Bioengineering

מודל calvarial של הגדלת עצם בארנב להערכת צמיחת העצם ונינובאסקולריזציה בחומרים החלפת עצם

Published: August 13, 2019 doi: 10.3791/59976

Laurine Marger¹, Antonio Barone², Carla P. Martinelli-Kläy³, Leandra Schaub¹, Malin Strasding⁴, Mustapha Mekki¹, Irena Sailer⁴, Susanne S Scherrer¹, Stéphane Durual¹

¹Division of Fixed Prosthodontics and Biomaterials, Biomaterials Laboratory, University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, ²Department of Surgery, Division of Oral and Maxillofacial Surgery (HUG), Unity of Oral Surgery and Implantology, University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, ³Department of Surgery, Division of Oral and Maxillofacial surgery (HUG), Laboratory of Oral & Maxillofacial Pathology, University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine, ⁴Division of Fixed Prosthodontics and Biomaterials, University of Geneva, University Clinic of Dental Medicine

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כירורגי ארנבים עם המטרה להעריך חומרים החלפת עצם במונחים של יכולות התחדשות העצם. על-ידי שימוש בגלילים הצצה הקבועים על גולגלות הארנבים, האוסטאופהלוגיה, אוסטורגנזה, אוסטג'נסיס וביוקולוגנזה הנגרמת על ידי החומרים עשויים להיות מוערכים על בעלי חיים חיים או מורדמים.

Abstract

העיקרון הבסיסי של מודל כיפת ארנב הוא לגדל רקמת עצם חדשה אנכית על גבי החלק של קליפת המוח של הגולגולת. מודל זה מאפשר הערכה של חומרים החלפת עצם עבור התחדשות העצם אוראלי הגולגולת במונחים של צמיחת העצם ו ניאוואסקולריזציה תמיכה. לאחר בעלי חיים הם מורדם ומאוורר (אנציקנה צנרור), ארבעה צילינדרים עשוי פוליאטר אתר קטון (מבט חטוף) הם דפקו על הגולגולת, משני צידי החציון ותפרים ילתית. חמש החורים הפנימי הם קדח בתוך אזור העצם מופרדים על ידי כל גליל, המאפשר זרם של תאים מח עצם. דגימות החומר ממוקמות לתוך הצילינדרים שנסגרו לאחר מכן. לבסוף, האתר הכירורגי משמים, ובעלי חיים הם להתעורר. צמיחת עצם עשויה להיות מוערך על חיות חיים באמצעות microtomography. לאחר בעלי חיים מורדמים, צמיחה עצם ו ניאוואסקולריזציה ניתן להעריך באמצעות microtomography, היסטולוגיה-החיסונית ו immunofluorescence. כאשר הערכה של חומר דורשת סטנדרטיזציה מקסימלית וכיול, מודל כיפת מופיע אידיאלי. Access קל מאוד, כיול וסטנדרטיזציה הם הקלה על ידי שימוש של צילינדרים מוגדרים ארבע דגימות ניתן להעריך בו. יתרה מזאת, ניתן להשתמש בטומוגרפיה חיה ובסופו של דבר ירידה גדולה בבעלי חיים מורדמים.

Introduction

מודל כיפת של הגדלת העצם פותחה בשנת 90 עם המטרה כדי לייעל את הרעיון של התחדשות עצם מודרך (gbr) בתחום כירורגי אוראלי הגולגולת. העיקרון הבסיסי של המודל הזה הוא לגדל רקמת עצם חדשה אנכית על גבי החלק של קליפת המוח של הגולגולת. כדי לעשות זאת, כור (למשל, טיטניום כיפה,-גליל או כלוב) הוא קבוע על הגולגולת כדי להגן על התחדשות העצם שנערך על ידי השתל (למשל, הידרוג'ל, עצם תחליף, וכו '). בעזרת מודל זה, טיטניום או כלובים קרמיים¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶, ממברנות gbr⁷^,⁸^,⁹ ^,¹⁰, גורמים אוסטגניים¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷, עצם חדש מחליפים¹²^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²^,²³ ^, בת ²⁴ ^, מיכל בן ²⁵ ^, מיכל בן ²⁶ ^, בן ²⁷ ^, מיכל בן ²⁸ ^, ²⁹ או המנגנון של ניאוואסקולריזציה במהלך תהליך התחדשות העצם³⁰ העריכו.

מנקודת מבט טרנסלבית, מודל הקאלוריון מייצג פגם בקיר אחד שניתן להשוותו לפגם בדרגה הרביעית בלסת³¹. המטרה היא לגדל עצם חדש מעל אזור קורטיקלית, ללא תמיכה לרוחב של קירות עצם אנדוגניים. המודל הוא ולכן מחמיר מאוד ומעריך את הפוטנציאל האמיתי של אוסטאנהולכה אנכית על החלק הקורטיקלי של העצם. אם המודל המתואר בזאת מוקדש בעיקר להערכת האוסטאופת בתחליפי עצמות, ניתן להעריך גם אוסטגנזה ו/או אוסטיואינדוקציה, כמו גם ואסיקולוגנזה¹^,²^,³^, ⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹,¹²,¹³ ^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²² ^,²³^,²⁴,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹^,³⁰.

למעשה עבור מסיבות אתיות, מעשיות וכלכליות, מודל כיפת פותחה בארנב שבו חילוף החומרים ומבנה העצם הם רלוונטיים בהשוואה לאדם³²אנושי. של 30 ההפניות המצוטטות לעיל, 80% השתמשו במודל הארנב¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷,⁸ ^,⁹^,¹⁰,¹¹^{, 12}^,¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁷^,²², ²³^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹,³⁰^,³³, ובכך מדגימים את הרלוונטיות של דגם בעל חיים זה. בשנת 2008, הקבוצה של בוסקנר העבירה את מודל כיפת לחזיר, כדי לאפשר השוואה של שמונה תחליפי עצמות בו זמנית²⁰ (בהשוואה לשתי תחליפי עצמות עם הארנב). מצד שני, הקבוצה שלנו העבירה את המודל הקלוריון של הארנב לכבשים. בקצרה, כיפות טיטניום הונחו על גולגלות כבשים כדי לאפיין את אוסטאנההולכה של תחליף העצם המודפס החדש 3D. מחקרים אלה אפשרו לנו לפתח ולשלוט במודל הקלוריון ובניתוח¹⁶^,²¹.

שלושת המחקרים האחרונים ציינו¹⁶^,²⁰^,²¹, יחד עם מספר חקירות נוספות¹²^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²², ²³,²⁴^,²⁶^,²⁷^,²⁸,²⁹, אישר את הפוטנציאל הגדול של מודל כיפת כהקרנה ואפיון ודל. עם זאת, למרות שהתוצאות התקבלו היו די מספקות, הם גם הצביעו על כמה מגבלות: (1) השימוש של כיפות טיטניום, אשר מנעו דיפוזיה רנטגן ו בתורו חי מיקרו-CT שימוש. אלה לא ניתן להסיר לפני עיבוד היסטולוגית, לאלץ את החוקרים להטביע את הדגימות ב-שרף (מתיל מתיונין) (PMMA). לפיכך, הניתוחים שהתקבלו היו מוגבלים במידה רבה לטופוגרפיה. (2) עלויות פיננסיות גבוהות במיוחד בשל העלות של בעלי החיים, והעלויות הקשורות ללוגיסטיקה, אחזקה וניתוח בעלי החיים. (3) קשיים להשיג אישורים אתיים לבעלי חיים גדולים.

מחקר שנערך לאחרונה על ידי פולו, ואח '²⁶ שיפרה במידה רבה את המודל על הארנב. כיפות טיטניום הוחלפו על ידי צילינדרים קלובל כי יכול להיות מלא בנפח קבוע של חומר. ארבעה מהצילינדרים האלה. הושמו על גולגולות ארנבים בסיום, ניתן להסיר את הגלילים כך שביופסיות יהיו חופשיות מתכת, המציגים גמישות רבה יותר בנוגע לעיבוד המדגם. מודל כיפת הארנב הפך אטרקטיבי עבור בדיקות סימולטני עם עלויות נמוכות יותר, בעלי חיים קלים טיפול והקלה על עיבוד לדוגמה. ניצול ההתפתחויות האחרונות, יש לנו שיפור נוסף המודל על ידי החלפת טיטניום עם מבט לייצר צילינדרים, ובכך לאפשר דיפוזיה רנטגן ושימוש microtomography על חיות חיים.

במאמר זה, ניתן לתאר את תהליכי ההרדמה וניתוח ולהראות דוגמאות של תפוקות שניתן להשיג באמצעות פרוטוקול זה, כלומר, (אימונו-) היסטולוגיה, histomorphometry, לחיות ולשעבר vivo מיקרוטומוגרפיה כדי להעריך את מנגנוני העצם התחדשות ומכמת את סינתזה העצם החדש נתמך על ידי חומרים תחליף עצם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

בקנה אחד עם דרישות משפטיות שוויצריות, הפרוטוקול אושר על ידי ועדה אקדמית ובפיקוח על ידי סוכנויות וטרינרי הפדרלי של הקנטונים (האישורים n ° GE/165/16 ו-GE/100/18).

1. התקנים ובעלי מפרט ספציפיים

צילינדרים
1. צילינדרים מכונות עם כרטיסיות ייצוב לרוחב מתוך הצצה יש קוטר פנימי של 5 מ"מ, קוטר החיצוני של 8 מ"מ גובה של 5 מ"מ (איור 1).
2. מכונת הצצה עם עיצוב המאפשר חיתוך בדיוק על החלק העליון של גליל (עובי 1 מ"מ).
3. לעקר צילינדרים הצצה וכובעים על ידי אוטוקלינג לפני הניתוח.
ברגים
1. השימוש עצמית קידוח מיקרו ברגים (עשוי טיטניום טהור מסחרי (כיתה 5)) כדי לתקן את צילינדרים (1.2 מ"מ קוטר, 4 מ"מ אורך). לחטא על ידי אוטוקלינג. לפני הניתוח
חיות
1. רכישת שלושה חודשים-בן ניו זילנד לבן ארנבים (זכר או נקבה), שוקל ~ 2.5 ק ג כל אחד.
  הערה: הצלחנו להשיג ארנבים באמצעות הרבייה באוניברסיטת ז'נבה.

2. כירורגיה

מגש כירורגי
1. לשמור על אזמל, מספריים, שני מלקחיים, מעלית הקרום, מזרקים (1, 2, 5, 50 mL), כירורגי מנוע, עגול כירורגי burs (0.8 מ"מ קוטר), מחטים, תמיסת מלח סטרילי, ארבעה צילינדרים, שמונה ברגים, ו מברג מוכן.
טיפול טרום-קליני
1. Acclimate את החיות שבוע לפני הניתוח.
2. לספק אנטיביוטיקה מניעתי יומית (5 – 10 מ"ג/ק"ג לפי פה (PO)) החל 2 h לפני הניתוח עד 3 ימים לאחר הניתוח.
הרדמה וצנרור
1. הרגעה בעלי חיים על ידי הזרקה (IM) הזרקת של קטמין (25 מ"ג/ק"ג, 50 mg/mL, 0.5 mL/ק"ג) + xylazin (3 מ"ג/ק"ג, 20 מ"ג/mL, 0.15 מ ל/ק"ג). לחכות ~ 20 דקות לחיות לישון
  עמוק (atony שרירי להשלים).
  הערה: תרופות מקדימות אלה יאפשרו תהליך של צנרור פשוט, מהיר ונטול כאבים. כאבים עמוקים והרדמה נגרמת כמתואר בשלב 2.3.8.
2. הניחו צינורית ורידי לתוך הווריד השולי מהאוזן ושמרו אותה סגורה עד להשלמת הצנרור.
  הערה: קו IV זה ישמש לעשות פנטניל ולהצעת משככי כאבים עמוקים והרדמה, בהתאמה (ראה שלב 2.3.8).
3. לשמור על ההרדמה על ידי אספקת 5% סבלאנה חמצן טהור עד הצנרור מבוצע.
  הערה: שלב זה הכרחי רק אם בעל החיים מראה סימנים של התעוררות (תנועות עיניים, התכווצויות שרירים).
4. . על-ידי ריסוס של 10% לידוקאין מניחים את הארנב בתנוחה מועדת ושומרים על ראשו בשלוחה אנכית.
5. החלק את הצינור האנדוקנה הראשון של קוטר קטן (2.5 מ"מ) לתוך קנה הנשימה של הארנב עד שניתן יהיה לשמוע את זרימת האוויר בשפופרת. זה יפתח את הגרון ויקל על החדרת הצינור הסופי.
6. הוסף מדריך (קטטר צנרור) בצינור כדי לתקן את המיקום של הצינור לתוך קנה הנשימה. הסר את שפופרת בקוטר קטן להחליק את צינור האנדוקנה הסופי (4.9 מ"מ) על המדריך.
7. הסר את המדריך ולנפח את הבלון בסוף הצינור האנדוקנה כדי לאטום ולחסום את המכשיר לתוך קנה הנשימה. הצינורית תישאר במקומה, אך היא עשויה להיות מאובטחת באמצעות תחרה הקשור סביב המצח. מייד האוויר (7 מ"ל/ק"ג, תדירות של 40/דקות) בעל החיים עם 3% סבלאנה בחמצן טהור.
8. באופן רציף (וריד האוזן) פנטניל (0.01 mg/mL, 2 – 4 מ"ל/h) כדי לגרום לחוסר כאבים, 2 – 4 מ"ג/ק"ג של (2%) ההצעת (20 מ"ג/mL, 4 – 8 מ ל/ח) כדי לגרום להרדמה, ו 4 מ ל/ק"ג/h של אצטט של צלצול לשמור על iso-נפחי תנאים.
9. . מניחים לווין בטמפרטורה רקטלית כמו כן, לפקח על תפקוד הלב, טמפרטורה ורווית חמצן במהלך התהליך כולו.
10. שלוט בעומק ההרדמה על ידי ניטור הנשימה האוטונומית; אם בעל החיים מראה סימנים של נשימה אוטונומית, מוותר על מנת להיפטר ממנה קטנה של הסדר והפנטניל.
הכנת האתר
1. מניחים את הארנב על משטח מחומם (39 ° c) מכוסה על ידי כרית מזרן (כדי למנוע כוויות) על שולחן הניתוח. . תגלח את הקרקפת
2. החלת ג'ל סיכה על העיניים כדי למנוע גירוי ויובש. לחטא את האתר על ידי קרצוף העור עם יוד povidone (10%). ואז לעטוף את הארנב עם העטוף כירורגי סטרילי לחתוך את אזור הגישה לגולגולת.
3. לחטא את האתר כירורגי עם יוד povidone (10%) בפעם השנייה החלת ג'ל סיכה על העיניים כדי למנוע גירוי ויובש.
4. הכינו שולחן עטוף (עטוף סטרילי) שעליו למקם את המגש הכירורגי המלא.
פתיחת אתר כירורגי
1. להרדמה מקומית עם הזרקת תת עורית (SC) של לידוקאין 2% (1 mL) על הגולגולת.
2. מעבר דרך העור (עם אזמל) לאורך קו משונן כיפת, מן המסלולים לכיוון העורף החיצוני (~ 4 ס מ אורך). ודא כי הקרום מונצח.
3. העלה בעדינות את הקרום (עם מעלית הקרום) משני צידי החתך. שטפו את האתר בתמיסת מלח סטרילית.
מיקום צילינדר
1. אתר את התפר החציוני ואת התפרים הקורואליות על הגולגולת (איור 2A, B). שימו לב כי קווים אנטומיים אלה יוצרים צלב. הגלילים ימוקמו בכל אחד מהרביעים המוגדרים על ידי הצלב, ויבטיח ששולי הגליל לא יהיו מעל לתפר (איור 2C).
2. מניחים את הגליל הראשון על הרביע העליון השמאלי (העצם הקדמית שמאל), ולנסות להניח את המכשיר שטוח. לתקן את המיקום עם לחץ ידיים חזק להרוס מיקרו בורג, עד התנגדות הוא הרגיש. ודא שראש הבורג מיושר עם פני השטח של לשונית הצילינדר.
3. חזור על אותו ההליך בכרטיסיה האחרת כדי לתקן את הצילינדר בחוזקה על הגולגולת. ודא כי הצילינדר הוא רמטית קבוע לעצם.
4. חזור על ההליך ברבעון העליון הימני (עצם הקדמית הימנית), הרבעון התחתון השמאלי (עצם הקודקוד השמאלי) והחלק הימני התחתון (עצם הקודקוד הימני).
קידוח עצם של 5 חורים מתוך מדולרי באזור להקיף את צילינדרים (איור 1)
1. מקדחה חור מתוך מדולרי תחת השקיה מלוחים (0.8 מ"מ בקוטר, ~ 1 מ"מ לעומק) עם סיבוב מעוגל על העצם, במרכז האזור להקיף את הגליל. ודא שהדימום מופיע.
2. לקדוח שני חורים למטה עוד מדולרי לאורך הציר עובר דרך שני ברגים כרטיסיה, בקצוות הפנימיים של הצילינדר. לאורך הגרזן הניצב, לקדוח שני חורים יותר מתוך מדולרי בקצוות הפנימיים של הגליל. ודא שהדימום מופיע.
3. חזור על הפעולה בתוך שלושת הצילינדרים האחרים.
מילוי צילינדרים בדגימות חומר וסימתי (איור 3)
1. הכן את חומר תחליף העצם הרצוי על פי הוראות היצרן או מפרט חומרים.
2. ממלאים את הצילינדר הראשון עד הסוף עם דגימת החומר ולסגור את הגליל על ידי התאמת כובע. חזור על התהליך ב 3 צילינדרים אחרים.
סגירת אתר כירורגית
1. סגרו את העור מעל הצילינדרים עם תפר שאינו נספג לסירוגין.
2. למרוח תחבושת על הפצע.

3. טיפול לאחר ניתוח

הפסיקו את המחסור בחוסר כאבים ובהרדמה (מעצר הרדמה ופנטניל) ובדקו את ההתאוששות של הנשימה האוטונומית.
הפסיקו את האוורור ברגע. שהחיה התאוששה מנשימות אוטונומיות שמרו על החיה תחת חמצן טהור לפני התעוררות מוחלטת.
הכנס בופרנורפין הידרוכלוריד SC (0.02 מ"ג/ק"ג, 0.03 mg/mL, 0.67 mL/ק"ג) ולחזור על הזריקה כל 6 h עבור 3 ימים כאבים שלאחר ניתוח.
להעביר את החיה לתוך הדיור הרגיל שלה עם מים והאכלה מלאה.
להסיר את התפרים לאחר כ 10 ימים של ריפוי בפצע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

המודל המתואר להלן מוקדש להערכת אוסטאליה בתחליפי עצמות. אוסטגנזה ו-או אוסטד של תחליפי עצם או (טרום) תאית או טעון עם מולקולות אקטיביים יכול להיות גם מוערך, כמו גם vasculogenesis¹^,²^,³^,⁴^, מיכל ⁵ ^, מיכל בן ⁶ ^, מיכל ^סבן ^, בן שמונה ^, מיכל בן ¹⁰ ^, מיכל ^עשור ^, מיכל בן ¹¹ ^, מיכל ^{בן 12} ^, מיכל ^{בן 13} ^, מיכל ^{בן 14} ^, מיכל ^{בן 15} ^, מיכל ^{בן 16} ^, מיכל ^{בן 17} ^, מיכל ^{בן 18} ^, מיכל ^{בן 19} ^, מיכל בן ²⁰ ^, מיכל ^{בן 21} ^, מיכל בן ²² ^, מיכל בן ²³ ^, בת ²⁴ ^, מיכל בן ²⁵ ^, מיכל בן ²⁶ ^, בן ²⁷ ^, מיכל בן ²⁸ ^, בן ²⁹ ^, ³⁰. מחקר קינטי ניתן להשתמש, מ 3 ימים עד 3 חודשים לאחר הניתוח בהתאם המנגנונים ו פלטי לניתוח. ציר זמן קלאסי המאפשר תיאורים בתחילת ובאמצע הזמן הוא: 2, 4, 6, 8 ו 12 שבועות. שים לב כי מינימום של 6 דגימות לכל נקודת זמן היא חובה כדי לקבל תוצאות משמעותיות. כל דוגמה שיש לבדוק צריכה להיות ממוקמת לפחות פעם אחת בכל תנוחה על הגולגולת לכל נקודת זמן (הקצאה אקראית). לבסוף, דגימות דמה (למשל, צילינדרים ממולאים דם תקרש) צריך להיכלל בפרוטוקול³⁴.

לאחר הניתוח הושלם, הגדילה העצם עשוי להיות מפוקח בנקודות זמן שונות על ידי שימוש טומוגרפיה העצם על חיות חיים. דוגמה מוצגת באיור 4A, B. ניתוח נוסף דורש בעלי חיים להיות הקריב (קטלני הזרקה של 150 מ"ג/ק"ג פנטוברביטל (100 mg/mL). לאחר המתת חסד, דגימות מנות וגלילים מוסרים בקפידה (איור 5). ביופסיות מתוקנות עם תמיסה של תמיסת מלח מוזרמת פוספט ו 4% פורמלדהיד. צמיחת עצם עשויה לאחר מכן להיות מוערך באמצעות microtomography (איור 4 C, D). דגימות עשוי גם להיות מעובד עבור (החיסונית-) כתמים היסטולוגית. ניתוח הידברות והסטנומטרים ספציפיים ניתן להשלים את הניתוח באופן ספציפי יותר (איור 6).

איור 1: מפרטים של צילינדרים הצצה. שני חורים (0.8 מ"מ בקוטר) היו קדח על כרטיסיות ייצוב לרוחב על התעסקות. המיקומים של 5 חורים התוך מדולרי (0.8 מ"מ בקוטר) להיות קדח על הגולגולת בתוך האזור המופרד על ידי גליל מסומנים באמצעות עיגולים אדומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: דמות מייצגת של גולגולת הארנב ומיקום הצילינדרים. תמונות המציגות את החציון והתפרים הקורונאליות על גולגולת הארנב משדרות את העצמות הקודקודית הימנית והקדמית (A,B). מיקום הגלילים משני צדי התפרים (C). קנה מידה ברים = 5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: הדמות הנציגה של צילינדרים קבוע, מלא ומלא. תמונה המציגה ארבעה צילינדרים קבוע על הגולגולת של ארנב עם ברגים טיטניום. בתוך האזור מופרד על ידי כל גליל, 5 חורים מתוך מדולרי (0.8 מ"מ בקוטר, ~ 1 מ"מ לעומק) היו קדח תחת השקיה עם סיבוב bur כדי לאפשר הגירה תא עצם. צילינדרים היו מלאים בדגימות תחליף עצם שונות (אמצעי אחסון מכויל) לפני הסגירה (גליל אחד סגור מוצג בלבד). סרגל בקנה מידה = 5 מ"מ. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: הדמויות הייצוגיות מניתוח מיקרוטוקסוגרפיות (micro-CT). עם המטרה הסופית כדי להעריך את הגדילה העצם שנערך על ידי תחליפי עצם, 4 צילינדרים היו קבועים על הגולגולת ארנב עם ברגים טיטניום ממולא בחומרים תחליף עצם. (א) הדמיה חיה: לסרוק רוחבי דו מימדי (14 דקות, 99 kV/88 μa עם רזולוציה של 20 μm) של גליל ב 12 שבועות. (ב) תלת מימדי (3d) שחזור מניתוח מיקרו-CT חיים 4 שבועות (עיגולים אדומים: תחליפי עצם בצילינדרים; החץ האדום: שליטה שבה הצילינדר הוא מלא בדם תקרש). (ג,ד) לאחר המתת חסד (12 שבועות), צילינדרים הוסרו לפני הקיבעון ניתוח מיקרו-CT. (ג) 2d סריקה רוחבי (57 דקות, 99 kV/88 μa עם רזולוציה של 10 μm) של גליל ו-3d-שחזור של העצם החדש הכולל בצילינדר (D). חלקיקים תחליף עצם (אדום), עצם חדש (ירוק) ומיטת העצם (צהוב) מוצגים. קנה מידה ברים = 2 מ"מ לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: תמונות מייצגות של ביופסיה ב 4 שבועות. לאחר המתת חסד (4 שבועות), דגימות היו בלוק ו צילינדרים הוסרו לפני קיבוע 4% formalin, ניתוח מיקרו-CT ועיבוד היסטולוגית. סרגל בקנה מידה = 5mm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: תמונות מייצגות של מקטעים היסטלוגיים (החיסונית-). עם המטרה הסופית כדי להעריך את צמיחת העצם ו ניאוואסקולריזציה שנערך על ידי תחליפי עצם, 4 צילינדרים תוקנו על גולגולת ארנב עם ברגים טיטניום ממולא תחליפי עצם. לאחר המתת חסד (12 שבועות), צילינדרים הוסרו לפני קיבוע ועיבוד היסטולוגית. (א) מכתים מסון-גולדנר (50x): תחליף עצם מופיע כחלקיקים ארגמן מוקף עצם חדש בירוק. (ב) הפרוסות נסרקו ועובדו להפקת דיגיטלי של חומר תחליף עצם, כך שניתן יהיה לכמת את העצם החדש (אדום) בקלות. (ג) חיסוני של CD31 (חיצים), סמן אופייני של תאי האנדותל ואת התהליך neovasבריזציה. (ד) אימונוofor, כתמים (ירוק) של אזור מאוד משופץ שבו כמה נימים חדשים מאוד אקספרס CD31 (חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המודל המתואר בזאת הוא פשוט ויש לפתח בקלות רבה כל עוד הצעדים מיועדים והציוד מתאים. כאשר הפרוטוקול המתואר הוא שיטה כירורגית, כל השלבים נראים קריטיים ויש לעקוב כראוי. זה קריטי להיות מאומן עבור ניסויים בבעלי חיים, במיוחד בטיפול בארנבים והרדמה. אל תהססו לבקש עזרה ההרדמה מקצועית והוטרינר. חשוב להתעקש על הניטור החזותי היומי של בעלי חיים לפני ואחרי הסרת תפר. גם אם העור מהגולגולת עבה, שופע ורופף, קיבעון הגלילים גורם למתחים גדולים. אם התפרים יוסרו מוקדם מדי, הפצע עשוי להיפתח מחדש ידרוש שבוע נוסף של הטיפול באנטיביוטיקה חדש. במקרה של הדחיניות מתוך קו הפצע, המנתח יצטרך לשקול אם התפירה אפשרית או לא. אם לא, לדוגמא דחייה תצטרך להיחשב.

בנוסף לשלבים הקריטיים המתוארים בסעיף הפרוטוקול, הפרטים הבאים עשויים להועיל בהטמעה נאותה של פרוטוקול זה. מבחינה טכנית, כאשר הארנבים המשמשים צעירים וקטנים, חשוב להשתמש בצנרור דו-שלבים, כפי שמתואר בפרוטוקול. הצינור השני (והסופי) גדול מדי כדי לשמש בצנרור הראשון, ויש סיכון אמיתי של "הדרך הלא נכונה" זה יכול להיות מוגזם או אפילו קטלני.
בהתאם לחומרים נבדק, זה יכול להיות מעניין לקחת קצת דגימת דם טרי מן האוזן קו IV כי הוא כבר ממוקם. זה יכול לספק שיטה טובה להחדיר מראש את החומר תחליף העצם עם תאים טבעיים וגורמי גדילה. דם תקרש טרי עשוי גם לספק דגימת התחזות אידיאלית.

הדרך החורים המדולרי הם הקידוחים צריך להיות מועיל מאוד לעיבוד היסטולוגית בעתיד וניתוח hiסטומאומאנטריקאל. למעשה, כל עוד החורים הם (i) באותו מיקום, (ii) ביופסיות הן בכיוון דומה ו-(iii) תהליך החיתוך הוא סטנדרטית (כלומר, עובי זהה, אותו רמת חתך), השדות הוערכו הם שווי ערך וההשוואה שלהם הוא מאוד רלוונטי. כעניין של סטנדרטיזציה, זה יכול להיות עניין רציני לכייל את עוצמת הקול-כמות החומר כדי למלא את הצילינדר, ולהכין אותו מראש, בצורה סטרילית.

מנקודת מבט מדעית, בהתאם המוצרים או ההשערה נבדק, זה עשוי להיות חשוב כדי למנוע הצבת צילינדרים על תפרים עצם. כמה תאי גזע ספציפיים נמצאים אלה מבנים³⁵, שונה מתאי גזע העצם mesenchymal המעורבים מנגנונים של intramembranous אוסיפיקציה, כלומר, תהליך התחדשות העצם נתקל באזור orofacial. לכן, הטיה אמיתית עלולה להתרחש במקרה של אי מניעת השחתה.

אחד היתרונות העיקריים של מודל כיפת הוא השימוש של מיקרוטומוגרפיה חיה שממנה צמיחת העצם עשויה להיות בעקבות בעל חיים יחיד כמחקר אורכי. אסטרטגיה זו עשויה להקטין במידה רבה את מספר החיות המורדמים ולכן לכבד את "כלל 3R"³⁶. בהתאם להתקן microtomograph המשמש (רזולוציה, שטח זמין עבור בעל החיים), וריאציות יתרחשו במונחים של אסטרטגיה של הרדמה (IV, גז, וכו '), כמו גם ברזולוציית התמונה ואת הרלוונטיות של הניתוח שהתקבל.
אנו משתמשים באופן קבוע בmicrotomograph המוקדש לניסויים בבעלי חיים (לדוגמה, GX קוונטית) לבדיקות שגרתיות. ניסוי אופייני מתחיל בהרדמה, כפי שמתואר בשלב 2.3.1. ההרדמה נשמרת עם 2%. בחמצן טהור זה מאפשר לחיה לנשום בשלווה בזמן סריקה של כ 14 דקות (99 kV/88 μA עם רזולוציה של 20 μm); זה מספיק לבדיקת פרמטרים בסיסיים (בתאום, קיבוע צילינדר, ניתוח חצי כמותי של צמיחת העצם, וכו '). כאשר מחפשים ניתוח איכותי וכמותי מדויק, כוונון עדין מאוד של זמן הסריקה, הרזולוציה, הרדמה מיצוב בעלי חיים יהיה צורך.

מודלים קיימים שפותחו לצורך הוצאת האוסטאוגנזה, אוסטגנזה, אוסטורפוזיה, כמו גם vasculogenesis, הם רבים, במיוחד בתחום orofacial. בשל שיקולים אתיים וכלכליים, מטרתנו תוגבל לארנבים או לבעלי חיים קטנים יותר. מלבד הגולגולת, המיקומים שבהם ניתן לבדוק את החומר הם הבולה³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^, ⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶^,⁴⁷, דיאסטמה⁴⁸ או שקעים (לאחר חילוץ השיניים)⁴⁹^,⁵⁰^,⁵¹. עכברים, עכברים, שרקנים וארנבים עשויים לשמש עבור כל אחד מהמודלים המתוארים להלן. בקצרה, פגם קריטי מקדח (או ששקע נוצר על-ידי מיצוי מקרים), מלא בדגימת החומר ולאחר מכן מכוסה על-ידי קרום. מלבד העובדה הברורה כי רק שתי דגימות ניתן לבחון בכל אחד מהמקומות האלה (מדגם אחד לכל צד הלסת התחתונה או מקרה מקרה), הליכים כירורגיים הם גם קשה במידה רבה פולשנית. הגישה לאתר מוגבלת, ואם משתמשים בעכבר או עכברים, הקושי גובר על ידי גודל החיות. לבסוף, הגודל הקריטי של הפגמים (כלומר, מידות שאינן מאפשרות התחדשות עצם ספונטנית) אינה מוגדרת היטב ומשתנה מבעל חיים אחד למשנהו.
מלבד אלה כלליים, אילוצים ספציפיים עלולים להתעורר בהתאם למיקום האנטומי נתון לפגם ולניתוח הבא. כדוגמה, במודל הלסת, שורשי השיניים נוכחים בתוך הפגם. זה עלול להפריע לחומר ולשנות את תהליך התחדשות העצם. הפגם יכול להיות ממוקם קרוב יותר על ramus, אבל במקרה זה, העצם יהיה דק מאוד (שני קורנים מודבקת עם מרחב מדולרי דק מאוד) ואת נפח פגם כתוצאה מכך עשוי להיות קטן מדי⁴⁵^,⁴⁶^, ⁴⁷. בהינתן דוגמאות אלה של מגבלות ובהתאם למודל, ייתכנו סטיות גדולות במונחים של נפח חומרים לבדיקה, איכות וכמות נתונים שנאספו.

כאשר הערכה של חומר דורש מקסימום של סטנדרטיזציה וכיול, מודל כיפת מופיע אידיאלי. Access קל מאוד, כיול וסטנדרטיזציה הם הקלה על ידי שימוש של צילינדרים מוגדרים 4 דגימות ניתן להעריך בו. יתר על כן, טומוגרפיה חיה ניתן להשתמש ולבסוף ירידה גדולה של בעלי חיים להיות מורדמים ניתן לצפות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחברים הם אסירי תודה לגייסטלליך AG (Wolhusen, CH) ואת הקרן אוסטאופולוגיה (לוצרן, CH) (להעניק n ° 18-049) עבור תמיכתם, כמו גם גלובל D (בריג, FR) לספק את הברגים. תודה מיוחדת. לדוקטור ב. שפר מגייסטלליך אנחנו גם אסירי תודה לאליאן דובואה וקלייר הרמן על עיבוד היסטולוגית מעולה ועצות יקרות שלהם. לבסוף, אנו מכירים בחום את אקסבייר בלין, סילבי Roulet ואת כל הצוות של Pr וליד Habre, "ניתוח ניסיוני Dpt", על הסיוע הטכני המדהימה שלהם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drugs
Enrofloxacine Baytril 10%	Bayer		Antibiotic
Fentanyl	Bischel		For analgesia
Ketalar 50mg/ml	Pfizer		Ketamine for anesthesia
Lidohex	Bichsel		Lubricating gel for the eyes
Opsite	Smith and Nephew	66004978	Sprayable dressing
Povidone iodine 10%, Betadine	Mundipharma		anti-infective agent
Propofol 2%	Braun	3538710	For anesthesia
Rapidocain 2%	sintetica		Local anesthesia
Ringer-acetate	Fresenius Kabi		Volume compensation
Rompun 2%	Bayer		Xylazin for anesthesia
Sevoflurane 5%	Abbvie		For anesthesia
Sterile saline	Sintetica
Temgesic	Reckitt Benckiser		Buprenorphine hydrochloride, analgesia
Thiopental Inresa	Ospediala		For anesthesia
Xylocaine 10% spray	Astra Zeneca		For intubation
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Fresenius Vial pilot C	Imexmed		Infusion pump
Heated pad	Harvard Apparatus
Suction dominant 50	Medela
Suction tubing Optimus	Promedical	80342.2
Surgical motor	Schick dental	Qube	Drilling of intramedullary holes
Ventilation	Maquet Servo1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
Cylinders and caps	Boutyplast	Customized	composition: PEEK (poly ether ether ketone)
Manual self-retaining shaft	GlobalD	ACT1K
Mobile handle for self-retaining shaft	GlobalD	MTM
Self- drilling screws	GlobalD	VA1.2KL4	cross-drive screws composed by Titanium grade5, ISO 5832-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Surgical tray
Endotracheal tube Shiley diameter 2,5mm	Covidien	86233	For intubation
Endotracheal tube Shiley diameter 4,9mm	Covidien	107-35G	For intubation
Ethicon prolene 4-0	Ehticon	8581H	Non-resorbable suture
Forceps	Marcel Blanc	BD027R	145 mm
Intubation catheter	Cook medical		Guide for intubation
Needlle holder	Marcel Blanc	BM008R
Needles BD Microlance3	Becton Dickinson	300300/304622	26G; 18G
Periosteal	HU-Friedy	P9X
Round surgical burs	Patterson	78000	0.8 mm in diameter, Drilling of intramedullary holes
Scalpel	Swann-Morton		n°10 and n°15
Scissors	Marcel Blanc	00657	180 mm
Syringes Omnifix	Braun	4616057V	5ml, 10ml and 50ml
Venflon G22	Braun	42690985-01	Vasofix safety for the ear iv line