruikt, wordt de moeilijkheidsgraad verder verhoogd door de grootte van de dieren. Ten slotte is de kritieke grootte van de defecten (d.w.z. dimensies die geen spontane botregeneratie toelaten) niet goed gedefinieerd en varieert van het ene dier tot het andere.
Naast deze algemeenheden kunnen specifieke beperkingen ontstaan afhankelijk van de anatomische locatie die aan het defect is onderworpen en aan de daaropvolgende analyse. Als voorbeeld, in het mandibulaire model, zijn tanden wortels aanwezig binnen het defect. Dit kan het materiaal verstoren en het botregeneratie proces wijzigen. Het defect kan worden geplaatst meer distale op de Ramus, maar in dat geval, het bot zou zeer dun (twee corticals aangebracht met een extreem dunne medullaire ruimte) en het resulterende defect volume kan te klein zijn45,46, 47. gezien deze voorbeelden van beperkingen en afhankelijk van het model, kunnen grote afwijkingen worden verwacht met betrekking tot het te testen materiaal volume, de kwaliteit en de hoeveelheid verzamelde gegevens.
Aangezien de evaluatie van een materiaal een maximale standaardisatie en kalibratie vereist, lijkt het calvarial-model ideaal. De toegang is zeer eenvoudig, kalibratie en standaardisatie worden vergemakkelijkt door het gebruik van gedefinieerde cilinders en 4 monsters kunnen tegelijkertijd worden beoordeeld. Bovendien kan Live tomografie worden gebruikt en tot slot kan worden voorzien in een grote afname van de te euthande dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs zijn dank verschuldigd aan Geistlich AG (Wolhusen, CH) en de osteologie Stichting (Luzern, CH) (Grant n ° 18-049) voor hun steun, evenals Global D (BRIGNAIS, FR) voor het leveren van de schroeven. Een bijzondere dank gaat uit naar Dr. B. Schaefer van Geistlich. We zijn ook Eliane Dubois en Claire Herrmann dankbaar voor hun uitstekende histologische verwerking en hun kostbare adviezen. Ten slotte erkennen we van harte Xavier Belin, Sylvie Roulet en het hele team van PR Walid Habre, "experimentele chirurgie dpt", voor hun opmerkelijke technische assistentie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs | |||
| Enrofloxacine Baytril 10% | Bayer | Antibiotic | |
| Fentanyl | Bischel | For analgesia | |
| Ketalar 50mg/ml | Pfizer | Ketamine for anesthesia | |
| Lidohex | Bichsel | Lubricating gel for the eyes | |
| Opsite | Smith and Nephew | 66004978 | Sprayable dressing |
| Povidone iodine 10%, Betadine | Mundipharma | anti-infective agent | |
| Propofol 2% | Braun | 3538710 | For anesthesia |
| Rapidocain 2% | sintetica | Local anesthesia | |
| Ringer-acetate | Fresenius Kabi | Volume compensation | |
| Rompun 2% | Bayer | Xylazin for anesthesia | |
| Sevoflurane 5% | Abbvie | For anesthesia | |
| Sterile saline | Sintetica | ||
| Temgesic | Reckitt Benckiser | Buprenorphine hydrochloride, analgesia | |
| Thiopental Inresa | Ospediala | For anesthesia | |
| Xylocaine 10% spray | Astra Zeneca | For intubation | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Fresenius Vial pilot C | Imexmed | Infusion pump | |
| Heated pad | Harvard Apparatus | ||
| Suction dominant 50 | Medela | ||
| Suction tubing Optimus | Promedical | 80342.2 | |
| Surgical motor | Schick dental | Qube | Drilling of intramedullary holes |
| Ventilation | Maquet Servo1 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Cylinders and caps | Boutyplast | Customized | composition: PEEK (poly ether ether ketone) |
| Manual self-retaining shaft | GlobalD | ACT1K | |
| Mobile handle for self-retaining shaft | GlobalD | MTM | |
| Self- drilling screws | GlobalD | VA1.2KL4 | cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tray | |||
| Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm | Covidien | 86233 | For intubation |
| Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm | Covidien | 107-35G | For intubation |
| Ethicon prolene 4-0 | Ehticon | 8581H | Non-resorbable suture |
| Forceps | Marcel Blanc | BD027R | 145 mm |
| Intubation catheter | Cook medical | Guide for intubation | |
| Needlle holder | Marcel Blanc | BM008R | |
| Needles BD Microlance3 | Becton Dickinson | 300300/304622 | 26G; 18G |
| Periosteal | HU-Friedy | P9X | |
| Round surgical burs | Patterson | 78000 | 0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes |
| Scalpel | Swann-Morton | n°10 and n°15 | |
| Scissors | Marcel Blanc | 00657 | 180 mm |
| Syringes Omnifix | Braun | 4616057V | 5ml, 10ml and 50ml |
| Venflon G22 | Braun | 42690985-01 | Vasofix safety for the ear iv line |
References
- Anderud, J., et al. Guided bone augmentation using a ceramic space-maintaining device. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology and Oral Radiology. 118 (5), 532-538 (2014).
- Lundgren, A. K., Lundgren, D., Hammerle, C. H., Nyman, S., Sennerby, L. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone. Clinical Oral Implants Research. 11 (2), 99-106 (2000).
- Lundgren, D., Lundgren, A. K., Sennerby, L., Nyman, S. Augmentation of intramembraneous bone beyond the skeletal envelope using an occlusive titanium barrier. An experimental study in the rabbit. Clinical Oral Implants Research. 6 (2), 67-72 (1995).
- Slotte, C., Lundgren, D. Impact of cortical perforations of contiguous donor bone in a guided bone augmentation procedure: an experimental study in the rabbit skull. Clinical Implant Dentistry and Relat Research. 4 (1), 1-10 (2002).
- Tamura, T., et al. Three-dimensional evaluation for augmented bone using guided bone regeneration. Journal of Periodontal Research. 40 (3), 269-276 (2005).
- Yamada, Y., et al. Correlation in the densities of augmented and existing bone in guided bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 23 (7), 837-845 (2012).
- Chierico, A., et al. Electrically charged GTAM membranes stimulate osteogenesis in rabbit calvarial defects. Clinical Oral Implants Research. 10 (5), 415-424 (1999).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of the permeability of shields with autologous bone grafts on bone augmentation. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (6), e386-e392 (2013).
- Ito, K., Nanba, K., Murai, S. Effects of bioabsorbable and non-resorbable barrier membranes on bone augmentation in rabbit calvaria. Journal of Periodontology. 69 (11), 1229-1237 (1998).
- Lee, Y. M., et al. Enhanced bone augmentation by controlled release of recombinant human bone morphogenetic protein-2 from bioabsorbable membranes. Journal of Periodontology. 74 (6), 865-872 (2003).
- Fugl, A., et al. S-nitroso albumin enhances bone formation in a rabbit calvaria model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 43 (3), 381-386 (2014).
- Ikeno, M., Hibi, H., Kinoshita, K., Hattori, H., Ueda, M. Effects of self-assembling peptide hydrogel scaffold on bone regeneration with recombinant human bone morphogenetic protein-2. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 28 (5), e283-e289 (2013).
- Ito, K., et al. Effects of ipriflavone on augmented bone using a guided bone regeneration procedure. Clinical Oral Implants Research. 18 (1), 60-68 (2007).
- Jung, R. E., Hammerle, C. H., Kokovic, V., Weber, F. E. Bone regeneration using a synthetic matrix containing a parathyroid hormone peptide combined with a grafting material. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 22 (2), 258-266 (2007).
- Minegishi, T., et al. Effects of ipriflavone on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvaria. Journal of Oral Science. 44 (1), 7-11 (2002).
- Moussa, M., et al. Medium-Term Function of a 3D Printed TCP/HA Structure as a New Osteoconductive Scaffold for Vertical Bone Augmentation: A Simulation by BMP-2 Activation. Materials. 8 (5), 2174-2190 (2015).
- Thoma, D. S., Kruse, A., Ghayor, C., Jung, R. E., Weber, F. E. Bone augmentation using a synthetic hydroxyapatite/silica oxide-based and a xenogenic hydroxyapatite-based bone substitute materials with and without recombinant human bone morphogenetic protein-2. Clinical Oral Implants Research. 26 (5), 592-598 (2014).
- Busenlechner, D., et al. Resorption of deproteinized bovine bone mineral in a porcine calvaria augmentation model. Clinical Oral Implants Research. 23 (1), 95-99 (2012).
- Busenlechner, D., et al. Paste-like inorganic bone matrix: preclinical testing of a prototype preparation in the porcine calvaria. Clinical Oral Implants Research. 20 (10), 1099-1104 (2009).
- Busenlechner, D., et al. Simultaneous in vivo comparison of bone substitutes in a guided bone regeneration model. Biomaterials. 29 (22), 3195-3200 (2008).
- Carrel, J. P., et al. A 3D printed TCP/HA structure as a new osteoconductive scaffold for vertical bone augmentation. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 55-62 (2016).
- Murai, M., et al. Effects of different sizes of beta-tricalcium phosphate particles on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Dental Materials Journal. 25 (1), 87-96 (2006).
- Nishida, T., et al. Effects of bioactive glass on bone augmentation within a titanium cap in rabbit parietal bone. Journal of Periodontology. 77 (6), 983-989 (2006).
- Nyan, M., et al. Feasibility of alpha tricalcium phosphate for vertical bone augmentation. Journal of Investigating and Clinical Dentistry. 5 (2), 109-116 (2012).
- Polimeni, G., et al. Histopathological observations of a polylactic acid-based device intended for guided bone/tissue regeneration. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 99-105 (2008).
- Polo, C. I., et al. Effect of recombinant human bone morphogenetic protein 2 associated with a variety of bone substitutes on vertical guided bone regeneration in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 84 (3), 360-370 (2013).
- Slotte, C., Lundgren, D., Burgos, P. M. Placement of autogeneic bone chips or bovine bone mineral in guided bone augmentation: a rabbit skull study. International Journal of Oral and Maxillofacial Implants. 18 (6), 795-806 (2003).
- Tamimi, F. M., et al. Bone augmentation in rabbit calvariae: comparative study between Bio-Oss and a novel beta-TCP/DCPD granulate. Journal of Clinical Periodontology. 33 (12), 922-928 (2006).
- Torres, J., et al. Effect of solely applied platelet-rich plasma on osseous regeneration compared to Bio-Oss: a morphometric and densitometric study on rabbit calvaria. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 10 (2), 106-112 (2008).
- Yamada, Y., et al. Angiogenesis in newly augmented bone observed in rabbit calvarium using a titanium cap. Clinical Oral Implants Research. 19 (10), 1003-1009 (2008).
- Cordaro, L., Terheyden, H. ITI Treatment Guide. Wismeijer, D., Chen, S., Buser, D. 7, Quintessence. (2014).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: A review. European Cells & Materials. 13, 1-10 (2007).
- Min, S., et al. Effects of marrow penetration on bone augmentation within a titanium cap in rabbit calvarium. Journal of Periodontology. 78 (10), 1978-1984 (2007).
- Braun, T. M. Ch. 4. Osteology guidelines for oral and maxillofacial regeneration Preclinical models for translational research. Giannobile, W. V., Nevins, M. , Quintessence publishing. 31-43 (2011).
- Doro, D. H., Grigoriadis, A. E., Liu, K. J. Calvarial Suture-Derived Stem Cells and Their Contribution to Cranial Bone Repair. Frontiers in Physiology. 8, 956 (2017).
- Russel, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. , Universities Federation for Animal Welfare. (1959).
- Asvanund, P., Chunhabundit, P. Alveolar bone regeneration by implantation of nacre and B-tricalcium phosphate in guinea pig. Implant Dentistry. 21 (3), 248-253 (2012).
- Gielkens, P. F., et al. Gore-Tex as barrier membranes in rat mandibular defects: an evaluation by microradiography and micro-CT. Clinical Oral Implants Research. 19 (5), 516-521 (2008).
- Lioubavina, N., Kostopoulos, L., Wenzel, A., Karring, T. Long-term stability of jaw bone tuberosities formed by "guided tissue regeneration". Clinical Oral Implants Research. 10 (6), 477-486 (1999).
- Mardas, N., Kostopoulos, L., Stavropoulos, A., Karring, T. Osteogenesis by guided tissue regeneration and demineralized bone matrix. Journal of Clinical Periodontology. 30 (3), 176-183 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Mardas, N., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone used as an adjunct to guided bone augmentation: an experimental study in the rat. Clinical Implant Dentistry and Related Research. 3 (3), 156-165 (2001).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Deproteinized bovine bone (Bio-Oss) and bioactive glass (Biogran) arrest bone formation when used as an adjunct to guided tissue regeneration (GTR): an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 30 (7), 636-643 (2003).
- Stavropoulos, A., Kostopoulos, L., Nyengaard, J. R., Karring, T. Fate of bone formed by guided tissue regeneration with or without grafting of Bio-Oss or Biogran. An experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 31 (1), 30-39 (2004).
- Stavropoulos, A., Nyengaard, J. R., Kostopoulos, L., Karring, T. Implant placement in bone formed beyond the skeletal envelope by means of guided tissue regeneration: an experimental study in the rat. Journal of Clinical Periodontology. 32 (10), 1108-1115 (2005).
- Thomaidis, V., et al. Comparative study of 5 different membranes for guided bone regeneration of rabbit mandibular defects beyond critical size. Medical Science Monitor. 14 (4), (2008).
- Zhang, J. C., et al. The repair of critical-size defects with porous hydroxyapatite/polyamide nanocomposite: an experimental study in rabbit mandibles. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 39 (5), 469-477 (2010).
- Zhang, X., et al. Osteoconductive effectiveness of bone graft derived from antler cancellous bone: an experimental study in the rabbit mandible defect model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 41 (11), 1330-1337 (2012).
- Bronoosh, P., et al. Effects of low-intensity pulsed ultrasound on healing of mandibular bone defects: an experimental study in rabbits. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 277-284 (2015).
- Gomes, F. V., et al. Low-level laser therapy improves peri-implant bone formation: resonance frequency, electron microscopy, and stereology findings in a rabbit model. International Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 44 (2), 245-251 (2014).
- Lalani, Z., et al. Spatial and temporal localization of secretory IgA in healing tooth extraction sockets in a rabbit model. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 62 (4), 466-472 (2004).
- Osorio, L. B., et al. Post-extraction evaluation of sockets with one plate loss--a microtomographic and histological study. Clinical Oral Implants Research. 27 (1), 31-38 (2014).
