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Genetics

आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करके परिपत्र आरएनए की पहचान

Published: November 14, 2019 doi: 10.3791/59981
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 2,3, 2,3, 1,2
1Translational Genomic Research Institute, 2Arizona Alzheimer's Consortium, 3Banner Sun Health Research Institute

Summary

परिपत्र आरएनए (सर्क्रैना) गैर-कोडिंग आरएनए हैं जिनमें प्रोटीन के बीच प्रतिलेखन विनियमन और मध्यस्थता बातचीत में भूमिकाएं हो सकती हैं। सर्आरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों के निर्माण के लिए विभिन्न मापदंडों के मूल्यांकन के बाद, एक प्रोटोकॉल RNase आर पूर्व उपचार के साथ फंसे कुल आरएनए पुस्तकालय की तैयारी का उपयोग संकलित किया गया था और यहां प्रस्तुत किया जाता है ।

Abstract

सर्कुलर आरएनए (सर्क्रैना) माइक्रो-आरएनए (मिरना) नियमन, प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की मध्यस्थता और माता-पिता के जीन ट्रांसक्रिप्शन के नियमन सहित कार्यों में शामिल गैर-कोडिंग आरएनए का एक वर्ग है। शास्त्रीय अगली पीढ़ी आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) में, सिरआरएनए को आमतौर पर एमआरएनए पुस्तकालयों के निर्माण के दौरान पॉली-ए चयन के परिणामस्वरूप अनदेखा किया जाता है, या बहुत कम बहुतायत में पाया जाता है, और इसलिए अलग-थलग और पता लगाना मुश्किल होता है। यहां, पुस्तकालय तैयार करने की किट, पूर्व उपचार विकल्प और विभिन्न कुल आरएनए इनपुट राशि की तुलना करके एक सिरआरएनए पुस्तकालय निर्माण प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया था। दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरे ट्रांसक्रिप्टोम लाइब्रेरी तैयारकरने किट, के साथ और RNase आर पूर्व उपचार के बिना, और कुल आरएनए इनपुट (1 से 4 μg) की चर मात्रा का उपयोग कर, परीक्षण किया गया । अंत में, कई ऊतक प्रकार; जिगर, फेफड़े, लिम्फ नोड, और अग्न्याशय सहित; साथ ही कई मस्तिष्क क्षेत्रों; जिसमें सेरिबैलम, अवर पार्श्व पालि, मध्यम लौकिक जायरस, ऑक्सीपिटल कॉर्टेक्स, और बेहतर ललाट जाइरस शामिल हैं; ऊतक प्रकारों में सिरआरएनए बहुतायत का मूल्यांकन करने के लिए तुलना की गई थी। छह अलग-अलग सिरआरएनए डिटेक्शन टूल (find_circ, सीआईआई, मैप्सप्लिस, नाइफ, डीसीसी और सीआईआरसीएक्सप्लोरर) का उपयोग करके उत्पन्न आरएनए-सीक्यू डेटा के विश्लेषण से पता चला कि आरएनसे आर प्री-ट्रीटमेंट और 4ग्राम आरएनए इनपुट के साथ एक फंसे कुल आरएनए लाइब्रेरी तैयारकरने किट इष्टतम है सर्क्रैना की उच्चतम सापेक्ष संख्या की पहचान करने के लिए विधि। पिछले निष्कर्षों के अनुरूप, अन्य ऊतक प्रकारों की तुलना में मस्तिष्क के ऊतकों में सर्केना का उच्चतम संवर्धन देखा गया था।

Introduction

परिपत्र आरएनए (सीआईआरसीआरएनए) एंडोजेनस, नॉन-कोडिंग आरएनए हैं जिन्होंने यूकेरियोटिक ट्रांसक्रिप्टोम1,2,3में अपनी व्यापक अभिव्यक्ति को देखते हुए ध्यान प्राप्त किया है। वे तब बनते हैं जब एक-दूसरे को वापस-स्प्लिस करते हैं और इसलिए शुरू में4,5की कलाकृतियां स्प्लिसिंग मानी जाती थीं । हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सर्क्रैना सेल प्रकार, ऊतक और विकासात्मक चरण विशिष्ट अभिव्यक्ति3,6 प्रदर्शित करते हैं और विकासवादी रूप से संरक्षितहैं 2,3। इसके अलावा, वे प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन7,माइक्रो-आरएनए (मिरना) बाध्यकारी3,8,9,10और माता-पिता के जीन ट्रांसक्रिप्शन11के नियमन की मध्यस्थता में शामिल हैं।

शास्त्रीय आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) में, एमआरएनआरए के लिए पॉली-ए चयन के परिणामस्वरूप पुस्तकालय निर्माण के दौरान सिरक्रैना पूरी तरह से खो सकता है या उनकी कम बहुतायत को देखते हुए अलग करना मुश्किल हो सकता है। हालांकि, हाल ही में सर्आरएनए लक्षण वर्णन अध्ययनों ने RNase आर का उपयोग करके एक पूर्व-उपचार कदम को शामिल किया है ताकि सर्कराना2,12,13के लिए समृद्ध किया जा सके। RNase R एक एक्सोरिजोन्यूकलीज है जो रैलियक आरएनए को पचाता है, जो परिपत्र आरएनए संरचनाओं को पीछे छोड़ता है। सिरआरएनए संवर्धन प्रोटोकॉल को दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पूरे ट्रांसपेटोम लाइब्रेरी निर्माण किट से डेटा उत्पन्न करने और तुलना करके अनुकूलित किया गया था, साथ और बिना एक RNase आर पूर्व उपचार चरण के बिना, और कुल आरएनए इनपुट (1 से 4 ग्राम) की अलग-अलग मात्रा का उपयोग करके। अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग अगले पांच विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों (सेरिबैलम [ईसा पूर्व], अवर पार्श्व पालि [आईपी], मध्य लौकिक जायरस [एमजी], ऑक्सीपिटल कॉर्टेक्स [ओसी] और बेहतर ललाट जाइरस [एसएफ]) और चार अन्य ऊतक प्रकारों (जिगर [एलवी], फेफड़े [एलयू], लिम्फ नोड [एलएन] और अग्न्याशय [पीए]) में सिरिआरएनए की बहुतायत का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था । आरएनए-सीक्यू पुस्तकालयों को अंतिम अनुक्रमित जोड़ा गया और डेटा का विश्लेषण छह अलग-अलग सर्आरएनए भविष्यवाणी एल्गोरिदम का उपयोग करके किया गया: find_circ3,सीआईआरआई14,मैप्सप्लिस15,चाकू16,डीसीसी17और सीआईआरसीएक्सप्लोरर18। हमारे विश्लेषण के आधार पर, रैनसे आर प्री-ट्रीटमेंट और 4 μg कुल इनपुट आरएनए के साथ एक फंसे कुल आरएनए लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग करते समय अद्वितीय सर्करनास की उच्चतम संख्या का पता लगाया गया था। अनुकूलित प्रोटोकॉल यहां वर्णित है। जैसा कि पहले19,20की रिपोर्ट थी, अन्य ऊतक प्रकारों की तुलना में मस्तिष्क में सिरक्रैना का उच्चतम संवर्धन देखा गया था।

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Protocol

यह शोध मानव कल्याण के लिए सभी संस्थागत, राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा-निर्देशों के अनुपालन में किया गया है । मस्तिष्क ऊतकों सूर्य शहर, AZ में बैनर सूर्य स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान मस्तिष्क और शरीर दान कार्यक्रम से प्राप्त किए गए । ब्रेन एंड बॉडी डोनेशन प्रोग्राम के संचालन को वेस्टर्न इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड (आईआरबी प्रोटोकॉल #20120821) द्वारा मंजूरी दी जाती है । सभी विषयों या उनके कानूनी प्रतिनिधियों ने सूचित सहमति पर हस्ताक्षर किए । प्रोटेजनेक्स से कमर्शियल (नॉन ब्रेन) बायोनमूज खरीदे गए थे।

1. RNase आर उपचार

नोट: निम्नलिखित चरणों में, प्रतिक्रिया की मात्रा को 50 माइक्रोन की कुल मात्रा में समायोजित किया जाता है। यह आरएनए सफाई और एकाग्रकिट (सामग्री की तालिकादेखें) में उपयोग किए जाने वाले न्यूनतम नमूना मात्रा है। इसके अतिरिक्त, यहां वर्णित अनुकूलित प्रोटोकॉल कुल आरएनए की 4 μg की इनपुट राशि के लिए है। एक इनपुट राशि और gt;4 μg के लिए RNase आर उपचार के लिए एक लंबे ऊष्मायन समय की सिफारिश की जाती है।

  1. एक माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में 39 μL RNase-मुक्त पानी में 4 μg करने के लिए कुल आरएनए पतला और पाइपटिंग द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण।
  2. एक अलग ट्यूब में, 1x RNase आर रिएक्शन बफर के साथ 2 U/μL की एक काम एकाग्रता के लिए RNase आर पतला । तत्काल उपयोग के लिए केवल पर्याप्त बनाएं।
  3. कुल आरएनए के 39 माइक्रोन और 10x आरनाज़ आर रिएक्शन बफर के 5 माइक्रोन 1.5 मिलीग्राम प्रतिक्रिया ट्यूब में और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं (50 माइक्रोन कुल प्रतिक्रिया मात्रा होगी)। इसके बाद, RNase आर (2 U/μL) के 6 μL जोड़ें ।
  4. पिपेट को पूर्ण प्रतिक्रिया मात्रा (50 माइक्रोन) में समायोजित करें और 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
  5. ट्यूब को 10 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें सुनिश्चित करें कि पूरी प्रतिक्रिया मात्रा पानी के स्नान में डूबी हुई है।
  6. ट्यूब को बर्फ पर रखें और तुरंत आरएनए सफाई और एकाग्रता (धारा 2) के साथ आगे बढ़ें।

2. आरएनए सफाई और एकाग्र किट का उपयोग करआरएन को शुद्ध करना

नोट: उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए (RIN>8, DV200>80%), RNase R उपचार का उपयोग करते समय आरएनए का लगभग 60% का नुकसान हो सकता है। 4 μg इनपुट का उपयोग करके, यह अनुमान लगाया गया है कि धारा 1 के बाद 2-2.5 माइक्रोन का इलाज आरएनए छोड़ दिया जाता है।

  1. शुरू करने से पहले, बफर ध्यान केंद्रित करने के लिए 100% इथेनॉल के 48 मिलील जोड़कर आरएनए वॉश बफर तैयार करें और पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं। संग्रह ट्यूबों में शुद्धिकरण स्तंभों को रखें (सामग्री की तालिकादेखें) और ट्यूब रैक में रखें।
    नोट: निम्नलिखित सभी चरणों के लिए निम्नलिखित केंद्रीकरण सेटिंग्स का उपयोग करें: 10,000-16,000 x ग्राम। यदि DNase मैं उपचार पहले से ही किया गया है, इस स्तर पर DNase मैं उपचार छोड़ ें ।
  2. आरएनए बाध्यकारी बफर के 2 संस्करणों को RNase आर उपचारित नमूने में जोड़ें, और पाइपिंग (कुल मात्रा: 150 माइक्रोन) द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. आरएनए बाइंडिंग बफर और आरएनएसई आर इलाज नमूना मिश्रण में 100% इथेनॉल की 1 मात्रा जोड़ें, और पाइपिंग (कुल मात्रा: 300 माइक्रोन) द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  4. पूरी मात्रा को कॉलम में स्थानांतरित करें और कॉलम को 30 एस डिस्कार्ड प्रवाह के लिए अपकेंद्रित करें।
  5. आरएनए प्रेप बफर के 400 माइक्रोन सीधे कॉलम में जोड़ें, कॉलम को 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र करें, और प्रवाह को त्यागें।
  6. आरएनए वॉश बफर के 700 माइक्रोन सीधे कॉलम में जोड़ें, कॉलम को 30 एस के लिए अपकेंद्रित्र करें, और प्रवाह को त्यागें।
  7. आरएनए वॉश बफर के 400 माइक्रोन सीधे कॉलम में जोड़ें, कॉलम को 2 मिन के लिए अपकेंद्रित करें, और कॉलम को नए सिरे से आरएनएसई-फ्री 1.5 एमएल ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
  8. कॉलम फिल्टर के ठीक ऊपर पिपेट टिप पकड़कर सीधे कॉलम में आरएनसे-मुक्त पानी के 11 माइक्रोन जोड़ें और यह सुनिश्चित करते हुए कि पानी केवल कॉलम फिल्टर पर उतरता है।
  9. कमरे के तापमान पर 1 न्यूनतम के लिए कॉलम को इनक्यूबेट करें और 1 न्यूनतम के लिए अपकेंद्री।
  10. कॉलम को त्यागने से पहले, RNase-मुक्त ट्यूब में प्रवाह की जांच करें। यदि एल्यूशन सफल रहा, तो नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या तुरंत पुस्तकालय तैयार करने के साथ आगे बढ़ें। लगभग 10 μL की अंतिम कुल elution मात्रा पुस्तकालय निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है।
    नोट: रोक बिंदु: पुस्तकालय की तैयारी जारी रखने से पहले 7 दिनों तक के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर आरएनए छोड़ दें।

3. सर्आरएनए लाइब्रेरी प्रेप

नोट: किट के लिए सामग्री की तालिका देखें, जिसमें इस अनुभाग में उपयोग किए जाने वाले अधिकांश अभिकर्मक शामिल हैं।

  1. आरएनए की कमी और विखंडन
    1. एक नए 96-अच्छी तरह से 0.3 मीटर पीसीआर प्लेट में एक साफ अच्छी तरह से शुद्ध आरएनए के 10 μL स्थानांतरित करें। अच्छी तरह से, RRNA बाध्यकारी बफर के 5 μL जोड़ें 5 μL rRNA हटाने मिश्रण के बाद । धीरे-धीरे मिश्रण करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    2. पूर्व-प्रोग्राम, पूर्व-गर्म थर्मोसाइकिलर ब्लॉक पर 68 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए सील प्लेट और इनक्यूबेट। 5 मिन ऊष्मायन पूरा होने के बाद बेंच पर प्लेट रखें और 1 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    3. प्लेट से सील हटा दें। नमूना करने के लिए भंवर कमरे के तापमान rRNA हटाने मोती के ३५ μL जोड़ें । पिपेट को 45 माइक्रोन में समायोजित करें और अच्छी तरह से मिलाने के लिए 10-20x को ऊपर और नीचे पिपेट करें। कमरे के तापमान पर 1 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट प्लेट।
    4. प्लेट को चुंबकीय स्टैंड पर स्थानांतरित करें और 1 मिन के लिए स्टैंड पर या समाधान साफ होने तक इनक्यूबेट करें। सुपरनेटेंट (~ 45 μL) के सभी एक ही थाली, या नई थाली पर नई अच्छी तरह से स्थानांतरण (कितने नमूनों के साथ आप काम कर रहे है पर निर्भर करता है) ।
    5. भंवर आरएनए सफाई मोती (सामग्री की तालिकादेखें) जब तक अच्छी तरह से फैलाया, और प्रत्येक नमूने में मोतियों के ९९ μL जोड़ें । मिश्रण करने के लिए 10x ऊपर और नीचे पिपेट करें। कमरे के तापमान पर थाली को 10 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. प्लेट को चुंबकीय स्टैंड पर स्थानांतरित करें और एक अतिरिक्त 5 मिन को इनक्यूबेट करें या जब तक समाधान साफ न हो जाएं। कुएं से सभी अधिने-भांति निकालें और त्यागें।
    7. अभी भी चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट के साथ, मोतियों को बाधित किए बिना अच्छी तरह से तैयार 80% EtOH के 200 μL जोड़ें। 30 एस के लिए इनक्यूबेट, फिर इथेनॉल को हटा दें और त्यागें। कुल 2 वॉश के लिए दोहराएं।
    8. प्रत्येक अच्छी तरह से Elution बफर के 11 μL जोड़ें और मिश्रण करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें । 2 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, और फिर चुंबकीय स्टैंड पर स्थानांतरित करें जब तक कि समाधान साफ नहीं हो जाता (1-5 न्यूनतम)।
    9. एक ही प्लेट पर या एक नई प्लेट पर एक नए कुएं के लिए कुएं से supernatant के 8.5 μL स्थानांतरण। प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त नमूना करने के लिए Elute, प्राइमर, खंड उच्च मिश्रण के 8.5 μL जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    10. पूर्व प्रोग्राम, पूर्व गर्म थर्मोसाइकिलर ब्लॉक पर 94 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिन के लिए सील प्लेट और इनक्यूबेट। थर्मोसाइकिलर से निकालें जब यह 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचता है और संक्षेप में अपकेंद्रित्र।
      नोट: सिंथेसाइज फर्स्ट स्ट्रैंड सीडीएनए प्रोटोकॉल पर तुरंत आगे बढ़ें।
  2. संश्लेषण सीडीएनए
    1. प्रत्येक नमूने तैयार किए जाने के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के 1 माइक्रोन के साथ 9 माइक्रोन फर्स्ट स्ट्रैंड संश्लेषण मिश्रण मिलाएं (सामग्री की तालिकादेखें)। नमूने में मिश्रण के 8 माइक्रोन जोड़ें। मिश्रण करने के लिए 6 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
      1. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके पूर्व-प्रोग्राम, पूर्व-गर्म थर्मोसाइकिलर ब्लॉक पर सील प्लेट और इनक्यूबेट: 10 मिन के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, 15 मिन के लिए 42 डिग्री सेल्सियस, 15 मिन के लिए 70 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस होल्ड। दूसरे स्ट्रैंड संश्लेषण के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
    2. प्रत्येक नमूने में रिस्पेंशन बफर के 5 माइक्रोन जोड़ें और उसके बाद दूसरा स्ट्रैंड मार्किंग मास्टर मिक्स का 20 माइक्रोन। पूरी मात्रा को 6 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    3. सील प्लेट और एक पूर्व प्रोग्राम पर इनक्यूबेट, पूर्व गर्म थर्मोसाइकिलर ब्लॉक 1 घंटे के लिए 16 डिग्री सेल्सियस करने के लिए सेट । ऊष्मायन के बाद, प्लेट को थर्मोसाइकिलर से निकाल ें और इसे कमरे के तापमान तक समान होने दें।
    4. भंवर पीसीआर शुद्धिकरण मोती (सामग्री की तालिकादेखें) और नमूना के प्रत्येक अच्छी तरह से 90 μL मोती जोड़ें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। 10 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    5. मनका/नमूना मिश्रण को चुंबकीय स्टैंड में स्थानांतरित करें और 5 मिन के लिए या तरल को साफ न होने तक इनक्यूबेट करें । अधिस्थान को निकालें और त्यागें।
    6. प्रत्येक नमूने में 80% EtOH के 200 μL जोड़ें। 30 एस डिस्कार्ड सुपरनेटेंट के लिए कमरे के तापमान पर चुंबकीय स्टैंड पर इनक्यूबेट नमूने। 1x दोहराएं।
    7. मोतियों को 6 मिन के लिए कमरे के तापमान पर सूखने दें, और फिर चुंबकीय स्टैंड से हटा दें।
    8. रिस्पेंशन बफर के 19.5 माइक्रोन में मोतियों को फिर से निलंबित करें। अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें। 2 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट, फिर चुंबकीय स्टैंड पर स्थानांतरित करें और अतिरिक्त 1 न्यूनतम के लिए या तरल साफ होने तक इनक्यूबेट करें।
    9. नई अच्छी तरह से/
      नोट: यदि तुरंत आगे नहीं बढ़ रहा है, तो नमूने 7 दिनों तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
  3. पुस्तकालय की तैयारी
    1. सुपरनेटेंट युक्त प्रत्येक कुएं में ए-टेलिंग मिक्स के 12.5 माइक्रोन जोड़ें। मिश्रण करने के लिए पूरी मात्रा को 10 बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    2. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके पूर्व-प्रोग्राम, पूर्व-गर्म थर्मोसाइकिलर ब्लॉक सेट 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें: 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5 मिन के लिए 70 डिग्री सेल्सियस, 4 डिग्री सेल्सियस होल्ड। जब नमूने 4 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचते हैं, तो तुरंत एडाप्टर लिगेशन के लिए आगे बढ़ें।
    3. प्रत्येक नमूने में रिस्पेंशन बफर का 2.5 माइक्रोन, एक अद्वितीय आरएनए एडाप्टर का 2.5 माइक्रोन और लिगेशन मिक्स का 2.5 माइक्रोन जोड़ें। मिश्रण करने के लिए 10x ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    4. 10 मिन के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्री-प्रोग्राम्ड, प्री-गर्म थर्मोसाइकिलर ब्लॉक पर इनक्यूबेट नमूने।
    5. प्रत्येक नमूने में स्टॉप लिगेशन बफर के 5 माइक्रोन जोड़ें और मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    6. प्रत्येक नमूने में मिश्रित पीसीआर शुद्धिकरण मोतियों के 42 माइक्रोन जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं। 3.2.10 के माध्यम से चरण 3.2.6 का पालन करें, लेकिन पुनर्निलंबन की मात्रा को 52 माइक्रोन और अंतिम एल्यूटियन वॉल्यूम को 50 माइक्रोन में बदल दें।
    7. चरण 3.3.6 से 50 माइक्रोन एल्युशन के साथ पीसीआर शुद्धिकरण मनका प्रोटोकॉल को फिर से दोहराएं, लेकिन पुनर्निलंबन की मात्रा को 22 माइक्रोन और अंतिम एल्यूटियन वॉल्यूम को 20 माइक्रोन में बदल दें।
      नोट: यदि तुरंत आगे नहीं बढ़ रहा है, तो नमूने 7 दिनों तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
    8. प्रत्येक नमूने में पीसीआर प्राइमर कॉकटेल के 5 माइक्रोन और पीसीआर मास्टर मिक्स के 25 माइक्रोन जोड़ें। 10 बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग करके पूर्व-प्रोग्राम, पूर्व-गर्म थर्मोसाइकिलर ब्लॉक पर प्रतिक्रिया को बढ़ादें: 30 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस; फिर 10 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 8 चक्र, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस; इसके बाद 5 मिन के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, फिर 4 डिग्री सेल्सियस पकड़।
      नोट: अनुक्रमण के लिए पर्याप्त मात्रा में पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए पीसीआर चक्रों की कुल संख्या का अनुकूलन करने की आवश्यकता हो सकती है।
    9. पीसीआर मनका शुद्धिकरण (चरण 3.2.4 से 3.2.9) के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें, सिवाय इसके कि अच्छी तरह से मिश्रित पीसीआर शुद्धिकरण मोतियों के 50 माइक्रोन जोड़ें और 30 माइक्रोन की अंतिम एल्यूशन वॉल्यूम के साथ पुनर्निलंबन की मात्रा को 32.5 माइक्रोन में बदल दें।
      नोट: नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए।
  4. न्यूक्लिक एसिड एनालाइजर का उपयोग करके क्वांटिफिकेशन और क्वालिटी कंट्रोल
    1. टेप और अभिकर्मकों को 30 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर समान करने की अनुमति दें।
    2. एचएस D1000 बफर के 2 μL के साथ पुस्तकालय के 2 μL मिश्रण, और एक संगत अच्छी तरह से थाली में जोड़ें ।
    3. संगत पन्नी सील के साथ कसकर सील, और 2,000 आरपीएम पर 1 मिन के लिए भंवर।
    4. नीचे स्पिन और सॉफ्टवेयर के बाद एनालाइजर पर प्लेट लोड संकेत देता है ।
      नोट: पुस्तकालयों के आकार में लगभग 260 बीपी होना चाहिए।

4. डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह

  1. अनुक्रम आरएनए-सीक्यू पुस्तकालयों (सामग्री की तालिका देखें) 82 बीपी बनती अंत पढ़ता उत्पन्न करने के लिए। bcl2fastq टूल (v0.2.19) का उपयोग करके बेसकॉल फ़ाइलों (.बीसीएल) के रूप में कच्चे अनुक्रमण डेटा को FASTQs में परिवर्तित करें।
  2. सर्क्रैना का पता लगाएं।
    नोट: पहले रिपोर्ट किए गए सबूतों के आधार पर कि एक पहनावा सिरआरएनए डिटेक्शन अप्रोच एक सिंगल डिटेक्शन टूल21,22का उपयोग करने की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करता है, हम सर्आरएनए का पता लगाने के लिए कई उपकरणों का उपयोग करने का सुझाव देते हैं। यहां, प्रत्येक एल्गोरिदम के लिए अनुशंसित पैरामीटर सेटिंग्स लागू करने के find_circ, सीआईआरआई, सीआईआरएक्सप्लोरर, मैप्सप्लिस, चाकू और डीसीसी: छह मौजूदा सर्आरएनए भविष्यवाणी एल्गोरिदम का उपयोग करके सिरक्रैना की पहचान की गई थी।
    1. डेवलपर्स द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों का उपयोग करके लिनक्स उच्च प्रदर्शन कंप्यूटिंग क्लस्टर पर प्रत्येक सिरआरएनए डिटेक्शन एल्गोरिदम डाउनलोड और इंस्टॉल करें।
    2. प्रत्येक उपकरण के लिए अनुशंसित संरेखक का उपयोग करते हुए संदर्भ जीनोम (GRCh37) के खिलाफ आरएनए-सीक्यू फास्टक्यू्स को संरेखित करें।
    3. संरेखण के बाद, अपने संबंधित अनुशंसित पैरामीटर सेटिंग्स लागू करके सिरआरएनए डिटेक्शन एल्गोरिदम निष्पादित करें।
    4. प्रत्येक उपकरण का पता लगाया circRNAs की सूची के साथ एक बहु कॉलम परिणाम फ़ाइल उत्पादन होगा, सर्ना सह-समन्वय निकालने और समर्थन की संख्या इस से पढ़ता है ताकि प्रत्येक नमूने में पता चला उंमीदवारों की संख्या की मात्रा का पता लगाने के लिए/
  3. सीआईआरआई, मैप्सप्लिस और डीसीसी द्वारा आउटपुट को अन्य तीन एल्गोरिदम के अनुरूप होने के लिए 0-आधारित निर्देशांक में परिवर्तित करें।
  4. दो या अधिक सहायक पुस्तकों या डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और तुलना के साथ सर्करना का चयन करें। तालिका 1 प्रत्येक नमूने के लिए उत्पन्न अनुक्रमण पढ़ता है की कुल संख्या के साथ हमारे अध्ययन में मूल्यांकन किए गए सभी मापदंडों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है।
  5. प्रत्येक नमूने/परीक्षण की स्थिति के लिए, उस पुस्तकालय के लिए उत्पन्न मैप किए गए रीडकी की संख्या के लिए सामान्यीकृत किए गए सर्नाकाओं की संख्या प्रति मिलियन की गणना करें । प्रतिनिधि परिणामों में विस्तृत रूप से बॉक्स भूखंडों में विभिन्न उपकरणों/नमूनों में परिणामों को संक्षेप में प्रस्तुत करें ।

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Representative Results

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध यूनिवर्सल कंट्रोल आरएनए (यूसी) का उपयोग करके उत्पन्न डेटा और दो पुस्तकालय तैयार करने की किट का उपयोग करके, जिनमें से दोनों में उनके प्रोटोकॉल में एक राइबो-कमी कदम शामिल है, पहले मूल्यांकन किया गया था। एक विश्लेषणात्मक कार्यप्रवाह (डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह, धारा 4) का उपयोग करके, कुल मिलाकर, कापा वालों(चित्रा 1)की तुलना में ट्रूसेक्यू डेटासेट में अधिक संख्या में सिर्केना का पता चला। हालांकि राइबोसोमल आरएनए (rRNA) प्रतिशत कम इनपुट मात्रा (1, 2 यूजी) के लिए दोनों किट से डेटासेट में 5% से नीचे थे, कापा डेटासेट में 4, 5 और 10 यूजी इनपुट्स(तालिका 2)के लिए अधिक rRNA सामग्री थी । इसलिए, पता चला सर्आरएनए और rRNA कमी दक्षता की संख्या के आधार पर, आगे प्रयोग TruSeq किट का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया ।

इसके बाद, RNase आर पूर्व उपचार के महत्व का परीक्षण RNase आर पूर्व इलाज और गैर पूर्व इलाज पुस्तकालयों से उत्पन्न डेटा की तुलना करके किया गया था । इस उद्देश्य के लिए, कुल आरएनए स्वस्थ बुजुर्ग व्यक्तियों के एमजी से निकाला गया था और (एन = 3) और बिना (एन = 3) पूर्व उपचार RNase आर23 का उपयोग कर पुस्तकालयों से उत्पन्न डेटा अनुक्रमण की तुलना में किया गया था । गैर-पूर्व-इलाज वाले(चित्रा 2)की तुलना में पूर्व-इलाज पुस्तकालयों में लगातार सर्क्रैना की अधिक संख्या की पहचान की गई थी। यह उम्मीद की जाती है क्योंकि पूर्व-उपचार रैखिक आरएनए को हटा देता है, इस प्रकार सर्आरएनए प्रजातियों के लिए समृद्ध होता है।

तीसरा, सर्केना की उच्च विविधता का पता लगाने के लिए इष्टतम होगा कि इनपुट आरएनए की राशि का परीक्षण किया गया था । पुस्तकालयों को 1, 2 और कुल इनपुट आरएनए के 4 μg का उपयोग करके तैयार किया गया था जो एमजी, ओसी और एसएफ मस्तिष्क क्षेत्रों और साथ ही यूसी आरएनए से निकाला गया था। प्रत्येक पुस्तकालय से पता लगाया circRNAs की बहुतायत की तुलना में, 2 और 1 μg(चित्रा 3)की तुलना में 4 μg इनपुट आरएनए का उपयोग करते समय सर्आरएनए प्रजातियों की उच्चतम विविधता देखी गई, जैसा कि पहचानकी गई अद्वितीय सर्करनाकी की संख्या से परिलक्षित होती है। ध्यान देने वाली एक चेतावनी यह है कि हालांकि आरएनएसई आर उपचार के दौरान विभिन्न ऊष्मायन समय का परीक्षण नहीं किया गया था, एक प्रवृत्ति जिसके तहत अन्य सभी मापदंडों के लिए नियंत्रित करते समय 1 से 4 μg के कुल आरएनए इनपुट में सिरक्रैना की बढ़ती संख्या का पता लगाया गया था।

इस अनुकूलित प्रोटोकॉल को तब सिररना बहुतायत की तुलना करने के लिए कई ऊतक प्रकारों में लागू किया गया था। चार स्वस्थ बुजुर्ग व्यक्तियों से बीसी, एमजी, ओसी, आईपी और एसएफ सहित पांच मस्तिष्क क्षेत्रों का परीक्षण किया गया, साथ ही छह स्वस्थ दानदाताओं से एलवी, एलयू, एलएन और पीए सहित चार अन्य ऊतक प्रकारों के साथ । कुल मिलाकर, मस्तिष्क में अन्य ऊतक प्रकारों(चित्रा 4)की तुलना में सिरक्रैना की अधिक प्रचुरता देखी गई, जैसा कि पहले19,20की सूचना दी गई है।

Figure 1
चित्रा 1: TruSeq बनाम Kapa कुल आरएनए किट का उपयोग कर CircRNA पता लगाने । यूसी आरएनए के लिए अनुक्रमण डेटा दो अलग-अलग कुल आरएनए लाइब्रेरी तैयारकरने किट का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, प्रत्येक में 1, 2, 4, 5, और 10 μg इनपुट आरएनए और रिबोरकलीज आर (RNase आर) पूर्व-उपचार था। प्रत्येक नमूने में उपकरणों द्वारा पाए गए सर्केना की संख्या को प्रति मिलियन (वाई-एक्सिस) मैप किए गए पढ़ता है, सामान्यीकृत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: RNase आर पूर्व उपचार के साथ और बिना CircRNA पता लगाने । ट्रूसेक्यू किट का उपयोग करके उत्पन्न अनुक्रमण डेटा का उपयोग RNase आर पूर्व-उपचार के प्रभाव की तुलना करने के लिए किया गया था। आरएनए को इस विश्लेषण के लिए स्वस्थ बुजुर्ग नियंत्रणों के मध्य लौकिक जायरस (एमजी) से निकाला गया था। पता चला सर्कराना (वाई-एक्सिस) की सामान्यीकृत संख्या की गणना इसी तरह चित्रा 1के लिए की गई थी । RNase R + = RNase आर के साथ पूर्व इलाज, RNase आर== RNase आर के साथ पूर्व इलाज नहीं है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: इनपुट आरएनए की अलग-अलग मात्रा का उपयोग करके सिरआरएनए का पता लगाना। एमजी, ऑक्सीपिटल कॉर्टेक्स (ओसी), और बेहतर ललाट जायरस (एसएफ) से निकाले गए आरएनए का उपयोग करना, साथ ही यूसी आरएनए, 1, 2 और इनपुट आरएनए के 4 μg का उपयोग करते समय अद्वितीय सिरक्रैना की संख्या का पता चला, प्रत्येक जिसकी लाइब्रेरी का निर्माण TruSeq किट और RNase आर पूर्व उपचार का उपयोग करके किया गया था, की तुलना की गई थी । पता चला सर्कराना (वाई-एक्सिस) की सामान्यीकृत संख्या की गणना इसी तरह चित्रा 1के लिए की गई थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मस्तिष्क बनाम अन्य ऊतक प्रकारों में सिरआरएनए का पता लगाना। सेरिबैलम (बीसी), अवर पार्श्व पालि (आईपी), एमजी, ओसी और एसएफ सहित विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से निकाले गए आरएनए का उपयोग करके सिरआरएनए समृद्ध डेटासेट उत्पन्न हुए, साथ ही जिगर (एलवी), फेफड़े (एलयू), लिम्फ नोड (एलएन), और अग्न्याशय (पीए) सहित चार अन्य ऊतक प्रकार उत्पन्न किए गए। RNase आर पूर्व उपचार और कुल इनपुट आरएनए के 4 μg के साथ Illumina TruSeq किट का उपयोग कर के सिररना संवर्धन किया गया था । बॉक्स भूखंड प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र/ऊतक प्रकार से नमूनों में छह उपकरणों में से कम से तीन द्वारा पता लगाया circRNAs की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

परीक्षा # पैरामीटर मूल्यांकन परीक्षण की स्थिति नमूना स्रोत इनपुट राशि/शर्तों/नमूनों की जांच अनुक्रमण पढ़ता है की कुल संख्या
1 लाइब्रेरी तैयार करने किट Illumina TruSeq फंसे कुल आरएनए बनाम Roche Kapa कुल आरएनए किट Uc TruSeq: 1 μg 8,91,46,128
TruSeq: 2 μg 7,93,90,202
TruSeq: 4 μg 6,66,12,238
TruSeq: 5 μg 7,88,56,902
TruSeq: 10 μg 6,61,06,874
कापा: 1 μg 8,83,95,496
कापा: 2 μg 10,66,59,272
कापा: 4 μg 10,62,34,954
कापा: 5 μg 7,47,75,914
कापा: 10 μg 11,00,68,504
2 प्री-ट्रीटमेंट RNase आर पूर्व इलाज बनाम गैर पूर्व इलाज मिलीग्राम Pair1: MG_1 (RNase आर +) 10,76,09,934
Pair1: MG_5 (RNase आर-) 9,62,15,516
Pair2: MG_2 (RNase आर +) 9,68,40,790
Pair2: MG_6 (RNase आर-) 10,16,09,754
Pair3: MG_3 (RNase आर +) 11,15,76,344
Pair3: MG_7 (RNase आर-) 11,13,14,114
3 कुल आरएनए इनपुट 1 μg बनाम 2 μg बनाम 4 μg एमजी, ओसी, एस एफ, यूसी एमजी: 1 μg 12,00,94,758
एमजी: 2 μg 11,64,75,728
एमजी: 4 μg 12,13,15,232
ओसी: 1 μg 11,11,18,120
ओसी: 2 μg 11,53,25,492
ओसी: 4 μg 11,49,13,266
एस एफ: 1 μg 12,27,24,142
एस एफ: 2 μg 9,39,33,288
एस एफ: 4 μg 12,33,31,474
यूसी: 1 μg 9,24,48,120
यूसी: 2 μg 12,58,15,354
यूसी: 4 μg 12,56,92,534
4 ऊतक प्रकार मस्तिष्क क्षेत्र बनाम अन्य ऊतक प्रकार बीसी, एमजी, ओसी, एस एफ, आईपी, एलयू, एलवी, एलएन, पीए BC_1 10,72,08,904
BC_2 11,18,33,362
BC_3 9,61,25,856
BC_4 9,62,77,094
IP_1 9,86,56,506
IP_2 11,35,95,746
IP_3 12,87,81,536
IP_4 9,59,81,446
MG_1 10,76,09,934
MG_2 9,68,40,790
MG_3 11,15,76,344
MG_4 10,05,39,028
OC_1 8,85,47,042
OC_2 12,09,83,142
OC_3 10,26,55,452
OC_4 10,84,49,330
SF_1 8,76,21,824
SF_2 14,50,57,894
SF_3 11,01,52,030
SF_4 9,67,24,472
LN_1 15,02,94,816
LN_2 8,33,30,187
LN_3 11,30,96,032
LN_4 10,78,38,278
LU_1 16,05,27,595
LU_2 8,94,30,799
LU_3 9,14,51,858
LV_1 9,72,18,369
LV_2 10,54,16,880
LV_3 8,86,53,148
LV_4 8,61,02,943
LV_5 12,87,88,483
LV_6 11,87,76,622
PA_1 8,79,20,160
PA_2 7,82,36,741
PA_3 10,21,24,209
PA_4 11,53,22,926

तालिका 1: नमूना और परीक्षण की स्थिति सारांश। इस अध्ययन में मूल्यांकन किए गए सभी मापदंडों और परीक्षण शर्तों का सारांश, प्रत्येक नमूने के लिए उत्पन्न अनुक्रमण पढ़ता है। यूसी = सार्वभौमिक नियंत्रण, एमजी = मध्य लौकिक जायरस, ओसी = ऑक्सीपिटल कॉर्टेक्स, बीसी = सेरिबैलम, आईपी = अवर पार्वत्य पालि, एसएफ = बेहतर ललाट जायरस, एलयू = फेफड़े, एलवी = लिवर, एलएन = लिम्फ नोड, पीए = अग्न्याशय, आरएनएएस आर = रिबोन्यूलीज आर, आरएनसे आर + = आरनास आर के साथ पूर्व व्यवहार किया गया।

नमूना स्रोत इनपुट राशि/नमूनों की जांच प्रतिशत rRNA
Uc TruSeq: 1 μg 5.53%
TruSeq: 2 μg 4.11%
TruSeq: 4 μg 4.38%
TruSeq: 5 μg 3.21%
TruSeq: 10 μg 3.74%
कापा: 1 μg 5.57%
कापा: 2 μg 4.56%
कापा: 4 μg 9.67%
कापा: 5 μg 12.69%
कापा: 10 μg 15.59%

तालिका 2: ट्रूसेक्यू बनाम कापा पुस्तकालयों में rRNA प्रतिशत।

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Discussion

इस अध्ययन में, सिरआरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों के निर्माण के लिए एक सर्आरएनए संवर्धन प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुस्तकालय तैयारकरने किट, पूर्व-उपचार विकल्प, और इनपुट आरएनए राशि का परीक्षण किया गया था। इस अध्ययन के आकलन के आधार पर, सिरआरएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों बनाने में कई प्रमुख पहलुओं और महत्वपूर्ण कदम स्पष्ट हैं । हमारा मूल्यांकन RNase आर पूर्व उपचार की उपयोगिता की पुष्टि करता है, जैसा कि पाया गया सर्क्रैना की बढ़ी हुई संख्या से परिलक्षित होता है। कुल मिलाकर, RNase आर पूर्व उपचार और इनपुट आरएनए के 4 μg के साथ Illumina TruSeq पुस्तकालय किट का उपयोग करते समय सर्नाना की एक उच्च विविधता देखी गई थी। ये परिणाम पिछले निष्कर्षों के अनुरूप हैं कि RNase आर संवर्धन कदम सर्नान्का2 का पता लगाने के लिए फायदेमंद है।

सर्आरएनए पुस्तकालय निर्माण के अतिरिक्त प्रमुख पहलुओं में कुल आरएनए की मात्रा शामिल है जो अनुक्रमण के साथ-साथ आरएनए द्वारा निकाले गए ऊतकों के प्रकार के लिए उपलब्ध है। यद्यपि कुल आरएनए का 4 μg इनपुट पाया गया था, लेकिन आरएनसेक अध्ययनों का अधिकांश हिस्सा कुल आरएनए का उपयोग और एलटी;= 1 μg का उपयोग करता है जैसे कि उच्च मात्रा प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से मानव नमूनों के विश्लेषण के लिए। कम इनपुट मात्रा के लिए सर्कोना की पहचान संभव बनी हुई है, लेकिन यह स्वीकार करना प्रासंगिक है कि विश्लेषण की विशिष्टता प्रभावित हो सकती है। इस अध्ययन में अन्य ऊतकों की तुलना में मानव मस्तिष्क में पाए जाने वाले सर्केना की अधिक संख्या पर प्रकाश डाला गया है, जैसा कि पहले19,20की सूचना दी गई थी। इस प्रकार विभिन्न ऊतक प्रकारों में सर्कराना की अंतर अभिव्यक्ति को स्वीकार करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, रोग के संदर्भ में अतिरिक्त अनुसंधान कैसे सर्आरएनए रोगजनक प्रक्रियाओं में शामिल किया जा सकता है में प्रकाश बहा के लिए महत्वपूर्ण होगा ।

दो मूल्यांकन आरएनए पुस्तकालय तैयार करने किट के प्रदर्शन में यह भी प्रकाश डाला गया है कि हालांकि विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट महत्वपूर्ण समानताएं प्रदर्शित कर सकते हैं, लेकिन सर्कराना का विश्लेषण करते समय मतभेद अभी भी देखे जाते हैं। इस तुलना से दो प्रमुख निष्कर्षों में आरएनए की कमी और एक दृष्टिकोण का उपयोग करके पहचाने गए सर्आरएनए की कम संख्या शामिल है । जबकि एक संभावना यह है कि एक नमूने में rRNA की एक उच्च बहुतायत अनुक्रम सक्षम सर्आरएनए पुस्तकालय अणुओं बनाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, इस खोज प्रतीत होता है इसी तरह की किट का आकलन करने की जरूरत पर जोर देती है, खासकर जब अभिकर्मक मालिकाना हैं ।

यद्यपि यहां प्रस्तुत किए गए डेटा विभिन्न ऊतक प्रकारों में सर्आरएनए के अस्तित्व और बहुतायत में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, इस अध्ययन में कुछ तकनीकी सीमाएं हैं। सबसे पहले, जबकि RNase आर उपचार एक नमूने में रैखिक RNAs की आबादी को कम कर देता है, यह अच्छी तरह से समझ में नहीं आता है अगर इस कमी कदम सर्आरएनए का पता लगाने में किसी भी पूर्वाग्रह का परिचय और क्या यह खतना समाप्त हो सकता है । पिछले अध्ययनों में बताया गया है कि कुछ मामलों में, सर्कराना RNaseR2,24,25के प्रति संवेदनशील होते हैं। दूसरे, यह स्पष्ट नहीं है कि 4 μg से ऊपर कुल आरएनए इनपुट में वृद्धि के परिणामस्वरूप पहचान किए गए सर्करनाकी की संख्या में रैखिक वृद्धि होगी । जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, उपलब्ध कुल आरएनए अक्सर अनुसंधान अध्ययनों में सीमित होता है इसलिए कम इनपुट मात्रा पर विचार किया जाता था। नोट के, कम आदानों का उपयोग करते समय अभी भी सिरक्रैना का पता लगाया जा सकता है लेकिन यह स्वीकार करना महत्वपूर्ण है कि कम आदानों कम संख्या में सर्केन्ना का पता लगाने से जुड़े हैं। तीसरा, यहां प्रस्तुत अनुकूलित प्रोटोकॉल ऊतकों के एक विशिष्ट सेट से निकाले गए आरएनए का उपयोग करता है। विभिन्न ऊतक प्रकारों में सर्आरएनए अभिव्यक्ति के परिवर्तनीय वितरण को देखते हुए, कुल आरएनए इनपुट राशि और पहचाने गए सर्आरएनए की संख्या के बीच संबंध ऊतकों में भिन्न हो सकता है।

सर्कराना की जैविक भूमिका को समझने में बढ़ती रुचियों के साथ, नई रणनीतियां भी विकसित की जा रही हैं ताकि सिरक्रैना के लक्षण वर्णन और पहचान को बेहतर ढंग से सक्षम किया जा सके । एक नया बायोइन्फॉर्मेटिक्स दृष्टिकोण सिरक्रैना की पहचान करने में सक्षम बनाता है जिसे पूर्ण लंबाई के सिरक्रैना के पुनर्निर्माण के माध्यम से नीच व्यक्त किया जा सकता है, और विशिष्ट सर्आरएनए आइसोफॉर्म की अभिव्यक्ति की मात्रा को भी सक्षम बनाताहै। यह दृष्टिकोण रिवर्स ओवरलैप (आरओ) के रूप में वर्णित सुविधाओं का लाभ उठाता है जो सर्आरएनए पुस्तकालय अणुओं के 3 ' या 5 ' सिरों पर हो सकता है। सर्कराना की पहचान करने के लिए नई रणनीतियों का विकास, प्रयोगशाला दृष्टिकोण और बायोइन्फॉर्मेटिक्स उपकरण दोनों को शामिल करते हुए, सर्नास के कार्य और प्रभाव के क्षेत्र की समझ में योगदान देगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम मानव मस्तिष्क ऊतकों के प्रावधान के लिए सूर्य शहर, एरिजोना के बैनर सूर्य स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान मस्तिष्क और शरीर दान कार्यक्रम (BBDP) के लिए आभारी हैं । BBDP को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डरएंड स्ट्रोक (पार्किंसंस डिजीज एंड संबंधित विकारों के लिए U24 NS072026 नेशनल ब्रेन एंड टिश्यू रिसोर्स), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (P30AG19610 एरिजोना अल्जाइमर डिजीज कोर सेंटर), एरिजोना डिपार्टमेंट ऑफ हेल्थ सर्विसेज (कॉन्ट्रैक्ट 211002, एरिजोना अल्जाइमर अनुसंधान केंद्र), एरिजोना जैव चिकित्सा अनुसंधान आयोग (अनुबंध ४००१, 0011, 05-901 और १००१ एरिजोना पार्किंसंस रोग कंसोर्टियम के लिए) और माइकल जे । पार्किंसंस रिसर्च27के लिए फॉक्स फाउंडेशन । इस अध्ययन को डीएचएस और एरिजोना राज्य (एडीएचएस अनुदान # ADHS14-052688) द्वारा भी समर्थित किया गया था। हम प्रशासनिक सहायता के लिए एंड्रिया श्मिट (बैनर रिसर्च) और सिंथिया लेचुगा (टीजेन) को भी धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,000 µL pipette tips Rainin GP-L1000F
20 µL pipette tips Rainin SR L 10F
200 µL pipette tips Rainin SR L 200F
2200 TapeStation Accessories (foil covers) Agilent Technologies 5067-5154
2200 TapeStation Accessories (tips) Agilent Technologies 5067-5153
Adhesive Film for Microplates VWR 60941-064
AMPure XP Beads 450 mL Beckman Coulter A63882 PCR purification
Eppendorf twin.tec 96-Well PCR Plates VWR 951020401
High Sensitivity D1000 reagents Agilent Technologies 5067-5585
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent Technologies 5067-5584
HiSeq 2500 Sequencing System Illumina SY-401-2501
HiSeq 3000/4000 PE Cluster Kit Illumina PE-410-1001
HiSeq 3000/4000 SBS Kit (150 cycles) Illumina FC-410-1002
HiSeq 4000 Sequencing System Illumina SY-401-4001
HiSeq PE PE Rapid Cluster Kit v2 Illumina PE-402-4002
HiSeq Rapid SBS Kit v2 (50 cycle) Illumina FC-402-4022
Kapa Total RNA Kit Roche KK8400
Molecular biology grade ethanol Fisher Scientific BP28184
Qubit Assay Tubes Supply Center by Thermo Fischer Q32856
Qubit dsDNA High Sense Assay Kit Supply Center by Thermo Fischer Q32854
RNA cleanup and concentrator - 5 Zymo RCC-100 Contains purification columns, collection tubes
RNAClean XP beads Beckman Coulter Genomics RNA Cleanup beads
Rnase R Lucigen RNR07250
SuperScript II Reverse Transcriptase 10,000 units ThermoFisher (LifeTech) 18064014
TapeStation 2200 Agilent Technologies Nucleic Acid analyzer
TElowE VWR 10128-588
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit Illumina 20020596 Kit used in section 3
Two-Compartment Divided Tray VWR 3054-1004
UltraPure Water Supply Center by Thermo Fischer 10977-015
Universal control RNA Agilent 740000

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References

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Sekar, S., Geiger, P., Cuyugan, L.,… More

Sekar, S., Geiger, P., Cuyugan, L., Boyle, A., Serrano, G., Beach, T. G., Liang, W. S. Identification of Circular RNAs using RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (153), e59981, doi:10.3791/59981 (2019).

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