Summary
El tau es una proteína neuronal presente tanto en el citoplasma, donde se une a los microtúbulos, como en el núcleo, donde ejerce funciones no convencionales, incluida la modulación de genes relacionados con la enfermedad de Alzheimer. Aquí, describimos un método para investigar la función de Tau nuclear excluyendo cualquier interferencia proveniente de Tau citoplasma.
Abstract
Tau es una proteína de unión a microtúbulos expresada en las neuronas y su principal función conocida está relacionada con el mantenimiento de la estabilidad citoesquelética. Sin embargo, la evidencia reciente indicó que Tau está presente también en otros compartimentos subcelulares, incluyendo el núcleo donde está implicado en la protección del ADN, en la transcripción del ARNR, en la movilidad de los retrotransposones y en la organización estructural de la Nucleolo. Recientemente hemos demostrado que El Tau nuclear está involucrado en la expresión del gen VGluT1, sugiriendo un mecanismo molecular que podría explicar el aumento patológico de la liberación de glutamato en las primeras etapas de la enfermedad de Alzheimer. Hasta hace poco, la participación de Tau nuclear en la modulación de la expresión de genes diana ha sido relativamente incierta y ambigua debido a limitaciones técnicas que impidieron la exclusión de la contribución de Tau citoplasmático o el efecto de otros factores aguas abajo no relacionados con el Tau nuclear. Para superar esta incertidumbre, desarrollamos un método para estudiar la expresión de genes diana modulados específicamente por la proteína nuclear Tau. Empleamos un protocolo que combina el uso de señales de localización y el fraccionamiento subcelular, permitiendo la exclusión de la interferencia de las moléculas citoplasmáticas Tau. Más notablemente, el protocolo es fácil y se compone de métodos clásicos y confiables que son ampliamente aplicables para estudiar la función nuclear de Tau en otros tipos de células y condiciones celulares.
Introduction
Las funciones de la proteína Tau en el núcleo han despertado un interés significativo en los últimos años, ya que se ha demostrado que está estrechamente asociada con los ácidos nucleicos1,2,3,4,5,6. De hecho, un estudio reciente en todo el genoma demostró que Tau une secuencias de ADN génicas e intergénicas in vivo7. Se ha sugerido un papel en la organización nucleolar8,9,10,11. Además, se ha propuesto a Tau participar en la protección del ADN contra el estrés oxidativo e hipertérmico5,10,12,13, mientras que Tau mutado se ha relacionado con la inestabilidad cromosómica y la aneuploidía14,15,16.
Hasta ahora, los desafíos en el estudio de las funciones de Tau en el compartimento nuclear seguían casi sin resolver debido a las dificultades para disección de la contribución específica de Tau nuclear de la contribución de Tau citoplasmático. Además, las funciones atribuidas a las moléculas Tau en el compartimento nuclear, hasta ahora, son sólo correlativas porque carecen de una demostración inequívoca de la implicación directa de las proteínas nucleares Tau. De hecho, la participación de Tau en la movilidad de los retrotransposonos o en la transcripción del ARNr o en la protección del ADN11,12,17,18,19 podría explicarse también por la contribución de Tau citoflásico o por el efecto de otros factores aguas abajo no relacionados con el Tau nuclear.
Aquí, proporcionamos un método que puede resolver este problema mediante la explotación de un procedimiento clásico para aislar el compartimento nuclear combinado con el uso de las construcciones Tau 0N4R etiquetadas con localización nuclear (NLS) o señales de exportación nuclear (NES). Este enfoque elimina los problemas complejos relacionados con posibles artefactos debido a la derrame de moléculas Tau del compartimiento citoplasmático. Además, las construcciones Tau-NLS y Tau-NES inducen el enriquecimiento o la exclusión de moléculas Tau del compartimiento nuclear, respectivamente, proporcionando controles positivos y negativos para la implicación de moléculas nucleares Tau en una función específica. El protocolo es técnicamente fácil y está compuesto por métodos clásicos y fiables que son ampliamente aplicables para estudiar la función nuclear de Tau en otros tipos de células, diferenciadas o no, como las células cancerosas que reactivan la expresión Tau20,21. Además, podría aplicarse también a otras proteínas que están presentes tanto en el citoplasma como en el núcleo con el fin de diseccionar funciones biológicas relacionadas con diferentes compartimentos.
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Protocol
1. Cultivo celular
- Cultivo de células SH-SY5Y (línea celular de neuroblastoma humano, CRL-2266) en medio completo (medio Eagle modificado de Dulbecco:mezcla de nutrientes F12 [DMEM/F-12] complementada con 10% de suero bovino fetal [FBS], 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomícica). Mantener las células en una incubadora a 37oC y 5%co2. Cultivar células en placas de 10 cm y dividir cuando confluente.
2. Diferenciación celular
- Para diferenciar las células SH-SY5Y, el día después del revestimiento, agregue ácido retinoico (RA) de 10 m para completar el medio durante 5 días.
- El sexto día sustituye el medio por medio de diferenciación: DMEM/F-12 complementado con 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamina. No agregue FBS ni antibióticos.
- Cultivar las células en medio de diferenciación durante 3 días.
3. Clonación de construcciones quiméricas
- Generar la construcción Tau-NLS clonando mediante la digestión enzimática de restricción en el marco en el extremo 3' de la secuencia Tau 0N4R (383aa) el 3xNLS(SV40NLS):5'-CCAAAAAAGAAGAGAGAGAAAAGGAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAGA-3'.
NOTA: El 3xNLS en el extremo 3' de Tau se clona en el plásmido pCMV-Tau para la expresión de mamíferos explotando los sitios de restricción XhoI y BamHI en el sitio de multicloning (MCS). - Generar la construcción Tau-NES mediante la clonación mediante la digestión enzimática de restricción en el marco en el extremo 3' de la secuencia Tau 0N4R (383aa) la secuencia NES: 5'-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGCTGGACTCGTACA-3'.
NOTA: La NES en el extremo 3' de Tau es clonada en el plásmido pCMV-Tau para la expresión de mamíferos explotando los sitios de restricción EcoRI y BamHI en el MCS. - Transforme la cepa DH5alpha E.coli con 100 ng de ADN de los pasos 3.1 o 3.2 y las células de placa en placas LB-Agar con 100 mg/ml de ampicilina. Dejar crecer durante la noche a 37oC.
- Escoge una sola colonia y pincha las células en 5 ml de LB con ampicilina. Dejar que las células crezcan a 37 oC en agitación durante la noche.
- Extraiga el plásmido con un miniprep de ADN(Tabla de Materiales)y secuencia para verificar las construcciones.
- Transforme la cepa DH5alpha E. coli con las construcciones de secuencia verificadas y las células de placa en placas de agar LB con ampicilina. Dejar crecer durante la noche a 37oC.
- Escoge una sola colonia y pincha las células en 5 ml de LB con ampicilina. Dejar que las células crezcan a 37oC en agitación durante 2 h.
- Ponga las células del paso 3.7 en 200 ml de LB con ampicilina. Dejar crecer durante la noche a 37oC.
- Peletizar las células a 3.500 x g durante 10 min a 4oC.
- Extraer plásmido con un maxiprep de ADN(Tabla de Materiales).
4. Transfección celular
- Semilla 400.000 células del paso 1.1 en placas de 6 pocillos o 20.000 celdas en diapositivas de cámara de 8 pocillos. Placa cuatro muestras: células de control que se deben transvenir con un vector vacío, células que se deben transfigurar con Tau sin etiquetar, células que se transcusarán con Tau-NLS y células que se deben transusar con Tau-NES.
- El día después de la sembración transfect 400 ng de ADN para cada pozo utilizando los lípidos catiónicos(Tabla de Materiales)en placas de 6 pocillos o 200 ng de ADN para cada pozo para diapositivas de cámara de 8 pocillos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Incubar el ADN y los lípidos catiónicos por separado en 250 l (para placas de 6 pocillos) o 25 l (para diapositivas de cámara de 8 pocillos) de medio sérico reducido durante 5 minutos a RT. Luego combínalos para generar el complejo DE LÍpidos de ADN e incubar durante 20 min.
- Sustituya el medio de cultivo por 2 ml (para placas de 6 pocillos) o 250 l (para diapositivas de cámara de 8 pocillos) de medio de cultivo completo fresco. Añadir el complejo de lípidos de ADN a las células e incubar a 37 oC durante la noche.
- Alternativamente, ADN transfecto con el reactivo catiónico polietilenimina (PEI).
- Mezclar 2 g de ADN y 6 l de PEI con 200 ml de medio de cultivo completo (para cada pocal en placas de 6 pocillos), o 1 g de ADN y 3 s de PEI con 100 ml de medio de cultivo completo (para cada pocto en diapositivas de cámara de 8 pocillos) , vórtice e incubar durante 10 min a RT.
- Agregue la mezcla a las células y agregue 1,8 ml de medio de cultivo completo por pozo en placas de 6 pocillos o 150 ml de medio de cultivo completo por pozo en diapositivas de cámara de 8 pocillos para alcanzar el volumen de chapado.
- Cambie el medio al día siguiente de la transfección y añada los medios de diferenciación como se describe en el paso 2.2.
5. Inmunofluorescencia
- Retire el medio de cultivo y enjuague las células con 1 x PBS. Fijar las células con 100% metanol helado durante 3 minutos sin agitar. Retire la solución de fijación y lávela brevemente con 1 PBS.
- Permeabilizar con tensioactivo no iónico al 0,1% en 1x PBS durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Brevemente, lavar con 1pbS, 3 veces.
- Incubar células con tampón de bloqueo (0,1% Tween 20 y 1% BSA en PBS) durante 30 minutos a RT en un agitador orbital.
- Incubar con anticuerpos primarios apropiados (p. ej., anticuerpo anti-Tau13 monoclonal de ratón) diluido 1:500 en tampón de bloqueo durante la noche a 4 oC en un agitador orbital. Retire la solución de anticuerpos y lávela brevemente con 1 x PBS.
- Incubar con anticuerpos secundarios conjugados con el fluoróforo (por ejemplo, anticuerpos antiratón de cabra conjugados a Alexa Fluor 633) diluido 1:500 en tampón de bloqueo durante 1 h en RT. Retire la solución de anticuerpos y lávese brevemente con 1x PBS 3 veces.
- Para manchar los núcleos, incubar con DAPI diluido 1:20,000 en tampón de bloqueo durante 10 minutos en RT. Lavar con 1x PBS 3 veces. Monte los cubreobjetos en una corredera utilizando un medio de montaje antidescolor.
6. Western Blot
- Para recoger el pellet celular del paso 4.4, retire el medio y lave las células con PBS. Incubar con 500 oC de trippsina al 0,1% durante 4 min a 37oC. Agregue un volumen igual de medio completo y vuelva a suspender celdas.
- Recoger las células en un tubo y centrifugar a 500 x g durante 5 min. Al final de la centrifugación retire cuidadosamente el sobrenadante. Añadir 1 ml de PBS, centrifugar a 500 x g durante 5 min y retirar cuidadosamente el sobrenadante. Almacene los gránulos celulares en hielo para su uso inmediato o congele a -80 oC para un almacenamiento a largo plazo.
- Para extractos de proteína total, incubar el pellet celular durante 30 minutos en hielo en tampón de lisis (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glicerol, 1% octilphenoxi poli(etilenoxi)etanol, ramificado(Tabla de Materiales),10 mM EDTA) complementado con proteasa e inhibidores de la fosfatasa. De acuerdo con la abundancia del pellet, utilice de 50 a 100 l de tampón de lisis.
- Centrifugar el extracto a 16.000 x g durante 15 min. Recoger el sobrenadante y cuantificar la concentración de proteínas mediante cualquier ensayo de cuantificación estándar. Preparar las muestras de proteínas para el SDS-PAGE mezclando 20 g de proteínas con 5 s de tampón de Laemmli de 4x en un volumen total de 20 ml y hervir a 100 oC durante 5 min.
NOTA: La muestra se puede almacenar a -20 oC.
- Centrifugar el extracto a 16.000 x g durante 15 min. Recoger el sobrenadante y cuantificar la concentración de proteínas mediante cualquier ensayo de cuantificación estándar. Preparar las muestras de proteínas para el SDS-PAGE mezclando 20 g de proteínas con 5 s de tampón de Laemmli de 4x en un volumen total de 20 ml y hervir a 100 oC durante 5 min.
- Para fraccionamientos subcelulares, resuspenda las células del paso 6.2 en medio completo y recoja 1 x 106 celdas por cada muestra. Centrífuga a 500 x g durante 10 min para obtener pellets celulares para los siguientes pasos.
- Para aislar los compartimentos subcelulares, fraccione de acuerdo con las especificaciones del kit. Para aislar cada fracción, incubar el pellet celular del paso 6.4 con el tampón correspondiente, centrífuga, recoger el sobrenadante y añadir el siguiente buffer al pellet como se describe en 6.4.1.1-6.4.1.5. Añadir en orden tampón de extracción citoplasmática, tampón de extracción de membrana, tampón de extracción nuclear, tampón de extracción nuclear complementado con 5 mM CaCl2 y 3 U/L de nucleasa microcócica y tampón de extracción citoesquelética.
NOTA: Todos los tampones deben complementarse con inhibidores de la proteasa. Escalar volúmenes de búfer según el volumen del pellet de celda.- Para aislar la fracción citosólica, incubar gránulos celulares en 100 ml de tampón de extracción citoplasmática helada suplementada con inhibidores de la proteasa a 4 oC con una mezcla suave durante 10 minutos. Centrifugar a 500 x g a 4 oC durante 5 min y transferir el sobrenadante a tubos preenfriados.
- Añadir 100 l de tampón de extracción de membrana helada suplementada con inhibidores de la proteasa al pellet del paso 6.4.1.1, e incubar a 4oC con una mezcla suave durante 10 min. Centrifuge a 3.000 x g a 4 oC durante 5 min y recoger el sobrenadante.
- Para la fracción nuclear soluble, agregue 50 ml de tampón de extracción nuclear complementado con inhibidores de la proteasa al pellet del paso 6.4.1.2 y al vórtice. Incubar a 4oC durante 30 min, centrifugar a 5.000 x g a 4oC durante 5 min, y recoger el sobrenadante.
- Para la fracción nuclear insoluble, agregue 50 l de tampón de extracción nuclear complementado con inhibidores de la proteasa, CaCl2 y nucleasa microcócica al pellet del paso 6.4.1.3 y vórtice. Incubar a 37oC durante 5 min y volver a vórtice. Centrifugar a 16.000 x g a RT durante 5 min y recoger el sobrenadante.
- Para la fracción citoesquelética, añadir 50 l de tampón de extracción citoesquelética complementado con inhibidores de la proteasa al pellet del paso 6.4.1.4, y vórtice. Incubar 10 min en RT. Centrifuge el tubo a 16.000 x g durante 5 min, recoger el sobrenadante y desechar el pellet.
NOTA: Escale los volúmenes de búfer según el volumen de celda, como se indica en el protocolo del kit. Consulte el protocolo kit para obtener más detalles sobre el tiempo de incubación y centrifugación y la temperatura22,23,24,25,26,27,28,29. Alternativamente, utilice cualquier método estándar30 que, mediante el uso de detergentes y mediante el aumento de la fuerza iónica y la velocidad de centrifugación, separa las fracciones citosólicas, las membranas unidas a membrana, las citoesqueléticas y las fracciones nucleares. Separe la fracción nuclear soluble y la fracción nuclear insoluble explotando los tampones de extracción nuclear estándar. La muestra se puede almacenar a -20 oC.
- Para el SDS-PAGE, añadir 7 l de tampón De 4x Laemmli a 20 s de fracciones subcelulares obtenidas de los pasos 6.4.1.1-6.4.1.5, hervir a 100 oC durante 5 min.
- Para aislar los compartimentos subcelulares, fraccione de acuerdo con las especificaciones del kit. Para aislar cada fracción, incubar el pellet celular del paso 6.4 con el tampón correspondiente, centrífuga, recoger el sobrenadante y añadir el siguiente buffer al pellet como se describe en 6.4.1.1-6.4.1.5. Añadir en orden tampón de extracción citoplasmática, tampón de extracción de membrana, tampón de extracción nuclear, tampón de extracción nuclear complementado con 5 mM CaCl2 y 3 U/L de nucleasa microcócica y tampón de extracción citoesquelética.
- Cargue muestras en un gel de acrilamida y realice electroforesis a una tensión constante de 120 V. Transfiera proteínas a la membrana de nitrocelulosa a 250 mA durante 90 min.
- Compruebe la electroforesis adecuada del gel proteico y la hinchazón exitosa incubando la membrana durante 5 minutos en la solución de tinción de Ponceau. Enjuague la membrana en agua destilada hasta que el fondo esté limpio. Retire la mancha si continúa lavándolo con la solución salina tamponada Tris con Tween 20 (TBST) durante 10 minutos en una coctelera.
- Incubar la membrana con solución de bloqueo (5% de leche en TBST) durante 1 h a RT en la coctelera. Lávese 3 veces con TBST durante 5 min.
- Hibridar la membrana con el anticuerpo primario en la solución de bloqueo (1% de leche en TBST) durante la noche a 4 oC. Lávese 3 veces con TBST durante 5 min.
- Hibridar la membrana con el anticuerpo secundario conjugado hrP en solución de bloqueo durante 1 h en RT. Lavar 3 veces con TBST durante 5 min.
- Detectar la banda de proteínas utilizando quimioluminiscencia. Cuantificar la intensidad de las bandas Western Blot por ImageJ. Normalizar la expresión proteica en el producto de un gen de limpieza: histona H2B para la fracción soluble nuclear e insoluble, GAPDH para la fracción citoplasmática y para extractos totales.
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Representative Results
La estrategia utilizada para diseccionar el impacto del Tau nuclear en la expresión génica evitando la contribución de las proteínas tau citoflásmicas se ha representado en la Figura 1. Brevemente, las proteínas Tau etiquetadas con NLS o NES se acumulan o excluyen del compartimento nuclear, respectivamente. El efecto funcional de este desequilibrio es la alteración de la expresión génica medida como el producto del gen VGluT1.
Siguiendo la descripción del protocolo, las células SH-SY5Y fueron tratadas con RA durante 5 días y luego con BDNF durante 3 días con el fin de obtener células posteriores a las neuronas mitoéticas(Figura 2). En ausencia de RA y BDNF, las células SH-SY5Y indiferenciadas asumen una morfología más híbrida y forman grumos celulares. Como era de esperar, a partir del protocolo de diferenciación, los grupos se desenredan y las células se extienden por los neurites; al final de la diferenciación, las células se distribuyen e interconectan uniformemente a través de una red de neurótesis ramificadas.
Al día siguiente de la sembración, las células han sido transcinfectadas con plásmidos Tau-NLS o Tau-NES (sección 4.2) con lípidos catiónicos. Para las células que expresan construcciones Tau-NLS o Tau-NES, la localización subcelular Tau puede detectarse mediante inmunofluorescencia con anticuerpos anti-Tau. Dependiendo de la eficiencia de la transfección, las células muestran una fuerte tinción nuclear fusionándose con la señal DAPI o una tinción citoplasma con núcleos vacíos si se están transpirando con éxito con Tau-NLS o Tau-NES, respectivamente(Figura 3). La falta de estas señales específicas indica una transfección ineficiente.
Para analizar las proteínas enriquecidas en diferentes compartimentos subcelulares, se recogieron y contaron células para procesar cantidades iguales de células por muestra. Cualquier método de fraccionamiento estándar que explote el aumento de la fuerza detergente e iónica y el aumento de la velocidad de centrifugación se puede utilizar para separar los compartimentos celulares entre sí y así aislar el citosólico, el unido a la membrana, el citoesquelético y las fracciones nucleares.
Una vez aislados los núcleos, la fracción soluble nuclear y la fracción unida a cromatina se separaron añadiendo 3 U/L de nucleasa microcócica y 5 mM de CaCl2.
Para el análisis de manchas occidentales, se han cargado volúmenes iguales de fracciones citoplasmáticas y de membrana y medias volúmenes de las otras fracciones en un gel de acrilamida prefabricado degradado, para corregir la diferente cantidad de tampón añadido en cada paso.
Para verificar la separación eficiente de diferentes fracciones, se ha realizado la mancha occidental explotando los siguientes anticuerpos: anti-GADPH (presente en todas las fracciones excepto el citoesqueleto y particularmente enriquecido en la fracción citoplasmasica); anti-actina (particularmente enriquecido en la fracción citoesquelética); anti-tubulina (particularmente enriquecido en fracciones citoplasmáticas y citoesqueléticas); anti-H2B (enriquecido en las fracciones nucleares) (Figura 4).
Un enriquecimiento de estos marcadores en diferentes fracciones subcelulares indica que el fraccionamiento no se realiza bien. Debe tenerse en cuenta que cualquier protocolo de fraccionamiento subcelular podría presentar un 10-15% de contaminación entre fracciones.
Una vez verificado el fraccionamiento exitoso de la muestra, se ha realizado la mancha occidental para comprobar la señal de Tau en el compartimento nuclear y la señal VGluT1 en el extracto total(Figura 5). Mientras que El Tau sin etiquetar es detectable en todas las fracciones, Tau-NLS está fuertemente enriquecido en el compartimiento nuclear y es poco detectable en la fracción citoplasmática. Por el contrario, Tau-NES se enriquece en la fracción citoplasmática y es menos detectable en la fracción nuclear. La presencia de una pequeña cantidad de Tau-NES en la fracción nuclear soluble tiene que esperarse ya que, al igual que el Tau endógeno, se transloca en el núcleo y una vez en el compartimento nuclear la señal de exportación nuclear permite su translocación al citoplasma. La detección de un enriquecimiento diferente para estas dos proteínas de fusión podría indicar un problema en la eficiencia de la transfección o en la clonación de construcciones o en fraccionamiento.
El análisis cuantitativo de Western blot se puede hacer usando ImageJ. Los valores se normalizan para el gen de limpieza específico para cada fracción (GAPDH para la fracción citoplasmasmica; histona H2B para fracciones solubles nucleares y ligadas a la cromatina).
El gráfico de la Figura 5B informa de la relación de Tau en la fracción nuclear soluble y la fracción citoplasmática para resaltar que Tau-NLS está altamente enriquecido en la fracción nuclear soluble (SNF) mientras que Tau-NES se reduce. Además, Tau-NLS se enriquece en la fracción ligada a la cromatina (CBF) con respecto a la fracción citoplasmática (CF) mientras que Tau-NES disminuye. SNF/CF a 1 y CBF/CF a 1 corresponden a la relación Tau en las celdas de control. El Tau endógeno es débilmente detectable en todas las fracciones como se esperaba. El gráfico de la Figura 5C informa de la cuantificación de la expresión VGluT1 en el total de extractos de muestras que expresan diferentes cantidades de Tau nuclear. En las celdas que expresan Tau-NES, la expresión VGluT1 es comparable a la expresión de línea base en las celdas de control. Por el contrario, en las células que expresan Tau sin etiquetar o Tau-NLS, la expresión de VGluT1 se duplica con más que el doble.
Figura 1: Representación gráfica de la estrategia utilizada para permitir una acumulación nuclear o citoplasmática de Tau. Tau-NLS se acumula en el compartimento nuclear, mientras que Tau-NES está excluido. La lectura experimental es la modulación de la expresión VGluT1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Referencia al cultivo celular indiferenciado y diferenciado. Imagen de SH-SY5Y indiferenciado (izquierda), celdas diferenciadas por RA (medio) y diferenciadas por RA y BDNF (derecha). Barra de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imagen representativa del enriquecimiento subcelular Tau por inmunofluorescencia. Imagen de células no transinfectadas o que expresan construcciones Tau, Tau-NES o Tau-NLS no etiquetadas. La señal Tau se ha obtenido por inmunofluorescencia (rojo), la señal de núcleos se ha obtenido mediante la tinción DAPI (azul), se informa de imágenes combinadas. Barra de escala a 10 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Detección representativa de proteínas enriquecidas en fracciones subcelulares por la mancha occidental. Mancha occidental de fracciones subcelulares de células SH-SY5Y. CF - fracción citoplasmática; MF - fracción de membrana; SNF - fracción nuclear soluble; CBF - fracción enlazada a la cromatina; CKF - fracción citoesquelética. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Detección representativa de proteínas nucleares Tau y VGluT1. (A) mancha occidental de proteína Tau detectada en las fracciones nucleares y citoplasmáticas. (B) El gráfico informa de la relación de Tau en las fracciones nucleares y la fracción citoplasmática. Los valores se han normalizado en el Tau endógeno. SNF/CF a 1 y CBF/CF a 1 corresponde a la relación Tau endógena en las células de control. (C) Mancha occidental de la proteína VGluT1. (D) El gráfico informa de la cuantificación de la expresión VGluT1 en el total de extractos de muestras que expresan diferentes cantidades de Tau nuclear. Prueba Kruskal-Wallis ANOVA y Mann-Whitney; p < 0.001, **** p < 0.0001, n.s. p > 0.05. Todos los resultados se muestran como medias - SEM de al menos tres experimentos independientes. Esta figura representativa ha sido modificada de Siano et al.31. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Describimos un método para medir el impacto de la proteína nuclear Tau en la expresión génica. Con este protocolo la contribución de Tau citoplasma es muy limitada. Los pasos críticos de este protocolo son los siguientes: la diferenciación de las células sh-SY5Y del neuroblastoma humano, el fraccionamiento subcelular y la localización de la proteína Tau en el compartimento nuclear.
En primer lugar, como se muestra en la sección de resultados representativos, la diferenciación de las células SH-SY5Y mediante la adición de RA y BDNF es crucial para obtener una buena preparación de las células similares a las neuronas en el cultivo. La densidad de las células sembradas es particularmente importante ya que una densidad más baja podría afectar la proliferación celular. Por otra parte, para los experimentos que necesitan un alto número de células, como el fraccionamiento celular y la mancha occidental, es importante tener en cuenta que el paso de diferenciación BDNF bloquea la proliferación celular para permitir la diferenciación terminal, limitando así el número de células en el cultivo. Los protocolos de diferenciación alternativos utilizan solamente RA o NGF en lugar de BDNF. Sin embargo, mientras que la adición de BDNF después de RA permite alcanzar una mejor diferenciación morfológica32,33, NGF induce un crecimiento de neurita más débil en las células SH-SY5Y34. Además, se ha demostrado ampliamente que la combinación de RA y BDNF permite obtener una población neuronal homogénea con expresión de marcadores neuronales y disminución de la proliferación35. Por esta razón, el protocolo de diferenciación explotado aquí combina RA y BDNF.
Sin embargo, el procedimiento reportado para diseccionar el papel de Tau en diferentes compartimentos subcelulares se puede utilizar también para células indiferenciadas o para diferentes tipos de células.
El fraccionamiento subcelular es un paso muy crítico y es crucial tener suficiente material de partida: un kit comercial requiere sólo 1 x 106 celdas, mientras que otros procedimientos pueden necesitar una cantidad inicial mucho mayor. Además, el uso de un kit con tampones y pasos estándar garantiza la reproducibilidad del experimento que es inevitable y esencial. Sin embargo, dado que la composición de los tampones es a menudo propietaria, pueden contener detergentes que pueden alterar la función de la proteína de interés y podría ser difícil optimizar el aislamiento de las fracciones. Además, incluso en las mejores condiciones, puede haber un 10-15% de contaminación entre fracciones. Un rendimiento pobre de cada fracción podría ser superado aumentando el tiempo de incubación en los tampones de extracción de fracciones específicas.
Dado que las funciones de Tau nuclear han ganado un interés significativo en los últimos años, es particularmente importante proporcionar un método confiable para diseccionar la función de Tau en diferentes compartimentos celulares. El acoplamiento del fraccionamiento subcelular, con la expresión de construcciones Tau específicamente dirigidas o excluidas del núcleo, permite afinar finamente la cantidad de Tau en diferentes compartimentos.
Un paso crítico en esta parte del protocolo es la clonación de Tau etiquetada con señal de localización nuclear o con la señal de exportación nuclear. La eficiencia del NLS está garantizada por la presencia de una secuencia de consenso 3XNLS del virus SV40. La translocación nuclear de la proteína se puede comprobar fácilmente por inmunofluorescencia, y la falta de señal en el núcleo podría deberse a una clonación incorrecta o a una transfección ineficiente. Por el contrario, la exportación nuclear está garantizada por la secuencia de consenso de la NES. En este caso, la inmunofluorescencia permite comprobar la exportación de Tau desde el núcleo. Sin embargo, una señal nuclear débil no debe excluirse ya que la proteína Tau-NES entra en el núcleo y luego, debido a la secuencia NES, se exporta al citosol.
Hasta ahora, la función de Tau nuclear sólo ha sido estudiada por enfoques correlativos que no aseguran su participación directa. El protocolo aquí descrito, proporciona el primer enfoque que permite discriminar claramente la función específica de Tau en el compartimento nuclear. Como se ha demostrado anteriormente, el Tau endógeno no afecta a los resultados obtenidos por este protocolo. De hecho, el mismo experimento realizado en células no neuronales que no expresan Tau endógeno, conduce a la expresión alterada VGluT1. Aplicamos este protocolo para estudiar la expresión de genes relacionados con la enfermedad31. De todos modos, podría ser explotado también para investigar otras funciones nucleares tau, como la participación en el daño del ADN, la interacción con cofactores nucleares o con la cromatina.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
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