Summary
Tau 是一种神经元蛋白，存在于细胞质中，它结合微管，在细胞核中，它发挥非常规功能，包括与阿尔茨海默氏病相关基因的调制。在这里，我们描述了一种研究核Tau功能的方法，同时排除了来自细胞质陶的任何干扰。
Abstract
Tau是一种在神经元中表达的微管结合蛋白，其主要已知功能与维持细胞骨骼稳定性有关。然而，最近的证据表明，Tau也存在于其他亚细胞室中，包括其与DNA保护、rRNA转录、逆转录泊剂流动性和结构组织有关的细胞核。核仁。我们最近已经证明，核Tau参与VGluT1基因的表达，建议一种分子机制，可以解释谷氨酸释放在阿尔茨海默氏病的早期阶段的病理增加。直到最近，由于技术限制，防止了细胞质Tau的贡献或其它影响，核陶参与调节目标基因的表达一直相对不确定和模糊。下游因素与核陶无关。为了克服这种不确定性，我们开发了一种方法，研究由核Tau蛋白专门调节的目标基因的表达。我们采用了一种协议，将定位信号和亚细胞分馏的使用耦合在一起，从而排除了细胞质Tau分子的干扰。最值得注意的是，该协议是容易的，由经典和可靠的方法组成，广泛适用于研究Tau在其他细胞类型和细胞条件下的核功能。
Introduction
Tau蛋白在核中的功能近年来引起了极大的兴趣，因为它已被证明与核酸1，2，3，4，5，6密切相关。事实上，最近的一项全基因组研究表明，Tau在体内结合基因和基因DNA序列。在核组织中的作用已被建议8，9，10，11。此外，Tau被建议参与DNA保护，免受氧化和高热应激5、10、12、13的影响，而突变的陶已与染色体不稳定和抗倍体14、15、16有关。
直至目前为止，研究陶在核舱的功能方面的挑战，由于难以剖析核陶在核质Tau的贡献中的具体贡献，因此，研究陶在核舱中所面临的挑战，几乎仍未解决。此外，迄今为止，核隔间中的Tau分子的功能只是相关的，因为它们缺乏核Tau蛋白直接参与的明确证明。事实上，陶参与逆子的流动或rRNA转录或DNA保护11、12、17、18、19，也可以由细胞质陶的贡献或与核陶无关的其他下游因素的影响来解释。
在这里，我们提供了一个方法，可以通过利用一个经典程序来隔离核隔间，结合使用带有核定位（NLS）或核出口信号（NES）标记的Tau构造0N4R来解决这个问题。这种方法消除了由于Tau分子从细胞质室溢出而可能产生的文物的复杂问题。此外，Tau-NLS和Tau-NES结构分别诱导Tau分子从核隔间中浓缩或排除，为核Tau分子参与特定功能提供正负控制。该协议在技术上是容易的，它由经典和可靠的方法组成，广泛适用于研究Tau在其他细胞类型中的核功能，有区别与否，如重新激活Tau表达20，21的癌细胞。此外，它也可以应用于细胞质和细胞核中存在的其他蛋白质，以解剖与不同隔间相关的生物功能。
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Protocol
1. 细胞培养
- 培养SH-SY5Y细胞（人类神经母细胞瘤细胞系，CRL-2266）在完整的介质（Dulbeco的改性鹰培养基：营养混合物F12[DMEM/F-12]补充10%胎儿牛血清[FBS]，2mM L-谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100微克/mL链霉素）。将孵化器中的细胞保持在37°C和5%CO2。在10厘米的板中生长细胞，并在汇入时分裂。
2. 细胞分化
- 为了区分SH-SY5Y细胞，在电镀后的第二天，加入10μM视黄酸（RA）以完成5天的培养基。
- 第六天用分化介质替换介质：DMEM/F-12辅以50纳克/mL BDNF、2 mM L-谷氨酰胺。不要添加FBS或抗生素。
- 在分化培养基中生长细胞3天。
3. 奇美构造克隆
- 通过通过在 Tau 序列 0N4R （383aa） 3xNLS （SV40NLS） 的 3xNLS （SV40NLS） 的 3xNLS （SV40NLS）的帧中限制酶消化来生成 Tau-NLS 构造：5'-CCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
注：Tau 3'末端的3xNLS被克隆成pCMV-Tau质粒，用于哺乳动物表达，利用XhoI和BamHI限制位点进入多克隆位点（MCS）。 - 通过通过在Tau序列0N4R（383aa）的3'端的帧中限制酶消化来生成Tau-NES构造：5'-AGTAGCTGAAAGAGAGATATATATATATATATATATATATATATATCTCTTACA-3'。
注：Tau 3'末端的NES被克隆成pCMV-Tau质粒，用于哺乳动物表达，利用EcoRI和BamHI限制位点进入MCS。 - 在步骤3.1或3.2中转换DH5α大肠杆菌菌株，在LB-Agar板上用100mg/mL阿霉素转化DNA。让我们在37°C生长过夜。
- 选择单个菌落，用阿霉素将细胞尖刺到5 mL的LB中。让细胞在37°C的搅拌中生长过夜。
- 提取质粒与DNA小准备 （材料表） 和序列来验证结构.
- 在LB-Agar板上用阿霉素进行序列验证的构造和板细胞，将DH5α大肠杆菌菌株转化。让我们在37°C生长过夜。
- 选择单个菌落，用阿霉素将细胞尖刺到5 mL的LB中。让细胞在37°C搅拌中生长2小时。
- 将步骤 3.7 中的细胞放入 200 mL 的 LB 中，使用阿霉素。让我们在37°C生长过夜。
- 在4°C下以3，500 x g粒细胞10分钟。
- 提取具有DNA最大值的质粒（材料表）。
4. 细胞转染
- 种子 400，000 细胞从步骤 1.1 在 6 孔板或 20，000 细胞在 8 孔腔室幻灯片。板四个样本：用空载体转染的对照细胞，用未标记的Tau转染的细胞，用Tau-NLS转染的细胞，用Tau-NES转染的细胞。
- 根据制造商的说明，在播种转染后的第二天，每口井的DNA400 ng，使用6孔板中的阳离子脂质（材料表），或8孔室滑动每孔200纳克的DNA。
- 在250μL（对于6孔板）或25μL（对于8孔腔室滑动）中分别在RT孵育DNA和阳离子脂质5分钟。然后将它们组合起来，产生DNA-脂质复合物，孵育20分钟。
- 将培养基用 2 mL（6 孔板）或 250 μL（对于 8 孔腔室幻灯片）更换新鲜完整的培养介质。将DNA-脂质复合物添加到细胞中，并在37°C孵育过夜。
- 或者，用阳离子试剂聚乙烯胺（PEI）转染DNA。
- 将 2 μg 的 DNA 和 6 μL 的 PEI 与 200 μL 的完整培养基（对于 6 孔板中的每口孔），或 1 μg DNA 和 3 μL PEI 与 100 μL 的完整培养基（对于 8 孔腔室幻灯片中的每口孔），涡旋，在RT孵育10分钟。
- 将混合物添加到电池中，在 6 孔板中每孔添加 1.8 mL 的完整培养介质，或在 8 孔腔室幻灯片中每孔 150 μL 的完整培养介质，以达到电镀体积。
- 转染后的第二天更改介质，并添加步骤 2.2 中描述的微分介质。
5. 免疫荧光
- 取出培养基，用1x PBS冲洗细胞。用100%冰冷的甲醇固定细胞3分钟，不摇晃。取出固定溶液，用 1x PBS 短暂清洗。
- 在室温 （RT） 下，在 1x PBS 中用 0.1% 非离子表面活性剂渗透 5 分钟。简单，用1xPBS洗涤，3次。
- 在轨道摇床的RT处孵育含有阻塞缓冲液（PBS中0.1%补间20和1%BSA）的细胞30分钟。
- 用适当的原抗体（例如小鼠单克隆抗Tau13抗体）孵育，在轨道摇床上4°C的缓冲液中稀释1：500。取出抗体溶液，用1x PBS短暂清洗。
- 与荧光结合的二级抗体（例如，山羊抗小鼠抗体与Alexa Fluor 633结合）在RT的阻断缓冲液中稀释1：500 1：500。去除抗体溶液，用1x PBS短暂洗涤3次。
- 为了染色核，用DAPI稀释1：20，000在阻断缓冲液中孵育10分钟，在RT.Wash用1xPBS3次洗涤。使用防褪色安装介质在幻灯片上安装盖玻片。
6. 西布洛特
- 要从步骤 4.4 收集细胞颗粒，请取出培养基，用 PBS 清洗细胞。在37°C下孵育500μL0.1%胰蛋白酶4分钟。添加相等体积的完整介质并重新挂起单元格。
- 在500 x g下收集细胞，在500 x g下收集细胞5分钟。离心结束时小心地去除上清液。加入1 mL的PBS，在500 x g下离心5分钟，并小心地去除上清液。将细胞颗粒储存在冰上，以便立即使用或冷冻在-80°C，以便长期储存。
- 对于总蛋白质提取物，在酶缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8，20 mM NaCl，10%甘油，1%八苯氧基多（乙氧）乙醇、分枝（材料表）、10mM EDTA）补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冰上孵育细胞颗粒30分钟。根据颗粒的丰度，使用50μL至100μL的液兰缓冲液。
- 在16，000 x g下将提取物离心15分钟。收集上清液，并通过任何标准定量测定对蛋白质浓度进行量化。将 20 μg 的蛋白质与 5 μL 的 4x Laemli 缓冲液混合在 20 μL 的总体积中，在 100°C 下煮 5 分钟，为 SDS-PAGE 制备蛋白质样品。
注：样品可储存在-20°C。
- 在16，000 x g下将提取物离心15分钟。收集上清液，并通过任何标准定量测定对蛋白质浓度进行量化。将 20 μg 的蛋白质与 5 μL 的 4x Laemli 缓冲液混合在 20 μL 的总体积中，在 100°C 下煮 5 分钟，为 SDS-PAGE 制备蛋白质样品。
- 对于亚细胞分馏，在完整培养基中重新悬浮步骤 6.2 中的细胞，并收集每个样本 1 x 106个细胞。在 500 x g下离心 10 分钟，以获得用于以下步骤的细胞颗粒。
- 要分离亚细胞腔，可根据试剂盒规格进行分馏。为了分离每个分数，用相应的缓冲液6.4孵育细胞颗粒，离心机，收集上清液，并将下一个缓冲液添加到颗粒中，如6.4.1.1-6.4.1.5所述。按顺序添加细胞质提取缓冲液、膜提取缓冲液、核提取缓冲液、核提取缓冲液，辅以5 mM CaCl2和3 U/μL微球菌核酸酶和细胞骨骼提取缓冲液。
注：所有缓冲液必须补充蛋白酶抑制剂。根据细胞颗粒的体积缩放缓冲液体积。- 为了分离细胞分量，在100μL的冰冷的细胞质提取缓冲液中孵育细胞颗粒，在4°C下辅以蛋白酶抑制剂，温和混合10分钟，在4°C下500 x g下离心5分钟，并将上清液转移到预冷冻管中。
- 从步骤6.4.1.1向颗粒中加入100μL的冰冷膜提取缓冲液，并加入4°C，温和混合10分钟。在4°C下3000 x g下离心5分钟，收集上清液。
- 对于可溶性核馏分，从步骤6.4.1.2和涡旋中加入50μL的核萃取缓冲液，并辅以蛋白酶抑制剂。在4°C孵育30分钟，在4°C下5，000 x g离心5分钟，并收集上清液。
- 对于不溶性核馏分，从步骤6.4.1.3和涡旋中加入50μL的核提取缓冲液，辅以蛋白酶抑制剂、CaCl2和微粒核酸酶。在37°C孵育5分钟，然后再次涡旋。在 RT 下 16，000 x g下离心 5 分钟，并收集上清液。
- 对于细胞骨骼部分，从步骤6.4.1.4和涡旋中加入50μL的细胞骨骼提取缓冲液，并辅以蛋白酶抑制剂。在RT.将管在16，000 x g下孵化10分钟，5分钟，收集上清液并丢弃颗粒。
注：如套件协议所示，根据单元体积缩放缓冲体积。有关孵化和离心时间和温度22、23、24、25、26、27、28、29的进一步详情，请参阅试剂盒协议。或者，使用任何标准方法30，通过使用洗涤剂，通过增加离子强度和离心速度，分离细胞，膜结合，细胞骨骼和核分数。利用标准核提取缓冲液，分离可溶性核馏分和不溶性核部分。样品可储存在-20°C。
- 对于SDS-PAGE，将7μL的4xLaemmli缓冲液加入从步骤6.4.1.1~6.4.1.5获得的亚细胞分量的20μL，在100°C下煮5分钟。
- 要分离亚细胞腔，可根据试剂盒规格进行分馏。为了分离每个分数，用相应的缓冲液6.4孵育细胞颗粒，离心机，收集上清液，并将下一个缓冲液添加到颗粒中，如6.4.1.1-6.4.1.5所述。按顺序添加细胞质提取缓冲液、膜提取缓冲液、核提取缓冲液、核提取缓冲液，辅以5 mM CaCl2和3 U/μL微球菌核酸酶和细胞骨骼提取缓冲液。
- 在丙烯酰胺凝胶上加载样品，并在120 V的恒定电压下进行电泳。
- 通过在Ponceau染色溶液中孵育膜5分钟，检查适当的蛋白质凝胶电泳和成功的印迹。在蒸馏水中冲洗膜，直到背景清洁。在摇摇器上用 Tween 20 （TBST） 继续清洗 Tris 缓冲盐水，去除污渍 10 分钟。
- 在摇床上的RT处用阻滞溶液（TBST中5%牛奶）孵育膜1小时。用TBST洗涤3次5分钟。
- 在4°C下，在阻断溶液（TBST中1%牛奶）中与原抗体混合膜过夜。用TBST洗涤3次5分钟。
- 在RT.Wash使用TBST洗涤3次，将膜与HRP结合的二级抗体混合在阻断溶液中1小时，5分钟。
- 使用化学发光检测蛋白质带。通过 ImageJ 量化西布洛特波段的强度。将蛋白质表达标准化到内务基因的产物上：用于核溶性和不溶性分数的组蛋白H2B，用于细胞质分数和总提取物的GAPDH。
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Representative Results
图1描述了用于剖析核陶在基因表达中避免细胞质Tau蛋白贡献的策略。简单地说，标有NLS或NES标记的Tau蛋白分别在核隔间中积累或排除。这种不平衡的功能效应是作为VGluT1基因产物测量的基因表达的改变。
按照协议描述，SH-SY5Y细胞用RA处理5天，然后用BDNF治疗3天，以获得后线神经样细胞（图2）。在没有RA和BDNF的情况下，未分化的SH-SY5Y细胞假定为圆形形态并形成细胞团块。正如所料，开始分化协议，团块展开，细胞扩散神经酸盐;在分化结束时，细胞通过分支神经酸盐网络均匀分布和互连。
播种后的第二天，细胞被转染为陶-NLS或Tau-NES质粒（第4.2节），具有阳离子脂质。对于表达Tau-NLS或Tau-NES结构的细胞，可以通过免疫荧光与抗Tau抗体检测出Tau亚细胞定位。根据转染的效率，细胞会显示与DAPI信号合并的强核染色，或者如果细胞质染色与空核分别成功转染Tau-NLS或Tau-NES（图3）。缺少这些特定信号表明转染效率低。
为了分析不同亚细胞室中富集的蛋白质，收集并计数细胞，以便处理每个样本的等量细胞。任何利用增加洗涤剂和离子强度以及提高离心速度的标准分馏方法都可用于将细胞腔体彼此分离，从而分离细胞体、膜结合、细胞骨骼和核分数。
一旦核被分离，通过加入3U/μL微球核酸酶和5 mM CaCl2分离核溶性分数和染色质结合分数。
对于西方斑点分析，在梯度预制丙烯酰胺凝胶上加载了相等体积的细胞质和膜分数和其他馏分的一半体积，以纠正每一步添加的不同缓冲液量。
为了验证不同分数的有效分离，利用以下抗体的西方印块进行了：抗GADPH（除细胞骨架外的所有馏分中存在，在细胞质部分中特别丰富）;抗actin（特别丰富在细胞骨骼部分）;抗图布林（特别丰富于细胞质和细胞骨骼部分）;抗H2B（在核馏分中丰富） （图4）。
这些标记在不同亚细胞分数中的富集表明分馏没有很好地执行。必须注意的是，任何亚细胞分馏协议都可能在分数之间呈现10-15%的污染。
一旦验证了样品的成功分馏，西印体被执行，以检查核舱中的Tau信号和总提取物中的VGluT1信号（图5）。虽然未标记的Tau在所有馏分中都是可检测到的，但Tau-NLS在核腔中具有很强的浓缩性，在细胞质分数中检测不良。相反，Tau-NES在细胞质馏中富集，在核馏中检测得较少。少量Tau-NES进入可溶性核部分是可以预料到的，因为像内源性Tau一样，它被转移到核中，一旦进入核舱，核出口信号就可以将其转移到细胞质。检测这两种融合蛋白的不同富集可能表明转染效率或结构克隆或分馏存在问题。
使用ImageJ可以对西方污点进行定量分析。值对每个分数的内务基因进行标准化（细胞质分数的GAPDH;可溶性核和染色质结合分数的组蛋白H2B）。
图5B中的图显示了Tau在可溶性核馏分和细胞质分数中的比例，以突出陶-NLS在可溶性核分数（SNF）中高度富集，而Tau-NES则减小。此外，Tau-NLS在染色质结合分数（CBF）中与细胞质分数（CF）有关而减少。SNF/CF = 1，CBF/CF = 1 对应于控制单元中的 Tau 比。内源性 Tau 在预期的所有分数中均弱可检测。图5C中的图报告了VGluT1表达在表达不同核Tau量的样本总提取物中的定量。在表达 Tau-NES 的单元格中，VGluT1 表达式与控制单元格中的基线表达式相当。相反，在表示未标记的 Tau 或 Tau-NLS 的单元格中，VGluT1 的表达增加了一倍以上。
图1：用于允许Tau核质或细胞质积累的策略的图形表示。Tau-NLS 在核隔间中累积，而 Tau-NES 则排除在外。实验读出是VGluT1表达式的调制。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：代表性无分化和分化细胞培养。未分化 SH-SY5Y 的图像（左），按 RA（中间）区分的细胞，RA 和 BDNF（右）区分的单元格。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：通过免疫荧光增强Tau亚细胞富集的代表性图像。未转染或表示未标记的 Tau、Tau-NES 或 Tau-NLS 构造的单元格的图像。Tau信号是通过免疫荧光（红色）获得的，核信号是通过DAPI染色（蓝色）获得的，合并的图像被报告。比例尺 = 10 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：西方斑点对亚细胞成分中富集的蛋白质的代表性检测。来自SH-SY5Y细胞的亚细胞分数的西方斑点。CF = 细胞质分数;MF = 膜分数;SNF = 可溶性核分数;CBF = 染色质结合分数;CKF = 细胞骨骼分数。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：核Tau和VGluT1蛋白的代表性检测。（A） 在核和细胞质部分中检测到的Tau蛋白的西方斑点。（B） 图表报告 Tau 在核分数和细胞质分数中的比例。值已在内源 Tau 上规范化。SNF/CF = 1，CBF/CF = 1 对应于控制细胞中的内源 Tau 比。（C） VGluT1蛋白的西体斑点.（D） 该图报告VGluT1表达在表达不同核Tau量的样本总提取物中的定量。克鲁斯卡尔-瓦利斯ANOVA和曼-惠特尼测试;p < 0.001， = p < 0.0001， n.s. p > 0.05.所有结果均显示为平均值 = SEM，至少三个独立实验。这个代表人物已由Siano等人31修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
我们描述了一种测量核Tau蛋白对基因表达影响的方法。有了这个协议，细胞质陶的贡献是强烈的限制。该协议的关键步骤如下：人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的分化、亚细胞分馏和Tau蛋白在核腔中的定位。
首先，如代表性结果部分所示，通过添加RA和BDNF来分化SH-SY5Y细胞对于在培养中获得神经元样细胞的良好制备至关重要。播种的细胞密度特别重要，因为较低的密度可能会影响细胞增殖。此外，对于需要大量细胞的实验（如细胞分馏和西体斑点），必须注意BDNF分化步骤阻止细胞增殖，从而允许终端分化，从而限制培养细胞的数量。替代差别化协议只使用RA或NGF，而不是BDNF。然而，虽然在RA后添加BDNF允许达到更好的形态分化32，33，NGF诱导在SH-SY5Y细胞34中较弱的神经质外生长。此外，已经证明，RA和BDNF的组合允许获得一个同质神经元群体与神经元标记的表达和减少增殖35。因此，此处利用的差异化协议结合了 RA 和 BDNF。
然而，报告解剖Tau在不同亚细胞室中的作用的过程也可用于未分化的细胞或不同的细胞类型。
亚细胞分馏是一个非常关键的步骤，它是至关重要的有足够的起始材料：一个商业套件只需要1 x 106细胞，而其他程序可能需要高得多的起始量。此外，使用带有标准缓冲器和步骤的套件可确保实验的可重复性，这是不可避免和必要的。然而，由于缓冲液的组成通常是专有的，它们可能含有可能改变感兴趣的蛋白质功能的洗涤剂，并且可能难以优化馏分的分离。此外，即使在最佳条件下，分数之间的污染也可能达到 10-15%。通过增加特定馏分的提取缓冲液中的孵育时间，可以克服每个馏分的不良产量。
由于核陶的功能近年来引起了极大的兴趣，因此提供一种可靠的方法来剖析陶在不同细胞室的功能尤为重要。将亚细胞分馏与Tau构造的表达结合，具体定向或排除在细胞核之外，可以微调不同隔间中的Tau量。
议定书这一部分的一个关键步骤是克隆带有核定位信号或核出口信号的Tau。NLS 的效率由来自 SV40 病毒的 3XNLS 共识序列得到保证。蛋白质的核易位可以通过免疫荧光来轻松检查，而核信号的缺乏可能是由于不正确的克隆或低效的转染造成的。相反，核出口是由NES共识序列保证的。在这种情况下，免疫荧光允许检查从核输出Tau。然而，由于Tau-NES蛋白进入细胞核，然后由于NES序列，它导出到细胞醇中，因此不排除弱核信号。
到目前为止，核陶的功能只通过不保证其直接参与的相关方法进行研究。此处所述的协议提供了第一种方法，允许将 Tau 的具体功能明确区分到核舱中。如前所述，内源性Tau不影响该协议获得的结果。事实上，在非神经元细胞中进行的同样实验，不表达内源性Tau，导致VGluT1改变的表达。我们应用这个协议来研究疾病相关基因的表达31。无论如何，它也可以被利用来研究其他核Tau功能，如DNA损伤的介入，与核辅助因子或染色质的相互作用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了斯库拉师范高级院（SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIO;SNS14_B_DIPRIMIOSNS16_B_DIPRIMIO）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
References
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