Summary
Механические силы имеют важное значение для контроля миграции ячеек. Этот протокол демонстрирует использование эластичных гидрогелей, которые могут быть деформированы с помощью стеклянного микропипетика и микроманипулятора, чтобы стимулировать клетки с локальным градиентом жесткости, чтобы вызвать изменения в структуре клеток и миграции.
Abstract
Дуротаксис – это процесс, с помощью которого клетки ощущают и реагируют на градиенты напряжения. Для того, чтобы изучить этот процесс in vitro, жесткость субстрата, лежащего в основе клетки, должна быть обработана. В то время как гидрогели с градуированной жесткостью и долгосрочными миграционными анализами оказались полезными в исследованиях durotaxis, немедленные, острые реакции на локальные изменения в напряжении субстрата позволяют целенаправленно изучать отдельные движения клеток и субклеточные сигнальные события. Для повторного тестирования способности клеток чувствовать и реагировать на тонус поддвижного субстрата используется модифицированный метод применения острых градиентов повышенного напряжения к отдельным клеткам, культивируемым на деформируемых гидрогелях, что позволяет в режиме реального времени манипуляции силы и направления жесткости градиентов, привитых на клетки в вопросе. Кроме того, путем тонкой настройки деталей и параметров исследования, таких как форма и размеры микропипетты или относительное положение, размещение и направление прикладного градиента, анализ может быть оптимизирован для изучения любого механически чувствительный тип клеток и система. Эти параметры могут быть изменены, чтобы надежно изменить прикладной стимул и расширить функциональность и универсальность асссе. Этот метод позволяет изучить как долгосрочные дуротаксические движения, а также более непосредственные изменения в клеточной сигнализации и морфологической динамики в ответ на изменение жесткости.
Introduction
За последние несколько десятилетий, важность механических свойств среды клетки получила все большее признание в клеточной биологии. Различные ткани и внеклеточные матрицы имеют различные относительные скованности и, как клетки мигрируют по всему телу, они перемещаются эти изменения, используя эти механические свойства, чтобы направлять их1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. Клетки используют жесткость данной ткани, чтобы сообщить их подвижное поведение во время процессов, таких как развитие, заживление ран, и метастазы рака. Тем не менее, молекулярные механизмы, которые позволяют ощущение и ответ на эти механические входы остаются в значительной степени неизвестны1,2,3,4,5, 6 , 7.
Для того, чтобы изучить механизмы, с помощью которых клетки реагируют на физические экологические сигналы, жесткость или жесткость подстилающих клеток адепта должны быть манипулированы. В 2000 году Чун-Мин Ло, Yu-Li Wang и его коллеги разработали асссс8, в соответствии с которым мотовый ответ отдельных клеток на изменение механических сигналов может быть непосредственно протестирован путем растяжения деформируемой внеклеточной матрицы (ECM) с покрытием полиакриламид гидрогели, на которых были покрыты клетки. Клетки демонстрируют значительное предпочтение для миграции в сторону более жестких субстратов, явление, которое они окрестили "durotaxis".
После первоначального доклада в 2000 году для изучения дуротаксиса были использованы многие другие методы. Крутые градиенты жесткости были изготовлены путем литья гелей над жесткими функциями, такими как полистирол бусы9 или жесткие полимерные столбы10 или путем полимеризации субстрата по краям стеклянных крышки11 для создания механических ' шаг-границы. Кроме того, гидрогели с более мелкими, но фиксированными градиентами жесткости были изготовлены различными методами, такими как градиенты кросслинкера, созданные микрофлюидными устройствами12,13 или бок о бок каплями гидрогеля различной жесткости8, или гидрогелей с фотореактивным кросслинкером, обработанным с градуированным воздействием УФ-излучения для создания линейного градиента жесткости14,15. Эти методы были использованы для большого эффекта для исследования durotactic клеточного движения в массовом порядке с течением времени. Однако, как правило, эти функции изготавливаются до клеточного покрытия и их свойства остаются последовательными в течение эксперимента, полагаясь на случайное движение клеток для выборки механических градиентов. Ни один из этих методов поддаются наблюдению быстрых изменений в клеточном поведении в ответ на острый механический стимул.
Для того, чтобы наблюдать клеточной реакции на острые изменения в механической среде, одиночные анализы durotaxis ячейки предлагают несколько преимуществ. В этих анализах, отдельные клетки даны острый, механический стимул, потянув основной субстрат от клетки со стеклянной микропипеткой, тем самым вводя направленный градиент клеточной матрицы напряженности. Изменения в поведении подвижного, такие как скорость или направление миграции, затем наблюдаются с помощью контрастной микроскопии фазы живых клеток. Такой подход облегчает прямое наблюдение причинно-следственной связи между механическими стимулами и миграцией клеток, поскольку позволяет быстро, итеративное манипулирование направлением и величиной градиента напряжения и оценку последующего сотовых реакций в режиме реального времени. Кроме того, этот метод может также использоваться для механически стимулирующих клетки, выражающие флуоресцентные белки синтеза или биосенсоры, чтобы визуализировать изменения в количестве, активности или субклеточной локализации белков, подозреваемых в участии в механосенсировании и дюротаксис.
Этот метод был использован группами, которые изучают durotaxis8,16 и описывается здесь, как он был адаптирован лабораторией Хоу для изучения дуротаксического поведения sKOV-3 раковых клеток яичников и молекулярных механизмов, которые под дуротаксис17. Кроме того, описан модифицированный метод изготовления гидрогелей с одним, ровным слоем флуоресцентных микросфер вблизи поверхности клеточной культуры; это облегчает визуализацию и оптимизацию микропайпетов генерируемых градиентов деформации и может позволить оценку сотруднности клеток с помощью микроскопии силы тяги.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление деформируемых гидрогелей полиакриламида со встроенными флуоресцентными микросферами
ПРИМЕЧАНИЕ: Направления описывают полимеризацию гидрогеля 25 кПа диаметром 22 мкм и толщиной около 66 мкм. Каждый или все эти параметры могут быть изменены и направления для этого можно найти в таблице 1 и в примечаниях17.
- Активация стеклянно-нижней посуды или чехлы
- Подготовьте связывающее силанное рабочее решение для активации стеклянного дна, в котором можно сделать визуализацию, или крышку, которая вписывается в живую камеру изображения. Смешайте 950 л 95% этанола, 50 л ледниковой уксусной кислоты и 5 л связующего силана (y-methacryloxypropyltrimthoxysilane).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование большего нижнего coverslip по сравнению с верхней coverslip даст дополнительную возможность для работы при подготовке геля и облегчит позиционирование стеклянного микропайпета в более поздних шагах. Кроме того, при использовании coverslip, а не стеклянное дно изображений блюдо, очистить крышку, как описано в следующем разделе. - Активируйте поверхность стекла на 20 с коронарной палочкой и немедленно накладывай 50 зл на связующего силана рабочего раствора. Дайте раствору высохнуть в течение 10 мин.
- Промыть два раза с 95% этанола, затем два раза с изопропанол, а затем позволить coverslips к airdry в течение примерно 20 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Активированное стекло может храниться до одной недели в desiccator.
- Подготовьте связывающее силанное рабочее решение для активации стеклянного дна, в котором можно сделать визуализацию, или крышку, которая вписывается в живую камеру изображения. Смешайте 950 л 95% этанола, 50 л ледниковой уксусной кислоты и 5 л связующего силана (y-methacryloxypropyltrimthoxysilane).
- Очистка верхних крышки
- Очистите 22 мм верхние крышки, инкубируя в 2% HCl при 70 градусах по Цельсию в течение 30 минут, затем промойте в ddH2O в течение 10 минут два раза.
- Инкубировать крышки в растворе 2% кювет очистки концентрата в ddH2O при 50 градусах по Цельсию в течение 30 мин, затем мыть в ddH2O в течение 10 мин два раза.
- Инкубировать крышки в ddH2O при 90 градусах по Цельсию в течение 30 мин, затем в 70% этанола при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин, а затем высушите воздух при 60 градусах по Цельсию в течение как минимум 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные крышки могут храниться бесконечно в чистом обезвращенном.
- Флуоресцентная микросфера/осаждение биса на верхние крышки
- Сосновкация стокового раствора флуоресцентных микросфер на 1 ч в ультразвуковой водяной бане. Сделать рабочий раствор биса путем разбавления биса бульон 1:200 в 100% этанола и sonicate снова в течение 1 ч.
- 15 мин до раствора бисины закончил sonicating, тщательно очистить крышки, поместив их вертикально в керамический держатель крышки и лечения комнатно-воздушной плазмы в течение 3 минут в столешнице плазмы чище.
- Для облегчения обработки и предотвращения скольжения крышки во время последующих шагов, поместите кусок парафильма в 60 мм крышкой чашки Петри или аналогичный контейнер. Поместите крышку в стабилизатор и слегка нажмите вниз, обеспечивая хороший контакт между parafilm и coverslip.
- Для 22 мм coverslip, добавить 150 л рабочего раствора биса в верхней части coverslip. Немедленно аспирировать раствор этанола с борта coverslip, оставляя шарики на coverslip. Разрешить coverslip к airdry.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество добавленного раствора рабочего бисора должно быть 4 л/см2 и может быть уменьшено для размещения любого размера крышки.
- Гидрогели литья со встроенными флуоресцентными бусинами
- Приготовьте гидрогелевый раствор ариламида и бис-акриламид. Смешайте раствор в соответствии с таблицей 1, затем добавьте 2,5 л 10% APS и 0,5 л TEMED. Хорошо перемешать. Немедленно переходите к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь раствора гидрогеля может быть изменена, чтобы изменить модули молодых, или жесткость, гидрогеля, изменив соотношение акриламид бис-акриламид, как показано в таблице 1. Эти значения были проверены для использования в лаборатории Хоу с использованием атомной микроскопии силы, но должны быть подтверждены в своем учреждении. - Сразу же после приготовления раствора гидрогеля, добавить 25 л капли в активированную сторону стеклянно-нижней тарелки или нижней крышкой, а затем сразу же поместите бисером покрытием крышкой на раствор, бисером стороной вниз. Контакт капли с дальней стороны coverslip следуют медленного снижения помогает избежать захвата пузырьков воздуха в гидрогеле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высота гидрогеля должна быть в пределах рабочего расстояния объектива, который будет использоваться в более позднем эксперименте. Гидрогель высотой 66 мкм хорошо работает для большинства систем. Размер гидрогеля можно масштабировать, добавляя более или менее гидрогелевное решение в зависимости от размера крышки. Для расчета соответствующего объема раствора гидрогеля используйте уравнение для объема цилиндра, V q r2h, где r является радиусом крышки, а h - желаемой высотой гидрогеля. Как правило, этот расчет с достаточной точностью предсказывает фактическую высоту гидрогеля, измеряемой путем подготовки геля с покрытыми бисой крышками как сверху, так и снизу и с помощью конфокального микроскопа для измерения расстояния между двумя плоскостями биса. Однако было отмечено, что фактическая высота гидрогеля может отклоняться от этого расчета на 20 мкм (например, в зависимости от толщины и производителя верхнего стеклянного покрытия). Рекомендуется прямое измерение высоты геля с использованием описанного выше метода. - Разрешить гель полимеризации в течение 30 мин, а затем удалить верхний coverslip мягко с щипками. Добавление 50 мМ HEPES pH 8.5 к блюду может облегчить удаление. Вымойте в течение 5 мин в 50 мМ HEPES pH 8,5 три раза.
- Приготовьте гидрогелевый раствор ариламида и бис-акриламид. Смешайте раствор в соответствии с таблицей 1, затем добавьте 2,5 л 10% APS и 0,5 л TEMED. Хорошо перемешать. Немедленно переходите к следующему шагу.
- Активация гидрогеля и внеклеточное матричного покрытия
- Активировать поверхность гидрогеля путем инкубации в 0,4 мм Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино) гексаноат в 50 мМ HEPES pH 8.5. Немедленно подвергаемую воздействию ультрафиолетовую дуговую лампу в закрытой зоне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите Sulfo-SANPAH от света до активации. Для лампы 400 Вт, положение гель 10 см от лампы в световой коробке и осветить в течение 100 с. Раствор Sulfo-SANPAH будет меняться от ярко-оранжевого до темно-коричневого. - Вымойте в течение 5 мин в 50 мМ HEPES pH 8,5 три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гидратированные гели могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение одной недели. - Инкубировать активированный гидрогель в 20 мкг/мл фибронектина в 50 мм HEPES pH 8.5 на 1 ч при 37 градусах Цельсия.
- Аспирировать раствор фибронектина и мыть в течение 5 минут в фосфат-буферных солен (PBS) в три раза. Стерилизовать гидрогель и крышку блюда в течение 15 минут под ультрафиолетовым светом в капюшоне культуры тканей с низким объемом PBS. Вымойте один раз в стерильных PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие типы белка ECM могут быть использованы для покрытия гидрогеля, включая коллаген и ламинин.
- Активировать поверхность гидрогеля путем инкубации в 0,4 мм Sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино) гексаноат в 50 мМ HEPES pH 8.5. Немедленно подвергаемую воздействию ультрафиолетовую дуговую лампу в закрытой зоне.
2. Покрытие ячеек
- Добавьте 3 мл носителей, содержащих 21 000 ячеек, чтобы заполнить 60-мм блюдо для конечной плотности клеток в 1000 ячеек/см2. Отрегулируйте плотность посева по мере необходимости, чтобы предотвратить скученность и обеспечить свободное передвижение отдельных клеток.
- Разрешить клеткам восстанавливаться при 37 градусах По Цельсия, по крайней мере 4 ч и до 18 ч до изображения. Приготовьтесь к визуализации, промывая с помощью средств обработки изображений два раза, прежде чем добавлять средства обработки изображений. Разрешить клеткам уравновесить, по крайней мере 30 минут до изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Условия среды экрана заранее определяют условия, которые оптимизируют миграцию в используемой линии ячейки. Для клеток SKOV-3, DMEM без фенола красного, содержащего 20 мМ HEPES и 12,5 нг/мл эпидермального фактора роста стимулирует наибольшую миграцию. Оптимальными условиями для клеток Ref52 являются буфер Рингерса с 10% сывороткой крупного рогатого скота плода (FBS) и 25 ng/mL тромбоцитов, полученных фактором роста.
3. Приготовление стеклянного микропипетта: пипетка и ковка
- Потяните 100 мм длинные борозиликатные стеклянные микропипеты с 1,0 мм экстерьером и диаметром 0,58 мм в двухэтапном процессе, чтобы получить конус более 2 мм, который уменьшает до 50 мкм в первом миллиметре и распространяется на длинную, параллельную трубку диаметром 10 мкм в последнем миллиметре.
- Нагрузка вытащила трубу в микрокузе. Форма pipet иметь 15 мкм тупой кончик, который заключен в самом конце 250 мкм раздел согнуты под углом 35 "от остальной части трубы. Ориентировозавательный диаметр на изгибе должен быть около 30 мкм, чтобы придать прочность кончику.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тапэр и наконечник размеры могут быть скорректированы должным образом применять желаемую силу (см. шаг 5). Тяговая микропипетты при 65 градусах по Цельсию для первой ступени на 3 мм, а 60 градусов по Цельсию для второго шага производит размеры, описанные в шаге 3.1. Результаты с использованием различных трубчатых вытягивающих может варьироваться. - Стерилизовать микропипетты в 70% этанола перед использованием.
4. Позиционирование микроманипулятора и микропипетика
- Снимите крышку тарелки и загрузите блюдо на сцену микроскопа и центр. Используйте цель 10X или аналогично низкого увеличения. Обложка средств массовой информации с минеральным маслом для предотвращения испарения средств массовой информации.
-
Вставка вытащил труба
- Вставьте вытащил пипетку в оболочку micropipette, указывая крючок вниз к блюду. Кончик крючка будет самой низкой точкой при понижении в гель.
- Вставьте оболочку в микроманипулятор и отрегулируйте до тех пор, пока кончик трубы не будет сосредоточен над объективным объективом в обоих направлениях X и Y.
- Опустите трубку с помощью грубого манипулятора, пока он не коснется поверхности жидкости.
- Используя фазовый контраст или яркое поле, сфокусируйте микроскоп на бисовидном слое в верхней части геля. Это будет эталонный план.
- Обеспечение того, чтобы цель не находится в опасности попадания образца или стадии, привлечь внимание выше геля, чтобы найти кончик микропайпета, используя небольшие корректировки грубого манипулятора в X и Y направлениях, чтобы бросить тени на фокусной плоскости. Только опустите микропипетт, когда уверены, что сам кончик трубы находится в поле зрения.
- Убедитесь, что притупоротный кончик микропайпета указывает вниз, вращая трубу в оболочке или вращая оболочку в микроманипуляторе до тех пор, пока кончик не будет перпендикулярно фокусной плоскости. Повторите шаги 4.4 и 4.5 по мере необходимости. Сосредоточьтесь на кончике трубы.
- Фокус обратно вниз к верхней бисовой слой геля, чтобы оценить, как далеко pipet от поверхности геля. Сосредоточьтесь обратно к плоскости, которая является частью пути между гелем и кончиком трубы. Медленно опустите трубку, чтобы достичь промежуточной фокусной плоскости.
- Повторите шаг 4.6 до очень слабых теней от кончика микропипетты можно оценить при фокусировке на гидрогеле. Увеличьте к следующему самому высокому увеличению.
- Нижняя микроманипулятор до тех пор, пока тени и преломления самого кончика микропипетты могут быть оценены в фокусной плоскости бисомного слоя.
- Увеличьте увеличение до того, что будет использоваться в эксперименте. Опустите трубку, пока она не зависнет чуть выше поверхности гидрогеля.
5. Калибровка микроманипулятора и генерации силы
- В фазе или ярком поле опустите парящий микропипет, чтобы коснуться поверхности гидрогеля. Наблюдайте, как пипетка смотрит на контакт с гидрогелем. Продолжайте снижать микропипетты в Кдо до тех пор, пока корректировки в X и Y не вызывают потянув и отклонение гидрогеля в этих направлениях. Используйте микросферы или близлежащие клетки в качестве фидуциарных знаков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если микроманипулятор прикреплен к руке конденсатора фазы или скамейке, а не самой стадии образца, всегда отключите гель перед перемещением стадии, чтобы избежать нарушения трубы или тревожных клеток. Если труба ломается, вернитесь к шагу 3 и шагу 4. - Найти область, лишенную клеток, чтобы заниматься гель. Потяните его во всех направлениях и получить комфортно с тем, как микроманипуляция переводится как деформация геля.
- Возьмите флуоресцентные изображения бисочного поля без манипуляций, с пайпета привлечения гель, и с участием трубки потянув гель. Повторите это несколько раз принимая хорошие заметки в отношении тиковых знаков на микроманипуляторе, как наконечник трубы выглядит в фазе или яркое поле на каждом этапе потянув, и расстояние кончик движется, используя эту манипуляцию.
- Используйте ImageJ, как ранее описано16,17 для расчета относительных смещений бисера и силы, применяемой к бисеру, сравнивая поле из шарика с полем из бисера без участия в пипете, бисерное поле с гелем, и вытащил гель.
- Чтобы настроить натяжной стимул, сравните применение силы, используя различные размеры наконечника микропайпета, расстояния от клетки или расстояние, вытягиванное микроманипулятором с начальной точки приземления. Влияние размера наконечника микропайпета на силовое применение дает большую гибкость пользователю, но также демонстрирует необходимость создания силовых карт для новых микропайпетов, даже если размеры и форма очень напоминают ранее откалиброванные советы.
6. Проведение проверки durotaxis
- Перед проведением эксперимента нарисуйте втягивание геля возле клетки и наблюдайте деформацию клетки при перемещении микроманипулятора.
- Мониторинг группы клеток, которые имеют явную полярность и, как представляется, движущихся в течение 30 минут, чтобы определить клетки, которые движутся в направленной манере.
- Выберите ячейку, которая движется в одном, ясном направлении и следите за ней с желаемой частотой кадров в течение дополнительных 30 минут.
- Если определение сил, оказываемых на ячейку или напряжение, оказываемое ячейкой желательно, захват бисполевидной изображения при каждом приобретении. Если клетка изменяет свое направление во время мониторинга, выберите другую ячейку для мониторинга, так как это затруднит определение эффекта стимуляции.
- Завьяйте гидрогель примерно в 50 мкм от клетки. Расположите трубу перед ближней стороной переднего края и переместите микроманипулятор таким образом, чтобы гель деформировался ортопедически в направлении движения клетки. Наблюдайте клетку над временем по мере того как она реагирует к акутовому, местному градиенту жесткости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сроки, предусмотренные здесь, эффективны при мониторинге SKOV3 или Fibroblasts Ref52, однако интервал и общий курс времени должны быть скорректированы в соответствии с типом клеток и наблюдаемым биологическим событием. При спаривании с флуоресценцией микроскопии, приостановить флуоресцентное приобретение непосредственно перед шагом 6.5., использовать фазовый контраст или яркое поле для расположения микропайпетта и тянуть, и перезапустить флуоресцентные приобретения сразу после. - Если труба скользит или если градиент иным образом расслаблен или освобожден, найдите новую ячейку, повторяя шаги 6.2 и 6.3.
7. Определение дуротаксической миграционной реакции
- Используя ImageJ19 или другую программу анализа изображений, вычислить угол поворота, нарисовав линию между серединой переднего края ячейки на 0 мин и 30 мин пост-монитор (отражающий первоначальную траекторию ячейки) и другой линией между серединой передний край незадолго до и 80 минут после стимуляции и измерения угла между этими двумя линиями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При подготовке микропипетты(Рисунок 1) и нормализации генерации силы тянет (Рисунок 2 и Рисунок3 ), как описано выше, оптимальные durotactic условия были определены для нескольких клеточных линий. Используя этот метод, как указано на рисунке 4, как SKOV-3 раковых клеток яичников17 и Ref52 крысы эмбриональных фибробластов (Рисунок5) двигаться в направлении повышенной жесткости в градиентах применяется стеклянный микропипет. В дополнение к durotaxis, этот метод может быть использован для изучения динамических событий сигнализации с помощью флуоресцентных биосенсоров и маркеров. Например, структура и сигнализация в фокусных структурах адгезии можно наблюдать при дуротаксической стимуляции. Винкулин напряжение датчик (VinTS) является FRET основе биосенсора, который локализует координационных спаек, что позволяет флуоресцентное наблюдение координационной динамики адгезии и измерения изменений в напряжении в этих структурах19. Ref52 клетки преходяще выражая VinTS на 125 kPa полякриламид гели показывают образование очаговых спаек в направлении растянуть в течение периода времени 40 мин (Рисунок 6A). Анализ FRET20 показывает, что винкулин локализован ный координационный спайки испытывает немедленное изменение напряжения при представлении с острой durotactic стимуляции(Рисунок 6B) расширение полезности этого анализа для наблюдения субклеточной сигнализирующих событий в ответ на дуротаксическую стимуляцию.
Рисунок 1. Диаграммы типичных вытащил (A) и кованые (B) микропипеты. (A) Micropipettes вытащил с помощью двухступенчатого протокола для достижения конус от 1 мм до 10 мкм более 2 мм. (B) Micropipettes затем загружаются в микрокузе и их кончики согнуты, заключены, и укорочены так, что последние 250 мкм micropipette согнут под углом 35 "и сужается от 30 мкм до закругленный наконечник, который измеряет 15 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Улучшенное бисиное поле после этанолового покрытия по сравнению с традиционным методом с использованием поли-L-лизин. Представитель гидрогель бисера поля поли-L-лизина и этанола (EtOH) испарения coverslip методы покрытия с использованием желто-зеленого, красного и темно-красного флуоресцентных шариков. Шкала бар: 25 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Поколение карты силы для примера durotactic простирание. (A) Положение флуоресцентных микросфер до и после (псевдо-цветные зеленые и красные, соответственно) деформирующие гидрогель с micropipette (расположено за правым краем панели). Шкала бар: 25 мкм. Переносные переносчики (B) и карта тепла смещения (C) между нулевыми и вытащил бисером поля, генерируемые плагинами traction Force Microscopy в ImageJ выделить градиент отклонения бисера и гидрогеля деформации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Схема durotaxis асссеии и определение угла отклонения. (A) Ячейка наблюдается, по крайней мере 30 минут, чтобы определить свою первоначальную траекторию. (B) Микропипетт расположен ортогонически к траектории клетки, 50 мкм от края клетки. Гидрогель занимается микропайпет таким образом, что перемещение микропайпета будет оказывать силу на поверхности гидрогеля. (C) Микропайпет вытягивается еще 20 мкм от клетки, ортогонал к траектории клетки, которая создает острый, локальный градиент напряжения (обозначается синим цветом), который увеличивается к микропайпету. (D) Ячейка наблюдается с течением времени, как он перемещается прикладного градиента. (E) В ImageJ или программе анализа изображений, исходная траектория (пунктированная линия) отмечена линией, взятой из середины ячейки через центр переднего края в первом кадре. Окончательная траектория (твердая линия) отмечена линией, нарисованной после того, как ячейке разрешено перемещаться по прикладному градиенту напряжения. Угол между этими двумя линиями к стимулу называется "угол поворота", отмеченный здесь: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Крысиные эмбриональные фибробласты движутся в сторону регионов повышенной жесткости субстрата в дуротаксисе. Курс времени, показывающий durotactic движение ячейки Ref52 10 мин до притяжения (панель 1), 1 мин до тянуть (панель 2), во время тянуть (панель 3), и 1 ч после тянуть (панель 4). Стрелка указывает направление растяжения. Шкала бар: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6. Локализация белка и активность во время дуротаксической стимуляции с использованием флуоресцентных маркеров или биосенсоров. Ref52 клетки преходяще выражая Винкулин Напряжение Датчик (VinTS)19 мигрирующих на 125 кПа полиакриламид гели представлены с острой durotactic стимуляции. ( A) После стимуляции, новые очаговые спайки образуются в направлении стрейч, как клетки переориентироваться вдоль градиента жесткости. В течение двух 10 минут, начиная с 20 мин до механической стимуляции и 21 мин после стимуляции, морфология клеток (вверху) и фокусное образование адгезии (внизу) были проверены. Красный цвет указывает на первую точку времени в течение периода времени, а зеленый цвет указывает на точку времени 10 минут позже. Новые очаговые спайки, образуемые в течение 10 мин, показаны зеленым цветом. Перед стимуляцией в направлении путешествия образуются новые очаговые спайки. После стимуляции в направлении растяжения образуются новые очаговые спайки. Стрелка указывает направление растяжения. Стрелы указывают области с очаговых спаек, образуювшихся в течение этого 10 мин периода. Шкала бар: 25 мкм. (B) АНАЛИЗ FRET флуоресценции VinTS указывает на изменение напряжения в фокусных спаеках проксимотли к durotactic стрейч. Очертания клеточной мембраны до и после растяжения выделить деформации клеток при стимуляции. Стрелы указывают примеры фокусных спаек, испытывающих изменения в соотношении FRET на растяжении. Шкала бар: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Пожеланная жесткость гидрогеля | 3 кПа | 25 кПа | 125 кПа |
| 7,5% Акриламид | 100 л | 100 л | 160 зл |
| 0,5% Бис-Акриламид | 10 зл | 100 л | 100 л |
| ddH2O | 287 Л | 197 Л | 137 Лл |
Таблица 1. Растворы акриламидного геля.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь демонстрируется повторяемый одноклеточный durotaxis тест, который позволяет оценить способность клетки изменять свое миграционное поведение в ответ на острые механические сигналы. Этот метод также может быть использован в сочетании с флуоресценционной микроскопией и соответствующими белками синтеза или биосенсорами для изучения субклеточной сигнализации и цитоскелетных событий в течение нескольких секунд механической стимуляции или в течение более длительного срока в течение дюротаксическому движению. Понимание отношения клетки к окружающей среде включает в себя изучение воздействия как химических, так и механических аспектов этой среды. Хотя потенциально трудно освоить, это durotaxis анализ может быть широко использован для понимания клеточной реакции на изменения в его механической микросреды.
Значение по отношению к существующим методам
Как упоминалось ранее, этот микропипетт основе метод durotactic стимуляции очень манипулируемый, что позволяет высокую степень пространственно-временного контроля над механическими стимулами, основным преимуществом по сравнению с другими методами, такими как предварительно сформированные линейные или ступенчатые градиенты жесткости. Величина и направление привитых градиентов деформации можно визуализировать путем отслеживания смещения флуоресцентных бусин, встроенных в гидрогель, вблизи поверхности клеточной культуры.
Ограничение этих фидуциальных маркеров одним слоем чуть ниже поверхности культуры повышает точность этого отслеживания. Микросферы, расположенные ниже плоскости отклонения (привитые либо микропипеттом, либо, для микроскопии тяговой силы, по клеточной сородичности), как это происходит при равномерном смешивании микросфер по всему гидрогелю, будут двигаться меньше, чем в плоскости микросферы, что может привести к недооценке прикладных сил. Кроме того, эта модификация легче выполнять и более надежным, чем методы, в которых бусы накладываются в чрезвычайно тонкий слой полиакриламидов, отлитых поверх предварительно сформированного геля21 или принесенных на поверхность гидрогеля при гравитационном урегулировании22 и производит более равномерное рассеивание шариков по гидрогелю, чем описанные ранее методы17,23.
Модификация и будущие приложения
Специфика этого ассеа может быть изменена, чтобы наилучшим образом удовлетворить линию интереса. Например, для функционализации гидрогеля могут использоваться различные молекулы внеклеточной матрицы(например, коллаген I, коллаген IV, ламинин) или другие клеевые лиганды. Кроме того, начиная жесткость гидрогеля можно легко поднять или опустить путем настройки соотношения акриламида к бис-акриламид (см. таблицу 1). Изменяя размеры наконечника micropipette и величину тяги, этот анализ может быть оптимизирован, чтобы придать повторяемый и эффективный durotactic стимул для типа клеток в вопросе.
Критические шаги и устранение неполадок
Только клетки, следующие по устойчивой, линейной траектории миграции до манипуляции гидрогелем, должны быть стимулированы, чтобы гарантировать, что изменения в траектории обусловлены механическим стимулом, а не случайными колебаниями. Необходимо позаботиться о изготовлении стеклянного микропайпета, который задействует поверхность гидрогеля без скольжения, но не разрывает гель при вытягивании. Важно применять устойчивый, постоянный растяжек к гидрогелю в ходе эксперимента, чтобы получить чистые результаты, что означает, что пользователь должен практиковаться при размещении и перемещении микропипетты перед встречей с клеткой. Любое непреднамеренное движение микропипетты, которое приводит к изменениям в градиенте напряжения, может повлиять на способность клетки к дюротаксису. Аналогичным образом, манипуляции гель должны практиковаться с каждым новым микропайпет, который выковывается, как незначительные изменения в форме трубы может привести к pipet / гель взаимодействия варьироваться.
Неспособность расположить микропипетт в микроскопическом поле зрения до увеличения может привести к случайному поломке хрупкого стеклянного наконечника. Убедитесь, что высота и X-Y положение наконечника известно, прежде чем опускать микропипетты с микроманипулятором. Всегда следите за положением микропипетты, чтобы снизить риск поломки. Рекомендуется, чтобы увеличение уменьшается до 10X для каждого нового микропипетиста, загруженного в микроманипулятор, так как небольшие движения микроманипулятора и трубной оболочки могут привести к большим очевидным изменениям в положении вновь загруженных микропипетт.
Прежде чем найти клетки для наблюдения, важно сначала проверить микропайпет, чтобы подтвердить, что он будет заниматься гидрогеля, как ожидалось, и что он подходит для применения желаемого участка. Поиск размеров наконечника, которые соответствуют эксперименту и типу клеток, имеет решающее значение для успеха в применении дюротаксической стимуляции. Конец микропипетты должен быть достаточно округлен, чтобы он не прорвал гель, но не так округлый, что он не в состоянии схватить его. Если труба не тянет гель эффективно, он может быть скольжения по поверхности. Форма наконечника микропайпета может быть слишком округлена, чтобы правильно взаимодействовать с поверхностью геля. Размеры на самом кончике микропипетты должны быть скорректированы до тех пор, пока фирма, устойчивый контакт может быть достигнуто последовательно. В некоторых случаях, когда микропайпет скользит по поверхности геля, это может быть необходимо, чтобы снизить микропайпет дальше в гидрогель, чтобы получить больше тяги. Если микропайпет прорвется через гель, кончик может быть слишком тонким или слишком острым. Гель разрыв может также указывать на слишком много силы в настоящее время применяется при потянув. Микропипетт следует слегка поднять, чтобы уменьшить деформацию геля и потянув более короткие расстояния.
Часто, если клетка или край клетки вытащил из фокуса микропайпет, кончик микропайпет занимается слишком близко к клетке или стрейч слишком сильно. Переместите микропайпет дальше от клетки, лишь слегка деформируя клетку в плоскостях X-Y. Перемещение клетки из фокуса не только сделает клеточные события невозможными для мониторинга и вызвать оптические аберрации, но это приведет к тому, что клетка испытает больше стимуляции, чем предполагалось 2-мерным градиентом напряжения.
Самое главное, очень важно записывать и анализировать только ответы, которые имеют последовательные durotactic манипуляции с минимальной человеческой ошибки. Если опускание наконечника неточно или если микропайпет перепозиционируется, результаты эксперимента будут омрачены. Так как этот анализ является сложным и многие шаги склонны к ошибкам, необходимо проявлять осторожность на каждом шагу, чтобы избежать непреднамеренных изменений в стимуляции клеток. Сбой на любом этапе может привести к несогласованному применению растяжения и ненадежным результатам.
Ограничения
Есть ограничения в этой технике, которые должны быть рассмотрены. Наиболее заметно, точная ковка и манипуляции стеклянных микропайпетов может представить крутой кривой обучения для новых пользователей. Кроме того, положение и величина притяжения гидрогеля должны быть оптимизированы для различных клеточных линий. Изучение флуоресцентных смещений биса до и после манипуляции гидрогелем может помочь с этим аспектом техники. Кроме того, в то время как техника позволяет высокой пространственно-временной наблюдения дюротаксического поведения в отдельных клетках, это делает его низкой пропускной результат анализа. Поэтому важно отметить, что этот анализ также может быть дополнен другими методами с более низкой манипулируемостью, но более высокой пропускной способностью, например, использованиегидрогелей с предварительно сформированными градиентами жесткости, для анализа дуротаксического поведения более крупных популяций клеток одновременно. Таким образом, высокая степень пространственно-временного контроля механических сигналов, предоставляемых одноклеточного durotactic анализа делают его очень полезным для разбора молекулярных механизмов, способствующих дуротаксическому поведению многих различных типов клеток под многими Условия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Ни один.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
