Enkelt celle Durotaxis analyse til vurdering mekanisk kontrol af cellulære bevægelse og relaterede signalering begivenheder
Summary
Mekaniske kræfter er vigtige for at kontrollere celle migration. Denne protokol demonstrerer brugen af elastiske silicagelrogeler, der kan deformeres ved hjælp af en glas mikropipette og en micromanipulator for at stimulere celler med en lokal stivhed gradient til at fremkalde ændringer i cellestruktur og migration.
Abstract
Durotaxis er den proces, hvorved cellerne fornemmer og reagerer på gradienter af spændinger. For at studere denne proces in vitro, skal stivheden af substratet underliggende en celle manipuleres. Mens silicagelrogeler med gradueret stivhed og langtids migration assays har vist sig nyttige i durotaxis undersøgelser, umiddelbare, akutte reaktioner på lokale ændringer i substrat spændinger tillader fokuseret undersøgelse af individuelle celle bevægelser og subcellulære signalering begivenheder. For at gentage test af cellernes evne til at fornemme og reagere på den underliggende substrat stivhed anvendes en modificeret metode til anvendelse af akutte stigninger i øget spænding til individuelle celler, der dyrkes på deformerbare silicagelrogeler, hvilket giver mulighed for realtid manipulation af styrken og retningen af stivhed gradienter skiltes på celler pågældende. Ved finjustering af analysens detaljer og parametre, såsom mikropipettens form og dimensioner eller den relative placering, placering og retning af den anvendte gradient, kan analysen desuden optimeres til studiet af enhver mekanisk følsom celletype og system. Disse parametre kan ændres til pålideligt at ændre den anvendte stimulus og udvide funktionaliteten og alsidigheden af analysen. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af både langsigtede durotaktisk bevægelse samt mere umiddelbare ændringer i cellulære signalering og morfologiske dynamik som reaktion på skiftende stivhed.
Introduction
I løbet af de sidste par årtier har betydningen af de mekaniske egenskaber af en celles miljø vundet stigende anerkendelse i cellebiologi. Forskellige væv og ekstracellulære matricer har forskellige relative stivhed og, som celler migrere i hele kroppen, de navigerer disse ændringer, ved hjælp af disse mekaniske egenskaber til at vejlede dem1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. cellerne bruger stivheden i et givet væv til at informere deres motile sædceller adfærd under processer som udvikling, sårheling og kræft metastaser. De molekylære mekanismer, der giver mulighed for at føle og reagere på disse mekaniske indgange, er dog stort set ukendte1,2,3,4,5, 6 , 7.
For at studere de mekanismer, hvorigennem cellerne reagerer på fysiske Miljøsignaler, skal stivhed eller stivhed af substratet underliggende celler manipuleres. I 2000 udviklede Chun-min Lo, Yu-Li Wang og kollegaer en assay8 , hvorved en individuel celles motile sædceller respons på skiftende mekaniske signaler kunne testes direkte ved at strække deformerbare ekstracellulære matrix (ECM)-belagt polyacrylamid silicagelrogeler, som cellerne blev belagt på. Celler udviser en betydelig præference for at migrere mod stivere substrater, et fænomen, de døbt “durotaxis.”
Siden den oprindelige rapport i 2000, mange andre teknikker har været ansat til studiet af durotaxis. Stejle stivhed gradienter er blevet fremstillet ved støbning geler over stive funktioner såsom polystyren perler9 eller stiv polymer stillinger10 eller ved polymeriserende substrat omkring kanterne af et glas dæksedler11 at skabe mekaniske ‘ trin-grænser «. Alternativt, silicagelrogeler med lavvandede men faste stivhed gradienter er blevet fremstillet af en række forskellige metoder såsom gradienter af krydsbinderens skabt af mikrofluidisk enheder12,13 eller side-by-side hydrogel opløsning dråber af forskellig stivhed8, eller silicagelrogeler med foto aktiv krydsbinderens behandlet med klassificeret UV lys eksponering for at skabe en lineær stivhed gradient14,15. Disse teknikker er blevet brugt til stor effekt til at undersøge durotaktisk cellulære bevægelse en masse over tid. Men, typisk disse funktioner er fremstillet i forvejen af celle plating og deres egenskaber forbliver konsekvent i løbet af eksperimentet, afhængige af tilfældige celle bevægelse for prøvetagning af mekaniske gradienter. Ingen af disse teknikker er modtagelig for observation af hurtige ændringer i cellulære adfærd som reaktion på akut mekanisk stimulus.
For at observere cellulære reaktioner på akutte ændringer i det mekaniske miljø, enkelt celle durotaxis assays tilbyder flere fordele. I disse analyser får individuelle celler en akut, mekanisk stimulus ved at trække det underliggende substrat væk fra cellen med en glas mikropipette, hvorved der indføres en retningsbestemt gradient af cellematrix spændinger. Ændringer i den motile sædceller adfærd, såsom hastighed eller retning af migration, er derefter observeret af levende celle fasekontrast mikroskopi. Denne fremgangsmåde letter direkte observation af årsag og virkning forholdet mellem mekaniske stimuli og celle migration, da det giver mulighed for hurtig, iterativ manipulation af retningen og størrelsen af spændings gradient og vurdering af deraf følgende cellulære svar i realtid. Desuden kan denne metode også anvendes til mekanisk stimulering af celler, der udtrykker fluorescerende fusions proteiner eller biosensorer, for at visualisere ændringer i mængden, aktiviteten eller den subcellulære lokalisering af proteiner, der mistænkes for at være involveret i mekaniserende og durotaxis.
Denne teknik har været anvendt af grupper, der studerer durotaxis8,16 og er beskrevet her, da det er blevet tilpasset af Howe Laboratory til at studere durotaktisk opførsel af skov-3 ovariecancerceller og de molekylære mekanismer, der bagvedlig durotaxis17. Derudover beskrives en modificeret metode til fremstilling af silicagelrogeler med et enkelt, jævnt lag af fluorescerende mikrosfærer nær celle kulturens overflade; Dette letter visualisering og optimering af mikropipette genererede stamme gradienter og kan tillade vurdering af celle kontraktilitet ved trækkraft mikroskopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Demonstreret her er en gentagelig, enkelt celle durotaxis assay, der giver mulighed for vurdering af en celles evne til at ændre sin migration adfærd som reaktion på akutte mekaniske signaler. Denne teknik kan også anvendes i kombination med Fluorescens mikroskopi og passende fusions proteiner eller biosensorer til at undersøge subcellulære signalering og cytoskeletale hændelser inden for sekunder af mekanisk stimulation eller over en længere tidshorisont under durotaktisk bevægelse. Forståelse af en celles for…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
