Summary
Tau er et neuronal protein til stede både i cytoplasmaet, hvor det binder mikrotubuler, og i kernen, hvor det udøver ukonventionelle funktioner, herunder graduering af Alzheimers sygdom-relaterede gener. Her beskriver vi en metode til at undersøge funktionen af nukleare Tau, mens udelukke eventuelle interferenser, der kommer fra cytoplasmisk Tau.
Abstract
Tau er en mikrotubulus bindende protein udtrykt i neuroner og dens vigtigste kendte funktion er relateret til vedligeholdelse af cytoskelet stabilitet. Nylige beviser indikerede imidlertid, at Tau også findes i andre subcellulære rum, herunder kernen, hvor det er impliceret i DNA-beskyttelse, i rRNA-transkriptionen, i mobiliteten af retrotransponer og i den strukturelle organisering af nucleolus. Vi har for nylig vist, at nuklear Tau er involveret i udtrykket af VGluT1 genet, hvilket tyder på en molekyl mekanisme, der kan forklare den patologiske stigning i glutamat frigivelse i de tidlige stadier af Alzheimers sygdom. Indtil for nylig har inddragelsen af nukleare Tau i modulering af ekspression af målgener været relativt usikker og tvetydig på grund af tekniske begrænsninger, der forhindrede udelukkelse af bidraget fra cytoplasmatiske Tau eller virkningen af andre downstream-faktorer, der ikke er relateret til nuklear Tau. For at overvinde denne usikkerhed, udviklede vi en metode til at studere ekspression af målgener specifikt moduleret af Nuclear Tau protein. Vi anvendte en protokol, der par brugen af lokaliserings signaler og subcellulære fraktionering, tillader udelukkelse af interferens fra cytoplasmatiske Tau molekyler. Mest bemærkelsesværdigt, at protokollen er let og er sammensat af klassiske og pålidelige metoder, der er stort set gælder for at studere den nukleare funktion af Tau i andre celletyper og cellulære betingelser.
Introduction
Funktionerne af Tau protein i kernen har høstet betydelig interesse i de seneste år, da det har vist sig at være tæt forbundet med nukleinsyre syrer1,2,3,4,5,6. Faktisk viste en nylig genomdækkende undersøgelse, at Tau binder gene og intergene DNA-sekvenser in vivo7. En rolle i nucleolar organisation er blevet foreslået8,9,10,11. Desuden er Tau blevet foreslået at være involveret i DNA-beskyttelse fra oxidativ og melfalan stress5,10,12,13, hvorimod muterede Tau har været forbundet med kromosom ustabilitet og aneuploidi14,15,16.
Indtil nu, de udfordringer i at studere funktionerne i Tau i det nukleare rum forblev næsten uløste på grund af vanskeligheder med at dissekerer det specifikke bidrag af nukleare Tau fra bidraget fra cytoplasmatiske Tau. Desuden er de funktioner, der tilskrives Tau-molekyler i det nukleare rum indtil nu, kun korrelative, fordi de mangler en utvetydig demonstration af den direkte involvering af nukleare Tau-proteiner. Ja, inddragelsen af Tau i mobiliteten af retrotransposons eller i rRNA transskription eller i DNA-beskyttelse11,12,17,18,19 kan også forklares ved bidrag af cytoplasmatiske Tau eller af virkningen af andre downstream faktorer, der ikke er relateret til nukleare Tau.
Her giver vi en metode, der kan løse dette problem ved at udnytte en klassisk procedure for at isolere det nukleare rum kombineret med brugen af Tau konstruktioner 0N4R mærket med nuklear lokalisering (NLS) eller nukleare eksport signaler (NES). Denne tilgang eliminerer de komplekse problemer i forbindelse med mulige artefakter på grund af den afsmittende af Tau molekyler fra cytoplasmisk rum. Desuden inducerer Tau-NLS og Tau-NES konstruktioner tilsætning eller udelukkelse af Tau-molekyler fra det nukleare rum, hvilket giver positive og negative kontroller for involvering af nukleare Tau-molekyler i en bestemt funktion. Protokollen er teknisk let og er sammensat af klassiske og pålidelige metoder, der generelt gælder for at studere den nukleare funktion af Tau i andre celletyper, differentieret eller ej, såsom kræftceller, der genaktiverer Tau udtryk20,21. Desuden kan det også anvendes til andre proteiner, der er til stede i både cytoplasmaet og kernen for at dissekere biologiske funktioner i forbindelse med forskellige rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellekultur
- Kultur SH-SY5Y celler (Human neuroblastom cellelinje, CRL-2266) i komplet medium (Dulbecco's modificerede Eagle medium: næringsstof blanding F12 [DMEM/F-12] suppleret med 10% føtal kvægserum [FBS], 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL streptomycin). Opretholde cellerne i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2. Vokse celler i 10 cm plader og split, når confluent.
2. Celledifferentiering
- For at skelne SH-SY5Y celler, dagen efter plating, tilsættes 10 μM retinsyre (RA) for at fuldføre medium i 5 dage.
- Den sjette dag erstatter medium med differentierings medium: DMEM/F-12 suppleret med 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamin. Tilsæt ikke FBS eller antibiotika.
- Vokse cellerne i differentiering medium for 3 dage.
3. chimeric Konstruer kloning
- Generer Tau-NLS konstruere ved kloning ved begrænsning enzym fordøjelse i ramme på den 3 ' ende af Tau sekvens 0N4R (383aa) 3xNLS (SV40NLS): 5 '-CCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3 '.
Bemærk: 3xNLS ved den 3 ' ende af Tau er klonet ind i pCMV-Tau plasmid for pattedyrs udtryk, der udnytter XhoI-og BamHI-begrænsnings stederne til multi-site (MCS). - Generer Tau-NES konstruere ved kloning ved begrænsning enzym fordøjelse i ramme ved den 3 ' ende af Tau sekvens 0N4R (383aa) NES sekvens: 5 '-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTCGTACAA-3 '.
Bemærk: NES ved den 3 ' ende af Tau er klonet ind i pCMV-Tau plasmid for pattedyrs udtryk, der udnytter EcoRI-og BamHI-begrænsnings stederne i MCS. - Omdanne DH5alpha E. coli stamme med 100 ng af DNA fra trin 3,1 eller 3,2 og plade celler på lb-agar plader med 100 mg/ml ampicillin. Lad vokse natten over ved 37 °C.
- Vælg en enkelt koloni og Spike cellerne i 5 mL LB med ampicillin. Lad cellerne vokse ved 37 °C i agitation natten over.
- Ekstrakt plasmid med en DNA miniprep (tabel over materialer) og sekvens for at verificere konstrukterne.
- Omdanne DH5alpha E. coli stamme med sekvens verificeret konstruktioner og plade celler på lb-agar plader med ampicillin. Lad vokse natten over ved 37 °C.
- Vælg en enkelt koloni og Spike cellerne i 5 mL LB med ampicillin. Lad cellerne vokse ved 37 °C i agitation i 2 timer.
- Placer cellerne fra trin 3,7 i 200 mL LB med ampicillin. Lad vokse natten over ved 37 °C.
- Pellet cellerne ved 3.500 x g i 10 minutter ved 4 °c.
- Ekstrakt plasmid med en DNA maxiprep (tabel over materialer).
4. celle Transfection
- Seed 400.000 celler fra trin 1,1 i 6-brønd plader eller 20.000 celler i 8-brøndkammer slides. Plade fire prøver: kontrol celler, der skal transficeret med en tom vektor, celler, der skal transficeret med ukodede Tau, celler, der skal transficeret med Tau-NLS og celler, der skal transficeret med Tau-NES.
- Dagen efter såning transficere 400 ng af DNA for hver brønd ved hjælp af kationiske lipiderne (tabel over materialer) i 6-brønd plader eller 200 ng af DNA for hver brønd for 8-brøndkammer glider, i henhold til producentens anvisninger.
- Inubat DNA og kationiske lipiderne separat i 250 μL (for 6-brønds plader) eller 25 μL (for 8-brøndkammer slides) af reduceret serum medium for 5 min ved RT. Derefter kombinere dem til at generere DNA-lipid kompleks og inkubere i 20 min.
- Udskift dyrkningsmediet med 2 mL (til 6-brønd plader) eller 250 μL (til 8-brøndkammer slides) af frisk komplet kulturmedium. Tilsæt DNA-lipid-komplekset til cellerne og Inkuber ved 37 °C natten over.
- Alternativt transficere DNA med kationisk reagens polyethylenimin (PEI).
- Bland 2 μg DNA og 6 μL PEI med 200 μL komplet dyrkningsmedium (for hver brønd i 6-brønd plader) eller 1 μg DNA og 3 μL PEI med 100 μL komplet dyrkningsmedium (for hver brønd i 8-brøndkammer slides) , vortex og Inkuber i 10 minutter ved RT.
- Tilsæt blandingen til cellerne, og tilsæt 1,8 mL komplet dyrkningsmedium pr. brønd i 6-brønd plader eller 150 μL komplet dyrkningsmedium pr. brønd i 8-brøndkammer glider for at nå plating volumen.
- Skift mellem mediet dagen efter transfektering, og Tilføj differentierings mediet som beskrevet i trin 2,2.
5. immunofluorescens
- Fjern dyrkningsmediet og skyl cellerne med 1x PBS. Fix celler med 100% iskold methanol i 3 min uden at ryste. Fjern fastgørelses opløsningen og vask kort med 1x PBS.
- Permeabilize med 0,1% ikke-ionisk overfladeaktivt stof i 1x PBS i 5 minutter ved stuetemperatur (RT). Kort, vask med 1x PBS, 3 gange.
- Inkubér celler med blokerende buffer (0,1% mellem 20 og 1% BSA i PBS) i 30 minutter ved RT på en orbital shaker.
- Inkubér med passende primære antistoffer (f. eks. mus monoklonale anti-Tau13 antistof) fortyndet 1:500 i blokerende buffer natten over ved 4 °C på en orbital shaker. Fjern antistof opløsningen og vask kortvarigt med 1x PBS.
- Inkubere med sekundære antistoffer konjugeret til fluoroforet (f. eks. ged anti-muse antistoffer konjugeret til Alexa fluor 633) fortyndet 1:500 i blokerende buffer i 1 time ved rt. Fjern antistof opløsningen, og vask kortvarigt med 1x PBS 3 gange.
- Til plette kerner, inkubere med DAPI fortyndet 1:20000 i blokerende buffer i 10 min ved RT. vask med 1x PBS 3 gange. Monter dæksedler på et dias ved hjælp af monterings mediet til antifade.
6. Western blot
- For at indsamle celle pellet fra trin 4,4, fjerne mediet, og vaske celler med PBS. Inkubatér med 500 μL 0,1% trypsin i 4 min ved 37 °C. Tilføj et tilsvarende volumen af komplette medium og resuspendere celler.
- Saml cellerne i et rør og centrifugeres ved 500 x g i 5 min. Ved afslutningen af Centrifugerings forsigtigt fjerne supernatanten. Tilsæt 1 mL PBS, centrifuge ved 500 x g i 5 minutter og fjern forsigtigt supernatanten. Opbevar celle piller på is til umiddelbar brug eller fryse ved-80 °C for langtidsopbevaring.
- For samlede proteinekstrakter Inkuber celle pellet i 30 min på is i lysis-buffer (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glycerol, 1% octylphenoxy poly (ethyleneoxy) ethanol, forgrenet (tabel over materialer), 10 mm EDTA) suppleret med proteasehæmmere og fosfataseinhibitorer. Ifølge den overflod af pellet, brug 50 μL til 100 μL af lysis buffer.
- Ekstrakten centrifugeres ved 16.000 x g i 15 minutter. opsamles supernatanten og kvantificeres proteinkoncentrationen ved enhver standard kvantificerings analyse. Protein prøverne forberedes til SDS-siden ved at blande 20 μg proteiner med 5 μL 4X Laemmli-buffer i et samlet volumen på 20 μL og koges ved 100 °C i 5 min.
Bemærk: Prøven kan opbevares ved-20 °C.
- Ekstrakten centrifugeres ved 16.000 x g i 15 minutter. opsamles supernatanten og kvantificeres proteinkoncentrationen ved enhver standard kvantificerings analyse. Protein prøverne forberedes til SDS-siden ved at blande 20 μg proteiner med 5 μL 4X Laemmli-buffer i et samlet volumen på 20 μL og koges ved 100 °C i 5 min.
- For subcellulære fraktioneringer, resuspendere celler fra trin 6,2 i komplet medium, og indsamle 1 x 106 celler pr hver prøve. Centrifugeres ved 500 x g i 10 minutter for at få celle pellets til følgende trin.
- For at isolere subcellulære rum, fraktionere i henhold til kit specifikationer. For at isolere hver fraktion skal du inkubere celle pellet fra trin 6,4 med den tilsvarende buffer, Centrifuge, Saml supernatanten og tilsæt den næste buffer til pellet som beskrevet i 6.4.1.1-6.4.1.5. Tilsæt i rækkefølge cytoplasmisk udvinding buffer, membran udvinding buffer, nuklear udvinding buffer, nuklear udvinding buffer suppleret med 5 mM CaCl2 og 3 U/μl mikrococcal nuclease og cytoskelet udvinding buffer.
Bemærk: Alle buffere skal suppleres med proteasehæmmere. Skala buffer volumener i henhold til mængden af celle pellet.- For at isolere cytosolisk-fraktionen inkuberes celle pellets i 100 μl iskold cytoplasmisk ekstraktions buffer suppleret med proteasehæmmere ved 4 °c med blid blanding i 10 min. centrifuge ved 500 x g ved 4 °c i 5 min og Overfør supernatanten til præ-kølede rør.
- Tilsæt 100 μL iskold membran ekstraktions buffer suppleret med proteasehæmmere til pellet fra trin 6.4.1.1, og Inkuber ved 4 °C med blid blanding i 10 min. centrifugeres ved 3.000 x g ved 4 °c i 5 minutter og opsamles supernatanten.
- For den opløselige nukleare fraktion tilsættes 50 μL nuklear ekstraktions buffer suppleret med proteasehæmmere til pellet fra trin 6.4.1.2 og vortex. Inkuber ved 4 °C i 30 minutter, centrifugeres ved 5.000 x g ved 4 °c i 5 minutter og opsamles supernatanten.
- For den uopløselige nukleare fraktion tilsættes 50 μL nuklear ekstraktions buffer suppleret med proteasehæmmere, CaCl2 og micrococcal nuclease til pellet fra trin 6.4.1.3, og vortex. Inkuber ved 37 °C i 5 minutter og derefter vortex igen. Centrifugeres ved 16.000 x g ved rt i 5 minutter og opsamles supernatanten.
- For cytoskelet fraktion tilsættes 50 μL cytoskelet ekstraktions buffer suppleret med proteasehæmmere til pellet fra trin 6.4.1.4, og vortex. Inkuber 10 min ved RT. centrifuger røret ved 16.000 x g i 5 minutter, Saml supernatanten og kassér pellet.
Bemærk: Skaler buffer volumener i henhold til celle volumen som angivet i pakke protokollen. Se pakke protokollen for yderligere oplysninger om inkubation og Centrifugerings tidspunkt og-temperatur22,23,24,25,26,27,28,29. Alternativt kan du bruge standardmetoder30 , som ved hjælp af rengøringsmidler og ved at forøge ionstyrken og centrifugeringshastigheden adskiller cytosolien, membranen, cytoskelettet og de nukleare fraktioner. Den opløselige nukleare fraktion og den uopløselige nukleare fraktion adskilles ved udnyttelse af standard nukleare ekstraktions buffere. Prøven kan opbevares ved-20 °C.
- Til SDS-siden tilsættes 7 μL 4X Laemmli-buffer til 20 μL subcellulære fraktioner opnået fra trin 6.4.1.1 − 6.4.1.5, kog ved 100 °C i 5 minutter.
- For at isolere subcellulære rum, fraktionere i henhold til kit specifikationer. For at isolere hver fraktion skal du inkubere celle pellet fra trin 6,4 med den tilsvarende buffer, Centrifuge, Saml supernatanten og tilsæt den næste buffer til pellet som beskrevet i 6.4.1.1-6.4.1.5. Tilsæt i rækkefølge cytoplasmisk udvinding buffer, membran udvinding buffer, nuklear udvinding buffer, nuklear udvinding buffer suppleret med 5 mM CaCl2 og 3 U/μl mikrococcal nuclease og cytoskelet udvinding buffer.
- Læg prøver på en acrylamid-gel, og Udfør elektroforese ved en konstant spænding på 120 V. Overfør proteiner til nitrocellulose membran ved 250 mA for 90 min.
- Kontroller korrekt protein gel elektroforese og vellykket blotting ved inkubering af membranen i 5 min i Ponceau farvningsopløsning. Skyl membranen i destilleret vand, indtil baggrunden er ren. Fjern pletten ved fortsat vask med Tris bufferet saltvand med Tween 20 (TBST) i 10 minutter på en shaker.
- Membranen med blokerende opløsning (5% mælk i TBST) inkubates i 1 time ved RT på shaker. Vask 3 gange med TBST i 5 min.
- Hybridize membranen med det primære antistof i blokerende opløsning (1% mælk i TBST) natten over ved 4 °C. Vask 3 gange med TBST i 5 min.
- Hybridize membranen med HRP-konjugeret sekundært antistof i blokerende opløsning i 1 time ved RT. vask 3 gange med TBST i 5 min.
- Detektér protein båndet ved hjælp af kemo luminescens. Kvantificere intensiteten af Western blot bands af ImageJ. Normalisere protein ekspression på produktet af en husholdning gen: Histon H2B for den nukleare opløselige og uopløselige fraktion, gapdh for cytoplasmatiske fraktion og for samlede ekstrakter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den strategi, der anvendes til at dissekere virkningen af nukleare Tau i genekspression undgå bidrag af cytoplasmatiske Tau proteiner er blevet afbildet i figur 1. Kort sagt akkumuleres Tau-proteiner, der er mærket med NLS eller NES, henholdsvis i eller udelukket fra det nukleare rum. Den funktionelle virkning af denne ubalance er ændringen af genekspression målt som produktet af VGluT1 genet.
Efter protokol beskrivelsen blev SH-SY5Y celler behandlet med RA i 5 dage og derefter med BDNF i 3 dage for at opnå post-mitotiske neuron-lignende celler (figur 2). I fravær af RA og BDNF antager udifferentierede SH-SY5Y celler en rounder morfologi og danner celle klumper. Som forventet, at starte differentierings protokollen, klumper slappe af og celler spredt ud neurites; i slutningen af differentiering, celler er jævnt fordelt og forbundet via et netværk af forgrenede neurites.
Dagen efter såning er cellerne blevet transficeret med Tau-NLS eller Tau-NES plasmider (afsnit 4,2) med kationiske lipiderne. For celler, der udtrykker Tau-NLS eller Tau-NES konstruktioner, kan Tau subcellulære lokalisering påvises ved immunofluorescens med anti-Tau-antistoffer. Afhængigt af effektiviteten af transfection, viser cellerne en stærk nuklear farvning fusionere med dapi-signalet eller en cytoplasmisk farvning med tomme kerner, hvis de er med held transficeret med Tau-NLS eller Tau-NES, henholdsvis (figur 3). Manglen på disse specifikke signaler indikerer en ineffektiv transfection.
For at analysere proteinerne, der er beriget i forskellige subcellulære rum, blev cellerne indsamlet og talt med henblik på at behandle lige store mængder af celler pr. prøve. Enhver standard fraktionerings metode, der udnytter stigende rengøringsmiddel og ionisk styrke og stigende centrifugeringshastighed kan bruges til at adskille de cellulære rum fra hinanden og dermed isolere cytosolic, den membranbundne, cytoskelet og de nukleare fraktioner.
Når kerner er blevet isoleret, den nukleare opløselige fraktion og den kromatin bundne fraktion blev adskilt ved at tilføje 3 U/μL mikrococcal nuclease og 5 mM CaCl2.
For Western blot analyse, er lige store mængder af cytoplasmatiske og membran fraktioner og halve volumener af de andre fraktioner blevet indlæst på en gradient præfabrikerede acrylamid gel, for at korrigere for den forskellige mængde buffer tilsat ved hvert trin.
For at verificere en effektiv adskillelse af forskellige fraktioner er den vestlige skamplet, der udnytter følgende antistoffer, blevet udført: anti-GADPH (til stede i alle fraktioner undtagen cytoskelettet og specielt beriget i cytoplasmisk fraktion); anti-actin (især beriget i cytoskelet fraktion); anti-Tubulin (især beriget med Cytoplasmiske og cytoskeletale fraktioner); anti-H2B (beriget i de nukleare fraktioner) (figur 4).
En berigelse af disse markører i forskellige subcellulære fraktioner indikerer, at fraktionering ikke er godt udført. Det skal bemærkes, at enhver protokol for subcellulære fraktionering kan udgøre en 10-15% af forureningen mellem fraktioner.
Når verificeret den vellykkede fraktionering af prøven, den vestlige blot er blevet udført for at kontrollere signalet af Tau i det nukleare rum og VGluT1 signal i den samlede ekstrakt (figur 5). Mens ukodede Tau er detekterbare i alle fraktioner, Tau-NLS er stærkt beriget i det nukleare rum, og det er dårligt detekterbar i cytoplasmisk fraktion. Tværtimod er Tau-NES beriget i den cytoplasmiske fraktion, og det er mindre detekterbart i den nukleare fraktion. Tilstedeværelsen af en lille mængde Tau-NES i den opløselige nukleare fraktion må forventes, da, ligesom den endogene Tau, er det translokeres i kernen og en gang ind i det nukleare rum den nukleare eksport signal giver sin translokation til cytoplasmaet. Påvisning af en anden berigelse for disse to fusions proteiner kan indikere et problem i effektiviteten af transfektering eller i kloning af konstruktioner eller i fraktionering.
Kvantitativ analyse af Western blot kan gøres ved hjælp af ImageJ. Værdier normaliseret for husholdnings genet specifikt for hver fraktion (GAPDH for cytoplasmisk fraktion; Histon H2B for opløselige nukleare og kromatin-bundne fraktioner).
Grafen i figur 5B rapporterer forholdet mellem Tau i den opløselige nukleare fraktion og cytoplasmiske fraktion for at fremhæve, at Tau-NLS er stærkt beriget i den opløselige nukleare fraktion (SNF), mens Tau-NES er faldet. Desuden er Tau-NLS beriget i den kromatin bundne fraktion (CBF) med hensyn til cytoplasmisk fraktion (CF), mens Tau-NES er faldet. SNF/CF = 1 og CBF/CF = 1 svarer til Tau ratio i kontrol celler. Den endogene Tau er svagt detekterbar i alle fraktioner som forventet. Grafen i figur 5C rapporterer kvantificeringen af VGluT1 udtryk i de samlede uddrag af prøver, som udtrykker forskellige mængde nukleare Tau. I celler, der udtrykker Tau-NES, kan VGluT1-udtrykket sammenlignes med det oprindelige udtryk i kontrol celler. Tværtimod, i celler, der udtrykker ukodede Tau eller Tau-NLS, er udtrykket VGluT1 mere end fordoblet.
Figur 1: grafisk gengivelse af den strategi, der anvendes til at tillade en nuklear eller en cytoplasmisk ophobning af Tau. Tau-NLS akkumuleres i det nukleare rum, mens Tau-NES er udelukket. Den eksperimentelle udlæser er modulationen af VGluT1 ekspression. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativ udifferentieret og differentieret cellekultur. Billede af udifferentieret SH-SY5Y (venstre), celler differentieret af RA (midten) og differentieret af RA og BDNF (højre). Scale bar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentativt billede af Tau subcellulære berigelse ved immunofluorescens. Billede af celler, som ikke er transficeret eller udtrykker ukodede Tau-, Tau-NES-eller Tau-NLS-konstruktioner. Tau signal er opnået ved immunofluorescens (rød), kerner signal er opnået ved dapi farvning (blå), fusionerede billeder rapporteres. Scale bar = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentativ påvisning af proteiner beriget med subcellulære fraktioner af Western blot. Western blot af subcellulære fraktioner fra SH-SY5Y celler. CF = cytoplasmisk fraktion; MF = membran fraktion; SNF = opløselige nukleare fraktion; CBF = kromatin bundet fraktion; CKF = cytoskelet fraktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentativ påvisning af nukleare Tau og VGluT1 proteiner. (A) Western blot af Tau protein påvist i de nukleare og cytoplasmiske fraktioner. (B) grafen rapporterer forholdet mellem Tau i de nukleare fraktioner og cytoplasmiske fraktion. Værdierne er blevet normaliseret på den endogene Tau. SNF/CF = 1 og CBF/CF = 1 svarer til endogene Tau ratio i kontrol celler. (C) Western blot af VGluT1 protein. (D) grafen rapporterer kvantificeringen af VGluT1 udtryk i de samlede uddrag af prøver, som udtrykker forskellige mængde nukleare Tau. Krubør-Wallis ANOVA og Mann-Whitney-testen; p < 0,001, * * * * p < 0,0001, n.s. p > 0,05. Alle resultater vises som Mean ± SEM fra mindst tre uafhængige eksperimenter. Dette repræsentative tal er blevet ændret fra Siano et al.31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en metode til at måle virkningen af nukleare Tau protein på genekspression. Med denne protokol er bidraget fra cytoplasmatiske Tau stærkt begrænset. Kritiske trin i denne protokol er følgende: differentieringen af humane neuroblastom SH-SY5Y celler, subcellulære fraktionering og lokalisering af Tau protein i det nukleare rum.
For det første, som det fremgår af afsnittet om repræsentative resultater, er differentieringen af SH-SY5Y celler ved at tilføje RA og BDNF afgørende for at opnå en god forberedelse af neuron-lignende celler i kulturen. Tætheden af celler seedet er særlig vigtigt, da en lavere tæthed kan påvirke celle proliferation. Desuden, for eksperimenter, der har brug for et stort antal celler, ligesom cellulære fraktionering og Western blot, er det vigtigt at bemærke, at BDNF differentiering trin blokerer cellulære spredning til at tillade den terminale differentiering, og dermed begrænse antallet af celler i kulturen. Alternative differentierings protokoller bruger kun RA eller NGF i stedet for BDNF. Men samtidig tilføjer BDNF efter RA gør det muligt at nå en bedre morfologiske differentiering32,33, ngf inducerer en svagere neurite udvækst i sh-SY5Y celler34. Desuden er det blevet udførligt påvist, at kombinationen af RA og BDNF gør det muligt at opnå en homogen neuronal population med ekspression af neuronal markører og nedsat spredning35. Derfor er den differentierings protokol, som udnyttes her, en kombination af RA og BDNF.
Men den procedure, der rapporteres at dissekere rollen som Tau i forskellige subcellulære rum kan også bruges til udifferentierede celler eller til forskellige celletyper.
Den subcellulære fraktionering er et meget kritisk skridt ogdet er afgørende for at have nok udgangsmateriale: en kommerciel kit kræver kun 1 x 106 celler, mens andre procedurer kan have brug for en meget højere start mængde. Desuden garanterer brugen af et kit med standard buffere og trin reproducerbarhed af forsøget, der er uundgåelig og afgørende. Men da sammensætningen af buffere ofte er proprietære, kan de indeholde vaskemidler, som kan ændre funktionen af det protein af interesse, og det kan være vanskeligt at optimere isoleringen af fraktioner. Desuden kan der, selv i den bedste tilstand, være en 10-15% kontaminering mellem fraktioner. Et dårligt udbytte fra hver fraktion kan overvindes ved at forøge inkubationstiden i ekstraktions buffere af specifikke fraktioner.
Da funktionerne i nukleare Tau har vundet betydelig interesse i de seneste år, er det særlig vigtigt at give en pålidelig metode til at dissekere funktionen af Tau i forskellige cellulære rum. Kobling af subcellulære fraktionering, med ekspression af Tau konstruktioner specifikt instrueret eller udelukket fra kernen, tillader en at finjustere mængden af Tau i forskellige rum.
Et kritisk skridt i denne del af protokollen er kloning af Tau mærket med nukleare lokaliserings signal eller med det nukleare eksport signal. Effektiviteten af NLS er garanteret af tilstedeværelsen af en 3XNLS konsensus sekvens fra SV40 virus. Den nukleare translokation af proteinet kan let kontrolleres ved immunofluorescens, og den manglende signal i kernen kan skyldes en forkert kloning eller en ineffektiv transfection. Tværtimod er den nukleare eksport garanteret af NES-konsensus sekvensen. I dette tilfælde tillader immunofluorescens kontrol af eksporten af Tau fra kernen. Et svagt nukleart signal må dog ikke udelukkes, da Tau-NES-proteinet kommer ind i kernen og derefter, på grund af NES-sekvensen, eksporteres til cytosol.
Indtil nu er funktionen af nuklear Tau kun blevet undersøgt af korrelative tilgange, der ikke sikrer dens direkte involvering. Den her beskrevne protokol giver den første fremgangsmåde, der gør det muligt klart at diskriminere Tau ' specifikke funktion i det nukleare rum. Som tidligere påvist påvirker det endogene Tau ikke de resultater, som denne protokol har opnået. Faktisk det samme eksperiment udført i ikke-neuronal celler, der ikke udtrykker endogene Tau, fører til VGluT1 ændret udtryk. Vi anvendte denne protokol til at studere ekspression af sygdomsrelaterede gener31. Under alle omstændigheder kunne det også udnyttes til at undersøge andre nukleare Tau funktioner, såsom involvering i DNA-skader, interaktion med nukleare cofaktorer eller med kromatin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Scuola normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
References
- Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
- Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
- Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
- Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
- Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
- Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
- Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
- Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
- Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
- Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
- Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
- Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
- Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
- Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
- Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
- Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
- Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
- Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
- Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
- Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
- Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
- Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
- Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
- Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
- Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
- Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
- ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
- Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
- Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
- Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
- Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
- Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).
