Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Modulering av tau Subcellulære lokalisering som et verktøy for å undersøke uttrykk for sykdom-relaterte gener

Published: December 20, 2019 doi: 10.3791/59988
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of Biology, BIO@SNS, Scuola Normale Superiore

Summary

Tau er en neuronal protein stede både i cytoplasma, hvor det binder mikrotubuli, og i kjernen, der det utøver ukonvensjonelle funksjoner inkludert modulering av Alzheimers sykdom-relaterte gener. Her beskriver vi en metode for å undersøke funksjonen av kjernefysiske tau mens unntatt eventuelle forstyrrelser som kommer fra cytoplasmatiske tau.

Abstract

Tau er et mikrotubulinettverket bindende protein uttrykt i neurons og dens viktigste kjente funksjon er knyttet til vedlikehold av cytoskjelettkomponenter stabilitet. Men nyere bevis indikerte at tau er til stede også i andre subcellulære avdelinger inkludert kjernen der det er innblandet i DNA-beskyttelse, i rRNA transkripsjon, i mobilitet av retrotransposons og i den strukturelle organiseringen av nucleolus. Vi har nylig demonstrert at kjernefysiske tau er involvert i uttrykket av VGluT1 genet, antyder en molekylær mekanisme som kan forklare den patologiske økningen av glutamat utgivelse i de tidlige stadiene av Alzheimers sykdom. Inntil nylig har involvering av kjernefysiske tau i modulerende uttrykk for målet gener vært relativt usikkert og tvetydig på grunn av tekniske begrensninger som forhindret utelukkelse av bidraget fra cytoplasmatiske tau eller effekten av andre nedstrøms faktorer som ikke er knyttet til kjernefysiske tau. For å overvinne denne usikkerheten, utviklet vi en metode for å studere uttrykk for målet gener spesielt modulert av kjernefysiske tau protein. Vi brukte en protokoll som par bruk av lokalisering signaler og subcellulære fraksjonering, slik at utelukkelse av forstyrrelser fra cytoplasmatiske tau molekyler. Spesielt er protokollen enkel og består av klassiske og pålitelige metoder som er bredt aktuelt å studere kjernefysiske funksjon av tau i andre celletyper og cellulære forhold.

Introduction

Funksjonene tau protein i kjernen har fått betydelig interesse de siste årene, som det har vist seg å være nært forbundet med nukleinsyre syrer1,2,3,4,5,6. Faktisk en nylig Genova bred studie viste at tau binder genic og intergenisk DNA-sekvenser i vivo7. En rolle i nucleolar organisasjon har blitt foreslått8,9,10,11. I tillegg har tau blitt foreslått å være involvert i DNA-beskyttelse mot oksidativt og hyperthermic stress5,10,12,13, mens mutert tau har vært knyttet til kromosom ustabilitet ogavvik 14,15,16.

Hittil har utfordringene i å studere funksjonene i tau i Atom rommet forble nesten uløst på grunn av vanskelighetene med å dissekere det konkrete bidraget fra kjernefysiske tau fra bidraget fra cytoplasmatiske tau. Videre funksjonene tilskrives tau molekyler i kjernefysiske rom, inntil nå, er bare correlative fordi de mangler en utvetydig demonstrasjon av direkte involvering av kjernefysiske tau proteiner. Faktisk, involvering av tau i mobiliteten av retrotransposons eller i rRNA transkripsjon eller i DNA-beskyttelse11,12,17,18,19 kan også forklares med bidraget fra cytoplasmatiske tau eller ved effekten av andre nedstrøms faktorer som ikke er relatert til kjernefysiske tau.

Her gir vi en metode som kan løse dette problemet ved å utnytte en klassisk prosedyre for å isolere Atom rommet kombinert med bruk av tau konstruerer 0N4R merket med kjernefysisk lokalisering (NLS) eller kjernefysiske eksport signaler (NES). Denne tilnærmingen eliminerer komplekse problemstillinger knyttet til mulige gjenstander på grunn av smitteeffekter av tau molekyler fra cytoplasmatiske kupé. Videre konstruerer tau-NLS og tau-NES den berikelse eller utelukkelse av tau molekyler fra kjernefysiske rom, henholdsvis gir positive og negative kontroller for involvering av kjernefysiske tau molekyler i en bestemt funksjon. Protokollen er teknisk lett og det er sammensatt av klassiske og pålitelige metoder som er bredt aktuelt å studere kjernefysiske funksjon av tau i andre celletyper, differensiert eller ikke, slik som kreftceller som reaktivere tau Expression20,21. Videre kan det brukes også til andre proteiner som er tilstede i både cytoplasma og kjernen for å analysere biologiske funksjoner knyttet til ulike avdelinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cell kultur

  1. Kultur SH-SY5Y celler (humant neuroblastom cellelinje, CRL-2266) i komplett medium (Dulbecco ' s modifisert Eagle medium: næringsstoff blanding F12 [DMEM/F-12] supplert med 10% fosterets storfe serum [FBS], 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin og 100 μg/mL Streptomycin). Oppretthold cellene i en inkubator ved 37 ° c og 5% CO2. Dyrke celler i 10 cm plater og splitt når confluent.

2. celle differensiering

  1. For å differensiere SH-SY5Y celler, dagen etter plating, tilsett 10 μM retinoic syre (RA) for å fullføre medium for 5 dager.
  2. Den sjette dagen erstatte medium med differensiering medium: DMEM/F-12 supplert med 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamin. Ikke Legg til FBS eller antibiotika.
  3. Vokse cellene i differensiering medium for 3 dager.

3. chimeric konstruerer kloning

  1. Generere tau-NLS konstruere ved kloning av begrensning enzym fordøyelsen i ramme på 3 ' slutten av tau sekvens 0N4R (383aa) den 3xNLS (SV40NLS): 5 '-CCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTAGATCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA-3 '.
    Merk: Den 3xNLS på 3 ' enden av tau er klonet i pCMV-tau plasmider for pattedyr uttrykk utnytte XhoI og BamHI begrensning nettsteder i multicloning området (MCS).
  2. Generere tau-NES konstruere ved kloning av begrensning enzym fordøyelsen i ramme på 3 ' slutten av tau sekvens 0N4R (383aa) den NES sekvens: 5 '-AGTGAGCTGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATCTGGACTCGTACAA-3 '.
    Merk: Den NES på 3 ' enden av tau er klonet i pCMV-tau plasmider for pattedyr uttrykk utnytte EcoRI og BamHI begrensning nettsteder i MCS.
  3. Transform DH5alpha E. coli stamme med 100 ng av DNA fra trinn 3,1 eller 3,2 og plate celler på lb-agar plater med 100 mg/ml Ampicillin. La vokse over natten ved 37 ° c.
  4. Velg en enkelt koloni og pigg cellene i 5 mL LB med Ampicillin. La cellene vokse ved 37 ° c i agitasjon over natten.
  5. Pakk ut plasmider med en DNA-miniprep (tabell av materialer) og sekvens for å verifisere konstruksjoner.
  6. Transform DH5alpha E. coli stamme med sekvensen verifisert konstruksjoner og plate celler på lb-agar plater med Ampicillin. La vokse over natten ved 37 ° c.
  7. Velg en enkelt koloni og pigg cellene i 5 mL LB med Ampicillin. La cellene vokse ved 37 ° c i omrøring for 2 t.
  8. Sett cellene fra trinn 3,7 i 200 mL LB med Ampicillin. La vokse over natten ved 37 ° c.
  9. Pellet cellene ved 3 500 x g i 10 min ved 4 ° c.
  10. Pakk plasmider med en DNA-maxiprep (tabell av materialer).

4. Cell Transfeksjoner

  1. Seed 400 000 celler fra trinn 1,1 i 6-brønn plater eller 20 000 celler i 8-brønn kammer lysbilder. Plate fire prøver: kontroll celler som skal transfekterte med en tom vektor, celler som skal transfekterte med umerkede tau, celler som skal transfekterte med tau-NLS og celler som skal transfekterte med tau-NES.
  2. Dagen etter seeding transfect 400 ng av DNA for hver brønn ved hjelp av kationiske lipider (tabell av materialer) i 6-brønn plater eller 200 ng av DNA for hver brønn for 8-brønn kammer lysbilder, i henhold til produsentens instruksjoner.
    1. Ruge DNA og kationiske lipider separat i 250 μL (for 6-brønn plater) eller 25 μL (for 8-brønn kammer lysbilder) av redusert serum medium for 5 min ved RT. Deretter kombinere dem for å generere DNA-lipid kompleks og ruge i 20 min.
    2. Erstatt kultur mediet med 2 mL (for 6-brønn plater) eller 250 μL (for 8-brønn kammer sklier) av friskt komplett kultur medium. Tilsett DNA-lipid-komplekset til cellene og ruge ved 37 ° c over natten.
  3. Alternativt, transfect DNA med kationiske reagens polyethylenimine (PEI).
    1. Bland 2 mikrogram DNA og 6 μL av PEI med 200 μL av komplett kultur medium (for hver brønn i 6-brønn plater), eller 1 mikrogram DNA og 3 μL av PEI med 100 μL av komplett kultur medium (for hver brønn i 8-brønn kammer slides) , Vortex og ruge i 10 minutter ved RT.
    2. Legg blandingen til cellene og tilsett 1,8 mL komplett kultur medium per brønn i 6-brønn plater eller 150 μL av komplett kultur medium per brønn i 8-brønn kammer lysbilder å nå plating volum.
  4. Endre mediet dagen etter transfeksjoner og Legg til differensiering Media som beskrevet i trinn 2,2.

5. Immunofluorescence

  1. Fjern kultur mediet og skyll cellene med 1x PBS. Fix celler med 100% iskald metanol i 3 minutter uten risting. Fjern feste løsningen og vask kort med 1x PBS.
  2. Permeabilize med 0,1% ikke-ioniske overflateaktivt middel i 1x PBS i 5 min ved romtemperatur (RT). Skyll kort med 1x PBS, 3 ganger.
  3. Ruge celler med blokkering buffer (0,1% mellom 20 og 1% BSA i PBS) for 30 min ved RT på en orbital shaker.
  4. Ruge med egnede primære antistoffer (f. eks, mus monoklonale anti-Tau13 antistoff) fortynnet 1:500 i blokkering buffer over natten ved 4 ° c på en orbital shaker. Fjern antistoff oppløsningen og vask, kort, med 1x PBS.
  5. Ruge med sekundære antistoffer som bøyes likt til fluoroforen (f. eks, geit anti-mus antistoffer bøyd til Alexa fluor 633) fortynnet 1:500 i blokkering buffer for 1 time ved RT. Fjern antistoff oppløsningen og vask kort med 1x PBS 3 ganger.
  6. Å flekk kjerner, ruge med DAPI fortynnet 1:20000 i blokkering buffer i 10 min ved RT. vask med 1x PBS 3 ganger. Monter coverslips på et lysbilde ved hjelp av Antifade festemiddel.

sjette Western Blot

  1. For å samle cellen pellet fra trinn 4,4, fjerne medium, og vaske celler med PBS. Ruge med 500 μL av 0,1% Trypsin i 4 min ved 37 ° c. Legg til et lik volum av komplett medium og resuspend celler.
  2. Samle celler i et rør og sentrifuger på 500 x g i 5 min. På slutten av sentrifugering forsiktig fjerne supernatanten. Tilsett 1 mL PBS, sentrifuger på 500 x g i 5 min og forsiktig fjerne supernatanten. Oppbevar celle pellets på is for umiddelbar bruk eller Frys ved-80 ° c for langtidslagring.
  3. For total protein ekstrakter, ruge celle pellet i 30 min på isen i lyseringsbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glyserol, 1% octylphenoxy Poly (ethyleneoxy) etanol, utvidet (tabell over materialer), 10 mm EDTA) supplert med protease og fosfatase hemmere. I henhold til den overflod av pellet, bruk 50 μL til 100 μL av lyseringsbuffer.
    1. Sentrifuger ekstraktet på 16 000 x g i 15 min. samle supernatanten og kvantifisere protein konsentrasjonen av noen standard kvantifisering analysen. Klargjør protein prøvene for SDS-side ved å blande 20 mikrogram proteiner med 5 μL av 4X Laemmli buffer i et total volum på 20 μL og kok ved 100 ° c i 5 min.
      Merk: Prøven kan oppbevares ved-20 ° c.
  4. For subcellulære fraksjoneringer, resuspend celler fra trinn 6,2 i komplett medium, og samle 1 x 106 celler per hver prøve. Sentrifuger på 500 x g for 10 min for å få celle pellets for følgende trinn.
    1. For å isolere subcellulære rom, fractionate i henhold til Kit spesifikasjoner. For å isolere hver brøk, ruge celle pellet fra trinn 6,4 med tilsvarende buffer, sentrifuger, samle supernatanten og tilsett neste buffer til pellet som beskrevet i 6.4.1.1-6.4.1.5. Legg for cytoplasmatiske utvinning buffer, membran utvinning buffer, kjernefysisk utvinning buffer, kjernefysisk utvinning buffer supplert med 5 mM CaCl2 og 3 U/μL micrococcal nuklease og cytoskjelettkomponenter utvinning buffer.
      Merk: Alle buffere må suppleres med protease hemmere. Skaler buffer volumer i henhold til volumet på celle pellet.
      1. For å isolere cytosolic fraksjon, ruge celle pellets i 100 μL av iskald cytoplasmatiske ekstraksjon buffer supplert med protease hemmere ved 4 ° c med skånsom miksing i 10 min. sentrifuger ved 500 x g ved 4 ° c i 5 min og Overfør supernatanten til pre-kjølt rør.
      2. Tilsett 100 μL av kjøle membran avsugs buffer supplert med protease hemmere til pellet fra trinn 6.4.1.1, og ruge ved 4 ° c med skånsom miksing i 10 min. sentrifuger ved 3 000 x g ved 4 ° c i 5 min og samle supernatanten.
      3. For løselig kjernefysisk brøkdel, tilsett 50 μL av kjernefysisk utvinning buffer supplert med protease hemmere til pellet fra trinn 6.4.1.2, og Vortex. Ruge ved 4 ° c i 30 min, sentrifuger ved 5 000 x g ved 4 ° c i 5 min, og samle supernatanten.
      4. For uløselig kjernefysisk brøkdel, tilsett 50 μL av kjernefysisk utvinning buffer supplert med protease hemmere, CaCl2 og micrococcal nuklease til pellet fra trinn 6.4.1.3, og Vortex. Ruge ved 37 ° c i 5 min, og deretter Vortex igjen. Sentrifuger på 16 000 x g ved RT for 5 min og samle supernatanten.
      5. For den cytoskjelettkomponenter fraksjonen, tilsett 50 μL av cytoskjelettkomponenter utvinnings buffer supplert med protease hemmere til pellet fra trinn 6.4.1.4, og Vortex. Ruge 10 min ved RT. sentrifuger røret ved 16 000 x g i 5 min, samle supernatanten og kast pellet.
        Merk: Skaler buffer volumer i henhold til celle volumet, som angitt i sett protokollen. Se Kit-protokollen for mer informasjon om inkubasjons og sentrifugering tid og temperatur22,23,24,25,26,27,28,29. Alternativt kan du bruke standard metoder30 som, ved hjelp av vaskemidler og ved å øke ioniske styrke og sentrifugering hastighet, skiller cytosolic, membranen-bundet, cytoskjelettkomponenter og kjernefysiske fraksjoner. Skill den løselige kjernefysiske fraksjonen og den uløselig kjernefysiske fraksjonen ved å utnytte vanlige, kjernefysiske utvinnings buffere. Prøven kan oppbevares ved-20 ° c.
    2. For SDS-side, tilsett 7 μL av 4X Laemmli buffer til 20 μL av subcellulære fraksjoner innhentet fra trinn 6.4.1.1 − 6.4.1.5, kok ved 100 ° c i 5 min.
  5. Last prøvene på en akrylamid gel og utfør elektroforese med en konstant spenning på 120 V. Overfør proteiner til nitrocellulose membran ved 250 mA for 90 min.
  6. Sjekk riktig protein gel elektroforese og vellykket blotting ved incubating membranen i 5 min i Ponceau farging løsning. Skyll membranen i destillert vann til bakgrunnen er ren. Fjern flekken ved å fortsette å vaske med Tris bufret saltvann med mellom 20 (TBST) i 10 minutter på en shaker.
  7. Ruge membranen med blokkerings løsning (5% melk i TBST) for 1 time ved RT på shaker. Vask 3 ganger med TBST i 5 minutter.
  8. Hybridize membranen med det primære antistoff i blokkerings løsning (1% melk i TBST) over natten ved 4 ° c. Vask 3 ganger med TBST i 5 minutter.
  9. Hybridize membranen med det HRP-bøyd sekundære antistoff i blokkerings løsning for 1 time ved RT. vask 3 ganger med TBST i 5 minutter.
  10. Oppdag protein båndet ved hjelp av kjemiluminescens. Kvantifisere intensiteten av Western Blot band av ImageJ. Normalisere protein uttrykk på produktet av et housekeeping gen: histone H2B for kjernefysisk løselig og uløselig brøk, GAPDH for cytoplasmatiske brøkdel og for total ekstrakter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Strategien brukes til å analysere virkningen av kjernefysiske tau i genet uttrykk unngå bidrag av cytoplasmatiske tau proteiner har blitt avbildet i figur 1. Kort, tau proteiner merket med NLS eller NES er akkumulert i eller ekskludert fra kjernefysiske rommet, henholdsvis. Den funksjonelle effekten av denne ubalanse er endring av genuttrykket målt som produktet av VGluT1-genet.

Etter protokollen beskrivelse, SH-SY5Y celler ble behandlet med RA i 5 dager og deretter med BDNF for 3 dager for å få post-mitotisk Nevron-lignende celler (figur 2). I fravær av RA og BDNF, udifferensierte SH-SY5Y celler anta en avrundet morfologi og danner celle klumper. Som forventet, starter differensiering protokollen, klumper slappe av og celler spredt ut neurites; ved slutten av differensiering, er celler jevnt fordelt og sammenkoblet via et nettverk av neurites.

Dagen etter seeding, har celler blitt transfekterte med tau-NLS eller tau-NES plasmider (§ 4,2) med kationiske lipider. For celler som uttrykker tau-NLS eller tau-NES konstruksjoner, kan tau subcellulære lokalisering oppdages av immunofluorescence med anti-tau antistoffer. Avhengig av effektiviteten av transfeksjoner, cellene vise en sterk kjernefysisk farging sammenslåing med DAPI signal eller en cytoplasmatiske farging med tomme kjerner hvis de er vellykket transfekterte med tau-NLS eller tau-NES, henholdsvis (Figur 3). Mangelen på disse spesifikke signalene indikerer en ineffektiv transfeksjoner.

For å analysere proteiner beriket med forskjellig subcellulære rom ble celler samlet og telt opp for å behandle like mengder celler per prøve. Enhver standard fraksjonering metode som utnytter økende vaskemiddel og ioniske styrke og økende sentrifugering hastighet kan brukes til å skille mobilnettet rom fra hverandre og dermed isolere cytosolic, membranen-bundet, den cytoskjelettkomponenter og kjernefysiske fraksjoner.

Når kjernene er isolert, ble den kjernefysiske oppløselige fraksjonen og kromatin bundet brøk separert ved å tilsette 3 U/μL av micrococcal nuklease og 5 mM CaCl2.

For Western Blot-analyser har like volumer av cytoplasmatiske og membran brøker og halv volumer av de andre fraksjonene blitt lastet på en gradient prefabrikerte akrylamid gel, for å korrigere for den forskjellige mengden buffer som tilsettes på hvert trinn.

For å verifisere den effektive separasjon av ulike fraksjoner, har Western Blot utnytte følgende antistoffer er utført: anti-GADPH (tilstede i alle fraksjoner unntatt cytoskeleton og spesielt beriket i cytoplasmatiske brøkdel); anti-utgangen (spesielt beriket i cytoskjelettkomponenter brøkdel); anti-tubulin (spesielt beriket med cytoplasmatiske og cytoskjelettkomponenter fraksjoner); anti-H2B (beriket i kjernefysiske fraksjoner) (Figur 4).

En berikelse av disse markørene i forskjellige subcellulære fraksjoner indikerer at fraksjonering ikke er godt utført. Det må bemerkes at enhver protokoll for subcellulære fraksjonering kan presentere en 10-15% av forurensning mellom fraksjoner.

Når bekreftet den vellykkede fraksjonering av prøven, har Western Blot blitt utført for å sjekke signalet av tau i Atom rommet og VGluT1 signalet i det totale ekstrakt (figur 5). Mens umerkede tau er synlig i alle fraksjoner, er tau-NLS sterkt beriket i det kjernefysiske rommet og det er dårlig synlig i cytoplasmatiske brøkdel. I motsetning til dette, er tau-NES beriket i cytoplasmatiske brøkdel og det er mindre synlig i den kjernefysiske fraksjonen. Tilstedeværelsen av en liten mengde tau-NES i løselig kjernefysiske brøkdel må forventes siden, som endogene tau, er det translocated inn i kjernen og en gang inn i kjernefysiske kupeen Atom eksport signalet tillater sin translokasjon til cytoplasma. Påvisning av en annen berikelse for disse to Fusion proteiner kan tyde på et problem i effektiviteten av transfeksjoner eller i kloning av konstruksjoner eller i fraksjonering.

Kvantitativ analyse av Western Blot kan gjøres ved hjelp ImageJ. Verdiene er normalisert for housekeeping genet spesifikke for hver brøkdel (GAPDH for cytoplasmatiske brøkdel; histone H2B for løselig kjernefysiske og kromatin-bundet fraksjoner).

Grafen i figur 5B rapporterer forholdet mellom tau i den oppløselige kjernefysiske fraksjonen og cytoplasmatiske fraksjon for å FREMHEVE at tau-NLS er høyt beriket i den OPPLØSELIGE kjernefysiske fraksjonen (SNF), mens tau-NES er redusert. I tillegg er tau-NLS beriket i den kromatin fraksjonen (CBF) med hensyn til cytoplasmatiske fraksjon (CF), mens tau-NES er redusert. SNF/CF = 1 og CBF/CF = 1 tilsvarer tau ratio i kontroll celler. Den endogene tau er svakt synlig i alle fraksjoner som forventet. Grafen i figur 5C rapporter kvantifisering av VGluT1 uttrykk i den totale utdrag av prøvene uttrykker ulik mengde kjernefysiske tau. I celler som uttrykker tau-NES, kan VGluT1 uttrykk sammenlignes med grunnlinje uttrykket i kontroll celler. Tvert imot, i celler uttrykker umerkede tau eller tau-NLS, er uttrykket av VGluT1 mer enn doblet.

Figure 1
Figur 1: grafisk representasjon av strategien som brukes til å tillate en kjernefysisk eller en cytoplasmatiske akkumulering av tau. Tau-NLS akkumuleres i det kjernefysiske rommet, mens tau-NES er ekskludert. Den eksperimentelle avlesning er modulering av VGluT1 uttrykket. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representative udifferensierte og differensiert cellekultur. Bilde av udifferensierte SH-SY5Y (venstre), celler differensiert av RA (midten) og differensiert av RA og BDNF (høyre). Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: representative bilde av tau subcellulære berikelse av immunofluorescence. Bilde av celler untransfected eller uttrykker umerkede tau, tau-NES eller tau-NLS konstruksjoner. Tau signalet er innhentet av immunofluorescence (rød), kjerner signalet er innhentet av DAPI farging (blå), fusjonerte bilder rapporteres. Scale bar = 10 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: representativ påvisning av proteiner beriket med subcellulære fraksjoner av Western Blot. Western Blot av subcellulære fraksjoner fra SH-SY5Y celler. CF = cytoplasmatiske brøkdel; MF = membran brøkdel; SNF = løselig kjernefysisk fraksjon; CBF = kromatin bundet brøk; CKF = cytoskjelettkomponenter brøk. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: representant deteksjon av kjernefysiske tau og VGluT1 proteiner. (A) Western Blot tau protein påvist i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner. (B) grafen rapporterer forholdet mellom tau i kjernefysiske fraksjoner og cytoplasmatiske brøkdel. Verdiene har blitt normalisert på endogene tau. SNF/CF = 1 og CBF/CF = 1 tilsvarer endogene tau ratio i kontroll celler. (C) Western Blot av VGluT1 protein. (D) grafen rapporterer kvantifisering av VGluT1 uttrykk i den totale utdrag av prøvene uttrykker ulik mengde kjernefysiske tau. Kruskal-Wallis ANOVA og mann-Whitney test; p < 0,001, * * * * p < 0,0001, n.s. p > 0,05. Alle resultatene er vist som gjennomsnittet ± SEM fra minst tre uavhengige eksperimenter. Denne representative figuren er blitt modifisert fra Siano et al.31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi beskriver en metode for å måle effekten av kjernefysiske tau protein på genuttrykk. Med denne protokollen er bidraget fra cytoplasmatiske tau sterkt begrenset. Kritiske trinn i denne protokollen er følgende: differensiering av menneskelige neuroblastom SH-SY5Y celler, subcellulære fraksjonering og lokalisering av tau protein i kjernefysiske kupé.

Først som vist i representative resultater delen, differensiering av SH-SY5Y celler ved å legge RA og BDNF er avgjørende for å få en god forberedelse av Nevron-lignende celler i kulturen. Tettheten av celler seeded er spesielt viktig siden en lavere tetthet kan påvirke celle spredning. Videre, for eksperimenter som trenger et høyt antall celler, som mobilnettet fraksjonering og Western Blot, er det viktig å merke seg at BDNF differensiering trinn blokkerer mobilnettet spredning å tillate terminalen differensiering, og dermed begrense antall celler i kulturen. Alternative differensiering protokoller bruker bare RA eller NGF stedet for BDNF. Men mens du legger til BDNF etter ra gjør det mulig å nå en bedre morfologiske differensiering32,33, NGF induserer en svakere neurite utvekst i sh-SY5Y celler34. Videre har det blitt grundig demonstrert at kombinasjonen av RA og BDNF gjør det mulig å oppnå en homogen neuronal befolkning med uttrykk for neuronal markører og redusert spredning35. Av denne grunn, den differensiering protokollen utnyttes her kombinerer RA og BDNF.

Imidlertid, fremgangsmåten rapportere å analysere rollen av tau inne annerledes subcellulære avdelinger kan brukes likeledes for udifferensierte celler eller for annerledes cellen typer.

Det subcellulære fraksjonering er en meget betenkelig steg ogDet er avgjørende å ha nok igangsetting materiale: en reklamen utstyr behøver bare 1 x 106 celler, mens derimot annet prosedyrer kanskje nød en mange høyere igangsetting kvantum. I tillegg garanterer bruk av et sett med standard buffere og trinn reproduserbarhet for eksperimentet som er uunngåelig og avgjørende. Men siden sammensetningen av buffere er ofte proprietær, de kan inneholde vaskemidler som kan endre funksjonen av protein av interesse og det kan være vanskelig å optimalisere isolering av fraksjoner. Dessuten, selv i beste stand, kan det være en 10-15% av forurensning mellom fraksjoner. En dårlig avkastning fra hver brøkdel kan overvinnes ved å øke inkubasjonstid i utvinning buffere av bestemte fraksjoner.

Siden funksjonene til kjernefysiske tau har fått betydelig interesse de siste årene, er det spesielt viktig å gi en pålitelig metode for å analysere funksjonen til tau i ulike cellulære rom. Kopling av subcellulære fraksjonering, med uttrykk for tau konstruerer spesielt rettet eller ekskludert fra kjernen, gjør det mulig å finjustere mengden tau i forskjellige rom.

Et kritisk skritt i denne delen av protokollen er kloning av tau merket med kjernefysisk lokalisering signal eller med kjernefysiske eksport signal. Effektiviteten til NLS garanteres av tilstedeværelsen av en 3XNLS konsensus sekvens fra SV40-viruset. Den kjernefysiske translokasjon av proteinet kan lett kontrolleres av immunofluorescence, og mangelen på signalet inn i kjernen kan skyldes en feil kloning eller til en ineffektiv transfeksjoner. Tvert imot, det kjernefysiske eksport er garantert av NES konsensus sekvensen. I dette tilfellet tillater immunofluorescence kontroll av eksport av tau fra kjernen. Imidlertid er en svak kjernefysisk signal ikke utelukkes siden tau-NES protein kommer inn i kjernen og deretter, på grunn av NES-sekvensen, er det eksportert til stoffer.

Inntil nå, funksjonen av kjernefysiske tau har blitt studert bare ved correlative tilnærminger som ikke forsikrer sin direkte engasjement. Protokollen her er beskrevet, gir den første tilnærmingen tillater å klart diskriminere den spesifikke funksjonen til tau inn i kjernefysiske kupé. Som tidligere demonstrert, den endogene tau påvirker ikke resultatene som oppnås ved denne protokollen. Faktisk, det samme eksperimentet utføres i ikke-neuronal celler som ikke uttrykker endogene tau, fører til VGluT1 endret uttrykk. Vi brukte denne protokollen for å studere uttrykk for sykdom-relaterte gener31. Anyhow, kan det utnyttes også til å undersøke andre kjernefysiske tau funksjoner, for eksempel involvering på DNA-skade, samspillet med kjernefysiske kofaktorer eller med kromatin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Scuola normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG Life Technologies A21050 IF 1:500
anti Actin Antibody BETHYL LABORATORIE A300-485A anti-rabbit WB 1:10,000
anti GAPDH Antibody Fitzgerald Industries International 10R-G109a anti-mouse WB 1:10,000
anti H2B Antibody Abcam ab1790 anti-rabbit WB 1:15,000
anti Tau-13 Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-21796 anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500
anti Tubulin alpha Antibody Thermo Fisher Scientific PA5-16891 anti-mouse WB 1:5,000
anti VGluT1 Antibody Sigma-Aldrich AMAb91041 anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay Kit Euroclone EMPO14500
BDNF Alomone Labs B-250
Blotting-Grade Blocker Biorad 1706404 Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMIN Sigma-Aldrich A4503-50g
cOmplete Mini Roche 11836170001 protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 well Biorad 5678093
DAPI Thermo Fisher Scientific 62247
DMEM/F-12 GIBCO 21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose Euroclone ECM0060L
EDTA Sigma-Aldrich 0390-100ml pH = 8, 0.5 M
Foetal Bovine Serum Euroclone EC50182L
Glycerol Sigma-Aldrich G5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2005 WB 1:1,000
Goat anti-rabbit IgG-HPR Santa Cruz Biotechnology sc-2004 WB 1:1,000
IGEPAL CA-630 Sigma-Aldrich I8896-50ml Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon Western MERCK WBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slide nunc 177402
L-glutamine Euroclone ECB3000D 100X
Lipofectamine 2000 transfection reagent Thermo Fisher Scientific 12566014 cationic lipid
Methanol Sigma-Aldrich 322415-6X1L
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266-100G
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1kg
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
PEI Sigma-Aldrich 40,872-7
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 10,000 U/mL, 100 mL
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) OXOID BR0014G
PhosStop Roche 4906837001 phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi Kit Qiagen 12163 Step 3.10
Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cells Thermo Fisher Scientific 78840
Supported Nitrocellulose membrane Biorad 1620097
TC-Plate 6well SARSTEDT 833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscope Leica N/A
Triton x-100 Sigma-Aldrich X100-500ml Non-ionic surfactant
Trypsin-EDTA Thermo Fisher Scientific 15400054 0.50%
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification Systems Promega A1330 Step 3.5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , Intechopen. (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells? Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

Tags

Genetikk kjernefysiske tau differensiert SH-SY5Y kjernefysiske fraksjoner lokalisering signaler subcellulære fraksjonering Western Blot
Modulering av tau Subcellulære lokalisering som et verktøy for å undersøke uttrykk for sykdom-relaterte gener
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco,… More

Siano, G., Caiazza, M. C., Varisco, M., Calvello, M., Quercioli, V., Cattaneo, A., Di Primio, C. Modulation of Tau Subcellular Localization as a Tool to Investigate the Expression of Disease-related Genes. J. Vis. Exp. (154), e59988, doi:10.3791/59988 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter