Summary
Tau est une protéine neuronale présente à la fois dans le cytoplasme, où il lie les microtubules, et dans le noyau, où il exerce des fonctions non conventionnelles, y compris la modulation des gènes liés à la maladie d'Alzheimer. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier la fonction du Tau nucléaire tout en excluant toutes les interférences provenant du Tau cytoplasmique.
Abstract
Tau est une protéine de liaison microtubule exprimée dans les neurones et sa fonction principale connue est liée au maintien de la stabilité cytosquelettique. Cependant, des preuves récentes ont indiqué que Tau est également présent dans d'autres compartiments subcellulaires, y compris le noyau où il est impliqué dans la protection de l'ADN, dans la transcription de l'ARNr, dans la mobilité des rétrotransposons et dans l'organisation structurelle de la Nucléole. Nous avons récemment démontré que le Tau nucléaire est impliqué dans l'expression du gène VGluT1, suggérant un mécanisme moléculaire qui pourrait expliquer l'augmentation pathologique de la libération de glutamate dans les premiers stades de la maladie d'Alzheimer. Jusqu'à récemment, l'implication du nucléaire Tau dans la modulation de l'expression des gènes cibles était relativement incertaine et équivoque en raison de limitations techniques qui empêchaient l'exclusion de la contribution du Tau cytoplasmique ou l'effet d'autres facteurs en aval non liés au Tau nucléaire. Pour surmonter cette incertitude, nous avons mis au point une méthode pour étudier l'expression des gènes cibles spécifiquement modulées par la protéine tau nucléaire. Nous avons utilisé un protocole qui couple l'utilisation de signaux de localisation et la fractionnement subcellulaire, permettant l'exclusion de l'interférence des molécules cytoplasmiques Tau. Plus particulièrement, le protocole est facile et est composé de méthodes classiques et fiables qui sont largement applicables pour étudier la fonction nucléaire de Tau dans d'autres types de cellules et les conditions cellulaires.
Introduction
Les fonctions de la protéine Tau dans le noyau ont suscité un intérêt significatif ces dernières années, car il a été montré pour être étroitement associé aux acides nucléiques1,2,3,4,5,6. En effet, une étude récente à l'échelle du génome a démontré que Tau lie des séquences d'ADN géniques et intergéniques in vivo7. Un rôle dans l'organisation nucléolar a été suggéré8,9,10,11. En outre, Tau a été proposé d'être impliqué dans la protection de l'ADN contre le stress oxydatif et hyperthermique5,10,12,13, tandis que Mutated Tau a été liée à l'instabilité chromosomique et l'aneuploidy14,15,16.
Jusqu'à présent, les défis dans l'étude des fonctions de Tau dans le compartiment nucléaire sont restés presque non résolus en raison des difficultés à disséquer la contribution spécifique de Tau nucléaire de la contribution de Tau cytoplasmique. En outre, les fonctions attribuées aux molécules de Tau dans le compartiment nucléaire, jusqu'à présent, ne sont que corrélatives parce qu'elles manquent d'une démonstration sans équivoque de l'implication directe des protéines tau nucléaires. En effet, l'implication de Tau dans la mobilité des rétrotransposons ou dans la transcription de l'ARNr ou dans la protection de l'ADN11,12,17,18,19 pourrait également s'expliquer par la contribution du cytoplasmique Tau ou par l'effet d'autres facteurs en aval non liés au Tau nucléaire.
Ici, nous fournissons une méthode qui peut résoudre ce problème en exploitant une procédure classique pour isoler le compartiment nucléaire combiné avec l'utilisation de Tau construit 0N4R marqué avec la localisation nucléaire (NLS) ou des signaux d'exportation nucléaire (NES). Cette approche élimine les problèmes complexes liés aux artefacts possibles en raison du débordement des molécules de Tau du compartiment cytoplasmique. En outre, les constructions Tau-NLS et Tau-NES induisent l'enrichissement ou l'exclusion des molécules De Tau du compartiment nucléaire, respectivement, fournissant des contrôles positifs et négatifs pour l'implication des molécules nucléaires de Tau dans une fonction spécifique. Le protocole est techniquement facile et il est composé de méthodes classiques et fiables qui sont largement applicables pour étudier la fonction nucléaire de Tau dans d'autres types de cellules, différenciées ou non, telles que les cellules cancéreuses qui réactivent l'expression Tau20,21. En outre, il pourrait être appliqué également à d'autres protéines qui sont présentes dans le cytoplasme et le noyau afin de disséquer les fonctions biologiques liées à différents compartiments.
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Protocol
1. Culture cellulaire
- Culture SH-SY5Y cells (human neuroblastoma cell line, CRL-2266) in complete medium (Dulbecco's modified Eagle medium:nutrient mixture F12 [DMEM/F-12] complété par 10% de sérum bovin fœtal [FBS], 2 mM L-glutamine, 100 U/mL pénicilline et 100 'g/mLstreptomy). Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 oC et 5 % de CO2. Cultivez les cellules dans des plaques de 10 cm et divisez-les lorsque le confluent.
2. Différenciation cellulaire
- Pour différencier les cellules SH-SY5Y, le lendemain du placage, ajouter 10 millions d'acide rétinoïque (RA) pour compléter le milieu pendant 5 jours.
- Le sixième jour remplacer le milieu par le milieu de différenciation : DMEM/F-12 complété avec 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamine. N'ajoutez pas de FBS ou d'antibiotiques.
- Cultivez les cellules dans le milieu de différenciation pendant 3 jours.
3. Chimeric Constructs Clonage
- Générer Tau-NLS construire par le clonage par digestion enzymatique de restriction dans le cadre à la fin 3' de la séquence Tau 0N4R (383aa) le 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAGAAGAGAAAAAAAAGAATCAAAAAAAAGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'.
REMARQUE: Le 3xNLS à l'extrémité 3' de Tau est cloné dans le plasmide pCMV-Tau pour l'expression des mammifères exploitant les sites de restriction XhoI et BamHI dans le site multiconisme (MCS). - Générer Tau-NES construire par clonage par digestion enzymatique restriction dans le cadre à la fin 3' de la séquence Tau 0N4R (383aa) la séquence NES: 5'-AGTGAGCCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTACTACACA-3'.
REMARQUE: La NES à l'extrémité 3' de Tau est clonée dans le plasmide pCMV-Tau pour l'expression des mammifères exploitant les sites de restriction EcoRI et BamHI dans le MCS. - Transformez la souche DH5alpha E. coli avec 100 ng d'ADN à partir de l'étape 3.1 ou 3.2 et les cellules de plaque sur les plaques LB-Agar avec 100 mg/mL d'ampicilline. Laisser pousser du jour au lendemain à 37 oC.
- Choisissez une seule colonie et piquez les cellules en 5 ml de LB avec de l'ampicilline. Laissez les cellules se développer à 37 oC dans l'agitation pendant la nuit.
- Extraire plasmide avec un miniprep d'ADN (Table des Matériaux) et séquence pour vérifier les constructions.
- Transformez la souche DH5alpha E. coli avec la séquence vérifiée des constructions et des cellules de plaque sur des plaques DE LB-Agar avec de l'ampicilline. Laisser pousser du jour au lendemain à 37 oC.
- Choisissez une seule colonie et piquez les cellules en 5 ml de LB avec de l'ampicilline. Laisser les cellules se développer à 37 oC en agitation pendant 2 h.
- Mettez les cellules de l'étape 3.7 dans 200 ml de LB avec l'ampicilline. Laisser pousser du jour au lendemain à 37 oC.
- Pelleter les cellules à 3 500 x g pendant 10 min à 4 oC.
- Extrait plasmide avec un maxiprep ADN (Table of Materials).
4. Transfection cellulaire
- Seed 400 000 cellules à partir de l'étape 1.1 dans des plaques de 6 puits ou 20 000 cellules dans des glissières de chambre à 8 puits. Plaque quatre échantillons : cellules témoins à transpercer avec un vecteur vide, cellules à transpercer avec du Tau non étiqueté, cellules à transfecter avec Tau-NLS et cellules à transfecter avec Tau-NES.
- Le lendemain de l'ensemencement transfect 400 ng d'ADN pour chaque puits en utilisant les lipides cationiques (Tableau des matériaux) dans 6-puits plaques ou 200 ng d'ADN pour chaque puits pour les diapositives de chambre de 8 puits, selon les instructions du fabricant.
- Incuber l'ADN et les lipides cationiques séparément en 250 l (pour les plaques de 6 puits) ou 25 l (pour les diapositives de chambre à 8 puits) de milieu sérique réduit pendant 5 min à RT. Ensuite, combinez-les pour générer le complexe ADN-lipide et incuber pendant 20 min.
- Remplacer le milieu de culture par 2 ml (pour 6 plaques de puits) ou 250 l (pour des toboggans de chambre de 8 puits) de milieu de culture complet frais. Ajouter le complexe ADN-lipide aux cellules et incuber à 37 oC pendant la nuit.
- Alternativement, l'ADN transfect avec la polyéthylène de réactif cationic (PEI).
- Mélanger 2 g d'ADN et 6 l de l'Ile-du-Prince-Édouard avec 200 l de milieu de culture complet (pour chaque puits dans des plaques de 6 puits), ou 1 g d'ADN et 3 oL de l'Ile-du-Prince-Édouard avec 100 l de milieu de culture complet (pour chaque puits dans des diapositives de chambre de 8 puits) , vortex et incuber pendant 10 min à RT.
- Ajoutez le mélange aux cellules et ajoutez 1,8 ml de milieu de culture complet par puits dans des plaques de 6 puits ou 150 l de milieu de culture complet par puits dans des glissières de chambre à 8 puits pour atteindre le volume de placage.
- Changez le médium le lendemain de la transfection et ajoutez les supports de différenciation tels que décrits à l'étape 2.2.
5. Immunofluorescence
- Retirez le milieu de culture et rincez les cellules avec 1x PBS. Fixer les cellules avec 100% de méthanol glacé pendant 3 min sans trembler. Retirez la solution de fixation et lavez brièvement avec 1x PBS.
- Perméabilize avec 0,1% de surfactant non ionique en 1x PBS pendant 5 min à température ambiante (RT). En bref, laver avec 1x PBS, 3 fois.
- Incuber les cellules avec tampon de blocage (0,1% Tween 20 et 1% BSA en PBS) pendant 30 min à RT sur un shaker orbital.
- Incuber avec des anticorps primaires appropriés (p. ex., anticorps anti-Tau13 monoclonal de souris) dilué 1:500 en bloquant le tampon pendant la nuit à 4 oC sur un shaker orbital. Retirez la solution d'anticorps et lavez brièvement avec 1x PBS.
- Incubate avec des anticorps secondaires conjugués au fluorophore (p. ex., anticorps antisouris de chèvre conjugués à Alexa Fluor 633) dilué 1:500 dans le tampon de blocage pendant 1 h à RT. Retirez la solution d'anticorps et lavez brièvement avec 1x PBS 3 fois.
- Pour tacher les noyaux, incuber avec DAPI dilué 1:20,000 dans le tampon de blocage pendant 10 min à RT. Laver avec 1x PBS 3 fois. Mount coverslips sur une glissière à l'aide du milieu de montage antifade.
6. Blot occidental
- Pour recueillir la pastille cellulaire de l'étape 4.4, retirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS. Incuber avec 500 oL de 0,1 % de trypsine pendant 4 min à 37 oC. Ajouter un volume égal de cellules moyennes complètes et resuspendre.
- Recueillir les cellules dans un tube et centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min. À la fin de la centrifugation, retirez soigneusement le supernatant. Ajouter 1 mL de PBS, centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min et retirer soigneusement le supernatant. Entreposez les granulés de cellules sur la glace pour une utilisation immédiate ou congelez-les à -80 oC pour le stockage à long terme.
- Pour les extraits totaux de protéines, incuber le granule cellulaire pendant 30 min sur la glace dans le tampon de lyse (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glycérol, 1% octylphenoxy poly(éthylèneoxy)ethanol, ramifié (Tableau des matériaux), 10 mM EDTA) complété par de la protéase et des inhibiteurs de la phosphatase. Selon l'abondance de la pastille, utilisez de 50 à 100 l de tampon de lyse.
- Centrifuger l'extrait à 16 000 x g pendant 15 min. Recueillir le supernatant et quantifier la concentration de protéines par tout analyse de quantification standard. Préparer les échantillons de protéines pour le SDS-PAGE en mélangeant 20 g de protéines avec 5 l de tampon 4x Laemmli dans un volume total de 20 L et faire bouillir à 100 oC pendant 5 min.
REMARQUE: L'échantillon peut être stocké à -20 oC.
- Centrifuger l'extrait à 16 000 x g pendant 15 min. Recueillir le supernatant et quantifier la concentration de protéines par tout analyse de quantification standard. Préparer les échantillons de protéines pour le SDS-PAGE en mélangeant 20 g de protéines avec 5 l de tampon 4x Laemmli dans un volume total de 20 L et faire bouillir à 100 oC pendant 5 min.
- Pour les fractionnements subcellulaires, resuspendre les cellules de l'étape 6.2 dans le milieu complet, et recueillir 1 x 106 cellules par échantillon. Centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min pour obtenir des granulés de cellules pour les étapes suivantes.
- Pour isoler les compartiments subcellulaires, fractionner selon les spécifications du kit. Pour isoler chaque fraction, incuber le granule cellulaire de l'étape 6.4 avec le tampon correspondant, centrifugeuse, recueillir le supernatant et ajouter le tampon suivant à la pastille comme décrit dans 6.4.1.1-6.4.1.5. Ajouter dans l'ordre tampon d'extraction cytoplasmique, tampon d'extraction de membrane, tampon d'extraction nucléaire, tampon d'extraction nucléaire complété par 5 mM CaCl2 et 3 U/ L nucléane micrococcal et tampon d'extraction cytosquelettique.
REMARQUE: Tous les tampons doivent être complétés par des inhibiteurs de la protéase. Échelle des volumes tampons en fonction du volume de la pastille cellulaire.- Pour isoler la fraction cytosolique, incuber les granulés de cellules dans 100 oL de tampon d'extraction cytoplasmique à froid complété par des inhibiteurs de la protéase à 4 oC avec un mélange doux pendant 10 min. Centrifugeuse à 500 x g à 4 oC pendant 5 min et transférer le supernatant aux tubes préréfrigérés.
- Ajouter 100 ll de tampon d'extraction de membrane glace-froid complété avec des inhibiteurs de la protéase à la pastille à partir de l'étape 6.4.1.1, et couver à 4 oC avec un mélange doux pendant 10 min. Centrifugeuse à 3 000 x g à 4 oC pendant 5 min et recueillir le supernatant.
- Pour la fraction nucléaire soluble, ajoutez 50 l de tampon d'extraction nucléaire complété par des inhibiteurs de la protéase à la pastille à partir de l'étape 6.4.1.2, et le vortex. Incuber à 4 oC pendant 30 min, centrifuger à 5 000 x g à 4 oC pendant 5 min, et recueillir le supernatant.
- Pour la fraction nucléaire insoluble, ajoutez 50 l de tampon d'extraction nucléaire complété par des inhibiteurs de la protéase, CaCl2 et nucléane micrococcique à la pastille à partir de l'étape 6.4.1.3, et le vortex. Incuber à 37 oC pendant 5 min, puis refaire un vortex. Centrifugeuse à 16 000 x g à RT pendant 5 min et collecte zetle le supernatant.
- Pour la fraction cytosquelettique, ajouter 50 l de tampon d'extraction cytosquelettique complété par des inhibiteurs de la protéase à la pastille à partir de l'étape 6.4.1.4, et le vortex. Incuber 10 min à RT. Centrifuge le tube à 16 000 x g pendant 5 min, ramasser le supernatant et jeter le granule.
REMARQUE: Échelle des volumes de mémoire tampon en fonction du volume de la cellule, tel qu'indiqué dans le protocole du kit. Se référer au protocole kit pour plus de détails sur l'incubation et le temps de centrifugation et la température22,23,24,25,26,27,28,29. Alternativement, utilisez toutes les méthodes standard30 qui, en utilisant des détergents et en augmentant la force ionique et la vitesse de centrifugation, sépare le cytosolique, la membrane liée, le cytosquelettique et les fractions nucléaires. Séparez la fraction nucléaire soluble et la fraction nucléaire insoluble en exploitant les tampons d'extraction nucléaire standard. L'échantillon peut être stocké à -20 oC.
- Pour le SDS-PAGE, ajouter 7 'L de tampon Laemmli 4x à 20 'L de fractions subcellulaires obtenues à partir des étapes 6.4.1.1-6.4.1.5, faire bouillir à 100 'C pendant 5 min.
- Pour isoler les compartiments subcellulaires, fractionner selon les spécifications du kit. Pour isoler chaque fraction, incuber le granule cellulaire de l'étape 6.4 avec le tampon correspondant, centrifugeuse, recueillir le supernatant et ajouter le tampon suivant à la pastille comme décrit dans 6.4.1.1-6.4.1.5. Ajouter dans l'ordre tampon d'extraction cytoplasmique, tampon d'extraction de membrane, tampon d'extraction nucléaire, tampon d'extraction nucléaire complété par 5 mM CaCl2 et 3 U/ L nucléane micrococcal et tampon d'extraction cytosquelettique.
- Chargez des échantillons sur un gel d'acrylamide et effectuez une électrophorèse à une tension constante de 120 V. Transférer les protéines à la membrane de nitrocellulose à 250 mA pendant 90 min.
- Vérifiez l'électrophorèse appropriée de gel de protéine et le ballonnement réussi en couvant la membrane pendant 5 min dans la solution de coloration de Ponceau. Rincer la membrane dans de l'eau distillée jusqu'à ce que le fond soit propre. Retirer la tache en continuant le lavage avec Tris tamponné saline avec Tween 20 (TBST) pendant 10 min sur un shaker.
- Incuber la membrane avec une solution de blocage (5% de lait en TBST) pendant 1 h à RT sur shaker. Laver 3 fois avec tBST pendant 5 min.
- Hybridez la membrane avec l'anticorps primaire dans la solution de blocage (1% de lait en TBST) pendant la nuit à 4 oC. Laver 3 fois avec tBST pendant 5 min.
- Hybridez la membrane avec l'anticorps secondaire HRP-conjugué dans la solution de blocage pendant 1 h à RT. Lavez-le 3 fois avec TBST pendant 5 min.
- Détecter la bande protéique à l'aide de la chemiluminescence. Quantifier l'intensité des groupes Western Blot par ImageJ. Normaliser l'expression des protéines sur le produit d'un gène d'entretien ménager : histone H2B pour la fraction soluble et insoluble nucléaire, GAPDH pour la fraction cytoplasmique et pour les extraits totaux.
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Representative Results
La stratégie utilisée pour disséquer l'impact du Tau nucléaire dans l'expression des gènes en évitant la contribution des protéines tau cytoplasmiques a été décrite dans la figure 1. En bref, les protéines Tau étiquetées avec NLS ou NES sont accumulées ou exclues du compartiment nucléaire, respectivement. L'effet fonctionnel de ce déséquilibre est l'altération de l'expression génique mesurée comme le produit du gène VGluT1.
Après la description du protocole, les cellules SH-SY5Y ont été traitées avec RA pendant 5 jours, puis avec BDNF pendant 3 jours afin d'obtenir des cellules post-mitotiques ressemblant à des neurones (Figure 2). En l'absence de RA et de BDNF, les cellules SH-SY5Y indifférenciées supposent une morphologie plus ronde et forment des amas cellulaires. Comme prévu, en commençant le protocole de différenciation, les amas se déroulent et les cellules étalent les neurites; à la fin de la différenciation, les cellules sont réparties uniformément et interconnectées via un réseau de neurites ramifiées.
Le lendemain de l'ensemencement, les cellules ont été transfectées avec des plasmides Tau-NLS ou Tau-NES (section 4.2) avec des lipides cationiques. Pour les cellules exprimant des constructions De Tau-NLS ou Tau-NES, la localisation subcellulaire de Tau peut être détectée par immunofluorescence avec des anticorps anti-Tau. Selon l'efficacité de la transfection, les cellules présentent une forte coloration nucléaire fusionnant avec le signal DAPI ou une coloration cytoplasmique avec des noyaux vides si elles sont transfectées avec succès avec Tau-NLS ou Tau-NES, respectivement (figure 3). L'absence de ces signaux spécifiques indique une transfection inefficace.
Pour analyser les protéines enrichies dans différents compartiments subcellulaires, des cellules ont été recueillies et comptées afin de traiter des quantités égales de cellules par échantillon. Toute méthode de fractionnement standard qui exploite l'augmentation du détergent et de la force ionique et l'augmentation de la vitesse de centrifugation peut être utilisée pour séparer les compartiments cellulaires les uns des autres et ainsi isoler le cytosolique, le membrane lié, le cytosquelettique et les fractions nucléaires.
Une fois que les noyaux ont été isolés, la fraction soluble nucléaire et la fraction liée à la chromatine ont été séparées en ajoutant 3 U/L de nucléase micrococcique et 5 mM CaCl2.
Pour l'analyse western blot, des volumes égaux de fractions cytoplasmiques et membranaires et la moitié des volumes des autres fractions ont été chargés sur un gel d'acrylamide précast gradient, pour corriger la quantité différente de tampon ajouté à chaque étape.
Pour vérifier la séparation efficace des différentes fractions, la tache occidentale exploitant les anticorps suivants a été réalisée : anti-GADPH (présent dans toutes les fractions sauf le cytosquelette et particulièrement enrichi dans la fraction cytoplasmique); anti-actine (particulièrement enrichie dans la fraction cytosquelettique); anti-tubuline (particulièrement enrichienenclasme en fractions cytoplémiques et cytosquelettiques); anti-H2B (enrichi en fractions nucléaires) (Figure 4).
Un enrichissement de ces marqueurs en différentes fractions subcellulaires indique que la fractionnement n'est pas bien réalisée. Il convient de noter que tout protocole de fractionnement subcellulaire pourrait présenter une contamination de 10 à 15 % entre les fractions.
Une fois vérifiée la fractionnement réussi de l'échantillon, la tache occidentale a été effectuée pour vérifier le signal de Tau dans le compartiment nucléaire et le signal VGluT1 dans l'extrait total (Figure 5). Alors que Tau non étiqueté est détectable dans toutes les fractions, Tau-NLS est fortement enrichi dans le compartiment nucléaire et il est mal détectable dans la fraction cytoplasmique. Au contraire, Tau-NES est enrichi dans la fraction cytoplasmique et il est moins détectable dans la fraction nucléaire. La présence d'une petite quantité de Tau-NES dans la fraction nucléaire soluble doit être attendue puisque, comme le Tau endogène, il est translocated dans le noyau et une fois dans le compartiment nucléaire le signal d'exportation nucléaire permet sa translocation au cytoplasme. La détection d'un enrichissement différent pour ces deux protéines de fusion pourrait indiquer un problème dans l'efficacité de la transfection ou dans le clonage des constructions ou dans la fractionnement.
L'analyse quantitative de Western blot peut être faite à l'aide d'ImageJ. Les valeurs sont normalisées pour le gène d'entretien spécifique pour chaque fraction (GAPDH pour la fraction cytoplasmique ; histone H2B pour les fractions nucléaires solubles et chromatine-liées).
Le graphique de la figure 5B indique le rapport de Tau dans la fraction nucléaire soluble et la fraction cytoplasmique pour souligner que Tau-NLS est fortement enrichi dans la fraction nucléaire soluble (SNF) tandis que Tau-NES est diminué. En outre, Tau-NLS est enrichi dans la fraction de chromatine -lié (CBF) en ce qui concerne la fraction cytoplasmique (CF) tandis que Tau-NES est diminué. SNF/CF et CBF/CF 1 correspondent au rapport Tau dans les cellules témoins. Le Tau endogène est faiblement détectable dans toutes les fractions comme prévu. Le graphique de la figure 5C indique la quantification de l'expression VGluT1 dans les extraits totaux d'échantillons exprimant une quantité différente de Tau nucléaire. Dans les cellules exprimant Tau-NES, l'expression VGluT1 est comparable à l'expression de base dans les cellules témoins. Au contraire, dans les cellules exprimant Tau ou Tau-NLS non étiquetés, l'expression de VGluT1 est plus que doublée.
Figure 1 : Représentation graphique de la stratégie utilisée pour permettre une accumulation nucléaire ou cytoplasmique de Tau. Tau-NLS est accumulé dans le compartiment nucléaire tandis que Tau-NES est exclu. La lecture expérimentale est la modulation de l'expression VGluT1. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Culture cellulaire représentative indifférenciée et différenciée. Image de SH-SY5Y indifférencié (gauche), cellules différenciées par RA (au milieu) et différenciées par RA et BDNF (droite). Barre d'échelle de 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Image représentative de l'enrichissement subcellulaire de Tau par immunofluorescence. Image des cellules non transfected ou exprimant des constructions non étiquetées de Tau, de Tau-NES ou de Tau-NLS. Le signal de Tau a été obtenu par immunofluorescence (rouge), le signal de noyaux a été obtenu par la coloration de DAPI (bleu), des images fusionnées sont rapportées. Barre d'échelle de 10 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Détection représentative des protéines enrichies en fractions subcellulaires par western blot. Tache occidentale des fractions subcellulaires des cellules de SH-SY5Y. CF - fraction cytoplasmique; MF - fraction de membrane; SNF - fraction nucléaire soluble; Fraction liée à la chromatine; CKF - fraction cytosquelettique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Détection représentative des protéines nucléaires Tau et VGluT1. (A) Tache occidentale de protéine Tau détectée dans les fractions nucléaires et cytoplasmiques. (B) Le graphique indique le rapport de Tau dans les fractions nucléaires et la fraction cytoplasmique. Les valeurs ont été normalisées sur le Tau endogène. SNF/CF et CBF/CF 1 correspondent au rapport Tau endogène dans les cellules témoins. (C) tache occidentale de protéine VGluT1. (D) Le graphique rapporte la quantification de l'expression VGluT1 dans les extraits totaux d'échantillons exprimant une quantité différente de Tau nucléaire. Test Kruskal-Wallis ANOVA et Mann-Whitney; p lt; 0,001, p 'lt; 0.0001, n.s. p 'gt; 0.05. Tous les résultats sont présentés comme étant la moyenne - SEM d'au moins trois expériences indépendantes. Ce chiffre représentatif a été modifié à partir de Siano et coll.31. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous décrivons une méthode pour mesurer l'impact de la protéine Tau nucléaire sur l'expression de gène. Avec ce protocole, la contribution du tau cytoplasmique est fortement limitée. Les étapes critiques de ce protocole sont les suivantes : la différenciation des cellules sH-SY5Y du neuroblastome humain, la fractionnement subcellulaire et la localisation de la protéine Tau dans le compartiment nucléaire.
Tout d'abord, comme le montre la section des résultats représentatifs, la différenciation des cellules SH-SY5Y en ajoutant la RA et le BDNF est cruciale pour obtenir une bonne préparation des cellules neuronales en culture. La densité des cellules enseissées est particulièrement importante car une densité plus faible pourrait avoir un impact sur la prolifération cellulaire. En outre, pour les expériences qui ont besoin d'un grand nombre de cellules, comme la fractionnement cellulaire et la tache occidentale, il est important de noter que l'étape de différenciation BDNF bloque la prolifération cellulaire pour permettre la différenciation terminale, limitant ainsi le nombre de cellules en culture. Les protocoles de différenciation alternatifs n'utilisent que RA ou NGF au lieu de BDNF. Cependant, tout en ajoutant BDNF après RA permet d'atteindre une meilleure différenciation morphologique32,33, NGF induit une croissance neurite plus faible dans les cellules SH-SY5Y34. En outre, il a été largement démontré que la combinaison de la RA et bDNF permet d'obtenir une population neuronale homogène avec l'expression des marqueurs neuronaux et la prolifération diminuée35. Pour cette raison, le protocole de différenciation exploité ici combine RA et BDNF.
Cependant, la procédure rapportée pour disséquer le rôle de Tau dans différents compartiments subcellulaires peut être employée également pour des cellules indifférenciées ou pour différents types de cellules.
La fractionnement subcellulaire est une étape très critique et il est crucial d'avoir assez de matériel de départ: un kit commercial ne nécessite que 1 x 106 cellules, tandis que d'autres procédures peuvent avoir besoin d'une quantité de départ beaucoup plus élevée. En outre, l'utilisation d'un kit avec des tampons et des étapes standard garantit la reproductibilité de l'expérience qui est inévitable et essentielle. Cependant, puisque la composition des tampons est souvent propriétaire, ils peuvent contenir des détergents qui peuvent modifier la fonction de la protéine d'intérêt et il pourrait être difficile d'optimiser l'isolement des fractions. En outre, même dans les meilleures conditions, il pourrait y avoir un 10-15% de contamination entre les fractions. Un faible rendement de chaque fraction pourrait être surmonté en augmentant le temps d'incubation dans les tampons d'extraction de fractions spécifiques.
Étant donné que les fonctions de Tau nucléaire ont gagné un intérêt significatif ces dernières années, il est particulièrement important de fournir une méthode fiable pour disséquer la fonction de Tau dans différents compartiments cellulaires. Le couplage de la fractionnement subcellulaire, avec l'expression de constructions Tau spécifiquement dirigées ou exclues du noyau, permet d'accorder finement la quantité de Tau dans différents compartiments.
Une étape cruciale dans cette partie du protocole est le clonage de Tau étiqueté avec le signal de localisation nucléaire ou avec le signal d'exportation nucléaire. L'efficacité du NLS est garantie par la présence d'une séquence de consensus 3XNLS du virus SV40. La translocation nucléaire de la protéine peut être facilement vérifiée par immunofluorescence, et l'absence de signal dans le noyau pourrait être due à un clonage incorrect ou à une transfection inefficace. Au contraire, l'exportation nucléaire est garantie par la séquence consensuelle de la NES. Dans ce cas, l'immunofluorescence permet de vérifier l'exportation de Tau à partir du noyau. Cependant, un signal nucléaire faible n'est pas à exclure puisque la protéine Tau-NES pénètre dans le noyau et puis, en raison de la séquence NES, il est exporté dans le cytosol.
Jusqu'à présent, la fonction du Tau nucléaire n'a été étudiée que par des approches corrélatives qui n'assurent pas son implication directe. Le protocole décrit ici, fournit la première approche permettant de discriminer clairement la fonction spécifique de Tau dans le compartiment nucléaire. Comme démontré précédemment, le Tau endogène n'affecte pas les résultats obtenus par ce protocole. En effet, la même expérience réalisée dans des cellules non neuronales qui n'expriment pas Tau endogène, conduit à l'expression altérée VGluT1. Nous avons appliqué ce protocole pour étudier l'expression des gènes liés à la maladie31. Quoi qu'il en soit, il pourrait être exploité aussi pour étudier d'autres fonctions nucléaires Tau, telles que l'implication sur les dommages à l'ADN, l'interaction avec les cofacteurs nucléaires ou avec la chromatine.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
References
- Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
- Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
- Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
- Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
- Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
- Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
- Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
- Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J.
- Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
- Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
- Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
- Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
- Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
- Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
- Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
- Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
- Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
- Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
- Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
- Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
- Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
- Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
- Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
- Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
- Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
- Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
- ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
- Siano, G., et al.
- Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
- Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
- Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
- Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).
