Summary
Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.
Abstract
Durotaxis is het proces waarbij cellen zich voelen en reageren op gradiënten van spanningen. Om dit proces in vitro te bestuderen, moet de stijfheid van de onderliggende ondergrond van een cel worden gemanipuleerd. Terwijl hydrogels met gegradeerde stijfheid en lange termijn Migratietesten zijn nuttig gebleken in durotaxis studies, onmiddellijke, acute reacties op lokale veranderingen in substraat spanning toestaan gerichte studie van individuele celbewegingen en subcellulaire signalering van gebeurtenissen. Om het vermogen van cellen op een herhaaldelijk manier te testen en te reageren op de onderliggende substraat stijfheid, wordt een aangepaste methode gebruikt voor het aanbrengen van acute gradiënten van verhoogde spanning op individuele cellen die worden gekweekt op vervormbare hydrogels, die real-time manipulatie van de sterkte en de richting van de stijfheid gradiënten op de cellen in kwestie. Door de details en parameters van de Assay, zoals de vorm en afmetingen van de micro pipet of de relatieve positie, plaatsing en richting van de toegepaste gradiënt, te finetuning, kan de test bovendien worden geoptimaliseerd voor de studie van een mechanisch gevoelig celtype en-systeem. Deze parameters kunnen worden gewijzigd om de toegepaste stimulus betrouwbaar te veranderen en de functionaliteit en veelzijdigheid van de test uit te breiden. Deze methode maakt onderzoek van zowel de lange termijn durotactische beweging als meer directe veranderingen in cellulaire signalering en morfologische dynamiek in reactie op veranderende stijfheid.
Introduction
De laatste decennia is het belang van de mechanische eigenschappen van de omgeving van een cel toegenomen erkenning in de celbiologie. Verschillende weefsels en extracellulaire matrices hebben verschillende relatieve verstijmen en, als cellen migreren door het hele lichaam, ze navigeren deze veranderingen, met behulp van deze mechanische eigenschappen om hen te begeleiden1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. cellen gebruiken de stijfheid van een bepaald weefsel om hun beweeglijke gedrag te informeren tijdens processen zoals ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen. Echter, de moleculaire mechanismen die het gevoel van en reactie op deze mechanische ingangen kunnen blijven grotendeels onbekend1,2,3,4,5, 6 , 7.
Om de mechanismen te bestuderen waardoor cellen reageren op fysieke omgevings aanwijzingen, moeten de stijfheid of stijfheid van het onderliggende substraat van de cellen worden gemanipuleerd. In 2000 ontwikkelden Chun-min Lo, Yu-Li Wang en collega's een assay8 waarbij de beweeglijke respons van een individuele cel op veranderende mechanische signalen direct kan worden getest door het strekken van vervormbare extracellulaire matrix (ECM)-gecoate Polyacrylamide hydrogels waarop de cellen zijn geplateerd. Cellen vertoont een belangrijke voorkeur voor de migratie naar stijvere substraten, een fenomeen dat ze "durotaxis" nagesynchroniseerde.
Sinds het oorspronkelijke rapport in 2000 zijn vele andere technieken gebruikt voor de studie van durotaxis. Steile stijfheids gradiënten zijn vervaardigd door gels te gieten over stijve functies zoals polystyreen kralen9 of stijve polymeer palen10 of door het substraat rond de randen van een glazen dekstroken te polymeriseren11 om mechanische ' Step-grenzen '. Als alternatief zijn hydrogels met onlagere maar vaste stijfheids gradiënten vervaardigd door een verscheidenheid aan methoden, zoals gradiënten van als gemaakt door microfluïdische apparaten12,13 of side-by-side hydrogel oplossing druppels van verschillende stijfheid8, of hydrogels met photoreactive als behandeld met Graded blootstelling aan UV-licht om een lineaire stijfheid gradiënt14,15te creëren. Deze technieken zijn gebruikt om een groot effect te onderzoeken durotactische cellulaire beweging en masse na verloop van tijd. Echter, meestal zijn deze functies vervaardigd op voorhand van celplating en hun eigenschappen blijven consistent in de loop van het experiment, afhankelijk van willekeurige celbeweging voor bemonstering van mechanische verlopen. Geen van deze technieken zijn vatbaar voor waarneming van snelle veranderingen in cellulaire gedrag in reactie op acute mechanische stimulus.
Om te observeren cellulaire reacties op acute veranderingen in de mechanische omgeving, eencellige durotaxis assays bieden verschillende voordelen. In deze tests krijgen individuele cellen een acute, mechanische stimulans door het onderliggende substraat weg te trekken van de cel met een glazen micro Pipet, waardoor een richtings gradiënt van de celmatrix spanning wordt ingevoerd. Veranderingen in het beweeglijke gedrag, zoals snelheid of richting van de migratie, worden vervolgens waargenomen door de Live-cel fase contrast microscopie. Deze aanpak vergemakkelijkt directe observatie van oorzaak en gevolg relaties tussen mechanische stimuli en Celmigratie, omdat het een snelle, iteratieve manipulatie van de richting en de grootte van de spannings gradiënt mogelijk maakt en de beoordeling van de daaruit voortvloeiende cellulaire reacties in real-time. Verder kan deze methode ook worden gebruikt om cellen die fluorescerende fusie proteïnen of biosensoren uitdrukken, mechanisch te stimuleren om veranderingen in de hoeveelheid, activiteit of subcellulaire lokalisatie van eiwitten die vermoedelijk betrokken zijn bij mechanosensing te visualiseren en durotaxis.
Deze techniek is gebruikt door groepen die durotaxis8,16 bestuderen en wordt hier beschreven omdat het door het Howe laboratorium is aangepast om het durotactische gedrag van SKOV-3 ovariële kankercellen te bestuderen en de moleculaire mechanismen die rela durotaxis17. Daarnaast wordt een gemodificeerde methode beschreven voor de fabricage van hydrogels met een enkele, gelijkmatige laag van fluorescerende microsferen in de buurt van het celkweek oppervlak; Dit vergemakkelijkt de visualisatie en optimalisatie van door micro pipet gegenereerde stam gradiënten en kan een beoordeling van de contractiliteit van de cellen door tractiekracht microscopie mogelijk maken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vervaardiging van vervormbare Polyacrylamidehydrogels met ingesloten fluorescerende microsferen
Opmerking: Aanwijzingen beschrijven polymerisatie van een 25 kPa hydrogel met een diameter van 22 μm en ongeveer 66 μm dik. Elk van deze parameters kan worden gewijzigd en de aanwijzingen hiervoor zijn te vinden in tabel 1 en in toelichting17.
- Activering van glasbodem gerechten of dekstroken
- Bereid de BIND silaan-werkoplossing voor de activering van een beeldvormings schaal met glazen bodem of een afdekplaat die past in een beeldvormings kamer met een live-cel. Meng 950 μL 95% ethanol, 50 μL ijsazijn en 5 μL BIND silaan (y-methacryloxypropyltrimethoxysilaan).
Opmerking: Het gebruik van een grotere bodem dekglaasje in vergelijking met de bovenste afdekplaat geeft extra ruimte om te werken bij het bereiden van de gel en vergemakkelijkt de positionering van de glazen micropipet in latere stappen. Als u een dekglaasje gebruikt in plaats van een beeldvormings schaal met glazen bodem, reinig dan de afdekplaat zoals beschreven in de volgende sectie. - Activeer het oppervlak van het glas voor 20 s met een Corona wand en overlay onmiddellijk 50 μL van de BIND silaan werkoplossing. Laat de oplossing 10 minuten drogen.
- Spoel tweemaal met 95% ethanol, vervolgens twee keer met isopropanol en laat de dekstroken vervolgens ongeveer 20 minuten aan de lucht drogen.
Opmerking: geactiveerd glas kan tot een week bewaard worden in een exsiccator.
- Bereid de BIND silaan-werkoplossing voor de activering van een beeldvormings schaal met glazen bodem of een afdekplaat die past in een beeldvormings kamer met een live-cel. Meng 950 μL 95% ethanol, 50 μL ijsazijn en 5 μL BIND silaan (y-methacryloxypropyltrimethoxysilaan).
- Reiniging van de bovenste afdek stroken
- Reinig 22 mm topdekstroken door gedurende 30 minuten in 2% HCl bij 70 °C te inbroden, en vervolgens gedurende 10 min tweemaal in ddH2O te spoelen.
- Incuvet de dekstroken in een oplossing van 2% kuvette Reinigingsconcentraat in ddH2o bij 50 °c gedurende 30 minuten, en was vervolgens gedurende 10 min tweemaal in DDH2o.
- Inbroed de afdek stroken in ddH2O bij 90 °c gedurende 30 minuten, vervolgens in 70% ethanol bij 70 °c gedurende 10 min, en vervolgens lucht drogen bij 60 °c gedurende minimaal 2 uur.
Opmerking: Gereinigde afdek stroken kunnen voor onbepaalde tijd worden opgeslagen in een schone exsiccator.
- Fluorescerende microsphere/Bead depositie op de bovenste afdek stroken
- Sonicate de stockoplossing van fluorescerende microsferen voor 1 uur in een ultrasoon waterbad. Maak een werkende kraal oplossing door het verdunen van kraal voorraad 1:200 in 100% ethanol en opnieuw sonificeren voor 1 h.
- 15 minuten voordat de kraal oplossing sonicatie heeft voltooid, reinig de dekstroken grondig door ze verticaal in een keramische afdek houder te plaatsen en 3 minuten in een plasma reiniger in een tafelblad te behandelen met Room-Air plasma.
- Om de hantering te vergemakkelijken en glijden van de afdekplaat te voorkomen tijdens volgende stappen, plaats een stukje Parafilm in een 60 mm Petri schaaldeksel of een soortgelijke container. Plaats de dekslip in de stabilisator en tik lichtjes omlaag, voor een goed contact tussen de Parafilm en de dekslip.
- Voeg voor een dekslip van 22 mm 150 μL van de werkende kraal oplossing toe aan de bovenkant van de dekslip. Zuig de ethanol oplossing onmiddellijk uit de zijkant van de Afdeklijst en laat de parels op de dekslip staan. Laat de dekslip aan de lucht drogen.
Opmerking: de hoeveelheid werk kraal oplossing toegevoegd moet ~ 4 μL/cm2 en kan worden geschaald voor elke grootte coverslip.
- Gieten hydrogels met ingesloten fluorescerende kralen
- Bereid de hydrogel oplossing van acrylamide en bis-acrylamide. Meng de oplossing volgens tabel 1en voeg vervolgens 2,5 μl van 10% APS en 0,5 ΜL TEMED toe. Meng goed. Ga onmiddellijk naar de volgende stap.
Opmerking: het mengsel van de hydrogel oplossing kan worden gewijzigd om de jonge modulus of stijfheid van de hydrogel te variëren door de verhouding van acrylamide naar bis-acrylamide te veranderen, zoals weergegeven in tabel 1. Deze waarden zijn geverifieerd voor gebruik in het Howe laboratorium met behulp van atomaire kracht microscopie, maar moeten worden bevestigd binnen de instelling. - Voeg onmiddellijk na het maken van de hydrogel-oplossing een druppel van 25 μL toe aan de geactiveerde zijde van de glazen bodem schotel of bodem dekglaasje, en plaats de afdekplaat met kraal coating onmiddellijk op de oplossing, de kraal zijde naar beneden. Door de druppel te contacteren met de achterkant van de dekslip, gevolgd door een langzame verlaging, vermijdt u luchtbellen in de hydrogel.
Opmerking: de hoogte van de hydrogel moet goed zijn binnen de werkafstand van de objectief lens die in het latere experiment moet worden gebruikt. Een hydrogel hoogte van 66 μm werkt goed voor de meeste systemen. De grootte van de hydrogel kan worden geschaald door meer of minder hydrogel-oplossing toe te voegen, afhankelijk van de grootte van de dekslip. Voor het berekenen van het juiste volume hydrogel oplossing, gebruikt u de vergelijking voor het volume van een cilinder, V = πr2h waar r de afdek RADIUS is en h de gewenste hydrogel hoogte. Typisch, deze berekening voorspelt met eerlijke nauwkeurigheid de werkelijke hoogte van de hydrogel, zoals gemeten door het voorbereiden van een gel met kraal-gecoate dekstroken op zowel de boven-en onderkant en met behulp van een confocale Microscoop te meten de afstand tussen de twee kraal vlakken. Er is echter waargenomen dat de werkelijke hoogte van de hydrogel van deze berekening met ± 20 μm kan afwijken (bijvoorbeeld afhankelijk van de dikte en de fabrikant van de bovenste glazen dekglaasje). Directe meting van de gelhoogte met behulp van de hierboven beschreven methode wordt aanbevolen. - Laat de gel gedurende 30 minuten polymeriseren en verwijder vervolgens de bovenste dekslip voorzichtig met de Tang. Het toevoegen van 50 mM HEPES pH 8,5 aan de schotel kan verwijdering vergemakkelijken. Wassen voor 5 min in 50 mM HEPES pH 8,5 drie keer.
- Bereid de hydrogel oplossing van acrylamide en bis-acrylamide. Meng de oplossing volgens tabel 1en voeg vervolgens 2,5 μl van 10% APS en 0,5 ΜL TEMED toe. Meng goed. Ga onmiddellijk naar de volgende stap.
- Hydrogel activatie en extracellulaire matrix coating
- Activeer het hydrogel oppervlak door te incuberen in 0,4 mM sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-nitrofenylamino) hexanoaat) in 50 mM HEPES pH 8,5. Onmiddellijk blootstellen aan een UV-booglamp in een afgesloten ruimte.
Opmerking: Bescherm sulfo-sanpah tegen licht voorafgaand aan de activatie. Voor een lamp van 400 W positioneer je de gel 10 cm van de lamp in de lichtbak en verlicht je 100 s. De sulfo-SANPAH oplossing zal veranderen van fel oranje naar donker bruin. - Wassen voor 5 min in 50 mM HEPES pH 8,5 drie keer.
Letop: gehydrateerde gels kunnen maximaal één week bij 4 °c worden bewaard. - Inbroed de geactiveerde hydrogel in 20 μg/mL fibronectine in 50 mM HEPES pH 8,5 gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Zuig de fibronectin-oplossing op en was driemaal 5 minuten in fosfaatgebufferde zout (PBS). Steriliseren de hydrogel en de deksel van het schaaltje gedurende 15 minuten onder UV-licht in een weefsel cultuurkap met een laag volume PBS. Eenmaal in steriele PBS wassen.
Opmerking: andere soorten ECM-eiwitten kunnen worden gebruikt om de hydrogel te Coat, waaronder collageen en laminine.
- Activeer het hydrogel oppervlak door te incuberen in 0,4 mM sulfo-SANPAH (sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-nitrofenylamino) hexanoaat) in 50 mM HEPES pH 8,5. Onmiddellijk blootstellen aan een UV-booglamp in een afgesloten ruimte.
2. plating cellen
- Voeg 3 mL media met 21.000 cellen toe om een schaal van 60 mm te vullen voor een uiteindelijke celdichtheid van ~ 1000 cellen/cm2. Pas de zaaien dichtheid zo nodig aan om verdringing te voorkomen en vrij verkeer van individuele cellen mogelijk te maken.
- Laat de cellen gedurende ten minste 4 uur en tot 18 uur vóór de beeldvorming op 37 °C herstellen. Bereid u voor op Imaging door twee keer met Imaging media te spoelen voordat u Imaging media toevoegt. Laat de cellen ten minste 30 minuten vóór de beeldvorming equilibraten.
Opmerking: scherm media voorwaarden vooraf om te bepalen van de voorwaarden die de migratie in de gebruikte cellijn zal optimaliseren. Voor SKOV-3 cellen stimuleert DMEM zonder fenolrood, met 20 mM HEPES en 12,5 ng/mL epidermale groeifactor de meeste migratie. Optimale omstandigheden voor Ref52 cellen zijn Ringer's buffer met 10% foetaal runderserum (FBS) en 25 ng/mL-trombocyten afgeleide groeifactor.
3. bereiding van een glazen pipet: pipet trekken en smeden
- Trek 100 mm lange borosilicaatglas micropipetten met een 1,0 mm exterieur en 0,58 mm binnendiameter in een tweestapsproces om een taper over 2 mm te verkrijgen die tot ~ 50 μm in de eerste millimeter vermindert en zich uitstrekt tot een lange, parallelle 10 μm diameter buis in de laatste millimeter.
- Laden getrokken pipet in een microforge. Vorm het pipet om een 15 μm-ingekort uiteinde te hebben dat is omsloten aan het uiteinde van een 250 μm-sectie, gebogen in een hoek van ~ 35 ° vanaf de rest van het pipet. De geschatte diameter bij de bocht moet ongeveer 30 μm zijn om de punt sterkte te verlenen.
Opmerking: de afmetingen van de conus en de punt kunnen worden aangepast om de gewenste kracht correct toe te passen (zie stap 5). Het trekken van micropipetten bij 65 °C voor de eerste stap voor 3 mm en 60 °C voor de tweede stap produceert de in stap 3,1 beschreven afmetingen. Resultaten met verschillende pipet trekkers kunnen variëren. - Steriliseren de micro pipet in 70% ethanol voor gebruik.
4. positionering van de micro manipulator en de micropipet
- Verwijder de deksel en plaats de schaal op de Microscoop en het midden. Gebruik een 10X of een vergelijkbare doelstelling met lage vergroting. Bedek de media met minerale olie om verdamping van de media te voorkomen.
-
Getrokken pipet invoegen
- Steek de getrokken pipet in de micro pipet schede en wijs de haak naar beneden in de richting van de schotel. Het uiteinde van de haak zal het laagste punt zijn wanneer het naar de gel wordt verlaagd.
- Plaats de schede in de micro manipulator en pas de punt van het pipet aan op de objectief lens in zowel X-als Y-richtingen.
- Verlaag het pipet met behulp van grove manipulator totdat het gewoon het oppervlak van de vloeistof aanraakt.
- Gebruik fase contrast of brightfield om de Microscoop op de laag van de kraal aan de bovenkant van de gel te richten. Dit wordt het referentievlak.
- Ervoor te zorgen dat het doel niet het gevaar van het raken van het monster of stadium is, breng de focus boven de gel om de punt van de micro pipet te vinden, met behulp van kleine aanpassingen van de grove manipulator in de X-en Y-richtingen om schaduwen op het brandvlak te werpen. Verlaag de micro pipet alleen als u er zeker van wilt zijn dat het uiteinde van het pipet zich in het gezichtsveld bevindt.
- Zorg ervoor dat de stomende punt van de micro pipet naar beneden wijst door het pipet in de mantel te draaien of de mantel in de micro manipulator te draaien totdat de punt loodrecht op het brandvlak staat. Herhaal de stappen 4,4 en 4,5 indien nodig. Focus op de punt van het pipet.
- Concentreer u terug op de bovenste kraal laag van de gel om te meten hoe ver het pipet is van het geloppervlak. Focus terug op een vlak dat deel uitmaakt van de gel en de punt van het pipet. Verlaag het pipet langzaam om het tussenliggende brandvlak te bereiken.
- Herhaal stap 4,6 tot zeer zwakke schaduwen van de punt van de micro pipet kunnen worden gewaardeerd wanneer u zich op de hydrogel concentreert. Verhogen tot de volgende hoogste vergroting.
- Verlaag de micro manipulator tot de schaduwen en brekingen van het uiteinde van de pipet kunnen worden gewaardeerd binnen het brandvlak van de kraal laag.
- Verhoog de vergroting tot die welke in het experiment zal worden gebruikt. Verlaag het pipet totdat het net boven het oppervlak van de hydrogel zweeft.
5. kalibratie van de micro manipulator en kracht opwekking
- Verlaag in fase of brightfield de zwevende micro pipet om het oppervlak van de hydrogel aan te raken. Kijk hoe het pipet eruitziet bij contact met de hydrogel. Doorgaan met het verlagen van micro pipet in Z totdat aanpassingen in X en Y leiden tot trekken en afbuiging van de hydrogel in die richtingen. Gebruik de microsferen of nabijgelegen cellen als fiduciair markeringen.
Opmerking: als de micro manipulator is bevestigd aan de fase condensor arm of de Bank en niet aan de monster fase zelf, moet u de gel altijd uitschakelen voordat u het werkgebied verplaatst om te voorkomen dat de pipet of storende cellen worden afgebroken. Als het pipet breekt, gaat u terug naar stap 3 en stap 4. - Zoek een gebied zonder cellen om de gel in te schakelen. Trek het in alle richtingen en maak je comfortabel met de manier waarop Micro manipulatie vertaalt naar vervorming van de gel.
- Neem fluorescerende afbeeldingen van het kraal veld zonder manipulatie, met het pipet dat de gel aandoet, en met de betrokken pipet die de gel trekt. Herhaal dit meerdere malen met goede aantekeningen over de maatstreepjes op de micro manipulator, de manier waarop de pipetpunt eruitziet in fase of brightfield in elke fase van het trekken, en de afstand die de punt beweegt met behulp van die manipulatie.
- Gebruik imagej zoals eerder beschreven16,17 om relatieve kraal verplaatsingen en kracht op de kralen te berekenen door het nulkraal veld te vergelijken met het kraal veld zonder pipet betrokkenheid, het kraal veld met de gel ingeschakeld, en de getrokken gel.
- Vergelijk Force-toepassing met verschillende micropipet punt afmetingen, afstanden van de cel of afstand getrokken door de micro manipulator vanaf het eerste punt van touchdown om de tensional-stimulus te verfijnen. Het effect van de micro pipetpunt dimensie op Force-toepassing biedt een grote flexibiliteit voor de gebruiker, maar toont ook de noodzaak aan om Force Maps te genereren voor nieuwe micropipetten, zelfs wanneer de afmetingen en vorm sterk lijken op eerder gekalibreerde tips.
6. het uitvoeren van de durotaxis-test
- Voordat u het experiment uitvoert, oefen de gel in de buurt van een cel en observeer de vervorming van de cel wanneer de micro manipulator wordt verplaatst.
- Bewaak een groep cellen die een duidelijke polariteit hebben en die gedurende 30 minuten lijken te bewegen om cellen te identificeren die op een gerichte manier bewegen.
- Kies een cel die beweegt in een enkele, duidelijke richting en controleer deze op de gewenste framesnelheid voor een extra 30 min.
- Als de bepaling van de krachten uitgeoefend op de cel of spanning uitgeoefend door de cel gewenst is, vangen kraal veld beelden bij elke overname. Als de cel tijdens het monitoren de koers van de richting verandert, kiest u een andere cel om te controleren, omdat dit het moeilijk zal maken om het effect van stimulatie te bepalen.
- Neem de hydrogel ongeveer 50 μm uit de buurt van de cel. Plaats het pipet voor de nabije kant van de voorkant en beweeg de micro manipulator zodanig dat de gel orthogonaal wordt vervormd tot de rijrichting van de cel. Observeer de cel in de loop van de tijd terwijl deze reageert op de acute, lokale helling van stijfheid.
Opmerking: de hier geleverde timing is effectief bij het monitoren van SKOV3 of Ref52 fibroblasten, maar het interval en de totale tijdsduur moeten worden aangepast aan het celtype en de biologische gebeurtenis die wordt waargenomen. Als u met fluorescentiemicroscopie koppelt, pauzeer dan de fluorescerende overname onmiddellijk voor stap 6,5., gebruik fase contrast of brightfield om micro pipet en pull te positioneren en start de fluorescerende acquisitie onmiddellijk na. - Als het pipet glijdt of als het verloop anders ontspannen of losgelaten is, zoekt u een nieuwe cel door de stappen 6,2 en 6,3 te herhalen.
7. bepaling van de reactie van durotactische migratie
- Gebruik ImageJ19 of een ander beeldanalyse programma om de draaihoek te berekenen door een lijn te tekenen tussen het midden van de bovenrand van de cel op 0 minuten en 30 minuten na de monitor (het oorspronkelijke traject van de cel weerspiegelen) en een andere lijn tussen het midden van de Leading Edge net voor en 80 min na stimulatie en het meten van de hoek tussen deze twee lijnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door micropipetten voor te bereiden (Figuur 1) en de kracht opwekking van de trekkrachten te normaliseren (Figuur 2 en Figuur 3), zoals hierboven beschreven, zijn voor meerdere cellijnen optimale durotactische condities vastgesteld. Met behulp van deze techniek, zoals uiteengezet in Figuur 4, bewegen zowel SKOV-3 ovariële kankercellen17 en Ref52 rat embryonale fibroblasten (Figuur 5) naar verhoogde stijfheid in gradiënten toegepast door een glazen micro pipet. Naast durotaxis, deze methode kan worden gebruikt om dynamische signalering gebeurtenissen met behulp van fluorescerende biosensoren en markers te bestuderen. De structuur van en signalering binnen focale adhesie structuren kan bijvoorbeeld worden waargenomen bij durotactische stimulatie. Vinculin Tension sensor (VinTS) is een op FRET gebaseerde biosensor die lokaliseert tot focale verklevingen, waardoor fluorescerende observatie van focale adhesie dynamiek en meting van spannings veranderingen binnen deze structuren19mogelijk wordt. Ref52 cellen die transitieve Vinten uitdrukken op 125 kPa polyacrylamidegels tonen de vorming van focale verklevingen in de richting van Stretch gedurende een periode van 40 min (Figuur 6a). FRET Analysis20 onthult dat vinculin gelokaliseerd op focale adhesies een onmiddellijke verandering in spanning ervaart wanneer deze wordt gepresenteerd met acute durotactische stimulatie (Figuur 6b), waardoor het nut van deze test wordt uitgebreid tot de observatie van subcellulaire signalering van gebeurtenissen in reactie op durotactische stimulatie.
Figuur 1. Diagrammen van typische getrokken (A) en gesmede (B) micropipetten. A) micropipetten worden getrokken met behulp van een tweestapsprotocol om een taps toelopende van 1 mm tot 10 μm over 2 mm te bereiken.B) micropipetten worden vervolgens in de microforge geladen en hun uiteinden zijn gebogen, ingesloten en ingekort zodat de laatste 250 μm van de micropipetten zijn gebogen in een hoek van ~ 35 ° en taps toeluikers van ~ 30 μm tot een afgeronde punt dat ~ 15 μm meet. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2. Verbeterde kraal veld na ethanol coating in vergelijking met de traditionele methode met behulp van poly-L-lysine. Representatieve hydrogel kraal velden van poly-L-lysine en ethanol (EtOH) verdamping afdek coating methoden met behulp van geel-groen, rood en donker-rode fluorescerende kralen. Schaal: 25 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3. Genereren van Force map voor een voorbeeld durotactische stretch. A) de positie van fluorescerende microsferen voor en na (respectievelijk pseudo-gekleurd groen en rood) die de hydrogel vervormen met een micro Pipet (buiten de rechterrand van het paneel). Schaal: 25 μm. Verplaatsings vectoren (B) en verplaatsing heatmap (C) tussen Null-en getrokken kraal velden gegenereerd door tractiekracht microscopie plugins in imagej markeren de gradiënt van kraal afbuiging en hydrogel stam. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4. Schematische analyse van durotaxis en bepaling van de afbuighoek. A) eencel wordt gedurende ten minste 30 minuten geobserveerd om zijn oorspronkelijke traject te bepalen. B) de micro pipet wordt orthogonaal gepositioneerd op het traject van de cel, 50 μm van de celrand. De hydrogel wordt door de micro pipet ingeschakeld, zodat het verplaatsen van de micro pipet kracht op het oppervlak van de hydrogel zal uitoefenen. C) de micro pipet wordt een extra 20 μm verwijderd van de cel, orthogonaal naar het traject van de cel, wat een acute, lokale helling van spanningen creëert (aangeduid in blauw) die toeneemt in de richting van de micro pipet. D) de cel wordt in de loop van de tijd geobserveerd terwijl deze het toegepaste verloop navigeert. (E) in imagej of een beeldanalyse programma wordt het oorspronkelijke traject (onderbroken lijn) gemarkeerd door een lijn die wordt getekend vanuit het midden van de cel door het midden van de voorloop rand in het eerste frame. Het laatste traject (ononderbroken lijn) wordt gemarkeerd door een lijn getekend nadat de cel is toegestaan om door de toegepaste spannings gradiënt te navigeren. De hoek tussen deze twee lijnen naar de stimulus wordt aangeduid als "Turn Angle", hier gemarkeerd door θ. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5. Rat embryonale fibroblasten verplaatsen zich naar regio's met verhoogde substraat stijfheid in durotaxis. Tijdsverloop van de durotactische beweging van een Ref52 cel 10 min voor de Trek (paneel 1), 1 min voor de Trek (paneel 2), op het moment van de Trek (paneel 3), en 1 h na Trek (paneel 4). Pijl geeft de richting van de stretch aan. Schaal: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6. Eiwit lokalisatie en activiteit tijdens durotactische stimulatie met behulp van fluorescerende markers of biosensoren. Ref52 cellen met een transitieve expressie van Vinculin Tension sensor (VinTS)19 migreren op 125 kPa polyacrylamidegels worden gepresenteerd met acute durotactische stimulatie. A) na stimulatie vormen nieuwe focale verklevingen in de richting van de stretch naarmate de cellen opnieuw oriënteren langs de stijgings gradiënt. Gedurende 2 10 min perioden, beginnend 20 minuten vóór de mechanische stimulatie en 21 min na stimulatie, werden celmorfologie (boven) en focale adhesie vorming (onder) gemonitord. Rode kleur geeft het eerste tijdpunt binnen de periode aan en groene kleur geeft het tijdpunt 10 min later aan. Nieuwe focale adhesies gevormd binnen de 10 min periode worden weergegeven in het groen. Vóór de stimulatie vormen nieuwe focale verklevingen in de richting van de reis. Na stimulatie vormen nieuwe focale verklevingen in de richting van Stretch. Pijl geeft de richting van de stretch aan. Pijlpunten geven gebieden aan met focale verklevingen die gedurende die 10 min-periode zijn gevormd. Schaal: 25 μm. B) fret-analyse van Vints-fluorescentie duidt op een verandering in de spanning binnen focale verklevingen proximaal tot durotactische stretch. Omtrek van celmembraan voor en na stretch Markeer vervorming van de cel bij stimulatie. Pijlpunten geven voorbeelden van focale verklevingen die veranderingen in de FRET ratio op stretch ervaren. Schaal: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Gewenste hydrogel stijfheid | 3 kPa | 25 kPa | 125 kPa |
| 7,5% acrylamide | 100 μL | 100 μL | 160 μL |
| 0,5% bis-acrylamide | 10 μL | 100 μL | 100 μL |
| ddH2O | 287 μL | 197 μL | 137 μL |
Tabel 1. Acrylamide gel-oplossingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier gedemonstreerd is een herhaalbare, eencellige durotaxis assay die het mogelijk maakt om de mogelijkheid van een cel om zijn migratie gedrag te veranderen in reactie op acute mechanische aanwijzingen. Deze techniek kan ook worden gebruikt in combinatie met fluorescentiemicroscopie en geschikte fusie proteïnen of biosensoren om subcellulaire signalering en cytoskelet gebeurtenissen binnen enkele seconden na mechanische stimulatie of over een langere tijdschaal te onderzoeken tijdens durotactische beweging. Het begrijpen van de relatie van een cel met zijn omgeving omvat de studie van de impact van zowel de chemische als de mechanische aspecten van die omgeving. Hoewel potentieel moeilijk te beheersen, deze Duro Taxis assay kan op grote schaal worden gebruikt om te begrijpen van de cellulaire reactie op veranderingen in de mechanische micro omgeving.
Significantie met betrekking tot bestaande methoden
Zoals eerder vermeld, is deze micropipet gebaseerde methode van durotactische stimulatie zeer losse, waardoor een hoge mate van spatiotemporele controle over mechanische stimuli mogelijk is, een groot voordeel ten opzichte van andere technieken, zoals vooraf gevormde lineaire of stap-gradiënten van stijfheid. De omvang en richting van de vergrootte van de stam gradiënten kunnen worden gevisualiseerd door het volgen van de verplaatsing van fluorescerende kralen ingebed in de hydrogel, in de buurt van het celkweek oppervlak.
Het beperken van deze fiducial markers tot een enkele laag net onder het cultuur oppervlak verhoogt de nauwkeurigheid van deze tracking. Microsferen die zich onder het vlak van afbuiging bevinden (hetzij door de micro pipet of, voor microscopie van de tractiekracht, door cellulaire contractiliteit), zoals zou optreden bij menging van de microsferen gelijkmatig in de hydrogel, zullen minder bewegen dan in-plane microsferen, wat kan leiden tot een onderschatting van de toegepaste krachten. Ook is deze modificatie gemakkelijker uit te voeren en betrouwbaarder dan methoden waarbij kralen worden overgelegd in een extreem dunne laag polyacrylamide die bovenop een voorgevormde gel21 wordt gegoten of naar het hydrogel oppervlak wordt gebracht door zwaartekracht geassisteerde bezinking22 en produceert een meer gelijkmatige verspreiding van kralen over de hydrogel dan eerder beschreven methoden17,23.
Wijzigingen en toekomstige toepassingen
De bijzonderheden van deze test kunnen worden aangepast om het beste bij de cellijn van belang te passen. Zo kan bijvoorbeeld een verscheidenheid aan extracellulaire matrix moleculen (bijv. collageen I, collageen IV, laminin) of andere lijm liganden worden gebruikt om de hydrogel te functionaliseren. Ook kan de start stijfheid van de hydrogel gemakkelijk worden verhoogd of verlaagd door de verhouding van acrylamide tot bis-acrylamide af te stemmen (Zie tabel 1). Door de afmetingen van de micropipet punt en de grootte van de trekkracht te wijzigen, kan deze test worden geoptimaliseerd om een herhaalbare en effectieve durotactische stimulus voor het betreffende celtype te maken.
Kritieke stappen en probleemoplossing
Alleen cellen na een gestage, lineaire traject van migratie voorafgaand aan de hydrogel manipulatie moeten worden gestimuleerd om ervoor te zorgen dat veranderingen in het traject te wijten zijn aan de mechanische prikkel en niet aan willekeurige fluctuaties. Er moet worden gezorgd voor het fabriceren van een glazen micropipet die het hydrogel oppervlak zonder uitglijden aangrijpt, maar de gel niet scheurt wanneer deze wordt getrokken. Het is belangrijk om in de loop van het experiment een stabiele, constante rek aan de hydrogel toe te passen om schone resultaten te verkrijgen, wat betekent dat de gebruiker moet worden beoefend bij het plaatsen en verplaatsen van de micro pipet voordat hij een cel tegenkomt. Elke onbedoelde beweging van de micro pipet die leidt tot veranderingen in de spannings gradiënt kan van invloed zijn op het vermogen van de cel tot Duro tax. Evenzo moet manipulatie van de gel worden beoefend met elke nieuwe micro pipet die wordt gesmeed omdat kleine veranderingen in de pipet vorm de pipet/gel-interactie kunnen variëren.
Het niet positioneren van de micro pipet binnen het microscopisch gezichtsveld voor het vergroten van de vergroting kan leiden tot het accidenteel breken van de breekbare glazen tip. Zorg ervoor dat de hoogte en de X-Y-positie van de tip bekend is voordat u de micro pipet met de micro manipulator verlaagt. Controleer altijd de positie van de micro pipet om het risico op breuk te verkleinen. Het wordt aanbevolen de vergroting terug te brengen tot 10X voor elke nieuwe micro pipet die in de micro manipulator wordt geladen, omdat lichte bewegingen van de micro manipulator en de pipet schede kunnen leiden tot grote schijnbare veranderingen in de positie van de nieuw geladen Micro pipet.
Voordat u cellen vindt om te observeren, is het belangrijk om eerst de micropipet te testen om te bevestigen dat het de hydrogel zal inschakelen zoals verwacht en dat het geschikt is voor het aanbrengen van het gewenste rek. Het vinden van tipafmetingen die passen bij het experiment en het celtype is essentieel voor succes bij het toepassen van durotactische stimulatie. Het uiteinde van de micro pipet moet voldoende worden afgerond, zodat het niet door de gel breekt, maar niet zo afgerond is dat het niet kan worden begrepen. Als het pipet niet effectief gel trekt, kan het langs het oppervlak glijden. De vorm van de pipetpunt kan te afgerond zijn om goed met het geloppervlak te communiceren. De afmetingen aan het uiteinde van de micro pipet moeten worden afgesteld totdat een stevig, stabiel contact consistent kan worden bereikt. In sommige gevallen waarin de micro pipet over het geloppervlak glijdt, kan het nodig zijn de micro pipet verder in de hydrogel te verlagen om meer tractie te krijgen. Als de micropipet tranen door gel, de tip kan te fijn of te scherp zijn. Gel scheuren kan ook duiden op te veel kracht wordt toegepast tijdens het trekken. De micro pipet moet lichtjes worden verhoogd om de deformatie van de gel te verminderen en kortere afstanden te trekken.
Vaak, als de cel of de rand van de cel uit de focus wordt getrokken door de micro Pipet, is de punt van de micro pipet te dicht bij de cel ingeschakeld of is het rek te krachtig. Verplaats de micro pipet verder van de cel, waardoor de cel in de X-Y-vlakken enigszins wordt vervormd. Het verplaatsen van de cel uit de focus zal niet alleen het onmogelijk maken om cellulaire gebeurtenissen te monitoren en optische aberraties te veroorzaken, maar het zorgt ervoor dat de cel meer stimulatie ervaart dan de beoogde 2-dimensionale spannings gradiënt.
Het belangrijkste is dat het belangrijk is om alleen reacties op te nemen en te analyseren die consistente durotactische manipulatie met minimale menselijke fouten hebben. Als de verlaging van de punt onnauwkeurig is of als de micro Pipet is verplaatst, worden de resultaten van het experiment vertrotaliseerd. Aangezien deze test complex is en veel stappen gevoelig zijn voor fouten, moet bij elke stap zorg worden besteed om onbedoelde veranderingen in het stimuleren van cellen te voorkomen. Falen bij elke stap kan leiden tot inconsistente stretch toepassing en onbetrouwbare resultaten.
Beperkingen
Er zijn beperkingen voor deze techniek die moeten worden overwogen. Het meest opvallende, nauwkeurige smeden en manipuleren van de glazen micropipetten kan een steile leercurve voor nieuwe gebruikers te presenteren. Bovendien moet de positie en grootte van de hydrogel-trek worden geoptimaliseerd voor verschillende cellijnen. Het onderzoeken van fluorescerende kraal verplaatsingen voor en na hydrogel manipulatie kan helpen met dit aspect van de techniek. Ook, terwijl de techniek hoge spatiotemporele observatie van durotactische gedrag in individuele cellen toestaat, dit maakt het een lage-doorvoer test. Het is daarom belangrijk erop te wijzen dat deze test ook kan worden aangevuld met andere technieken met een lagere manipulability maar hogere doorvoer, zoals het gebruik van hydrogels met voorgevormde hellingen van stijfheid, om het durotactische gedrag van grotere populaties van cellen tegelijk. Kortom, de hoge mate van spatiotemporele beheersing van mechanische signalen die worden geboden door de eencellige durotactische assay maken het zeer nuttig voor het parseren van de moleculaire mechanismen die bijdragen aan het durotactische gedrag van veel verschillende celtypen onder veel Voorwaarden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 μg DNA / 6 μL fugene 6 per 35 mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. 3rd Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
