Summary
RNAs מעגלית (circRNAs) הם RNAs שאינם מצפינה לקידוד שעשויים להיות בעלי תפקידים ברגולציה ובניהול אינטראקציות מדיה בין חלבונים. בעקבות הערכה של פרמטרים שונים לבניית ספריות רצף circRNA, פרוטוקול הושלם באמצעות הכנה נטוש הכולל הספריה RNA עם RNase R טרום טיפול והוא מוצג כאן.
Abstract
RNAs מעגלית (circRNAs) הם מחלקה של RNAs שאינם קידוד מעורב פונקציות כולל מיקרו-RNA (miRNA) רגולציה, גישור של אינטראקציות חלבונים חלבון, ויסות של תמלול הורים. ברצף הקלאסי של RNA הדור הבא (RNA-seq), circRNAs הם בדרך כלל להתעלם כתוצאה מבחירה פולי-A במהלך הבנייה של ספריות mRNA, או מצויים בשפע נמוך מאוד, ולכן קשה לבודד ולזהות. כאן, פרוטוקול בנייה של ספריית circRNA היה מיטבי על ידי השוואת ערכות הכנה לספריות, אפשרויות טרום טיפול וכמויות שונות של קלט RNA. שני מסחרית זמין שלמים הכנה הספרייה ערכות, עם ובלי RNase R טרום טיפול, ושימוש כמויות משתנה של סך RNA קלט (1 כדי 4 μg), נבדקו. לבסוף, מספר סוגי רקמות; כולל כבד, ריאות, לימפה הלימפה, ולבלב; כמו גם אזורי מוח מרובים; כולל המוח העליון, האונה הקודקודית, פיתול הרקה התיכונה, קליפת העורף, והפיתול הקדמי העליון; הושוו להערכת השפע circRNA על פני סוגי רקמות. ניתוח של נתוני ה-RNA-seq שנוצרו באמצעות שישה כלי איתור מסוגים שונים של כלים (find_circ, CIRI, מפות, סכין, DCC ו-Circrna) חשף שערכת הכנה של ספריית RNA הכוללת את הספריה עם RNase R ו-4 μg כניסת RNA היא המיטבית שיטה לזיהוי המספר הקרוב ביותר של circRNAs. בהתאם לממצאים הקודמים, ההעשרה הגבוהה ביותר של circRNAs נצפתה ברקמות המוח לעומת סוגי רקמות אחרים.
Introduction
Rnas מעגלית (circrnas) הם אנדוגני, rnas שאינם קידוד שקיבלו תשומת לב באמצעות הביטוי המתפשט שלהם ב-איקריוטית הטרנססקריפט1,2,3. הם נוצרו כאשר exons בחזרה אחד לשני ולכן נחשבו בתחילה להיות החדרת חפצים4,5. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו כי סוג תא מוצג, רקמה, התפתחות ביטוי ספציפי בשלב3,6 והוא שימור אבולוציונית2,3. יתר על כן, הם מעורבים בגישור של חלבון-חלבון אינטראקציות7, מיקרו RNA (mirna) כריכה3,8,9,10, ויסות של שעתוק גן הורים11.
ברצף RNA הקלאסי (RNA-seq), circRNAs עשוי להיות אבוד לחלוטין במהלך בניית הספרייה כתוצאה פולי בחירה של mRNAs או עלול להיות קשה לבודד נתון שלהם שגשוג נמוך. עם זאת, לימודי האפיון האחרונים שילבו צעד טרום טיפול באמצעות rnase R על מנת להעשיר עבור circrna2,12,13. RNase R הוא exoribonuclease כי מעכל RNAs ליניארי, השארת מאחורי מבנים RNA מעגלי. הפרוטוקולים העשרה CircRNA היו ממוטבים על ידי יצירת והשוואת נתונים משני מסחרית זמין שלמות הספרייה ערכות הבנייה, עם וללא צעד RNase R טרום הטיפול, ושימוש בכמויות משתנות של סך RNA קלט (1 עד 4 μg). הפרוטוקול הממוטב נעשה בשלב הבא כדי להעריך את השפע של circrnas על פני חמישה אזורי מוח שונים (המוח השני [BC], האונה הקודקודית [IP], פיתול כישור הזמני האמצעי [MG], קליפת העורף [OC] והפיתול הקדמי העליון [SF]) וארבעה סוגי רקמות אחרים (כבד [LV], ריאה [LU], הלימפה [LN] ו הלבלב [הרשות]). הספריות השונות של RNA מזווגים ברצף והנתונים נותחו באמצעות שישה אלגוריתמים שונים של חיזוי מעגלי: find_circ3, ciri14, מפות15, סכין16, DCC17, ו-circrna18. בהתבסס על האנליזה שלנו, המספר הגבוה ביותר של circRNAs הייחודי זוהה בעת שימוש בערכת הכנה כוללת של הספרייה RNA הכולל עם RNase R טרום הטיפול ו 4 μg כולל הקלט RNA. הפרוטוקול הממוטב מתואר כאן. כפי שדווחו בעבר19,20, העשרת הגבוהים ביותר של circrnas נצפתה במוח לעומת סוגי רקמות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה בוצע בהתאם לכל ההנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם. רקמות המוח הושגו מן המחקר הבריאות השמש המכון מחקר המוח ותרומות הגוף בסאן סיטי, AZ. הפעילות של התוכנית לתרומת המוח והגוף מאושרת על ידי מועצת הביקורת המוסדית המערבית (פרוטוקול ויראל #20120821). כל הנושאים או נציגיה המשפטיים חתמו על הסכמה מושכלת. מסחרי (non-המוח) ביודגימות נרכשו מ פרוטאוגנקס.
1. טיפול RNase R
הערה: בשלבים הבאים, עוצמת התגובה מותאמת לנפח כולל של 50 μL. זהו נפח המדגם המינימלי לשימוש במערכת ניקוי ה-RNA & רכז (ראה טבלת חומרים). בנוסף, הפרוטוקול הממוטב המתואר כאן הוא עבור כמות הקלט של 4 μg של כולל RNA. זמן דגירה ארוכה יותר עבור טיפול RNase R מומלץ עבור כמות הקלט > 4 μg.
- לדלל RNA סה כ 4 μg ב 39 μL RNase-מים בחינם בצינור מיקרוצנטריפוגה ומערבבים היטב על ידי ליטוף.
- בצינור נפרד, לדלל את RNase R לריכוז עבודה של 2 U/μL עם מאגר התגובה של 1x RNase R. הפוך מספיק לשימוש מיידי.
- פיפטה 39 μL של RNA כולל ו-5 μL של מאגר התגובות 10x RNase R לתוך צינור התגובה 1.5 mL ומערבבים היטב על ידי ליטוף (50 μL יהיה נפח התגובה הכולל). לאחר מכן, הוסף 6 μL של RNase R (2 U/μL).
- להתאים את הצינורות לנפח התגובה המלאה (50 μL) ולערבב היטב על ידי ליטוף למעלה ולמטה 10 פעמים.
- הניחו את הצינור באמבט מים בגודל 37 ° c במשך 10 דקות. ודא שנפח התגובה המלא שקוע באמבט המים.
- מניחים את השפופרת על הקרח ומיד להמשיך עם ניקוי RNA & ריכוז (סעיף 2).
2. טיהור רנ א באמצעות שימוש בערכת לניקוי RNA ומרכז
הערה: כאשר משתמשים באיכות גבוהה RNA (רין > 8, DV200 > 80%), טיפול RNase R עלול לגרום לאובדן של כ 60% של RNA. באמצעות קלט 4 μg, מעריכים כי 2 – 2.5 μg של RNA שטופלו הוא עזב לאחר סעיף 1.
- לפני שמתחילים, להכין את מאגר שטיפת RNA על ידי הוספת 48 mL של 100% אתנול כדי המאגר להתרכז לערבב היטב על ידי ליטוף. מניחים עמודות טיהור לצינורות האוסף (ראו טבלת חומרים) ומניחים במתלה שפופרת.
הערה: השתמש בהגדרות הצנטריפוגה הבאות עבור כל השלבים הבאים: 10000 – 16000 x g. אם הטיפול DNase I כבר בוצע, לדלג על DNase אני טיפול בשלב זה. - הוסף 2 כרכים של מאגר כריכת RNA למדגם RNase R מטופלים, וערבבו היטב על ידי ליטוף (נפח כולל: 150 μL).
- להוסיף נפח 1 של 100% אתנול למאגר כריכת RNA RNase R טיפול לדוגמה, ולערבב היטב על ידי ליטוף (נפח כולל: 300 μL).
- העבר את כל אמצעי האחסון לעמודה וצנטריפוגה את העמודה עבור 30 s. התעלם מזרימת.
- הוסף 400 μL של מאגר הכנה RNA ישירות לעמודה, צנטריפוגה את העמודה עבור 30 s, ולמחוק זרימה דרך.
- הוסף 700 μL של RNA שטוף מאגר ישירות לעמודה, צנטריפוגה את העמודה עבור 30 s, ולמחוק זרימה דרך.
- הוסף 400 μL של RNA שטוף מאגר ישירות על העמודה, צנטריפוגה את העמודה עבור 2 דקות, ולהעביר את העמודה ל-RNase חדש-חינם 1.5 mL.
- הוסף 11 μL של מים חינם RNase-ישירות לעמודה על ידי החזקת את הקצה של הפיפטה מעל מסנן העמודה ולהבטיח כי המים ינחת רק על מסנן עמודה.
- מודיית את העמודה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר ו צנטריפוגה עבור 1 דקות.
- לפני מחיקת העמודה, חפש זרימה בשפופרת RNase-free. אם הימנעות הצליחה, החנות לדוגמה ב-80 ° צ' או מייד להמשיך עם הכנת הספרייה. הכמות הסופית הכוללת של 10 μL משמשת לבניית ספריה.
הערה: נקודת עצירה: עזבו את ה-RNA ב-80 ° צ' עד 7 ימים לפני המשך ההכנה לספרייה.
3. הכנה לספריה של circRNA
הערה: ראה טבלת חומרים עבור קיט, אשר מכיל את רוב הריאגנטים המשמשים בסעיף זה.
- rRNA המחסור והפיצול
- העברה 10 μL של רנ א מטוהרים משלב 2.10 לבאר נקי ב חדש 96-ובכן 0.3 mL PCR. לבאר, להוסיף 5 μL של מאגר כריכה rRNA ואחריו 5 מיקס μL rRNA להסרת. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב.
- לוחית החותם ואת הדגירה עבור 5 דקות ב 68 ° c על מתוכנן מראש, מחומם מראש לחסום תרמוציקלer. לאחר השלמת הדגירה 5 דקות, צלחת המקום על הספסל והדגירה בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות.
- . הסר את החותם מלוחית הרישוי הוסף 35 μL של טמפרטורת החדר הסרת rRNA להסרת חרוזים למדגם. להתאים את הצינורות כדי 45 μL ו פיפטה למעלה ולמטה 10 – 20x כדי לערבב היטב. הצלחת הדגירה 1 דקות בטמפרטורת החדר.
- להעביר את הצלחת למעמד מגנטי מודטה על המעמד עבור 1 דקות או עד הפתרון מנקה. העבר את כל supernatant (~ 45 μL) לחדש היטב על צלחת זהה, או צלחת חדשה (בהתאם למספר דגימות אתה עובד עם).
- המערבולת חרוזים לניקוי RNA (ראה טבלת חומרים) עד התפזרו היטב, ולהוסיף 99 μl של חרוזים לכל מדגם. הפיפטה עולה ויורדת 10x כדי לערבב. מודקת את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
- העבר את הצלחת אל המעמד המגנטי והדגירה של 5 דקות נוספות או עד לניקוי הפתרון. להסיר ולמחוק את כל הסופרנטאנט מן הבאר.
- עם הצלחת עדיין על המעמד המגנטי, להוסיף 200 μL של טרי מוכן 80% אטוח לבאר בלי לשבש את החרוזים. דגירה של 30 s, ואז להסיר ולמחוק אתנול. חזור על הסכום הכולל של 2 שוטף.
- הוסף 11 μL של מאגר האלוטור לכל באר ו פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 דקות, ולאחר מכן להעביר למעמד המגנטי עד הפתרון מנקה (1 – 5 דקות).
- העברת 8.5 μL של סופרנטאנט מבאר לבאר חדשה על אותה צלחת או לצלחת חדשה. הוסף 8.5 μL של האליוט, פריימר, שילוב גבוה של מקטע לכל מדגם המכיל היטב. הפיפטה עולה ויורדת 10 פעמים כדי לערבב היטב.
- לוחית החותם ואת הדגירה עבור 8 דקות ב 94 ° c על מתוכנן מראש, מחומם מראש לחסום תרמוציקלer. מוציאים מהפטרטרמר כאשר הוא מגיע ל -4 ° צ' ולצנטריפוגה בקצרה.
הערה: . המשך מיד לפרוטוקול הראשון
- סנתז cDNA
- עבור כל דוגמה להיות מוכן, לערבב 9 μL הראשון מיקס סינתזה עם 1 μL של היפוך הטרנסקריפטאז (ראה טבלת חומרים). הוסף 8 μL של התערובת למדגם. . פיפטה למעלה ולמטה 6 פעמים כדי לערבב
- לחסום את הצלחת ואת הדגירה על גבי מתוכנתים מראש, מחומם מראש בלוק תרמוציקלer באמצעות הפרמטרים הבאים: 25 ° c עבור 10 דקות, 42 ° צ' צלזיוס עבור 15 דקות, 70 ° צ' עבור 15 דקות, 4 ° c להחזיק. המשך מיד לסינתזה הגדיל השני.
- הוסף 5 μL של מאגר Resuspension לכל מדגם ואחריו 20 μL של מיקס הבסיס השני של סימן סטרנד. מצנעת את כל הווליום. למעלה ולמטה 6 פעמים
- לחסום את הצלחת ואת הדגירה על מתוכנן מראש, מחומם לפני החום בלוק מראש הגדר 16 ° צ' עבור 1 h. בעקבות דגירה, להסיר את הצלחת מן הציקלונט ולתת לו להיות שולי לטמפרטורת החדר.
- מערבולת ה-PCR מחרוזת טיהור (ראה טבלת חומרים) ולהוסיף 90 μl חרוזים לכל טוב של דגימה. הפיפטה עולה ויורדת 10 פעמים כדי לערבב היטב. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 10 דקות.
- העבר את התמהיל חרוז/לדוגמה למעמד מגנטי ו-דגירה של 5 דקות או עד נוזל מנקה. הסרה וביטול של סופרנטאנט.
- הוסף 200 μL של 80% אטוח למדגם. . בטמפרטורת החדר במשך 30 שנות שלושים. למחוק סופרנטאנט חזור על 1x.
- אפשר חרוזים להתייבש בטמפרטורת החדר עבור 6 דקות, ולאחר מכן להסיר ממעמד מגנטי.
- השהה חרוזים מחדש ב-19.5 μL של מאגר Resuspend. הפיפטה עולה ויורדת 10 פעמים כדי לערבב היטב. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 דקות, ולאחר מכן להעביר את המעמד המגנטי הדגירה עבור 1 דקות נוספות או עד הנוזל מנקה.
- העברת 17.5 μL של סופרנטאנט לצלחת חדשה/חדשה.
הערה: אם לא ממשיכים מייד, ניתן לאחסן דגימות ב-20 ° c עד 7 ימים.
- עבור כל דוגמה להיות מוכן, לערבב 9 μL הראשון מיקס סינתזה עם 1 μL של היפוך הטרנסקריפטאז (ראה טבלת חומרים). הוסף 8 μL של התערובת למדגם. . פיפטה למעלה ולמטה 6 פעמים כדי לערבב
- הכנה לספריות
- הוסף 12.5 μL של מיקס למעקב לכל היטב המכיל supernatant. פיפטה את כל אמצעי האחסון למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב.
- מגדיר את התגובה על בלוק מתוכנתים מראש, מחומם מראש לפני החום לפני 37 ° c באמצעות הפרמטרים הבאים: 37 ° c עבור 30 דקות, 70 ° צ' עבור 5 דקות, 4 ° c להחזיק. כאשר הדגימות מגיעות ל -4 ° c, המשיכו מיד לכיוון המתאם.
- לכל דגם להוסיף 2.5 μL של מאגר Resuspension, 2.5 μL של מתאם RNA ייחודי, ו 2.5 μL של שילוב ליטל. הפיפטה עולה ויורדת 10x כדי לערבב.
- הדגימה ממתוכנתת מתוכננת לפני בלוק התרמוציקלייט בגיל 30 ° c במשך 10 דקות.
- הוסף 5 μL של מאגר ליטל הפסקה לכל מדגם ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב.
- הוסף 42 μL של מעורב מחרוזת טיהור PCR לכל מדגם ומערבבים ביסודיות. בצע את השלבים 3.2.6 באמצעות 3.2.10, אבל לשנות את נפח ההשעיה כדי 52 μL ונפח משחרלי הסופי ל 50 μL.
- חזור על פרוטוקול ה-PCR לטיהור נוהל שוב עם ה3.3.6 μL של 50 משלב השלבים, אך לשנות את נפח ההשעיה ל -22 μL ואמצעי האחסון הסופי כדי 20 μL.
הערה: אם לא ממשיכים מייד, ניתן לאחסן דגימות ב-20 ° c עד 7 ימים. - הוסף 5 μL של קוקטייל PCR פריימר ו -25 μL של מיקס מאסטר של PCR לכל דוגמה. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה 10 פעמים. דגירה את התגובה על מתוכנתים מראש, מחומם מראש לחסום תרמוציקלer באמצעות הפרמטרים הבאים: 98 ° צ' עבור 30 s; אז 8 מחזורים של 98 ° צ' עבור 10 s, 60 ° צ' עבור 30 s, ו 72 ° צ' עבור 30 s; לאחר מכן 72 ° c עבור 5 דקות, לאחר מכן 4 ° c להחזיק.
הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב את המספר הכולל של מחזורי ה-PCR להפקת כמויות מספיקות של ספריות לרצף. - בצע את הפרוטוקול ל-PCR חרוז לטיהור (שלבים 3.2.4 דרך 3.2.9), למעט להוסיף 50 μL של מעורב היטב מיקס מחרוזת טיהור PCR ולשנות את נפח ההשעיה ל 32.5 μL עם נפח הסופי של 30 μL.
הערה: יש לאחסן דגימות ב-20 ° c.
- קוונפיקציה ובקרת איכות באמצעות מנתח חומצות גרעין
- אפשר לקלטות וריאגנטים להתמצא בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
- מערבבים 2 μL של הספריה עם 2 μL של מאגר HS D1000, ולהוסיף צלחת היטב תואם.
- חותם הדוק עם חותם נייר תואם, ומערבולת עבור 1 דקות ב 2,000 סל ד.
- ספין למטה לטעון צלחת על המנתח הבאים התוכנה הנחיות.
הערה: הספריות צריכות להיות בגודל של 260 bp.
4. זרימת עבודה של ניתוח נתונים
- רצף של ספריות RNA-seq (ראה טבלת חומרים) כדי ליצור קריאות 82 bp לזווג בסוף. המר נתוני רצף גולמי בצורה של קבצי basecall (. bcl) ל-FASTQs באמצעות הכלי bcl2fastq (v 0.2.19).
- זיהוי מעגלי.
הערה: מבוסס על ראיות שדווחו בעבר כי ההרכב מבצע איתור של הרכב מתבצע בצורה טובה יותר בהשוואה לשימוש בכלי זיהוי יחיד21,22, אנו מציעים באמצעות כלים מרובים עבור איתור circrna. בשלב זה, התגלתה הפונקציה circRNAs באמצעות שישה אלגוריתמי חיזוי קיימים: find_circ, CIRI, Circrnas, מפות, מפות, סכין ו-DCC, החלת הגדרות הפרמטר המומלצות עבור כל אלגוריתם.- הורד והתקן כל אלגוריתם זיהוי circRNA באשכול מיחשוב באיכות גבוהה של לינוקס באמצעות ההוראות המסופקות על-ידי המפתחים.
- יישר RNA-seq FASTQs נגד הגנום הייחוס (GRCh37), ניצול התנינים המומלצים עבור כל כלי.
- בהתאם ליישור, בצע את אלגוריתמי הזיהוי של circRNA על-ידי החלת הגדרות הפרמטרים המומלצות שלהם.
- כל כלי מפיק קובץ תוצאות מרובה עמודות עם רשימת circRNAs שאותרו, לחלץ את הקואורדינטות Circrnas ואת מספר קריאות התמיכה מתוך זה כדי לכמת את מספר המועמדים שזוהו בכל תנאי לדוגמה/בדיקה.
- המרת הקואורדינטות circRNA על-ידי CIRI, מפות הסיביות והפונקציה DCC ל-0 מבוססי קואורדינטות כדי להיות עקבי עם שלושת האלגוריתמים האחרים.
- בחר באפשרות circRNAs עם שניים או יותר קריאות תמיכה או ניתוחים והשוואות במורד הזרם. טבלה 1 מסכמת את כל הפרמטרים שוערכו במחקר שלנו יחד עם המספר הכולל של ברצף קריאות שנוצרו עבור כל מדגם.
- עבור כל תנאי לדוגמה/בדיקה, ספור את המספר של circRNAs שזוהו מנורמל למספר הקריאות הממופה שנוצרו עבור אותה ספריה, לכל מיליון. סכם את התוצאות לאורך הכלים/דגימות השונות בחלקות הקופסא, כמפורט בתוצאות הנציגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
נתונים שנוצרו באמצעות שליטה אוניברסלית מסחרית בקרה אוניברסלי (UC) ושימוש בשתי ערכות הכנה לספרייה, שניהם כוללים צעד מחסור ribo בפרוטוקולים שלהם, העריכו לראשונה. באמצעות זרימת עבודה אנליטית (זרימת עבודה של ניתוח נתונים, סעיף 4), כולל, מספר גבוה יותר של circRNAs זוהה בקבוצות הנתונים TruSeq בהשוואה לאלה של Kapa (איור 1). למרות RNA הריבוזומבית (rRNA) האחוזים היו מתחת 5% ב-datasets משני הקיטים עבור כמויות קלט נמוכות יותר (1, 2 לסרוג), הנתונים של Kapa היו בעלי תוכן rRNA גבוה יותר עבור 4, 5 ו-10 כניסות (טבלה 2). מכאן, מבוסס על מספר היעילות של circRNAs ו rRNA מחסור, ניסויים נוספים בוצעו באמצעות ערכת TruSeq.
לאחר מכן, המשמעות של RNase R טרום הטיפול נבדק על ידי השוואת הנתונים שנוצרו RNase R מטופלים מראש וספריות שאינן מטופלות מראש. לצורך זה, RNA סה כ חולצו מ-MG של אנשים קשישים בריאים ברצף נתונים שנוצרו מספריות עם (N = 3) ובלי (N = 3) טרום טיפול באמצעות RNase R23 הושווה. מספר גבוה יותר של circRNAs זוהה באופן עקבי בספריות שטופלו מראש בהשוואה לאלה שאינם מטופלים מראש (איור 2). זה צפוי מאז טיפול טרום מסיר RNAs ליניארי, ובכך מעשירה עבור מינים circRNA.
שלישית, כמות הקלט RNA שיהיה אופטימלי לגילוי מגוון גבוה יותר של circRNAs נבדק. ספריות היו מוכנות באמצעות 1, 2, ו 4 μg של הקלט הכולל RNA אשר חולצו מ-MG, OC, ו-SF המוח אזורים, וכן UC RNA. השוואת השפע של circRNAs שזוהו מכל ספרייה, המגוון הגבוה ביותר של מינים Circrnas נצפתה בעת שימוש ב 4 μg קלט RNA לעומת 2 ו-1 μg (איור 3), כפי שמשתקף על ידי מספר circrnas הייחודי זיהה. אזהרה אחת לציין היא כי למרות שונים הדגירה פעמים במהלך הטיפול RNase R לא נבדקו, מגמה לפיה מספר גדל והולך של circRNAs זוהו על פני סה כ תשומות RNA של 1 עד 4 μg נצפתה בעת שליטה על כל הפרמטרים האחרים.
פרוטוקול ממוטב זה הוחל לאחר מכן על-פני סוגי רקמות מרובים כדי להשוות את הריקודים של circRNA. חמישה מאזורי המוח, כולל לפנה ס, MG, OC, IP, ו-SF, מארבעה אנשים קשישים בריאים, נבדקו, יחד עם ארבעה סוגים אחרים של רקמות, כולל LV, LU, LN ו-PA, משישה תורמים בריאים. הכולל, שפע גבוה יותר של circrnas נצפתה במוח לעומת סוגים אחרים של רקמות (איור 4), כפי שדווחו בעבר19,20.
איור 1: זיהוי CircRNA באמצעות TruSeq vs. Kapa סה כ ערכות RNA. רצף הנתונים נוצר עבור ה-rna באמצעות שני שונים הכולל בספרייה rna ערכות הכנה, כל אחד עם 1, 2, 4, 5, ו 10 μg קלט RNA ו ריבונוקלאז r (rnase r) טרום טיפול. מספר הcircrnas שזוהו על-ידי הכלים בכל דוגמה היה מנורמל למספר הקריאות הממופים, למיליון (ציר Y). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זיהוי CircRNA עם ו ללא RNase R טרום טיפול. רצף נתונים שנוצר באמצעות ערכת TruSeq נעשה שימוש כדי להשוות את ההשפעה של RNase R טרום טיפול. RNA הופק מהפיתול הזמני הבינוני (MG) של בקרת קשישים בריאים לניתוח זה. המספר המנורמל של ה-circRNAs שזוהה (ציר Y) חושב באופן דומה לאיור 1. RNase R + = מטופל מראש עם RNase R, RNase R-= לא מטופלים מראש עם RNase R. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: זיהוי CircRNA באמצעות כמות משתנה של הקלט RNA. באמצעות RNA שחולצו מ-MG, קליפת העורף (OC), ו פיתול כישור חזיתית מעולה (SF), כמו גם ה-rna, מספר circrnas ייחודי זיהה בעת שימוש 1, 2, ו 4 μg של קלט RNA, כל שהספריה נבנתה באמצעות ערכת truseq ו rnase R טרום הטיפול, הושווה. המספר המנורמל של ה-circRNAs שזוהה (ציר Y) חושב באופן דומה לאיור 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: זיהוי CircRNA במוח לעומת סוגים אחרים של רקמות. CircRNA מועשר datasets באמצעות RNA שחולצו מאזורי המוח השונים כולל המוח השני (BC), האונה הקודקודית הנחותה (IP), MG, OC, ו-SF, כמו גם ארבעה סוגי רקמות אחרים כולל הכבד (LV), ריאה (LU), הלימפה (LN), ו הלבלב (PA) נוצרו העשרה CircRNA בוצע באמצעות ערכת האור TruSeq עם RNase R טרום טיפול ו 4 μg של הקלט כולל RNA. מגרשים של תיבות מייצגים את מספר circRNAs שזוהו על ידי לפחות שלושה מתוך ששת הכלים על פני דגימות מאזור המוח/סוג רקמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| בחן # | חישוב פרמטר | תנאי בדיקה | מקור לדוגמה | סכומי קלט/תנאים/דגימות שנבדקו | מספר כולל של ברצף קריאות |
| 1 | ערכת הכנה לספריה | הארה TruSeq הכולל של כל ה-RNA לעומת הכולל של הקסה-RNA | UC | TruSeq: 1 μg | 8, 91, 46128 |
| TruSeq: 2 μg | 7, 93, 90202 | ||||
| TruSeq: 4 μg | 6, 66, 12238 | ||||
| TruSeq: 5 μg | 7, 88, 56902 | ||||
| TruSeq: 10 μg | 6, 61, 06874 | ||||
| Kapa: 1 μg | 8, 83, 95496 | ||||
| Kapa: 2 μg | 10, 66, 59272 | ||||
| Kapa: 4 μg | 10, 62, 34954 | ||||
| Kapa: 5 μg | 7, 47, 75914 | ||||
| Kapa: 10 μg | 68504, 11, 00 | ||||
| 2 | טרום טיפול | RNase R מטופל מראש לעומת שאינו מטופל מראש | מ ג | Pair1: MG_1 (RNase R +) | 10, 76, 09934 |
| Pair1: MG_5 (RNase R-) | 9, 62, 15516 | ||||
| Pair2: MG_2 (RNase R +) | 9, 68, 40790 | ||||
| Pair2: MG_6 (RNase R-) | 10, 16, 09754 | ||||
| Pair3: MG_3 (RNase R +) | 11, 15, 76344 | ||||
| Pair3: MG_7 (RNase R-) | 11, 13, 14114 | ||||
| 3 | סך הכל קלט RNA | 1 μg לעומת 2 μg לעומת 4 μg | MG, OC, SF, UC | MG: 1 μg | 94758, 12, 00 |
| מ ג: 2 μg | 11, 64, 75728 | ||||
| MG: 4 μg | 12, 13, 15232 | ||||
| OC: 1 μg | 11, 11, 18120 | ||||
| OC: 2 μg | 11, 53, 25492 | ||||
| OC: 4 μg | 11, 49, 13266 | ||||
| SF: 1 μg | 12, 27, 24142 | ||||
| SF: 2 μg | 9, 39, 33288 | ||||
| SF: 4 μg | 31474, 12, 33 | ||||
| UC: 1 μg | 9, 24, 48120 | ||||
| UC: 2 μg | 12, 58, 15354 | ||||
| UC: 4 μg | 92534, 12, 56 | ||||
| 4 | סוגי רקמה | אזורי מוח לעומת סוגי רקמות אחרים | BC, MG, OC, SF, IP, LU, LV, LN, PA | BC_1 | 08904, 10, 72 |
| BC_2 | 11, 18, 33362 | ||||
| BC_3 | 9, 61, 25856 | ||||
| BC_4 | 9, 62, 77094 | ||||
| IP_1 | 9, 86, 56506 | ||||
| IP_2 | 95746, 11, 35 | ||||
| IP_3 | 12, 87, 81536 | ||||
| IP_4 | 9, 59, 81446 | ||||
| MG_1 | 10, 76, 09934 | ||||
| MG_2 | 9, 68, 40790 | ||||
| MG_3 | 11, 15, 76344 | ||||
| MG_4 | 10, 05, 39028 | ||||
| OC_1 | 8, 85, 47042 | ||||
| OC_2 | 12, 09, 83142 | ||||
| OC_3 | 10, 26, 55452 | ||||
| OC_4 | 10, 84, 49330 | ||||
| SF_1 | 8, 76, 21824 | ||||
| SF_2 | 57894, 14, 50 | ||||
| SF_3 | 11, 01, 52030 | ||||
| SF_4 | 9, 67, 24472 | ||||
| LN_1 | 15, 02, 94816 | ||||
| LN_2 | 30187, 8, 33 | ||||
| LN_3 | 11, 30, 96032 | ||||
| LN_4 | 10, 78, 38278 | ||||
| LU_1 | 16, 05, 27595 | ||||
| LU_2 | 8, 94, 30799 | ||||
| LU_3 | 9, 14, 51858 | ||||
| LV_1 | 9, 72, 18369 | ||||
| LV_2 | 10, 54, 16880 | ||||
| LV_3 | 8, 86, 53148 | ||||
| LV_4 | 8, 61, 02943 | ||||
| LV_5 | 12, 87, 88483 | ||||
| LV_6 | 11, 87, 76622 | ||||
| PA_1 | 8, 79, 20160 | ||||
| PA_2 | 36741, 7, 82 | ||||
| PA_3 | 10, 21, 24209 | ||||
| PA_4 | 11, 53, 22926 |
טבלה 1: תקציר תנאי לדוגמה ובדיקה. סיכום כל הפרמטרים ותנאי הבדיקה הוערכו במחקר זה, יחד עם המספר הכולל של ברצף קריאות שנוצרו עבור כל מדגם. UC = בקרה אוניברסלי, MG = gyrus באמצע התיכון, OC = קליפת העורף, BC = המוח העליון, IP = האונה הקודקודית הנחותה, SF = gyrus חזיתית מעולה, LU = ריאה, LV = כבד, LN = צומת לימפה, הרשות הפלסטינית = לבלב, rnase r = ריבונוקלאז r, rnase r + = מטופל מראש עם rnase r, rnase r-=
| מקור לדוגמה | סכומי קלט/דגימות שנבדקו | אחוז rRNA |
| UC | TruSeq: 1 μg | 5.53% |
| TruSeq: 2 μg | 4.11% | |
| TruSeq: 4 μg | 4.38% | |
| TruSeq: 5 μg | 3.21% | |
| TruSeq: 10 μg | 3.74% | |
| Kapa: 1 μg | 5.57% | |
| Kapa: 2 μg | 4.56% | |
| Kapa: 4 μg | 9.67% | |
| Kapa: 5 μg | 12.69% | |
| Kapa: 10 μg | 15.59% |
טבלה 2: אחוז rRNA בספריות TruSeq vs. Kapa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, שתי ערכות הכנה לספריות זמינות מסחרית, אפשרויות טרום טיפול, וכמויות קלט RNA נבדקו כדי למטב פרוטוקול העשרה של circRNA לבניית ספריות ברצף של circRNA. בהתבסס על הערכות של מחקר זה, מספר היבטים מרכזיים ושלבים קריטיים ביצירת ספריות רצף של circRNA גלויים לעין. ההערכה שלנו מאשרת את השירות של RNase R טרום הטיפול, כפי שמתבטא מספר מוגבר של circRNAs זוהה. באופן כללי, מגוון גבוה יותר של circRNAs בעת שימוש בערכת הספריה של המאייר TruSeq עם RNase R טרום הטיפול ו 4 μg של קלט RNA נצפתה. תוצאות אלה מיושרות עם ממצאים קודמים שצעד ההעשרה של RNase R מועיל לזיהוי של circRNAs2.
היבטים מרכזיים נוספים של בניית הספרייה circRNA כוללים את כמות ה-RNA הכולל הזמין לרצף, כמו גם את סוג של רקמות כי RNA שחולצו מ. למרות 4 μg קלט של RNA סה כ נמצא להניב את המספר הגבוה ביותר של circRNAs שזוהו, רוב מחקרים RNAseq לנצל < = 1 μg של RNA סה כ כגון השגת כמויות גבוהות יותר עשוי להיות מאתגר, במיוחד עבור ניתוח של דגימות אדם. זיהוי של circRNAs נשאר אפשרי עבור סכומי קלט נמוכים יותר, אך הוא רלוונטי להכיר בכך שייתכן שהספציפיות של הניתוח מושפעים. מחקר זה מדגיש עוד יותר את המספר הגבוה של circrnas שזוהו במוח האנושי לעומת רקמות אחרות, כפי שדווח בעבר19,20. לכן קריטי להכיר בביטוי הדיפרנציאלי של circRNAs על-פני סוגי רקמות שונים. יתר על כן, מחקר נוסף בהקשר של מחלות יהיה חשוב לשפוך אור לתוך כיצד circRNAs עשוי להיות מעורב בתהליכים פתוגניים.
הביצועים של שתי ערכות ה-RNA המוערך בספריה הכנה גם מדגיש כי למרות ערכות שונות מסחרית זמין עשוי להפגין דמיון משמעותי, ההבדלים עדיין נצפו בעת ניתוח circRNAs. שני ממצאים עיקריים מהשוואת השוואה זו כוללים מחסור rRNA ומספר נמוך יותר של circRNAs שזוהו באמצעות גישה אחת. בעוד אפשרות אחת היא כי שפע גבוה יותר של rRNA במדגם עלול להפריע ליצירת רצף מולקולות הספרייה circRNA, ממצא זה מדגיש את הצורך להעריך ערכות דומות לכאורה, במיוחד כאשר ריאגנטים הם קניינית.
למרות שהנתונים המוצגים כאן מספקים תובנות לקיום ולשפע של circRNAs בסוגי רקמות שונים, למחקר זה יש מספר מגבלות טכניות. ראשית, בעוד הטיפול RNase R מפחית את האוכלוסייה של RNAs ליניארי במדגם, זה לא הבינו היטב אם צעד זה מצמצם מציג כל הביוסים בזיהוי circRNA והאם עשוי לרוקן Circrna. מחקרים קודמים דיווחו כי במקרים מסוימים, circrnas הם רגישים rnase R2,24,25. שנית, לא ברור אם הגדלת הקלט RNA הכולל מעל 4 μg יביא לעלייה ליניארית במספר הנתונים של circRNAs המזוהים. כפי שהוזכר קודם לכן, רנ א זמין לעתים קרובות מוגבל במחקרים מחקר כל כך כמויות קלט נמוך נחשבו כאן. לתשומת לבך, ניתן עדיין לזהות את circRNAs בעת שימוש בקלט תחתון, אך חשוב להכיר בכך שקלט תחתון משויך לזיהוי מספר נמוך יותר של circRNAs. שלישית, הפרוטוקול הממוטב המוצג כאן מנצל RNAs שחולצו מתוך מערכת מסוימת של רקמות. בהינתן התפלגות המשתנה של ביטוי circRNA על-פני סוגי רקמות שונים, השיוך בין סכומי הקלט של RNA הכולל ומספר הcircrna המזוהים עשוי להיות שונה באמצעות רקמות.
עם הגדלת האינטרסים של הבנת התפקיד הביולוגי של circRNAs, גם אסטרטגיות חדשות מפותחות כדי לאפשר בצורה טובה יותר אפיון וזיהוי של circRNAs. גישה חדשה בביואינפורמטיקה מאפשרת זיהוי של circRNAs שעשוי להיות נמוך ביטוי באמצעות שחזור של circRNAs באורך מלא, וכן גם מאפשר כימות ביטוי של Circrnas מסוימים מסוג מסוים26. גישה זו מנצלת תכונות המתוארות כקריאות חפיפה הפוכה (RO) שעלולות להתרחש בקצוות של 3 ' או 5 ' של מולקולות הספריות של circRNA. פיתוח אסטרטגיות חדשות לזיהוי circRNAs, המקיף הן גישות מעבדה וכלים ביואינפורמטיקה, יתרום להבנת התחום של הפונקציה וההשפעה של circRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנחנו אסירי תודה על באנר שמש המחקר המכון לחקר המוח והגוף תרומות (BBDP) של סאן סיטי, אריזונה לאספקת רקמות המוח האנושי. BBDP נתמך על ידי המכון הלאומי של הפרעות נוירולוגיות שבץ (U24 NS072026 המוח הלאומי משאב רקמות למחלת פרקינסון והפרעות קשורות), המכון הלאומי על הזדקנות (P30AG19610 אריזונה מחלת ליבה של אלצהיימר), מחלקת אריזונה של שירותי בריאות (חוזה 211002, אריזונה אלצהיימר מרכז המחקר), הנציבות אריזונה מחקר ביו (חוזים 4001, 0011, 05-901 ו 1001 הקונסורציום מחלת פרקינסון אריזונה) ואת מייקל J. קרן פוקס לחקר פרקינסון27. מחקר זה היה נתמך גם על ידי המולדת ומדינת אריזונה (המענק ADHS ADHS14-052688). אנו מודים גם לאנדריאה שמיט (מחקר באנר) ולסינתיה לצ (TGen) לתמיכה ניהולית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
- Salzman, J., Gawad, C., Wang, P. L., Lacayo, N., Brown, P. O. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types. PloS One. 7 (2), e30733 (2012).
- Jeck, W. R., et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats. RNA. 19 (2), 141-157 (2013).
- Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
- Sanger, H. L., Klotz, G., Riesner, D., Gross, H. J., Kleinschmidt, A. K. Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (11), 3852-3856 (1976).
- Nigro, J. M., et al.
- Salzman, J., Chen, R. E., Olsen, M. N., Wang, P. L., Brown, P. O. Cell-type specific features of circular RNA expression. PLoS Genetics. 9 (9), e1003777 (2013).
- Du, W. W., et al. Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. European Heart Journal. 38 (18), 1402-1412 (2016).
- Capel, B., et al. Circular transcripts of the testis-determining gene Sry in adult mouse testis. Cell. 73 (5), 1019-1030 (1993).
- Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
- Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495 (7441), 384-388 (2013).
- Li, Z., et al. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 256-264 (2015).
- Tan, W. L., et al. A landscape of circular RNA expression in the human heart. Cardiovascular Research. 113 (3), 298-309 (2016).
- Zhong, Z., Lv, M., Chen, J. Screening differential circular RNA expression profiles reveals the regulatory role of circTCF25-miR-103a-3p/miR-107-CDK6 pathway in bladder carcinoma. Scientific Reports. 6, 30919 (2016).
- Gao, Y., Wang, J., Zhao, F. CIRI: an efficient and unbiased algorithm for de novo circular RNA identification. Genome Biology. 16, 4-014-0571-0573 (2015).
- Wang, K., et al. MapSplice: accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), e178 (2010).
- Szabo, L., et al. Statistically based splicing detection reveals neural enrichment and tissue-specific induction of circular RNA during human fetal development. Genome Biology. 16, 126-015-0690-0695 (2015).
- Cheng, J., Metge, F., Dieterich, C. Specific identification and quantification of circular RNAs from sequencing data. Bioinformatics. 32 (7), 1094-1096 (2016).
- Zhang, X. O., et al.
- Rybak-Wolf, A., et al. Circular RNAs in the mammalian brain are highly abundant, conserved, and dynamically expressed. Molecular Cell. 58 (5), 870-885 (2015).
- Ji, P., et al. Expanded Expression Landscape and Prioritization of Circular RNAs in Mammals. Cell Reports. 26 (12), 3444-3460 (2019).
- Hansen, T. B., Venø, M. T., Damgaard, C. K., Kjems, J. Comparison of circular RNA prediction tools. Nucleic Acids Research. 44 (6), e58 (2016).
- Zeng, X., Lin, W., Guo, M., Zou, Q. A comprehensive overview and evaluation of circular RNA detection tools. PLoS Comput Biol. 13 (6), e1005420 (2017).
- Sekar, S., et al. ACValidator: a novel assembly-based approach for in silico validation of circular RNAs. bioRxiv. , (2019).
- Westholm, J. O., et al. Genome-wide analysis of drosophila circular RNAs reveals their structural and sequence properties and age-dependent neural accumulation. Cell Reports. 9 (5), 1966-1980 (2014).
- Szabo, L., Salzman, J. Detecting circular RNAs: bioinformatic and experimental challenges. Nature Reviews Genetics. 17 (11), 679-692 (2016).
- Zheng, Y., Ji, P., Chen, S., Hou, L., Zhao, F. Reconstruction of full-length circular RNAs enables isoform-level quantification. Genome Medicine. 11 (1), 2 (2019).
- Beach, T. G., et al. Arizona study of aging and neurodegenerative disorders and brain and body donation program. Neuropathology. 35 (4), 354-389 (2015).
