Summary
Gli RNA circolari (circRNA) sono RNA non codificanti che possono avere ruoli nella regolazione trascrizionale e nelle interazioni di mediazione tra proteine. A seguito della valutazione di diversi parametri per la costruzione di librerie di sequenziamento di circuitRNA, è stato compilato un protocollo che utilizza la preparazione della libreria totale di RNA spiaggiata con il pretrattamento di RNase R ed è presentato qui.
Abstract
Gli RNA circolari (circRNA) sono una classe di RNA non codificanti coinvolti in funzioni tra cui la regolazione del microRNA (miRNA), la mediazione delle interazioni proteina-proteina e la regolazione della trascrizione genica parentale. Nel sequenziamento dell'RNA di nuova generazione (RNA-seq) classico, i circolrRNA sono tipicamente trascurati come risultato della selezione poli-A durante la costruzione di librerie di mRNA, o si trovano a un'abbondanza molto bassa e sono quindi difficili da isolare e rilevare. In questo caso, un protocollo di costruzione della libreria di circRNA è stato ottimizzato confrontando kit di preparazione della libreria, opzioni di pretrattamento e varie quantità totali di ingresso di RNA. Sono stati testati due kit di preparazione della libreria di trascrittomi interi disponibili in commercio, con e senza RNase R pre-trattamento, e utilizzando quantità variabili di ingresso totale di RNA (da 1 a 4 g). Infine, più tipi di tessuto; tra cui fegato, polmone, linfonodo e pancreas; così come più regioni cerebrali; tra cui il cervelletto, il lobo parietale inferiore, il giro temporale medio, la corteccia occipitale e il giro frontale superiore; sono stati confrontati per valutare l'abbondanza di circRNA tra i tipi di tessuto. L'analisi dei dati generati in RNA-seq utilizzando sei diversi strumenti di rilevamento degli RNA (find_circ, CIRI, Mapsplice, KNIFE, DCC e CIRCexplorer) ha rivelato che un kit di preparazione della libreria di RNA totale infilato con pretrattamento RNase R e 4 g di ingresso in RNA è l'ottimale per identificare il numero relativo più elevato di circRNA. Coerentemente con i risultati precedenti, il più alto arricchimento dei circRNA è stato osservato nei tessuti cerebrali rispetto ad altri tipi di tessuti.
Introduction
Gli RNA circolari (CircRNA) sono RNA endogeni e non codificanti che hanno guadagnato attenzione data la loro espressione pervasiva nel trascrittoma eucarotico1,2,3. Si formano quando gli esoni si ricongiungino l'uno con l'altro e quindi sono stati inizialmente considerati artefatti di giunzione4,5. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che i circRNA presentano il tipo di cellula, il tessuto e l'espressione specifica dello stadio di sviluppo3,6 e sono evolutivamente conservati2,3. Inoltre, sono coinvolti nella mediazione delle interazioni proteina7, microRNA (miRNA) legame3,8,9,10, e la regolazione della trascrizione genica parentale11.
Nel sequenziamento dell'RNA classico (RNA-seq), i circRNA possono essere completamente persi durante la costruzione della biblioteca a causa della selezione poli-A per gli mRNA o possono essere difficili da isolare data la loro bassa abbondanza. Tuttavia, recenti studi di caratterizzazione degli anni 'rcRNA hanno incorporato una fase di pre-trattamento utilizzando RNase R al fine di arricchire per i circRNA2,12,13. RNase R è un exoribonucleolaga che digerisce gli RNA lineari, lasciando dietro di sé strutture circolari di RNA. I protocolli di arricchimento di CircRNA sono stati ottimizzati generando e confrontando i dati di due kit di costruzione della libreria di trascrittomi interi disponibili in commercio, con e senza una fase di pretrattamento di RNase R, e utilizzando quantità variabili di input totale di RNA (da 1 a 4 g). Il protocollo ottimizzato è stato successivamente utilizzato per valutare l'abbondanza di circRNA in cinque diverse regioni del cervello (cervelletto [BC], lobo parietale inferiore [IP], giro temporale medio [MG], corteccia occipitale [OC] e giro frontale superiore [SF]) e altri quattro tipi di tessuto (fegato [LV], polmone [LU], nodo linfoficio [LN]). Le librerie RNA-seq sono state accoppiate fine sequenziate e i dati sono stati analizzati utilizzando sei diversi algoritmi di previsione di circRNA: find_circ3, CIRI14, Mapsplice15, KNIFE16, DCC17e CIRCexplorer18. Sulla base della nostra analisi, il numero più alto di circRNA unici è stato rilevato quando si utilizza un kit di preparazione della libreria di RNA totale infilata con pre-trattamento RNase R e 4 RNA di input totale. Il protocollo ottimizzato è descritto qui. Come riportato in precedenza19,20, il più alto arricchimento di circRNA è stato osservato nel cervello rispetto ad altri tipi di tessuto.
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Protocol
Questa ricerca è stata condotta nel rispetto di tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano. I tessuti cerebrali sono stati ottenuti dal Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program a Sun City, a. Le operazioni del Brain and Body Donation Program sono approvate dal Western Institutional Review Board (protocollo WIRB #20120821). Tutti i soggetti o i loro rappresentanti legali hanno firmato il consenso informato. Le biocampionie commerciali (non cerebrali) sono state acquistate da Proteogenex.
1. Trattamento RNase R
NOT: Nei passaggi seguenti, il volume di reazione viene regolato ad un volume totale di 50 gradi l. Questo è il volume minimo del campione da utilizzare nel kit di pulizia e concentratore dell'RNA (vedere Tabella dei materiali). Inoltre, il protocollo ottimizzato descritto qui è per una quantità di ingresso di 4 g di RNA totale. Si raccomanda un tempo di incubazione più lungo per il trattamento RNase R per una quantità di ingresso >4 g.
- Diluire l'RNA totale a 4 g in 39 g di acqua senza RNase in un tubo di microcentrifuga e mescolare bene con la pipicantazione.
- In un tubo separato, diluire la RNase R a una concentrazione di lavoro di 2 U/L con 1x Buffer di reazione RNase R. Rendere solo sufficiente per l'uso immediato.
- Pipette 39 - L di RNA totale e 5 -L di 10x RNase R Reaction Buffer in un tubo di reazione 1,5 mL e mescolarsi bene con la pipettatura (50 - L sarà il volume di reazione totale). Aggiungete quindi 6 di RNase R (2 U/L).
- Regolare la pipetta per l'intero volume di reazione (50 l) e mescolare bene pipetting su e giù 10 volte.
- Collocare il tubo in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 10 min. Assicurarsi che l'intero volume di reazione sia immerso nel bagno d'acqua.
- Posizionare il tubo sul ghiaccio e procedere immediatamente con la pulizia e la concentrazione dell'RNA (sezione 2).
2. Purificazione dell'RNA utilizzando un kit di pulizia e concentratore di RNA
NOT: Quando si utilizza RNA di alta qualità (RIN>8, DV200>80%), il trattamento Con RNase R può comportare la perdita di circa il 60% dell'RNA. Utilizzando un ingresso da 4 g, si stima che dopo la sezione 1 vengano lasciati 2-2,5 g di RNA trattato.
- Prima di iniziare, preparare il buffer di lavaggio dell'RNA aggiungendo 48 mL di 100% di etanolo al concentrato del buffer e mescolare bene pipettando. Posizionare le colonne di purificazione nei tubi di raccolta (vedere Tabella dei materiali)e collocarle in un rack di tubi.
NOT: Utilizzare le seguenti impostazioni di centrifugazione per tutti i passaggi seguenti: 10.000–16.000 x g. Se il trattamento DNase I è già stato eseguito, saltare il trattamento DNase I in questa fase. - Aggiungere 2 volumi di RNA Binding Buffer al campione trattato rNase R e mescolare bene con la pipettatura (volume totale: 150 l).
- Aggiungere 1 volume di etanolo 100% alla miscela del campione trattato RNA Binding Buffer e RNase R e mescolare bene con la pipettatura (volume totale: 300 .L).
- Trasferire l'intero volume nella colonna e centrifugare la colonna per 30 s. Scartare flusso attraverso.
- Aggiungere 400 l of RNA Prep Buffer direttamente alla colonna, centrifugare la colonna per 30 s e scartare il flusso attraverso.
- Aggiungere 700 l of RNA Wash Buffer direttamente alla colonna, centrifugare la colonna per 30 s e scartare il flusso attraverso.
- Aggiungere 400 l of RNA Wash Buffer direttamente alla colonna, centrifugare la colonna per 2 min e trasferire la colonna in un nuovo tubo RNase-free 1.5 mL.
- Aggiungere 11 l'acqua senza RNase direttamente alla colonna tenendo la punta della pipetta proprio sopra il filtro della colonna e assicurando che l'acqua atterri solo sul filtro della colonna.
- Incubare la colonna per 1 min a temperatura ambiente e centrifugare per 1 min.
- Prima di scartare la colonna, verificare il flusso nel tubo privo di RNase. Se l'eluizione ha avuto esito positivo, conservare il campione a -80 gradi centigradi o procedere immediatamente con la preparazione della libreria. Per la costruzione della biblioteca viene utilizzato il volume di eluizione totale finale di circa 10 zeri.
NOT: Punto di sosta: Lasciare l'RNA a -80 gradi centigradi per un massimo di 7 giorni prima di continuare con la preparazione della libreria.
3. Preparazione della biblioteca di circRNA
NOT: Vedere Tabella dei materiali per il kit, che contiene la maggior parte dei reagenti utilizzati in questa sezione.
- esaurimento e frammentazione dell'rRNA
- Trasferire 10 l di RNA purificato dal passo 2.10 a un pozzo pulito in una nuova piastra PCR da 96 pozzetto. Al pozzo, aggiungere 5 L di buffer di legatura rRNA seguiti da 5 . Delicatamente pipette su e giù 10 volte per mescolare.
- Piastra di sigillare e incubare per 5 min a 68 gradi centigradi su un blocco termociclista pre-programmato e preriscaldato. Dopo il completamento dell'incubazione di 5 min, mettere la piastra in panchina e incubare a temperatura ambiente per 1 min.
- Rimuovere il sigillo dalla piastra. Aggiungete 35 l di perline di rimozione rRNA a temperatura ambiente vortice da campionare. Regolare la pipetta a 45 -L e pipetta su e giù 10-20x per mescolare accuratamente. Incubare la piastra per 1 min a temperatura ambiente.
- Trasferire la piastra su un supporto magnetico e incubare sul supporto per 1 min o fino a quando la soluzione non si schiarisce. Trasferire tutti i supernatant (45 dollari l) in un nuovo pozzo sulla stessa piastra, o nuova piastra (a seconda del numero di campioni con cui si sta lavorando).
- Vorticare le perline di pulizia dell'RNA (vedi Tabella dei materiali) fino a ben disperdersi, e aggiungere 99 l di perline ad ogni campione. Pipette su e giù 10x per mescolare. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 10 min.
- Trasferire la piastra sul supporto magnetico e incubare altri 5 min o fino a quando la soluzione non si schiarisce. Rimuovere e scartare tutti i supernatali dal pozzo.
- Con la piastra ancora sul supporto magnetico, aggiungere 200 l of appena preparato 80% EtOH al pozzo senza interrompere le perline. Incubare per 30 s, quindi rimuovere e scartare l'etanolo. Ripetere per un totale di 2 lavamenti.
- Aggiungete 11 l di tampone di eluizione ad ogni pozzo e alla pipetta su e giù 10 volte per mescolare. Incubare a temperatura ambiente per 2 min, quindi trasferire al supporto magnetico fino a quando la soluzione si schiarisce (1-5 min).
- Trasferire 8,5 litri del supernatante dal pozzo a un nuovo pozzo sullo stesso piatto o su un nuovo piatto. Aggiungete 8,5 l di miscela Elute, Primer, Fragment High a ogni pozzo contenente. Pipette su e giù 10 volte per mescolare accuratamente.
- Piastra di sigillare e incubare per 8 min a 94 gradi centigradi su un blocco termociclista pre-programmato e preriscaldato. Togliere dal termociclore quando raggiunge i 4 gradi centigradi e centrifugare brevemente.
NOT: Procedere immediatamente al protocollo Synthesize First Strand cDNA.
- Sintetizzare cDNA
- Per ogni campione da preparare, mescolare 9 - LL First Strand Synthesis Mix con 1 -L di trascrizione inversa (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere 8 o l della miscela al campione. Pipette su e giù 6 volte per mescolare.
- Piastra di tenuta e incubazione su un blocco termociclista pre-programmato e preriscaldato utilizzando i seguenti parametri: 25 gradi centigradi per 10 min, 42 gradi centigradi per 15 min, 70 gradi centigradi per 15 min, 4 gradi centigradi. Procedere immediatamente alla sintesi del secondo filamento.
- Aggiungete 5 L di buffer Resuspension ad ogni campione seguito da 20 gradi l of Second Strand Marking master mix. Pipette l'intero volume su e giù 6 volte.
- Piastra di sigillare e incubare su un blocco termociclista pre-programmato e preriscaldato impostato a 16 gradi centigradi per 1 h. Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra dal termociclore e lasciare che ecchegua a temperatura ambiente.
- Vortice pcR perline di purificazione (vedere Tabella dei materiali) e aggiungere 90 perline l ad ogni pozzetto di campione. Pipette su e giù 10 volte per mescolare accuratamente. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Trasferire il getto di perline/campione sul supporto magnetico e incubare per 5 min o fino a quando il liquido si schiarisce. Rimuovere e scartare supernatante.
- Aggiungere 200 L dell'80% EtOH ad ogni campione. Incubare campioni sul supporto magnetico a temperatura ambiente per 30 s. Scartare supernatante. Ripetere 1x.
- Lasciare asciugare le perline a temperatura ambiente per 6 min, quindi rimuovere dal supporto magnetico.
- Risospendere le perline in 19,5 gradi l l di Resuspension buffer. Pipette su e giù 10 volte per mescolare accuratamente. Incubare a temperatura ambiente per 2 min, quindi trasferire al supporto magnetico e incubare per un ulteriore 1 min o fino a quando il liquido si schiarisce.
- Trasferire 17,5 l l di supernatali su una nuova piastra ben/nuova.
NOT: Se non procede immediatamente, i campioni possono essere conservati a -20 gradi centigradi per un massimo di 7 giorni.
- Per ogni campione da preparare, mescolare 9 - LL First Strand Synthesis Mix con 1 -L di trascrizione inversa (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere 8 o l della miscela al campione. Pipette su e giù 6 volte per mescolare.
- Preparazione della biblioteca
- Aggiungete 12,5 l di A-Tailing Mix ad ogni pozzo che contiene supernatali. Pipette l'intero volume su e giù 10 volte per mescolare.
- Incubare la reazione su un blocco termociclista pre-programmato e preriscaldato impostato su 37 gradi centigradi utilizzando i seguenti parametri: 37 gradi centigradi per 30 min, 70 gradi centigradi per 5 min, 4 gradi centigradi. Quando i campioni raggiungono i 4 gradi centigradi, procedere immediatamente alla legatura dell'adattatore.
- Ad ogni campione si aggiungono 2,5 luna di buffer Resuspension, 2,5 l di un adattatore RNA unico e 2,5 lofili di Mix di ligazione. Pipette su e giù 10x per mescolare.
- Incubare campioni su un blocco termociclista pre-programmato e preriscaldato a 30 gradi centigradi per 10 min.
- Aggiungere 5 - L di stop Ligation buffer ad ogni campione e pipetta su e giù per mescolare.
- Aggiungete 42 ll di perline di purificazione miste di PCR ad ogni campione e mescolate accuratamente. Seguire i passaggi da 3,2,6 a 3,2,10, ma modificare il volume di sospensione a 52 l e il volume di elusione finale a 50.
- Ripetere il protocollo di purè PCR con l'eluion i 50,l dal passo 3.3.6, ma modificare il volume di sospensione a 22 l e il volume di elusione finale a 20.
NOT: Se non procede immediatamente, i campioni possono essere conservati a -20 gradi centigradi per un massimo di 7 giorni. - Aggiungete ad ogni campione 5 -L di PCR Primer Cocktail e 25 l di PCR Master Mix. Mescolare pipetting su e giù 10 volte. Incubare la reazione su un blocco termociclista pre-programmato e preriscaldato utilizzando i seguenti parametri: 98 gradi centigradi per 30 s; quindi 8 cicli di 98 gradi centigradi per 10 s, 60 gradi centigradi per 30 s, e 72 gradi centigradi per 30 s; poi 72 gradi centigradi per 5 min, poi 4 gradi centigradi.
NOT: Per generare quantità sufficienti di librerie per la sequenza, potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione del numero totale di cicli PCR. - Seguire il protocollo per la purificazione del tallone PCR (passaggi da 3,2,4 a 3,2,9), ad eccezione di aggiungere 50 -L di perline di purificazione PCR ben mescolate e modificare il volume di sospensione a 32,5 l con un volume di eluizione finale di 30 .
NOT: I campioni devono essere conservati a -20 gradi centigradi.
- Quantificazione e controllo qualità utilizzando un analizzatore di acido nucleico
- Lasciare che nastri e reagenti eclitino a temperatura ambiente per 30 min.
- Mescolare 2 - L di libreria con 2 L di HS D1000 tampone, e aggiungere a una piastra di pozzo compatibile.
- Sigillare saldamente con guarnito in lamina compatibile e vortice per 1 min a 2.000 rpm.
- Spin down e caricare piastra sull'analizzatore seguenti prompt software.
NOT: Le dimensioni delle librerie devono essere di circa 260 bp.
4. Flusso di lavoro di analisi dei dati
- Sequenza di librerie RNA-seq (vedi Tabella dei materiali) per generare letture a base di estremità accoppiate a 82 bp. Convertire i dati di sequenza non elaborati sotto forma di file basecall (.bcl) in FASTQs utilizzando lo strumento bcl2fastq (v0.2.19).
- Rilevare i circuiti circolrRNA.
NOT: Sulla base di prove precedentemente riportate che un approccio di rilevamento degli circRNA di un insieme offre prestazioni migliori rispetto all'utilizzo di un singolo strumento di rilevamento21,22, suggeriamo di utilizzare più strumenti per il rilevamento degli errori. Qui, i circRNA sono stati identificati utilizzando sei algoritmi di previsione di circRNA esistenti: find_circ, CIRI, CIRCexplorer, Mapsplice, KNIFE e DCC, applicando le impostazioni dei parametri consigliate per ogni algoritmo.- Scaricare e installare ogni algoritmo di rilevamento di circRNA in un cluster di calcolo ad alte prestazioni Linux utilizzando le istruzioni fornite dagli sviluppatori.
- Allineare i FASTQ RNA-seq rispetto al genoma di riferimento (GRCh37), utilizzando l'allineatore raccomandato per ogni strumento.
- Dopo l'allineamento, eseguire gli algoritmi di rilevamento degli anni rcRNA applicando le rispettive impostazioni dei parametri consigliate.
- Ogni strumento emetterà un file dei risultati multicolonna con l'elenco dei circRNA rilevati, estrarrà le coordinate di circRNA e il numero di letture di supporto da questo al fine di quantificare il numero di candidati rilevati in ogni condizione campione/test.
- Convertire l'output delle coordinate di circRNA di CIRI, Mapsplice e DCC in coordinate basate su 0 per essere coerente con gli altri tre algoritmi.
- Selezionare circRNA con due o più letture di supporto o analisi e confronti a valle. La Tabella 1 riepiloga tutti i parametri valutati nel nostro studio insieme al numero totale di letture di sequenziamento generate per ogni campione.
- Per ogni condizione di esempio/test, contare il numero di circRNA rilevati normalizzati per il numero di letture mappate generate per tale libreria, per milione. Riepilogare i risultati tra i vari strumenti/campioni in box plot, come descritto in Dettagli o risultati rappresentativi.
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Representative Results
I dati generati utilizzando un RNA di controllo universale (UC) disponibile in commercio e utilizzando due kit di preparazione della libreria, entrambi inclusi entrambi una fase di deplezione nei loro protocolli, sono stati valutati per la prima volta. Utilizzando un flusso di lavoro analitico (flusso di lavoro di analisi dei dati, sezione 4), nel complesso, è stato rilevato un numero maggiore di circRNA nei set di dati TruSeq rispetto a quelli Kapa (Figura 1). Sebbene le percentuali di RNA ribosomico (rRNA) fossero inferiori al 5% nei set di dati di entrambi i kit per quantità di input inferiori (1, 2 ug), i set di dati Kapa avevano un contenuto di rRNA più elevato per gli ingressi a 4, 5 e 10 ug(tabella 2). Quindi, in base al numero di circRNA rilevati e all'efficienza di esaurimento dell'rRNA, sono stati effettuati ulteriori esperimenti utilizzando il kit TruSeq.
Successivamente, il significato del pretrattamento di RNase R è stato testato confrontando i dati generati dalle librerie RNase R pretrattate e non pretrattate. A tal fine, l'RNA totale è stato estratto dalla MG di individui anziani sani e sono stati confrontati i dati di sequenziamento generati dalle librerie con (N ) e senza (N ) utilizzando RNase R23. Un numero più elevato di circRNA è stato costantemente identificato nelle librerie pretrattate rispetto a quelle non pretrattate (Figura 2). Questo è previsto poiché il pretrattamento rimuove gli RNA lineari, arricchendosi così per le specie di circRNA.
In terzo luogo, è stata testata la quantità di RNA di input che sarebbe ottimale per rilevare una maggiore diversità di fattori. Le biblioteche sono state preparate utilizzando 1, 2 e 4 g di RNA di input totale che è stato estratto dalle regioni cerebrali MG, OC e SF, nonché dall'RNA UC. Confrontando l'abbondanza di circRNA rilevati da ogni biblioteca, è stata osservata la più alta diversità di specie di circRNA quando si utilizzava un RNA di input di 4 g rispetto a 2 e 1 g (Figura 3), come riflesso dal numero di circRNA univoci identificati. Un avvertimento da notare è che anche se vari periodi di incubazione durante il trattamento di RNase R non sono stati testati, è stata osservata una tendenza in base alla quale è stato rilevato un numero crescente di fattori circolari in tutti gli input di RNA totali da 1 a 4 g durante il controllo di tutti gli altri parametri.
Questo protocollo ottimizzato è stato poi applicato a più tipi di tessuto per confrontare l'abbondanza di circRNA. Sono state testate cinque regioni cerebrali, tra cui BC, MG, OC, IP e SF, provenienti da quattro individui anziani sani, insieme ad altri quattro tipi di tessuti, tra cui LV, LU, LN e PA, da sei donatori sani. Nel complesso, è stata osservata una maggiore abbondanza di circRNA nel cervello rispetto ad altri tipi di tessuto (Figura 4), come è stato precedentemente riportato19,20.
Figura 1: rilevamento di circRNA utilizzando kit di RNA totali TruSeq vs Kapa. I dati di sequenziamento sono stati generati per UC RNA utilizzando due kit di preparazione separati della libreria di RNA totale, ciascuno con pre-trattamento di 1, 2, 4, 5 e 10 g di RNA di ingresso e ribonuclease R (RNase R). Il numero di circRNA rilevati dagli strumenti in ogni campione è stato normalizzato in base al numero di letture mappate, per milione (asse Y). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rilevamento di CircRNA con e senza pretrattamento RNase R. I dati di sequenziamento generati utilizzando il kit TruSeq sono stati utilizzati per confrontare l'impatto del pretrattamento di RNase R. L'RNA è stato estratto dal giro temporale centrale (MG) dei controlli anziani sani per questa analisi. Il numero normalizzato di circRNA rilevati (asse Y) è stato calcolato in modo analogo alla figura 1. RNase R- - pre-trattata con RNase R, RNase R- - non pre-trattata con RNase R. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rilevamento di CircRNA utilizzando quantità variabile di RNA di input. Utilizzando l'RNA estratto dalla MG, dalla corteccia occipitale (OC) e dal giro frontale superiore (SF), così come dall'RNA UC, è stato confrontato il numero di circRNA unici rilevati quando si utilizzano 1, 2 e 4 g di RNA di input, ognuno dei quali è stato costruito utilizzando il kit TruSeq e il pretrattamento RNase R. Il numero normalizzato di circRNA rilevati (asse Y) è stato calcolato in modo analogo alla figura 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Rilevamento di circRNA nel cervello rispetto ad altri tipi di tessuto. Sono stati generati set di dati arricchiti da CircRNA utilizzando RNA estratto da varie regioni del cervello, tra cui il cervelletto (BC), il lobo parietale inferiore (IP), MG, OC e SF, nonché altri quattro tipi di tessuto tra cui fegato (LV), polmone (LU), linfonodo (LN) e pancreas (PA). L'arricchimento di CircRNA è stato effettuato utilizzando il kit Illumina TruSeq con pretrattamento RNase R e 4 g di RNA di input totale. I grafici a scatola rappresentano il numero di circRNA rilevati da almeno tre dei sei strumenti tra i campioni di ogni regione/tessuto cerebrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Test # | Parametro valutato | Condizioni di prova | Origine di esempio | Quantità di ingresso/condizioni/campioni testati | Numero totale di letture di sequenziamento |
| 1 | Kit di preparazione della libreria | Illumina TruSeq Stranded Total RNA vs. | Uc | TruSeq: 1 g | 8,91,46,128 |
| TruSeq: 2 g | 7,93,90,202 | ||||
| TruSeq: 4 g | 6,66,12,238 | ||||
| TruSeq: 5 g | 7,88,56,902 | ||||
| TruSeq: 10 g | 6,61,06,874 | ||||
| Kapa: 1 g | 8,83,95,496 | ||||
| Kapa: 2 g | 10,66,59,272 | ||||
| Kapa: 4 g | 10,62,34,954 | ||||
| Kapa: 5 g | 7,47,75,914 | ||||
| Kapa: 10 g | 11,00,68,504 | ||||
| 2 | Pretrattamento | RNase R pretrattata e non pretrattata | Mg | Coppia1: MG_1 (RNase R) | 10,76,09,934 |
| Coppia1: MG_5 (RNase R-) | 9,62,15,516 | ||||
| Coppia2: MG_2 (RNase R) | 9,68,40,790 | ||||
| Coppia2: MG_6 (RNase R-) | 10,16,09,754 | ||||
| Coppia3: MG_3 (RNase R) | 11,15,76,344 | ||||
| Coppia3: MG_7 (RNase R-) | 11,13,14,114 | ||||
| 3 | Ingresso totale di RNA | 1 g contro 2 g contro 4 g | MG, OC, SF, UC | MG: 1 g | 12,00,94,758 |
| MG: 2 g | 11,64,75,728 | ||||
| MG: 4 g | 12,13,15,232 | ||||
| OC: 1 g | 11,11,18,120 | ||||
| OC: 2 g | 11,53,25,492 | ||||
| OC: 4 g | 11,49,13,266 | ||||
| SF: 1 g | 12,27,24,142 | ||||
| SF: 2 g | 9,39,33,288 | ||||
| SF: 4 g | 12,33,31,474 | ||||
| UC: 1 g | 9,24,48,120 | ||||
| UC: 2 g | 12,58,15,354 | ||||
| UC: 4 g | 12,56,92,534 | ||||
| 4 | Tipi di tessuto | Regioni cerebrali rispetto ad altri tipi di tessuto | BC, MG, OC, SF, IP, LU, LV, LN, PA | BC_1 | 10,72,08,904 |
| BC_2 | 11,18,33,362 | ||||
| BC_3 | 9,61,25,856 | ||||
| BC_4 | 9,62,77,094 | ||||
| IP_1 | 9,86,56,506 | ||||
| IP_2 | 11,35,95,746 | ||||
| IP_3 | 12,87,81,536 | ||||
| IP_4 | 9,59,81,446 | ||||
| MG_1 | 10,76,09,934 | ||||
| MG_2 | 9,68,40,790 | ||||
| MG_3 | 11,15,76,344 | ||||
| MG_4 | 10,05,39,028 | ||||
| OC_1 | 8,85,47,042 | ||||
| OC_2 | 12,09,83,142 | ||||
| OC_3 | 10,26,55,452 | ||||
| OC_4 | 10,84,49,330 | ||||
| SF_1 | 8,76,21,824 | ||||
| SF_2 | 14,50,57,894 | ||||
| SF_3 | 11,01,52,030 | ||||
| SF_4 | 9,67,24,472 | ||||
| LN_1 | 15,02,94,816 | ||||
| LN_2 | 8,33,30,187 | ||||
| LN_3 | 11,30,96,032 | ||||
| LN_4 | 10,78,38,278 | ||||
| LU_1 | 16,05,27,595 | ||||
| LU_2 | 8,94,30,799 | ||||
| LU_3 | 9,14,51,858 | ||||
| LV_1 | 9,72,18,369 | ||||
| LV_2 | 10,54,16,880 | ||||
| LV_3 | 8,86,53,148 | ||||
| LV_4 | 8,61,02,943 | ||||
| LV_5 | 12,87,88,483 | ||||
| LV_6 | 11,87,76,622 | ||||
| PA_1 | 8,79,20,160 | ||||
| PA_2 | 7,82,36,741 | ||||
| PA_3 | 10,21,24,209 | ||||
| PA_4 | 11,53,22,926 |
Tabella 1: Riepilogo delle condizioni di campionamento e test. Riepilogo di tutti i parametri e le condizioni di test valutati in questo studio, insieme al numero totale di letture di sequenziamento generate per ogni campione. UC - controllo universale, MG - giro temporale medio, corteccia occipital, corteccia occipitale, BC , cervelletto, IP , lobo parietale inferiore, SF - giro frontale superiore, LU - polmone, LV , fegato, LN - linfonodo, PA - pancreas, RNase R , ribonuclease R , RNase R , pre-trattato con RNase R, RENas R-
| Origine di esempio | Quantità/campioni di ingresso testati | Percentuale rRNA |
| Uc | TruSeq: 1 g | 5.53% |
| TruSeq: 2 g | 4.11% | |
| TruSeq: 4 g | 4.38% | |
| TruSeq: 5 g | 3.21% | |
| TruSeq: 10 g | 3.74% | |
| Kapa: 1 g | 5.57% | |
| Kapa: 2 g | 4.56% | |
| Kapa: 4 g | 9.67% | |
| Kapa: 5 g | 12.69% | |
| Kapa: 10 g | 15.59% |
Tabella 2: percentuali di rRNA nelle librerie TruSeq vs Kapa.
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Discussion
In questo studio sono stati testati due kit di preparazione della libreria disponibili in commercio, opzioni di pre-trattamento e quantità di RNA di input al fine di ottimizzare un protocollo di arricchimento del circRNA per la costruzione di librerie di sequenziamento del circRNA. Sulla base delle valutazioni di questo studio, sono evidenti una serie di aspetti chiave e passaggi critici nella creazione di librerie di sequenziamento degli xml circolr. La nostra valutazione conferma l'utilità del pretrattamento di RNase R, come si riflette dall'aumento del numero di circRNA rilevati. Nel complesso, è stata osservata una maggiore diversità di circRNA quando si utilizza il kit di libreria Illumina TruSeq con pre-trattamento RNase R e 4 g di RNA di input. Questi risultati sono in linea con i risultati precedenti secondo cui la fase di arricchimento di RNase R è vantaggiosa per il rilevamento di circRNA2.
Altri aspetti chiave della costruzione della libreria di circRNA includono la quantità di RNA totale disponibile per il sequenziamento, nonché il tipo di tessuto da cui l'RNA ha estratto. Anche se è stato riscontrato che un input di 4 g di RNA totale produceva il maggior numero di circRNA rilevati, la maggior parte degli studi di RNAseq utilizzano <-1 g di RNA totale in modo tale che l'ottenimento di quantità più elevate può essere impegnativo, in particolare per l'analisi di campioni umani. L'identificazione dei circRNA rimane fattibile per importi di input inferiori, ma è rilevante riconoscere che la specificità dell'analisi può essere influenzata. Questo studio evidenzia ulteriormente il maggior numero di circRNA che vengono rilevati nel cervello umano rispetto ad altri tessuti, come precedentemente riportato19,20. È quindi fondamentale riconoscere l'espressione differenziale dei circRNA in diversi tipi di tessuto. Inoltre, ulteriori ricerche nel contesto della malattia saranno importanti per far luce sul modo in cui i fattori ambulatori possono essere coinvolti nei processi patogeni.
Le prestazioni dei due kit di preparazione valutati della libreria dell'RNA evidenziano anche che, sebbene diversi kit disponibili in commercio possano dimostrare significative somiglianze, si osservano ancora differenze nell'analisi dei circRNA. Due importanti risultati di questo confronto includono la diminuzione dell'esaurimento dell'rRNA e un minor numero di circRNA identificati utilizzando un approccio. Mentre una possibilità è che una maggiore abbondanza di rRNA in un campione possa interferire con la creazione di molecole di libreria di circRNA in grado di sequenziare, questa scoperta sottolinea la necessità di valutare kit apparentemente simili, in particolare quando i reagenti sono proprietari.
Anche se i dati qui presentati forniscono informazioni sull'esistenza e l'abbondanza di circRNA in vari tipi di tessuto, questo studio ha alcune limitazioni tecniche. In primo luogo, mentre il trattamento RNase R riduce la popolazione di RNA lineari in un campione, non è ben chiaro se questa fase di esaurimento introduca eventuali distorsioni nel rilevamento degli circRNA e se possa esaurirsi con i circRNA. Studi precedenti hanno riferito che in alcuni casi, i circRNA sono sensibili a RNase R2,24,25. In secondo luogo, non è chiaro se l'aumento dell'ingresso totale dell'RNA al di sopra di 4 g comporterà un aumento lineare del numero di circRNA identificati. Come accennato in precedenza, l'RNA totale disponibile è spesso limitato negli studi di ricerca, quindi qui sono state considerate quantità di input inferiori. Da notare che i circRNA possono ancora essere rilevati quando si utilizzano ingressi più bassi, ma è importante riconoscere che gli ingressi più bassi sono associati al rilevamento di un numero inferiore di circRNA. In terzo luogo, il protocollo ottimizzato qui presentato utilizza RNA estratti da uno specifico insieme di tessuti. Data la distribuzione variabile dell'espressione di circRNA tra diversi tipi di tessuto, l'associazione tra quantità totali di ingresso di RNA e il numero di circRNA identificati può differire tra i tessuti.
Con l'aumento degli interessi nella comprensione del ruolo biologico dei circRNA, vengono sviluppate anche nuove strategie per consentire una migliore caratterizzazione e identificazione dei circRNA. Un nuovo approccio bioinformatica consente l'identificazione di circRNA che possono essere espressi male attraverso la ricostruzione di circRNA a lunghezza intera, e consente anche la quantificazione dell'espressione di specifiche isoforme di circRNA26. Questo approccio sfrutta le caratteristiche descritte come letture in sovrapposizione inversa (RO) che possono verificarsi sulle 3' o 5' estremità delle molecole della libreria di circRNA. Lo sviluppo di nuove strategie per l'identificazione dei circuiti circolari, che comprendono sia approcci di laboratorio che strumenti di bioinformatica, contribuirà alla comprensione del campo della funzione e dell'impatto dei circRNA.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Siamo grati al Banner Sun Health Research Institute Brain and Body Donation Program (BBDP) di Sun City, Arizona, per la fornitura di tessuti cerebrali umani. Il BBDP è stato supportato dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke (U24 NS072026 National Brain and Tissue Resource for Parkinson's Disease and Related Disorders), il National Institute on Aging (P30AG19610 Arizona's Disease Core Center), l'Arizona Department of Health Services (contratto 211002, Arizona Alzheimer's Research Center), Arizona Biomedical Research Commission (contratti 4001, 0011, 05-901 e 1001 per l'Arizona Parkinson's Disease Consortium) e il Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research27. Questo studio è stato sostenuto anche dal DHS e dallo Stato dell'Arizona (ADHS grant - ADHS14-052688). Ringraziamo anche Andrea Schmitt (Banner Research) e Cynthia Lechuga (TGen) per il supporto amministrativo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,000 µL pipette tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 20 µL pipette tips | Rainin | SR L 10F | |
| 200 µL pipette tips | Rainin | SR L 200F | |
| 2200 TapeStation Accessories (foil covers) | Agilent Technologies | 5067-5154 | |
| 2200 TapeStation Accessories (tips) | Agilent Technologies | 5067-5153 | |
| Adhesive Film for Microplates | VWR | 60941-064 | |
| AMPure XP Beads 450 mL | Beckman Coulter | A63882 | PCR purification |
| Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates | VWR | 951020401 | |
| High Sensitivity D1000 reagents | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
| High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit | Illumina | PE-410-1001 | |
| HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) | Illumina | FC-410-1002 | |
| HiSeq 4000 Sequencing System | Illumina | SY-401-4001 | |
| HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 | Illumina | PE-402-4002 | |
| HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) | Illumina | FC-402-4022 | |
| Kapa Total RNA Kit | Roche | KK8400 | |
| Molecular biology grade ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | |
| Qubit Assay Tubes | Supply Center by Thermo Fischer | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sense Assay Kit | Supply Center by Thermo Fischer | Q32854 | |
| RNA cleanup and concentrator - 5 | Zymo | RCC-100 | Contains purification columns, collection tubes |
| RNAClean XP beads | Beckman Coulter Genomics | RNA Cleanup beads | |
| Rnase R | Lucigen | RNR07250 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units | ThermoFisher (LifeTech) | 18064014 | |
| TapeStation 2200 | Agilent Technologies | Nucleic Acid analyzer | |
| TElowE | VWR | 10128-588 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit | Illumina | 20020596 | Kit used in section 3 |
| Two-Compartment Divided Tray | VWR | 3054-1004 | |
| UltraPure Water | Supply Center by Thermo Fischer | 10977-015 | |
| Universal control RNA | Agilent | 740000 |
References
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