Summary
Tau is een neuronale eiwit aanwezig zowel in het cytoplasma, waar het bindt microtubuli, en in de Nucleus, waar het oefent onconventionele functies, met inbegrip van de modulatie van de ziekte van Alzheimer-gerelateerde genen. Hier beschrijven we een methode om de functie van nucleaire tau te onderzoeken, terwijl alle interferenties uit cytoplasmatische tau worden uitgesloten.
Abstract
Tau is een microtubulus bindend eiwit uitgedrukt in neuronen en de belangrijkste bekende functie is gerelateerd aan het behoud van cytoskelet stabiliteit. Recent bewijs gaf echter aan dat tau ook aanwezig is in andere subcellulaire compartimenten, waaronder de Nucleus waar het betrokken is bij DNA-bescherming, in rRNA transcriptie, in de mobiliteit van retrotransposons en in de structuur organisatie van de Nucleolus. We hebben onlangs aangetoond dat nucleaire Tau is betrokken bij de uitdrukking van het VGluT1 gen, suggereren een moleculair mechanisme dat de pathologische toename van glutamaat vrijlating in de vroege stadia van de ziekte van Alzheimer verklaren kan. Tot voor kort was de betrokkenheid van nucleaire tau bij het moduleren van de uitdrukking van doel genen relatief onzeker en dubbelzinnig vanwege technische beperkingen die de uitsluiting van de bijdrage van cytoplasmische tau of het effect van andere downstream-factoren die geen verband houden met nucleaire tau. Om deze onzekerheid te overwinnen, ontwikkelden we een methode om de expressie van doel genen te bestuderen die specifiek zijn gemoduleerd door het nucleaire Tau-eiwit. We werkten met een protocol dat koppels het gebruik van lokalisatie signalen en de subcellulaire fractionering, waardoor de uitsluiting van de interferentie van de cytoplasmatische tau moleculen. Met name is het protocol eenvoudig en bestaat uit klassieke en betrouwbare methoden die algemeen toepasbaar zijn om de nucleaire functie van tau in andere celtypen en cellulaire omstandigheden te bestuderen.
Introduction
De functies van Tau-eiwit in de Nucleus hebben de afgelopen jaren aanzienlijke belangstelling gekregen, omdat is aangetoond dat het nauw geassocieerd is met nucleïnezuren1,2,3,4,5,6. Inderdaad, een recente genoom-brede studie toonde aan dat tau genic en intergene DNA-sequenties bindt in vivo7. Een rol in de nucleolar organisatie is voorgesteld8,9,10,11. Bovendien is tau voorgesteld om betrokken te zijn bij DNA-bescherming tegen oxidatieve en hyperthermische stress5,10,12,13, terwijl gemuteerde Tau is gekoppeld aan chromosoominstabiliteit en aneuploïdie14,15,16.
Tot nu toe bleven de uitdagingen bij het bestuderen van de functies van tau in het nucleaire compartiment bijna onopgelost vanwege de moeilijkheden bij het ontleden van de specifieke bijdrage van nucleaire tau uit de bijdrage van cytoplasmatische tau. Bovendien zijn de functies die aan tau-moleculen in het nucleaire compartiment worden toegeschreven tot nu toe slechts correlatief omdat ze geen eenduidige demonstratie hebben van de directe betrokkenheid van nucleaire tau-eiwitten. De betrokkenheid van Tau bij de mobiliteit van retrotransposons of in de transcriptie van de rRNA of in de DNA-bescherming11,12,17,18,19 kan ook worden verklaard door de bijdrage van cytoplasmatische tau of door het effect van andere downstream factoren die geen verband houden met nucleaire tau.
Hier bieden we een methode om dit probleem op te lossen door een klassieke procedure te benutten om het nucleaire compartiment te isoleren in combinatie met het gebruik van Tau-constructies 0N4R gelabeld met nucleaire lokalisatie (NLS) of nucleaire export signalen (NES). Deze aanpak elimineert de complexe problemen met betrekking tot mogelijke artefacten als gevolg van de overloop van tau moleculen uit het cytoplasmische compartiment. Bovendien veroorzaken tau-NLS en tau-NES constructies de verrijking of uitsluiting van tau-moleculen uit het nucleaire compartiment, en leveren zij positieve en negatieve controles op de betrokkenheid van nucleaire tau-moleculen in een specifieke functie. Het protocol is technisch eenvoudig en bestaat uit klassieke en betrouwbare methoden die algemeen toepasbaar zijn om de nucleaire functie van tau in andere celtypen te bestuderen, gedifferentieerd of niet, zoals kankercellen die tau-expressie20,21opnieuw activeren. Bovendien, het kan ook worden toegepast op andere eiwitten die aanwezig zijn in zowel het cytoplasma en de Nucleus om te ontleden van biologische functies die verband houden met verschillende compartimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celcultuur
- Cultuur SH-SY5Y cellen (menselijke neuroblastoom cellijn, CRL-2266) in het volledige medium (Dulbecco's gemodificeerde adelaar medium: nutriënten mengsel F12 [DMEM/F-12] aangevuld met 10% foetaal runderserum [FBS], 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine). Houd de cellen in een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Kweekcellen in 10 cm platen en splits bij Confluent.
2. celdifferentiatie
- Om te differentiëren SH-SY5Y cellen, de dag na de plating, voeg 10 μM retinoïnezuur (RA) om het medium te voltooien voor 5 dagen.
- De zesde dag vervangen medium met differentiatie medium: DMEM/F-12 aangevuld met 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamine. Voeg geen FBS of antibiotica toe.
- Kweek de cellen in differentiatie medium gedurende 3 dagen.
3. Chimeric Construteert klonen
- Bouw tau-NLS construct door het klonen door beperking enzym spijsvertering in frame aan de 3 ' einde van Tau sequentie 0N4R (383aa) de 3xNLS (SV40NLS): 5 '-CCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3 '
Opmerking: De 3xNLS aan het 3 ' einde van Tau wordt gekloond in de pCMV-tau plasmide voor zoogdier uitingen die de sites van XhoI en BamHI beperken tot de multicloning-site (MCS). - Het genereren van Tau-NES construct door het klonen door beperking enzym spijsvertering in frame aan de 3 ' einde van Tau sequentie 0N4R (383aa) de NES sequentie: 5 '-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTCGTACAA-3 '.
Opmerking: De NES aan het 3 ' einde van Tau worden gekloond in de pCMV-tau plasmide voor zoogdier uitingen die de EcoRI-en BamHI-beperkings sites exploiteren in de MCS. - Transformeer DH5alpha E. coli stam met 100 ng van DNA uit stap 3,1 of 3,2 en plaat cellen op lb-agar platen met 100 mg/ml ampicillaire. Laat u 's nachts groeien op 37 °C.
- Kies een enkele kolonie en Spike de cellen in 5 mL LB met ampicillaire. Laat de cellen groeien bij 37 °C in agitatie 's nachts.
- Extract plasmide met een DNA miniprep (tabel van materialen) en sequentie om de constructies te controleren.
- Transformeer DH5alpha E. coli stam met de sequentie geverifieerde constructies en plaat cellen op lb-agar platen met ampicillaire. Laat u 's nachts groeien op 37 °C.
- Kies een enkele kolonie en Spike de cellen in 5 mL LB met ampicillaire. Laat de cellen groeien bij 37 °C in agitatie gedurende 2 uur.
- Plaats de cellen van stap 3,7 in 200 mL LB met ampicillaire. Laat u 's nachts groeien op 37 °C.
- Pellet de cellen bij 3.500 x g gedurende 10 min bij 4 °c.
- Extract plasmide met een DNA maxiprep (tabel van de materialen).
4. celtransfectie
- Zaad 400.000 cellen uit stap 1,1 in 6-well platen of 20.000 cellen in 8-well kamer dia's. Plaat vier monsters: controle cellen die met een lege Vector moeten worden getransffecteerd, cellen die met niet-gelabelde tau worden getransffecteerd, cellen die met tau-NLS en cellen moeten worden getransffecteerd met tau-NES.
- De dag na het zaaien transfect 400 ng van het DNA voor elke put met behulp van de kationische lipiden (tabel van de materialen) in 6-well platen of 200 ng van DNA voor elke put voor 8-well kamer dia's, volgens de instructies van de fabrikant.
- Inbroed het DNA en de kationische lipiden afzonderlijk in 250 μL (voor 6-well-platen) of 25 μL (voor 8-well kamer glaasjes) van verlaagd serum medium gedurende 5 minuten bij RT. Combineer ze vervolgens om het DNA-lipide complex te genereren en inincuberen gedurende 20 minuten.
- Vervang het kweekmedium door 2 mL (voor 6-well platen) of 250 μL (voor 8-well kamer glaasjes) van vers compleet kweekmedium. Voeg het DNA-lipide complex toe aan de cellen en inincuberen bij 37 °C 's nachts.
- Alternatief, transfect DNA met de kationische reagens polyethylenimine (PEI).
- Meng 2 μg DNA en 6 μL PEI met 200 μL volledig kweekmedium (voor elk goed in 6-well platen), of 1 μg DNA en 3 μL PEI met 100 μL volledig kweekmedium (voor elke put in 8-well kamer glaasjes) , Vortex en incuberen gedurende 10 minuten bij RT.
- Voeg de mix toe aan de cellen en voeg 1,8 mL volledig kweekmedium per put toe in 6-well platen of 150 μL volledig kweekmedium per put in 8-well kamer dia's om het plating volume te bereiken.
- Verander het medium de dag na transfectie en voeg de differentiatie media toe zoals beschreven in stap 2,2.
5. immunofluorescentie
- Verwijder het kweekmedium en spoel de cellen af met 1x PBS. Repareer cellen met 100% ijskoude methanol gedurende 3 minuten zonder te schudden. Verwijder de bevestigingsoplossing en spoel kort met 1x PBS.
- Permeabilize met 0,1% niet-ionische oppervlakteactieve stof in 1x PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT). Kort, wassen met 1x PBS, 3 keer.
- Inincuberen cellen met blokkerende buffer (0,1% Tween 20 en 1% BSA in PBS) gedurende 30 minuten bij RT op een rondschudapparaat.
- Inbroed met geschikte primaire antilichamen (bijv. muis monoklonaal anti-Tau13 antilichaam) verwaterde 1:500 in blokkerende buffer 's nachts bij 4 °C op een rondschudapparaat. Verwijder de antilichaam oplossing en was kort met 1x PBS.
- Inincuberen met secundaire antilichamen geconjugeerd aan de (bijv. geit anti muis antilichamen geconjugeerd aan Alexa Fluor 633) verdund 1:500 in blokkerende buffer voor 1 uur bij RT. Verwijder de antilichaam oplossing en was kort met 1x PBS 3 keer.
- Om kernen te vlekken, inincuberen met DAPI verdund 1:20000 in blokkerende buffer gedurende 10 min bij RT. wassen met 1x PBS 3 keer. Monteer de dekstroken op een glijbaan met anti fade-afdekmedium.
6. Western Blot
- Om de celpellet van stap 4,4 te verzamelen, verwijdert u het medium en wast u cellen met PBS. Inincuberen met 500 μL 0,1% trypsine gedurende 4 min bij 37 °C. Voeg een gelijk volume aan volledige medium en respendeer cellen toe.
- Verzamel cellen in een buis en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten. Verwijder voorzichtig het supernatant aan het einde van de centrifugeren. Voeg 1 mL PBS toe, centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten en verwijder voorzichtig het supernatant. Bewaar celpellets op ijs voor onmiddellijk gebruik of bevriezing bij-80 °C voor langdurige opslag.
- Voor totaal eiwitextracten, inbroed de celpellet voor 30 min op ijs in lysisbuffer (20 mM tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glycerol, 1% octylfenoxy poly (ethyleeneoxy) ethanol, vertakte (tabel van materialen), 10 mm EDTA) aangevuld met protease en fosfatase remmers. Gebruik volgens de overvloed van de pellet 50 μL tot 100 μL lysisbuffer.
- Centrifugeer het extract bij 16.000 x g gedurende 15 min. Verzamel het supernatant en Kwantificeer de eiwitconcentratie met een standaard kwantificerings test. Bereid de eiwit monsters voor op de SDS-PAGE door 20 μg eiwitten te mengen met 5 μL 4x Laemmli buffer in een totaal volume van 20 μL en kook bij 100 °C gedurende 5 minuten.
Opmerking: Het monster kan bij-20 °C worden bewaard.
- Centrifugeer het extract bij 16.000 x g gedurende 15 min. Verzamel het supernatant en Kwantificeer de eiwitconcentratie met een standaard kwantificerings test. Bereid de eiwit monsters voor op de SDS-PAGE door 20 μg eiwitten te mengen met 5 μL 4x Laemmli buffer in een totaal volume van 20 μL en kook bij 100 °C gedurende 5 minuten.
- Voor subcellulaire fractionaties, respendeer cellen uit stap 6,2 in het volledige medium en verzamel 1 x 106 cellen per monster. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 10 minuten om celpellets te verkrijgen voor de volgende stappen.
- Om subcellulaire compartimenten te isoleren, fractioneren volgens de specificaties van de kit. Om elke breuk te isoleren, inbroed de celpellet van stap 6,4 met de corresponderende buffer, centrifugeer, verzamel het supernatant en voeg de volgende buffer toe aan de pellet zoals beschreven in 6.4.1.1-6.4.1.5. Voeg in volgorde cytoplasmische extractiebuffer, membraan extractiebuffer, nucleaire extractiebuffer, nucleaire extractiebuffer aangevuld met 5 mM CaCl2 en 3 U/μL micrococcal Nuclease en cytoskelet extractiebuffer.
Opmerking: Alle buffers moeten worden aangevuld met proteaseremmers. Schaal buffer volumes op basis van het volume van de celpellet.- Om de cytosolische fractie te isoleren, incuberen celpellets in 100 μL ijskoude cytoplasmische extractiebuffer aangevuld met proteaseremmers bij 4 °C met zacht mengen gedurende 10 min. Centrifugeer bij 500 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten en breng de supernatant over naar voorgekoelde buizen.
- Voeg 100 μL ijskoude membraan extractiebuffer aangevuld met proteaseremmers aan de pellet uit stap 6.4.1.1, en inbroed bij 4 °C met voorzichtige menging gedurende 10 min. Centrifugeer bij 3.000 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten en verzamel het supernatant.
- Voeg voor de oplosbare kern fractie 50 μL kern extractiebuffer, aangevuld met proteaseremmers, toe aan de pellet uit stap 6.4.1.2 en Vortex. Inbroed bij 4 °C gedurende 30 minuten, centrifugeer op 5.000 x g bij 4 °c gedurende 5 minuten en verzamel het supernatant.
- Voeg voor de onoplosbare kern fractie 50 μL kern extractiebuffer toe, aangevuld met proteaseremmers, CaCl2 en micrococcal Nuclease aan de pellet uit stap 6.4.1.3, en Vortex. Inincuberen bij 37 °C gedurende 5 minuten en vervolgens weer Vortex. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT met 16.000 x g en verzamel het supernatant.
- Voor de cytoskelet breuk, voeg 50 μL cytoskelet extractiebuffer aangevuld met proteaseremmers aan de pellet uit stap 6.4.1.4, en Vortex. Inbroed 10 min bij RT. Centrifugeer de buis bij 16.000 x g gedurende 5 minuten, verzamel het supernatant en gooi de pellet weg.
Opmerking: Schaal buffer volumes op basis van het celvolume, zoals aangegeven in het Kit-protocol. Raadpleeg het Kit-protocol voor meer informatie over incubatie en centrifugeren tijd en temperatuur22,23,24,25,26,27,28,29. U ook standaardmethoden gebruiken30 die, door het gebruik van detergenten en door het verhogen van Ionische sterkte en centrifugeersnelheid, de cytosolische, de membraan-gebonden, het cytoskelet en de nucleaire fracties scheidt. De oplosbare nucleaire Fractie en de onoplosbare kern fractie scheiden door de standaard nucleaire extractie buffers te exploiteren. Het monster kan bij-20 °C worden bewaard.
- Voeg voor de SDS-PAGE 7 μL 4x Laemmli-buffer toe aan 20 μL subcellulaire fracties verkregen uit stap 6.4.1.1 − 6.4.1.5, kook bij 100 °C gedurende 5 minuten.
- Om subcellulaire compartimenten te isoleren, fractioneren volgens de specificaties van de kit. Om elke breuk te isoleren, inbroed de celpellet van stap 6,4 met de corresponderende buffer, centrifugeer, verzamel het supernatant en voeg de volgende buffer toe aan de pellet zoals beschreven in 6.4.1.1-6.4.1.5. Voeg in volgorde cytoplasmische extractiebuffer, membraan extractiebuffer, nucleaire extractiebuffer, nucleaire extractiebuffer aangevuld met 5 mM CaCl2 en 3 U/μL micrococcal Nuclease en cytoskelet extractiebuffer.
- Laad monsters op een acrylamidegel en voer elektroforese uit met een constante spanning van 120 V. Breng de eiwitten over naar nitrocellulose membraan bij 250 mA gedurende 90 min.
- Controleer de juiste proteïne-gel elektroforese en succesvolle blotting door het membraan gedurende 5 minuten in Ponceau kleurings oplossing te inbroed. Spoel het membraan in gedestilleerd water totdat de achtergrond schoon is. Verwijder de vlek door verder te wassen met tris-gebufferde zoutoplossing met tween 20 (TBST) gedurende 10 minuten op een shaker.
- Inbroed het membraan met blokkerende oplossing (5% melk in TBST) gedurende 1 uur bij RT op Shaker. Was 3 keer met TBST gedurende 5 min.
- Hybridiseren van het membraan met het primaire antilichaam in blokkerende oplossing (1% melk in TBST) 's nachts bij 4 °C. Was 3 keer met TBST gedurende 5 min.
- Hybridiseer het membraan met het HRP-geconjugeerde secundaire antilichaam in blokkerende oplossing voor 1 uur bij RT. was 3 keer met TBST gedurende 5 min.
- Detecteer de proteïne band met behulp van chemiluminescentie. Kwantificeer de intensiteit van de Western Blot-bands door ImageJ. Normaliseer eiwit expressie op het product van een huishoudelijk gen: Histon H2B voor de nucleaire oplosbare en onoplosbare Fractie, gapdh voor de cytoplasmische Fractie en voor totale extracten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De strategie voor het ontleden van de impact van nucleaire tau in genexpressie die de bijdrage van cytoplasmische tau-eiwitten vermijdt, is afgebeeld in Figuur 1. In het kort worden tau-eiwitten die met NLS of NES zijn gelabeld, samengevoegd in of uitgesloten van het nucleaire compartiment. Het functionele effect van deze onbalans is de verandering van de genexpressie, gemeten als het product van het VGluT1 gen.
Na de beschrijving van het protocol werden de SH-SY5Y cellen gedurende 5 dagen behandeld met RA en daarna met BDNF gedurende 3 dagen om post-mitotische neuron-achtige cellen te verkrijgen (Figuur 2). Bij afwezigheid van RA en BDNF veronderstellen ongedifferentieerde SH-SY5Y cellen een rondere morfologie en vormen celklonten. Zoals verwacht, starten van het differentiatie protocol, klontjes ontspannen en cellen verspreiden neurites; aan het einde van de differentiatie worden cellen gelijkmatig verdeeld en onderling verbonden via een netwerk van vertakte neurites.
De dag na het zaaien zijn cellen met tau-NLS of tau-NES plasmiden (paragraaf 4,2) met kationische lipiden getransffecteerd. Voor cellen die tau-NLS-of tau-NES-constructies uitdrukken, kan tau subcellulaire lokalisatie worden gedetecteerd door immunofluorescentie met anti-tau antilichamen. Afhankelijk van de efficiëntie van transfectie vertonen cellen een sterke nucleaire kleuring die samenvoegt met het DAPI-signaal of een cytoplasmische kleuring met lege kernen als ze met succes zijn getransffecteerd met tau-NLS of tau-NES, respectievelijk (Figuur 3). Het ontbreken van deze specifieke signalen duidt op een inefficiënte transfectie.
Om de in verschillende subcellulaire compartimenten verrijkte eiwitten te analyseren, werden cellen verzameld en geteld om gelijke hoeveelheden cellen per monster te verwerken. Elke standaard fractionering methode die het verhogen van het reinigingsmiddel en Ionische sterkte en het verhogen van de centrifugeersnelheid benut, kan worden gebruikt om de cellulaire compartimenten van elkaar te scheiden en zo de cytosolische, de membraan-gebonden, het cytoskelet te isoleren en de nucleaire fracties.
Zodra de kernen geïsoleerd zijn, werden de nucleaire oplosbare breuk en de chromatische gebonden fractie gescheiden door toevoeging van 3 e/μL micrococcal Nuclease en 5 mM CaCl2.
Voor de analyse van Western Blot zijn gelijke volumes cytoplasma-en membraan fracties en halve volumes van de andere fracties geladen op de gel van een gradiënt prefabacrylamide, om de verschillende hoeveelheid buffer die bij elke stap is toegevoegd, te corrigeren.
Om de efficiënte scheiding van verschillende fracties te controleren, is de Western Blot die de volgende antilichamen exploiteert uitgevoerd: anti-GADPH (aanwezig in alle fracties behalve het cytoskelet en met name verrijkt in de cytoplasmische Fractie); anti-actin (met name verrijkt in de cytoskelet Fractie); anti-tubulin (met name verrijkt in Cytoplasmische en cytoskelet fracties); anti-H2B (verrijkt in de nucleaire fracties) (Figuur 4).
Een verrijking van deze markeringen in verschillende subcellulaire fracties geeft aan dat de fractionering niet goed wordt uitgevoerd. Er moet worden opgemerkt dat elk protocol voor subcellulaire fractionering een 10-15% van de verontreiniging tussen fracties kan inhouden.
Eenmaal geverifieerd de succesvolle fractionering van het monster, de Western Blot is uitgevoerd om te controleren van het signaal van tau in het nucleaire compartiment en de VGluT1 signaal in het totale extract (Figuur 5). Hoewel niet-gecodeerde tau in alle fracties aantoonbaar is, is tau-nls sterk verrijkt in het nucleaire compartiment en is het slecht detecteerbaar in de cytoplasmische Fractie. Integendeel, tau-NES is verrijkt in de cytoplasmische Fractie en het is minder detecteerbaar in de nucleaire Fractie. De aanwezigheid van een kleine hoeveelheid tau-NES in de oplosbare nucleaire fractie moet worden verwacht, aangezien, zoals de endogene tau, het is transgevestigd in de kern en eenmaal in het nucleaire compartiment het nucleaire export signaal maakt zijn translocatie aan het cytoplasma. De opsporing van een andere verrijking voor deze twee fusie proteïnen kan duiden op een probleem in de efficiëntie van de transfectie of het klonen van constructies of fractionering.
Kwantitatieve analyse van Western Blot kan worden gedaan met behulp van ImageJ. Waarden zijn genormaliseerd voor het huishoudelijk gen specifiek voor elke fractie (GAPDH voor cytoplasmatisch fractie; Histon H2B voor oplosbare nucleaire en Chromatin-gebonden fracties).
De grafiek in Figuur 5B meldt de verhouding van tau in de oplosbare nucleaire Fractie en de cytoplasmische Fractie om te benadrukken dat tau-nls sterk verrijkt is in de oplosbare nucleaire fractie (SNF) terwijl tau-NES is afgenomen. Bovendien is tau-NLS verrijkt met de chromatisch-gebonden fractie (CBF) met betrekking tot de cytoplasmatisch fractie (CF) terwijl tau-NES is afgenomen. SNF/CF = 1 en CBF/CF = 1 komen overeen met de tau-verhouding in de controle cellen. De endogene Tau is zwak detecteerbaar in alle fracties zoals verwacht. De grafiek in Figuur 5C meldt de kwantificering van VGluT1 uitdrukking in de totale extracten van monsters die verschillende hoeveelheid nucleaire tau uitdrukken. In cellen die tau-NES uitdrukken, is VGluT1 expressie vergelijkbaar met de basislijn expressie in besturings cellen. Integendeel, in cellen die niet-gecodeerde tau of tau-NLS uitdrukken, is de uitdrukking van VGluT1 meer dan verdubbeld.
Figuur 1: grafische weergave van de strategie die wordt gebruikt om een nucleaire of een cytoplasmatisch accumulatie van Tau toe te staan. Tau-NLS wordt geaccumuleerd in het nucleaire compartiment, terwijl tau-NES uitgesloten is. De experimentele uitlezen is de modulatie van de VGluT1 expressie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve ongedifferentieerde en gedifferentieerde celcultuur. Afbeelding van ongedifferentieerde SH-SY5Y (links), cellen gedifferentieerd door RA (midden) en gedifferentieerd door RA en BDNF (rechts). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatief beeld van Tau subcellulaire verrijking door immunofluorescentie. Beeld van cellen niet-getransfundeert of uitdrukken van niet-gelabelde tau-, tau-NES-of tau-NLS-constructies. Tau-signaal is verkregen door immunofluorescentie (rood), kernen-signaal is verkregen door DAPI-kleuring (blauw), samengevoegde afbeeldingen worden gerapporteerd. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: representatieve opsporing van in subcellulaire fracties verrijkte eiwitten door Western Blot. Western Blot van subcellulaire fracties van SH-SY5Y cellen. CF = cytoplasmische Fractie; MF = membraan breuk; SNF = oplosbare nucleaire Fractie; CBF = chromatine gebonden Fractie; CKF = cytoskelet breuk. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: representatieve opsporing van nucleaire tau-en VGluT1-eiwitten. A) Western Blot van Tau-eiwit gedetecteerd in de nucleaire en cytoplasmorische fracties. B) de grafiek rapporteert de verhouding van tau in de nucleaire fracties en cytoplasmische Fractie. De waarden zijn genormaliseerd op de endogene tau. SNF/CF = 1 en CBF/CF = 1 komt overeen met de endogene tau ratio in controle cellen. C) Western Blot van VGluT1-eiwit. D) de grafiek meldt de kwantificering van VGluT1-uitdrukking in de totale extracten van monsters die een andere hoeveelheid nucleaire tau uitdrukken. Kruskal-Wallis ANOVA en Mann-Whitney test; p < 0,001, * * * * p < 0,0001, n.s. p > 0,05. Alle resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Dit representatieve cijfer is gewijzigd van Siano et al.31. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven een methode om de impact van nucleaire tau-eiwitten op genexpressie te meten. Met dit protocol de bijdrage van cytoplasmatische Tau is sterk beperkt. Kritieke stappen van dit protocol zijn de volgende: de differentiatie van menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen, de subcellulaire fractionering en de lokalisatie van Tau-eiwit in het nucleaire compartiment.
Ten eerste is, zoals blijkt uit de representatieve resultaten sectie, de differentiatie van de SH-SY5Y cellen door het toevoegen van RA en BDNF cruciaal om een goede bereiding van neuron-achtige cellen in cultuur te verkrijgen. De dichtheid van de cellen is bijzonder belangrijk omdat een lagere dichtheid de celproliferatie kan beïnvloeden. Bovendien, voor experimenten die een groot aantal cellen nodig hebben, zoals cellulaire fractionering en Western Blot, is het belangrijk op te merken dat de stap van de differentiatie van BDNF de cellulaire proliferatie blokkeert om de terminale differentiatie mogelijk te maken, waardoor het aantal cellen in de cultuur wordt beperkt. Alternatieve differentiatie protocollen gebruiken alleen RA of NGF in plaats van BDNF. Echter, terwijl het toevoegen van BDNF na Ra toelaat om een betere morfologische differentiatie32,33, NGF induceert een zwakkere neuriet uitgroei in sh-SY5Y cellen34. Bovendien is uitgebreid aangetoond dat de combinatie van RA en BDNF toelaat om een homogene neuronale populatie te verkrijgen met een expressie van neuronale markers en een afname van de proliferatie35. Daarom combineert het hier geëxploiteerde differentiatie protocol RA en BDNF.
Echter, de procedure gerapporteerd aan het ontleden van de rol van tau in verschillende subcellulaire compartimenten kan ook worden gebruikt voor ongedifferentieerde cellen of voor verschillende celtypen.
De subcellulaire fractionering is een zeer kritische stap enhet is van cruciaal belang om genoeg uitgangsmateriaal te hebben: een commerciële Kit vereist slechts 1 x 106 cellen, terwijl andere procedures een veel hogere starthoeveelheid nodig kunnen hebben. Bovendien garandeert het gebruik van een kit met standaard buffers en stappen de reproduceerbaarheid van het experiment dat onvermijdelijk en essentieel is. Aangezien de samenstelling van buffers echter vaak eigen is, kunnen ze detergenten bevatten die de functie van het eiwit van belang kunnen veranderen en het kan moeilijk zijn om de isolatie van de fracties te optimaliseren. Bovendien, zelfs in de beste staat, kan er een 10-15% van de verontreiniging tussen fracties. Een slechte opbrengst van elke fractie kan worden overwonnen door de incubatietijd in extractie buffers van specifieke fracties te verhogen.
Aangezien de functies van nucleaire tau in de afgelopen jaren aanzienlijke belangstelling hebben opgedaan, is het bijzonder belangrijk om een betrouwbare methode te bieden om de functie van tau in verschillende cellulaire compartimenten te ontleden. Het koppelen van de subcellulaire fractionering, met de uitdrukking van Tau-constructies die specifiek zijn gericht of uitgesloten van de Nucleus, maakt het mogelijk om de hoeveelheid tau in verschillende compartimenten fijn af te stemmen.
Een cruciale stap in dit deel van het protocol is het klonen van Tau gelabeld met nucleair lokalisatie signaal of met het nucleaire export signaal. De efficiëntie van de NLS wordt gegarandeerd door de aanwezigheid van een consensussequentie van 3XNLS van het SV40 virus. De nucleaire translocatie van het eiwit kan eenvoudig worden gecontroleerd door immunofluorescentie, en het gebrek aan signaal in de Nucleus kan te wijten zijn aan een onjuist klonen of aan een inefficiënte transfectie. Integendeel, de nucleaire export wordt gegarandeerd door de NES-consensussequentie. In dit geval, de immunofluorescentie controleren van de uitvoer van tau uit de Nucleus. Een zwak nucleair signaal moet echter niet worden uitgesloten, omdat tau-NES-eiwitten de kern binnenstroomt en vervolgens, als gevolg van de NES-volgorde, wordt geëxporteerd naar de cytosol.
Tot nu is de functie van Nuclear tau alleen bestudeerd door correlatieve benaderingen die niet de directe betrokkenheid ervan verzekeren. Het protocol dat hier wordt beschreven, biedt de eerste benadering waarmee de specifieke functie van tau in het nucleaire compartiment duidelijk kan worden gediscrimineerd. Zoals eerder aangetoond, heeft de endogene tau geen invloed op de resultaten die door dit protocol worden verkregen. Inderdaad, hetzelfde experiment uitgevoerd in niet-neuronale cellen die niet endogene tau uiten, leidt tot VGluT1 veranderde expressie. We hebben dit protocol toegepast om de uitdrukking van ziektegerelateerde genen31te bestuderen. Hoe dan ook, het zou kunnen worden misbruikt om andere nucleaire tau-functies te onderzoeken, zoals de betrokkenheid bij DNA-schade, de interactie met nucleaire cofactoren of met het Chromatin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A21050 | IF 1:500 |
| anti Actin Antibody | BETHYL LABORATORIE | A300-485A | anti-rabbit WB 1:10,000 |
| anti GAPDH Antibody | Fitzgerald Industries International | 10R-G109a | anti-mouse WB 1:10,000 |
| anti H2B Antibody | Abcam | ab1790 | anti-rabbit WB 1:15,000 |
| anti Tau-13 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-21796 | anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500 |
| anti Tubulin alpha Antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-16891 | anti-mouse WB 1:5,000 |
| anti VGluT1 Antibody | Sigma-Aldrich | AMAb91041 | anti-mouse WB 1:500 |
| BCA Protein Assay Kit | Euroclone | EMPO14500 | |
| BDNF | Alomone Labs | B-250 | |
| Blotting-Grade Blocker | Biorad | 1706404 | Non-fat dry milk |
| BOVIN SERUM ALBUMIN | Sigma-Aldrich | A4503-50g | |
| cOmplete Mini | Roche | 11836170001 | protease inhibitor |
| Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well | Biorad | 5678093 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| DMEM/F-12 | GIBCO | 21331-020 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose | Euroclone | ECM0060L | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 0390-100ml | pH = 8, 0.5 M |
| Foetal Bovine Serum | Euroclone | EC50182L | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ml | |
| Goat anti-mouse IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | WB 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit IgG-HPR | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | WB 1:1,000 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896-50ml | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol |
| Immobilon Western | MERCK | WBKLS0500 | |
| Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide | nunc | 177402 | |
| L-glutamine | Euroclone | ECB3000D | 100X |
| Lipofectamine 2000 transfection reagent | Thermo Fisher Scientific | 12566014 | cationic lipid |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 322415-6X1L | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1kg | |
| Opti-MEM reduced serum medium | Gibco | 31985070 | |
| PEI | Sigma-Aldrich | 40,872-7 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL, 100 mL |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) | OXOID | BR0014G | |
| PhosStop | Roche | 4906837001 | phosphatase inhibitor |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12163 | Step 3.10 |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-100mg | |
| Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells | Thermo Fisher Scientific | 78840 | |
| Supported Nitrocellulose membrane | Biorad | 1620097 | |
| TC-Plate 6well | SARSTEDT | 833,920 | |
| TCS SP2 laser scanning confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ml | Non-ionic surfactant |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | 0.50% |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ml | |
| VECTASHIELD antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems | Promega | A1330 | Step 3.5 |
References
- Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
- Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
- Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
- Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
- Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
- Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
- Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
- Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
- Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J.
- Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
- Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
- Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
- Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
- Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
- Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
- Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
- Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
- Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
- Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
- Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
- Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
- Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
- Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
- Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
- Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
- Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
- Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
- Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
- ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
- Siano, G., et al.
- Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
- Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
- Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
- Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).
