Summary
원형 RNA (circRNAs)는 단백질 사이 전사 규칙 그리고 중재 상호 작용에 있는 역할을 할 수 있는 비 코딩 RNA입니다. circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 구성을 위한 상이한 파라미터의 평가에 이어, RNase R 전처리와 함께 좌초된 총 RNA 라이브러리 제제를 활용한 프로토콜이 컴파일되고 여기에 제시된다.
Abstract
원형 RNA (circRNAs)는 마이크로 RNA (miRNA) 규정, 단백질 상호 작용의 중재 및 부모 유전자 전사의 조절을 포함하는 기능에 관여하는 비 코딩 RNA의 부류입니다. 고전적인 차세대 RNA 염기서열 분석(RNA-seq)에서 circRNAs는 전형적으로 mRNA 라이브러리의 시공 동안 폴리-A 선택의 결과로 간과되거나 매우 낮은 풍부함에서 발견되며, 따라서 분리 및 검출하기 가 어렵습니다. 여기서, circRNA 라이브러리 시공 프로토콜은 라이브러리 제제 키트, 전처리 옵션 및 다양한 총 RNA 입력 량을 비교하여 최적화되었다. RNase R 전처리 및 가변 적인 양의 총 RNA 입력(1~ 4 μg)을 사용 하 여 2 개의 시판 된 전체 전사체 라이브러리 준비 키트를 테스트 했습니다. 마지막으로, 여러 조직 유형; 간을 포함 하 여, 폐, 림프절, 그리고 췌 장; 뿐만 아니라 여러 뇌 영역; 소뇌, 열등한 정수리 엽, 중간 측두엽, 후두 피질 및 우수한 전두엽 자이러스를 포함; 조직 모형에 걸쳐 circRNA 풍부를 평가하기 위하여 비교되었습니다. 6개의 서로 다른 circRNA 검출 도구(find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC 및 CIRCexplorer)를 사용하여 생성된 RNA-seq 데이터를 분석한 결과 RNase R 전처리 및 4 μg RNA 입력을 사용한 총 RNA 라이브러리 준비 키트가 최적임을 밝혀냈습니다. circRNAs의 가장 높은 상대 수를 식별하는 방법. 이전 사실 인정과 일치, circRNAs의 가장 높은 농축 다른 조직 유형에 비해 뇌 조직에서 관찰 되었다.
Introduction
원형 RNA(CircRNAs)는 진핵 전사체1,2,3에서그들의 만연한 발현을 감안할 때 주목을 받고 있는 내인성, 비코딩 RNA이다. 그(것)들은 exons가 서로 에 다시 접합할 때 형성되고, 그러므로 처음에 접합유물4,5로여겨졌습니다 . 그러나, 최근 연구에 따르면 circRNAs는 세포 유형, 조직 및 발달 단계 특이적 발현3,6을 나타내고 진화적으로 보존되는2,3. 더욱이, 이들은 단백질-단백질 상호작용7,마이크로RNA(miRNA) 결합3,8,9,10,및 부모 유전자전사(11)의조절에 관여한다.
고전적인 RNA 염기서열 분석(RNA-seq)에서, circRNAs는 mRNA를 위한 폴리-A 선택의 결과로 라이브러리 시공 도중 완전히 손실될 수 있거나 그들의 낮은 풍부도를 감안할 때 격리하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 최근 circRNA 특성화 연구는 CircRNAs2,12,13을풍부하게 하기 위해 RNase R을 이용한 전처리 단계를 통합했다. RNase R은 선형 RNA를 소화하는 외분비증으로, 원형 RNA 구조를 남깁니다. CircRNA 농축 프로토콜은 RNase R 전처리 단계의 유무에 관계없이 시판되는 두 개의 전체 전사체 라이브러리 구성 키트에서 데이터를 생성 및 비교하고 다양한 양의 총 RNA 입력(1 ~ 4 μg)을 사용하여 최적화되었습니다. 최적화된 프로토콜은 5개의 상이한 뇌 영역(소뇌 [BC], 열등한 정수리 엽 [IP], 중간 측두엽 [MG], 후두 피질 [OC] 및 우수한 전두엽 자이러스 [SF]) 및 4개의 다른 조직 유형(간[LV], 폐[LU]] 및 파프린스 [LN]에 걸쳐 circRNAs의 풍부를 평가하는 데 사용되었다. RNA-seq 라이브러리는 짝을 이루고 데이터를 6개의 상이한 circRNA 예측 알고리즘을 사용하여 분석했다: find_circ3,CIRI14,Mapsplice15,나이프16,DCC17,및 CIRCexplorer18. 우리의 분석에 기초하여, RNase R 전처리 및 4 μg 총 입력 RNA를 가진 좌초된 총 RNA 라이브러리 준비 키트를 사용할 때 가장 많은 고유 circRNAs가 검출되었다. 최적화된 프로토콜은 여기에 설명되어 있습니다. 이전에 보고 된 바와 같이19,20,circRNAs의 가장 높은 농축은 다른 조직 유형에 비해 뇌에서 관찰되었다.
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Protocol
이 연구는 인간의 복지에 대한 모든 제도적, 국가적, 국제적 지침을 준수하여 수행되었습니다. 뇌 조직은 애리조나 주 선시티에 있는 배너 선 건강 연구소 뇌 및 신체 기증 프로그램에서 얻어졌습니다. 두뇌와 바디 기증 프로그램의 운영은 서부 기관 검토 위원회 (WIRB 프로토콜 #20120821)에 의해 승인됩니다. 모든 주체 또는 법정 대리인은 통보된 동의서에 서명했습니다. 상업적(비뇌) 생물표본은 프로테오제넥스로부터 구입하였다.
1. RNase R 치료
참고: 다음 단계에서, 반응 부피는 총 부피 50 μL로 조정된다. 이것은 RNA 정리 및 농축기 키트에 사용되는 최소 샘플 부피입니다(재료 표참조). 부가적으로, 여기서 설명된 최적화된 프로토콜은 총 RNA의 4 μg의 입력량에 대한 것이다. RNase R 치료를 위한 더 긴 배양 시간은 입력량 >4 μg에 권장됩니다.
- 총 RNA를 39 μL RNase 불물에서 4 μg로 미세 원심 분리 튜브에 희석하고 파이펫팅을 통해 잘 섞습니다.
- 별도의 튜브에서 RNase R을 1X RNase R 반응 버퍼로 2 U/μL의 작동 농도로 희석합니다. 즉시 사용하기에 충분합니다.
- 파이펫 39 μL의 총 RNA 및 10x RNase R 반응 버퍼의 5 μL을 1.5 mL 반응 튜브에 넣고 파이펫팅에 의해 잘 혼합된다 (50 μL은 총 반응 량이 될 것이다). 다음으로 RNase R(2 U/μL)의 6μL을 추가합니다.
- 파이펫을 전체 반응 량(50 μL)으로 조정하고 10회 위아래로 파이펫팅하여 잘 섞습니다.
- 튜브를 37°C 수조에 10분 동안 놓습니다.
- 튜브를 얼음 위에 놓고 즉시 RNA 정화 및 농도(섹션 2)를 진행합니다.
2. RNA 정화 및 농축기 키트를 사용하여 RNA 정화
참고: 고품질 RNA (RIN>8, DV200>80%)를 사용하는 경우, RNase R 치료는 RNA의 약 60%의 손실을 초래할 수 있습니다. 4 μg 입력을 사용하여, 처리된 RNA의 2-2.5 μg가 섹션 1 후에 남아 있는 것으로 추정된다.
- 시작하기 전에, 버퍼 농축액에 100% 에탄올 48 mL를 첨가하여 RNA 세척 버퍼를 준비하고 파이펫팅을 통해 잘 섞는다. 정화 컬럼을 수집 튜브에 넣고(재료 표참조) 튜브 랙에 놓습니다.
참고: 다음 모든 단계에 대해 다음 원심 분리 설정을 사용합니다: 10,000-16,000 x g. DNase I 치료가 이미 수행된 경우 이 단계에서 DNase I 치료를 건너뜁니다. - RNase R 처리 된 샘플에 2 개의 RNA 결합 버퍼를 추가하고 파이펫팅 (총 부피 : 150 μL)으로 잘 혼합하십시오.
- RNA 결합 버퍼 및 RNase R 처리 된 샘플 혼합물에 1 부피 1 부피를 추가하고 파이펫팅 (총 부피 : 300 μL)으로 잘 섞습니다.
- 전체 볼륨을 컬럼으로 전송하고 30초 동안 컬럼을 원심분리합니다.
- 400 μL의 RNA 준비 버퍼를 컬럼에 직접 추가하고, 30초 동안 컬럼을 원심분리하고, 흐르는 흐름을 폐기합니다.
- 700 μL의 RNA 세척 버퍼를 컬럼에 직접 추가하고, 30초 동안 컬럼을 원심분리하고, 흐르는 흐름을 폐기합니다.
- 400 μL의 RNA 세척 버퍼를 컬럼에 직접 넣고 2분 동안 컬럼을 원심분리하고 컬럼을 신선한 RNase 프리 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 넣습니다.
- 열 필터 바로 위에 파이펫 팁을 잡고 물이 기둥 필터에만 닿도록 하여 11 μL의 RNase-free 물을 컬럼에 직접 추가합니다.
- 실온에서 1 분 동안 컬럼을 배양하고 원심 분리기를 1 분 동안 배양합니다.
- 컬럼을 폐기하기 전에 RNase 가없는 튜브에서 흐르는지 확인하십시오. 용출이 성공하면 샘플을 -80°C에 저장하거나 즉시 라이브러리 준비를 진행합니다. 약 10 μL의 최종 총 용출 부피가 라이브러리 시공에 사용됩니다.
참고: 중지 지점: RNA를 -80°C에서 최대 7일 간 방치한 후 라이브러리 준비를 계속하십시오.
3. circRNA 도서관 준비
참고: 이 섹션에서 사용되는 대부분의 시약을 포함하는 키트용 재료 표를 참조하십시오.
- rRNA 고갈 및 단편화
- 정제된 RNA의 10 μL을 2.10단계에서 새로운 96웰 0.3 mL PCR 플레이트에서 깨끗한 우물로 옮김. 잘, 5 μL의 rRNA 결합 버퍼를 넣고 5 μL rRNA 제거 믹스를 추가합니다. 부드럽게 파이펫을 위아래로 10회 부드럽게 섞어주세요.
- 미리 프로그래밍된 사전 가열된 열자전거 블록에서 68°C에서 5분 동안 인큐베이션합니다. 5 분 배양을 완료 한 후, 벤치에 접시를 놓고 실온에서 1 분 동안 배양하십시오.
- 접시에서 씰을 제거합니다. 35 μL의 와르텍스실 온온 rRNA 제거 비드를 시료에 넣습니다. 파이펫을 45μL로 조정하고 파이펫을 10~20배 위아래로 조정하여 완전히 혼합합니다. 실온에서 1 분 동안 인큐베이팅 플레이트.
- 플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮기고 스탠드에서 1분 동안 또는 용액이 지워지때까지 인큐베이팅합니다. 모든 상판(~45 μL)을 동일한 플레이트또는 새 플레이트에 새 우물로 옮김(작업중인 샘플 수에 따라 다름).
- RNA 정화 구슬을 소용돌이(재료 표참조)가 잘 분산될 때까지, 각 샘플에 99 μL의 구슬을 추가한다. 파이펫을 위아래로 10배 섞어 보시고 섞어보시다. 접시를 실온에서 10 분 동안 배양합니다.
- 플레이트를 마그네틱 스탠드로 옮기고 5분 간 추가로 인큐베이션하거나 용액이 지워지때까지 배양합니다. 우물에서 상급자 모두를 제거하고 버린다.
- 마그네틱 스탠드에 여전히 플레이트를 장착한 후, 구슬을 방해하지 않고 새로 준비된 80% EtOH의 200 μL을 웰에 추가합니다. 30 s에 대 한 배양, 다음 제거 하 고 에탄올을 폐기. 총 2회 를 반복합니다.
- 각 우물에 11 μL의 용출 버퍼를 추가하고 파이펫을 위아래로 10회 섞어 보입니다. 실온에서 2분 동안 인큐베이션한 다음 용액이 지워지지 때까지 자기 스탠드로 옮김(1-5분).
- 상급물의 8.5 μL을 우물에서 동일한 플레이트 또는 새 판에 새 우물로 옮김. 엘루트, 프라이머, 프래그먼트 하이 믹스의 8.5 μL을 각 웰 함유 시료에 추가합니다. 파이펫을 위아래로 10회 완전히 섞어 줍니다.
- 사전 프로그래밍된 사전 가열된 열자전거 블록에서 94°C에서 8분 동안 인큐베이션합니다. 4 °C에 도달하면 열자전거에서 제거하고 원심 분리기를 짧게 제거하십시오.
참고: 신디사이징 퍼스트 스트랜드 cDNA 프로토콜을 즉시 진행합니다.
- cDNA 합성
- 제조중인 각 샘플에 대해, 9 μL 첫 번째 스트랜드 합성 믹스를 역전사 1 μL과 혼합합니다(재료 표참조). 혼합물의 8 μL을 샘플에 추가합니다. 파이펫을 위아래로 6번 섞어 섞으세요.
- 밀봉 플레이트 및 다음과 같은 파라미터를 사용하여 미리 프로그램된 예열 열사이클러 블록상에서 배양: 10분 동안 25°C, 15분 동안 42°C, 15분 동안 70°C, 4°C 홀드. 즉시 두 번째 가닥 합성을 진행합니다.
- 각 샘플에 5 μL의 재서스펜션 버퍼를 넣고 20 μL의 두 번째 스트랜드 마킹 마스터 믹스를 추가합니다. 전체 볼륨을 6회 위아래로 파이펫합니다.
- 플레이트를 밀봉하고 1시간 동안 16°C로 설정된 사전 가열된 열열 사이클러 블록상에 인큐베이션한다. 배양 후, 열자전거에서 플레이트를 제거하고 실온에 평형화시키십시오.
- 소용돌이 PCR 정제 비드 (재료 표참조) 및 샘플의 각 우물에 90 μL 비드를 추가합니다. 파이펫을 위아래로 10회 완전히 섞어 줍니다. 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- 비드/샘플 믹스를 마그네틱 스탠드에 옮기고 5분 동안 또는 액체가 깨끗해질 때까지 배양합니다. 장식품을 제거하고 폐기하십시오.
- 각 샘플에 80% EtOH의 200 μL을 추가합니다. 30 초 동안 실온에서 자기 스탠드에 샘플을 인큐베이터하십시오. 1x를 반복합니다.
- 구슬이 실온에서 6분 동안 건조되도록 한 다음 마그네틱 스탠드에서 제거합니다.
- 19.5 μL의 재서스펜션 버퍼에서 비드를 다시 일시 중단합니다. 파이펫을 위아래로 10회 완전히 섞어 줍니다. 실온에서 2 분 동안 배양 한 다음 자기 스탠드로 옮기고 추가로 1 분 동안 또는 액체가 지워지때까지 배양하십시오.
- 17.5 μL의 상판을 새로운 우물/새 플레이트로 옮김.
참고: 즉시 진행되지 않으면 샘플을 -20°C에서 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다.
- 제조중인 각 샘플에 대해, 9 μL 첫 번째 스트랜드 합성 믹스를 역전사 1 μL과 혼합합니다(재료 표참조). 혼합물의 8 μL을 샘플에 추가합니다. 파이펫을 위아래로 6번 섞어 섞으세요.
- 도서관 준비
- 상급물질을 함유한 각 우물에 12.5 μL의 A-테일링 믹스를 추가합니다. 전체 볼륨을 위아래로 10회 파이펫하여 혼합합니다.
- 다음 파라미터를 사용하여 37°C로 설정된 미리 프로그래밍된 예열 열사이클러 블록상에서 반응을 인큐베이션합니다: 30분 동안 37°C, 5분 동안 70°C, 4°C 홀드. 시료가 4°C에 도달하면 즉시 어댑터 결찰을 진행합니다.
- 각 샘플에 2.5 μL의 재서스펜션 버퍼, 2.5 μL의 고유 RNA 어댑터 및 2.5 μL의 결찰 믹스를 추가합니다. 파이펫을 위아래로 10배 섞어 보시고 섞어보시다.
- 30°C에서 10분 동안 미리 프로그래밍된 예열 열자전거 블록에 샘플을 인큐베이트합니다.
- 각 시료에 5 μL의 스톱 리감 버퍼를 추가하고 파이펫을 위아래로 섞어 보도록 합니다.
- 각 샘플에 42 μL의 혼합 PCR 정제 구슬을 넣고 완전히 섞습니다. 3.2.6 단계부터 3.2.10 단계까지 를 따르되, 재서스펜션 부피를 52 μL로 변경하고 최종 용출 볼륨을 50 μL로 변경하십시오.
- 3.3.6단계에서 50 μL 용출을 사용하여 PCR 정제 비드 프로토콜을 다시 반복하지만 재서스펜션 부피를 22 μL로 변경하고 최종 용출 볼륨을 20 μL로 변경합니다.
참고: 즉시 진행되지 않으면 샘플을 -20°C에서 최대 7일 동안 보관할 수 있습니다. - 각 샘플에 PCR 프라이머 칵테일 5 μL과 PCR 마스터 믹스 25 μL을 추가합니다. 위아래로 10번 파이펫팅하여 섞으세요. 다음 파라미터를 사용하여 미리 프로그램된, 예열된 열사이클러 블록에 대한 반응을 배양한다: 30s에 대한 98°C; 이어서 10s에 대한 98°C의 8사이클, 30s에 대한 60°C, 30s에 대한 72°C; 72°C를 5분 동안 유지한 다음 4°C를 유지합니다.
참고: 시퀀싱을 위해 충분한 양의 라이브러리를 생성하려면 총 PCR 사이클 수를 최적화해야 할 수 있습니다. - 잘 혼합된 PCR 정제 비드 의 50 μL을 추가하고 30 μL의 최종 용출 부피로 재서스펜션 부피를 32.5 μL로 변경하는 것을 제외하고, PCR 비드 정제(단계 3.2.4 ~ 3.2.9)에 대한 프로토콜을 따르십시오.
참고: 샘플은 -20 °C에서 보관해야합니다.
- 핵산 분석기를 이용한 정량화 및 품질 관리
- 테이프와 시약이 실온에서 30분 동안 평형화되도록 하십시오.
- 2 μL의 라이브러리를 HS D1000 버퍼의 2 μL과 혼합하고 호환되는 웰 플레이트에 추가합니다.
- 호환 되는 호일 씰로 단단히 밀봉하고 2,000 rpm에서 1 분 동안 소용돌이를 밀봉하십시오.
- 소프트웨어 프롬프트에 따라 분석기에서 스핀다운 및 로드 플레이트를 돌이켜야 합니다.
참고: 라이브러리의 크기는 약 260bp여야 합니다.
4. 데이터 분석 워크플로우
- 82bp 의 쌍을 이루는 엔드 판독을 생성하는 RNA-seq 라이브러리(재료 표 참조)를 시퀀스. bcl2fastq 도구(v0.2.19)를 사용하여 기본 호출 파일(.bcl) 형태로 원시 시퀀싱 데이터를 FASTQ로 변환합니다.
- circRNAs를 감지합니다.
참고: 이전에 보고된 증거에 기초하여 앙상블 circRNA 검출 접근법은 단일 검출 도구21,22를사용하는 것에 비해 더 잘 수행된다는 것을, 우리는 circRNA 검출을 위한 다중 공구를 사용하는 것이 좋습니다. 여기서 circRNAs는 find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE 및 DCC의 6개의 기존 circRNA 예측 알고리즘을 사용하여 각 알고리즘에 권장되는 매개 변수 설정을 적용하여 확인되었습니다.- 개발자가 제공한 지침을 사용하여 Linux 고성능 컴퓨팅 클러스터에 각 circRNA 검색 알고리즘을 다운로드하여 설치합니다.
- RNA-seq FASTQs를 각 공구에 권장되는 정렬자를 활용하여 기준 게놈(GRCh37)에 맞춥습니다.
- 정렬 다음, 각각의 권장 매개 변수 설정을 적용하여 circRNA 검출 알고리즘을 실행합니다.
- 각 도구는 각 샘플/테스트 조건에서 검색된 후보 수를 정량화하기 위해 감지된 circRNAs 목록과 함께 다중 열 결과 파일을 출력하고 circRNA 좌표를 추출하고 이로부터 읽기를 지원합니다.
- CIRI, Mapsplice 및 DCC에 의한 circRNA 좌표 출력을 다른 세 알고리즘과 일치하도록 0기반 좌표로 변환합니다.
- 두 개 이상의 지원 읽기 또는 다운스트림 분석 및 비교가 있는 circRNAs를 선택합니다. 표 1은 각 샘플에 대해 생성된 총 시퀀싱 판독 횟수와 함께 연구에서 평가된 모든 매개 변수를 요약합니다.
- 각 샘플/테스트 조건에 대해 해당 라이브러리에 대해 생성된 매핑된 읽기 수(백만개)로 정규화된 검색된 circRNAs 수를 계산합니다. 대표 결과에 자세히 설명된 대로 상자 플롯의 다양한 도구/샘플에서 결과를 요약합니다.
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Representative Results
시판되는 범용 제어 RNA(UC)를 사용하여 생성된 데이터와 두 개의 라이브러리 준비 키트를 사용하여 생성된 데이터는 둘 다 프로토콜에서 리보 고갈 단계를 포함하고, 먼저 평가되었다. 분석 워크플로우(데이터 분석 워크플로우, 섹션 4)를 사용하여 전체적으로 Kapa 데이터 집합에 비해 TruSeq 데이터 집합에서 더 많은 수의 circRNAs가 검출되었습니다(그림1). 리보소말 RNA(rRNA) 백분율은 낮은 입력 량(1, 2 ug)에 대한 두 키트의 데이터 세트에서 5% 미만이었지만, Kapa 데이터 세트는 4, 5 및 10 ug 입력에 대한 더 높은 rRNA 함량을가졌다(표 2). 따라서, 검출된 circRNAs 및 rRNA 고갈 효율의 수에 기초하여, 추가의 실험은 TruSeq 키트를 사용하여 수행되었다.
다음으로, RNase R 전처리의 유의성RR 전처리 및 비처리 라이브러리로부터 생성된 데이터를 비교하여 시험하였다. 이를 위해, RNase R23을 사용하여 (N=3) 및(N=3) 전처리 없이(N=3)를 가진 라이브러리로부터 생성된 건강한 노인 개인의 MG 및 시퀀싱 데이터를 MG로부터 추출하였다. 더 높은 수의 circRNAs는 전처리되지 않은 라이브러리에 비해 전처리된 라이브러리에서 일관되게 확인되었다(그림2). 이는 전처리가 선형 RNA를 제거하여 circRNA 종을 풍부하게 하기 때문에 예상됩니다.
셋째, circRNAs의 더 높은 다양성을 검출하기 위해 최적일 입력 RNA의 양을 시험했다. 라이브러리는 MG, OC 및 SF 뇌 영역, 및 UC RNA로부터 추출된 총 입력 RNA의 1, 2 및 4 μg를 사용하여 제조하였다. 각 라이브러리에서 검출된 circRNAs의 풍부를 비교하여, 확인된 고유 circRNAs의 수에 의해 반영된 바와 같이, 2 및 1 μg(그림3)에비해 4 μg 입력 RNA를 사용할 때 circRNA 종의 가장 높은 다양성이 관찰되었다. 주의해야 할 한 가지 주의사항은 RNase R 치료 동안 다양한 배양 시간이 테스트되지 않았지만, 다른 모든 파라미터를 조절할 때 총 RNA 입력에서 1~4μg의 circRNAs가 검출되는 추세가 관찰되었다는 점입니다.
이 최적화된 프로토콜은 circRNA 풍부도를 비교하기 위하여 다중 조직 모형에 걸쳐 그 때 적용되었습니다. BC, MG, OC, IP 및 SF를 포함한 5개의 뇌 영역은 4명의 건강한 노인개인으로부터, 6명의 건강한 기증자로부터 LV, LU, LN 및 PA를 포함한 4가지 다른 조직 유형과 함께 시험되었습니다. 전반적으로, 이전에 보고된 바와 같이, 다른 조직유형(도 4)에비해 뇌에서 더 높은 풍부한 circRNAs가 관찰되었다19,20.
그림 1: TruSeq 대 카파 총 RNA 키트를 사용한 CircRNA 검출. 시퀀싱 데이터는 UC RNA에 대해 각각 1, 2, 4, 5 및 10 μg 입력 RNA 및 리보누클러R(RNase R) 전처리를 가하는 2개의 개별적인 총 RNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 생성되었다. 각 샘플의 도구에 의해 검출된 circRNAs의 수는 백만(Y축)당 매핑된 판독 횟수로 정규화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: RNase R 전처리 유무에 관계없이 CircRNA 검출. TruSeq 키트를 사용하여 생성된 시퀀싱 데이터는 RNase R 전처리의 영향을 비교하는 데 사용되었습니다. RNA는 이 분석을 위한 건강한 노인 대조군의 중간 측두엽(MG)으로부터 추출되었다. 표준화된 circRNAs(Y축)의 수는 그림 1과유사하게 계산되었습니다. RNase R + = RNase R- = RNase R로 미리 처리되지 않음으로 사전 처리되지 않음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 다양한 양의 입력 RNA를 이용한 CircRNA 검출. MG, 후두 피질(OC) 및 우수한 전두엽 자이러스(SF)로부터 추출된 RNA를 사용하여 UC RNA뿐만 아니라, 입력 RNA의 1, 2 및 4 μg를 사용할 때 검출된 고유 circRNAs의 수를 사용하여, 각각의 라이브러리가 TruSeq 키트 및 RNase R 전처리를 사용하여 시공되었다. 표준화된 circRNAs(Y축)의 수는 그림 1과유사하게 계산되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 뇌에서 CircRNA 검출 대 다른 조직 유형. CircRNA 농축 된 데이터 세트를 포함 하 여 다양 한 뇌 영역에서 추출 된 RNA를 사용 하 여 소뇌 (BC), 열등 한 정수리 엽 (IP), MG, OC, 그리고 SF, 뿐만 아니라 간 을 포함 하 여 4 개의 다른 조직 유형 (LV), 폐 (LU), 림프절 (LN), 그리고 췌 장 (PA) 생성 되었다. CircRNA 농축은 RNase R 전처리 및 총 입력 RNA의 4 μg를 이용한 일루미나 트루세크 키트를 사용하여 수행되었다. 상자 플롯은 각 뇌 영역/조직 유형에서 샘플에 걸쳐 6개의 도구 중 적어도 3개에 의해 검출된 circRNAs의 수를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 테스트 # | 매개 변수 평가 | 테스트 조건 | 샘플 소스 | 입력 량/조건/샘플 테스트 | 총 시퀀싱 읽기 수 |
| 1 | 도서관 준비 키트 | 일루미나 트루세크 스트랜드 토탈 RNA vs. 로슈 카파 토탈 RNA 키트 | Uc | 트루세크: 1 μg | 8,91,46,128 |
| 트루세크: 2 μg | 7,93,90,202 | ||||
| 트루세크: 4 μg | 6,66,12,238 | ||||
| 트루세크: 5 μg | 7,88,56,902 | ||||
| 트루세크: 10 μg | 6,61,06,874 | ||||
| 카파: 1 μg | 8,83,95,496 | ||||
| 카파: 2 μg | 10,66,59,272 | ||||
| 카파: 4 μg | 10,62,34,954 | ||||
| 카파: 5 μg | 7,47,75,914 | ||||
| 카파: 10 μg | 11,00,68,504 | ||||
| 2 | 전처리 | RNase R 전처리 vs. 비 전처리 | Mg | 쌍1: MG_1 (RNase R+) | 10,76,09,934 |
| 페어1: MG_5 (RNase R-) | 9,62,15,516 | ||||
| 쌍2: MG_2 (RNase R+) | 9,68,40,790 | ||||
| 페어2: MG_6 (RNase R-) | 10,16,09,754 | ||||
| 쌍3: MG_3 (RNase R+) | 11,15,76,344 | ||||
| 페어3: MG_7 (RNase R-) | 11,13,14,114 | ||||
| 3 | 총 RNA 입력 | 1 μg 대 2 μg 대 4 μg | MG, OC, SF, UC | MG: 1 μg | 12,00,94,758 |
| MG: 2 μg | 11,64,75,728 | ||||
| MG: 4 μg | 12,13,15,232 | ||||
| OC: 1 μg | 11,11,18,120 | ||||
| OC: 2 μg | 11,53,25,492 | ||||
| OC: 4 μg | 11,49,13,266 | ||||
| SF: 1 μg | 12,27,24,142 | ||||
| SF: 2 μg | 9,39,33,288 | ||||
| SF: 4 μg | 12,33,31,474 | ||||
| UC: 1 μg | 9,24,48,120 | ||||
| UC: 2 μg | 12,58,15,354 | ||||
| UC: 4 μg | 12,56,92,534 | ||||
| 4 | 조직 유형 | 뇌 영역 대. 다른 조직 유형 | BC, MG, OC, SF, IP, 루, LV, LN, PA | BC_1 | 10,72,08,904 |
| BC_2 | 11,18,33,362 | ||||
| BC_3 | 9,61,25,856 | ||||
| BC_4 | 9,62,77,094 | ||||
| IP_1 | 9,86,56,506 | ||||
| IP_2 | 11,35,95,746 | ||||
| IP_3 | 12,87,81,536 | ||||
| IP_4 | 9,59,81,446 | ||||
| MG_1 | 10,76,09,934 | ||||
| MG_2 | 9,68,40,790 | ||||
| MG_3 | 11,15,76,344 | ||||
| MG_4 | 10,05,39,028 | ||||
| OC_1 | 8,85,47,042 | ||||
| OC_2 | 12,09,83,142 | ||||
| OC_3 | 10,26,55,452 | ||||
| OC_4 | 10,84,49,330 | ||||
| SF_1 | 8,76,21,824 | ||||
| SF_2 | 14,50,57,894 | ||||
| SF_3 | 11,01,52,030 | ||||
| SF_4 | 9,67,24,472 | ||||
| LN_1 | 15,02,94,816 | ||||
| LN_2 | 8,33,30,187 | ||||
| LN_3 | 11,30,96,032 | ||||
| LN_4 | 10,78,38,278 | ||||
| LU_1 | 16,05,27,595 | ||||
| LU_2 | 8,94,30,799 | ||||
| LU_3 | 9,14,51,858 | ||||
| LV_1 | 9,72,18,369 | ||||
| LV_2 | 10,54,16,880 | ||||
| LV_3 | 8,86,53,148 | ||||
| LV_4 | 8,61,02,943 | ||||
| LV_5 | 12,87,88,483 | ||||
| LV_6 | 11,87,76,622 | ||||
| PA_1 | 8,79,20,160 | ||||
| PA_2 | 7,82,36,741 | ||||
| PA_3 | 10,21,24,209 | ||||
| PA_4 | 11,53,22,926 |
표 1: 샘플 및 테스트 조건 요약. 이 연구에서 평가된 모든 매개 변수 및 테스트 조건의 요약과 각 샘플에 대해 생성된 총 시퀀싱 읽기 수입니다. UC = universal control, MG = middle temporal gyrus, OC = occipital cortex, BC = cerebellum, IP = inferior parietal lobe, SF = superior frontal gyrus, LU = lung, LV = liver, LN = lymph node, PA = pancreas, RNase R = ribonuclease R, RNase R+ = pre-treated with RNase R, RNase R- = not pre-treated with RNase R.
| 샘플 소스 | 입력 량/샘플 테스트 | 백분율 rRNA |
| Uc | 트루세크: 1 μg | 5.53% |
| 트루세크: 2 μg | 4.11% | |
| 트루세크: 4 μg | 4.38% | |
| 트루세크: 5 μg | 3.21% | |
| 트루세크: 10 μg | 3.74% | |
| 카파: 1 μg | 5.57% | |
| 카파: 2 μg | 4.56% | |
| 카파: 4 μg | 9.67% | |
| 카파: 5 μg | 12.69% | |
| 카파: 10 μg | 15.59% |
표 2: 트루세크 대 카파 라이브러리의 rRNA 백분율.
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Discussion
본 연구에서, 시판되는 2개의 라이브러리 준비 키트, 전처리 옵션 및 입력 RNA 양은 circRNA 염기서열 분석 라이브러리의 시공을 위한 circRNA 농축 프로토콜을 최적화하기 위해 시험되었다. 이 연구의 평가에 기초하여, circRNA 염기서열 분석 라이브러리를 만드는 중요한 단계및 중요한 단계의 숫자는 명백하다. 우리의 평가는 검출된 circRNAs의 증가수에 의해 반영되는 RNase R 전처리의 유용성을 확인합니다. 전반적으로, RNase R 전처리 및 4 μg의 입력 RNA와 함께 일루미나 TruSeq 라이브러리 키트를 사용할 때 circRNAs의 더 높은 다양성이 관찰되었다. 이러한 결과는 RNase R 농축 단계가 circRNAs2의검출에 유익하다는 이전 연구 결과와 일치합니다.
circRNA 라이브러리 구조의 추가 주요 양상으로는 RNA가 추출한 조직의 유형뿐만 아니라 시퀀싱에 사용할 수 있는 총 RNA의 양이 포함됩니다. 총 RNA의 4 μg 입력이 검출된 circRNAs의 가장 높은 수를 산출하는 것을 발견되었지만, RNAseq 연구의 대다수는 더 높은 양을 얻는 것이 도전적일 수 있다, 특히 인간 표본의 분석을 위해 총 RNA의 <=1 μg를 이용합니다. circRNAs의 식별은 낮은 입력 금액에 대해 가능한 상태로 유지되지만 분석의 특이성이 영향을 받을 수 있음을 인정하는 것과 관련이 있습니다. 이 연구는 이전에 보고된19,20. 따라서 다른 조직 모형에 걸쳐 circRNAs의 차등 표현을 인정하는 것이 중요합니다. 게다가, 질병의 맥락에서 추가 연구는 circRNAs가 병원성 프로세스에서 관련시킬 수 있는 방법에 빛을 흘리기 위해 중요할 것입니다.
2개의 평가된 RNA 라이브러리 준비 키트의 성과는 또한 다른 상업적으로 이용 가능한 키트가 중요한 유사성을 보여줄 수 있더라도, circRNAs를 분석할 때 다름이 아직도 관찰된다는 것을 강조합니다. 이 비교에서 2개의 중요한 사실 인정은 1개의 접근을 사용하여 확인된 감소된 rRNA 고갈 및 circRNAs의 더 낮은 수를 포함합니다. 한 가지 가능성은 견본에 있는 rRNA의 더 높은 풍부가 서열 가능한 circRNA 라이브러리 분자를 만드는 것을 방해할 수 있다는 것입니다, 이 사실 인정은 시약이 독점적인 경우에 특히, 겉보기에 유사한 키트를 평가하는 필요를 강조합니다.
여기에 제시된 데이터는 다양한 조직 유형에서 circRNAs의 존재와 풍부에 대한 통찰력을 제공하지만,이 연구는 몇 가지 기술적 한계가 있습니다. 첫째, RNase R 처리가 견본에 있는 선형 RNA의 인구를 감소시키는 동안, 이 고갈 단계가 circRNA 검출에 있는 어떤 편견을 소개하고 circRNAs를 고갈할 수 있는지 여부는 잘 이해되지 않습니다. 이전 연구는 어떤 경우에는 circRNAsRNas R2,24,25에민감하다고 보고했습니다. 둘째, 총 RNA 입력을 4 μg 이상으로 증가시키면 확인된 circRNAs의 수가 선형적으로 증가하게 될지는 불분명하다. 앞서 언급 했 듯이, 사용 가능한 총 RNA는 종종 연구 연구에서 제한 그래서 낮은 입력 금액 여기 고려 되었다. 참고로, circRNAs는 낮은 입력을 사용할 때 여전히 검색할 수 있지만 낮은 입력은 더 적은 수의 circRNAs 의 검색과 관련이 있음을 인정하는 것이 중요합니다. 셋째, 여기에 제시된 최적화된 프로토콜은 특정 조직 세트에서 추출된 RNA를 활용합니다. 상이한 조직 모형에 걸쳐 circRNA 발현의 가변 분포를 감안할 때, 총 RNA 입력 량과 확인된 circRNAs의 수 사이 협회는 조직 다사이에서 다를 수 있습니다.
circRNAs의 생물학적 역할을 이해하는 것에 대한 관심이 증가함에 따라 circRNAs의 특성화 및 식별을 더 잘 가능하게 하는 새로운 전략도 개발되고 있습니다. 1개의 새로운 생물정보학 접근은 전체 길이 circRNAs의 재건을 통해 낮게 표현될 수 있는 circRNAs의 확인을 가능하게 하고, 또한 특정 circRNA 이소폼26의발현의 정량화를 가능하게 합니다. 이 접근법은 circRNA 라이브러리 분자의 3' 또는 5' 말단에서 발생할 수 있는 역중첩(RO) 판독으로 기술된 특징을 활용한다. 실험실 접근법과 생물 정보학 도구를 모두 포괄하는 circRNAs를 식별하기위한 새로운 전략의 개발은 circRNAs의 기능과 영향에 대한 현장의 이해에 기여할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 인간의 뇌 조직의 제공에 대한 선 시의 배너 태양 건강 연구소 뇌와 신체 기증 프로그램 (BBDP)에 감사드립니다. BBDP는 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (U24 NS072026 파킨슨 병 및 관련 장애에 대한 국가 뇌 및 조직 자원), 노화에 대한 국립 연구소 (P30AG19610 애리조나 알츠하이머 병 핵심 센터), 건강 서비스의 애리조나 부서 (계약 211002, 애리조나 알츠하이머 연구 센터), 애리조나 생물 의학 연구위원회 (계약 4001, 0011, 05-901 및 1001 애리조나 파킨슨 병 컨소시엄) 및 마이클 J. 파 킨 슨 병의 연구에 대 한 폭스 재단27. 이 연구는 또한 DHS와 애리조나 주 (ADHS 교부금 # ADHS14-052688)에 의해 지원되었다. 우리는 또한 안드레아 슈미트 (배너 연구)와 신시아 레슈가 (TGen) 행정 지원을 주셔서 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
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