Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay
Summary
Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.
Abstract
Durotaksis, hücrelerin gerilim degradelerini algılama ve tepki verme sürecidir. Bu süreci in vitro olarak incelemek için, bir hücrenin altında yatan substrat sertliği manipüle edilmelidir. Dereceli sertlik ve uzun süreli göç testleri ile hidrojeller durotaksis çalışmalarında yararlı kanıtlanmış olsa da, substrat gerginliği yerel değişikliklere hemen, akut tepkiler bireysel hücre hareketleri ve subselliler sinyal olayları odaklanmış çalışma sağlar. Hücrelerin altta yatan substrat sertliğini algılama ve yanıt verme yeteneğini tekrar tekrar test etmek için, deforme edilebilir hidrojeller üzerinde kültürlenmiş bireysel hücrelere artan gerilimin akut degradelerinin uygulanması için değiştirilmiş bir yöntem kullanılır ve bu yöntem gerçek zamanlı olarak söz konusu hücrelere verilen sertlik degradelerinin gücü ve yönünün manipülasyonu. Ayrıca, mikropipetin şekli ve boyutları veya uygulanan degradenin göreceli konumu, yerleşimi ve yönü gibi tayın ayrıntılarını ve parametrelerini ince ayarlayarak, hassas hücre tipi ve sistemi. Bu parametreler, uygulanan uyaranları güvenilir bir şekilde değiştirmek ve talın işlevselliğini ve çok yönlülüğünü genişletmek için değiştirilebilir. Bu yöntem, değişen sertliğe yanıt olarak hem uzun süreli durotaktik hareketin hem de hücresel sinyalizasyon ve morfolojik dinamiklerde daha acil değişikliklerin incelenmesini sağlar.
Introduction
Son birkaç on yıl içinde, bir hücrenin çevremekanik özelliklerinin önemi hücre biyolojisinde giderek daha fazla tanıma kazanmıştır. Farklı dokular ve hücre dışı matrisler farklı göreceli sertliklere sahiptir ve hücreler vücuda göç ettikçe, bu değişiklikleri yönlendirirler, bu mekanik özellikleri kullanarak onlara rehberlik ederler1,2,3 , 4.2.2 , 5.000 , 6.000 , 7. Hücreler geliştirme, yara iyileşmesi ve kanser metastazı gibi süreçler sırasında onların hareketli davranış bilgilendirmek için belirli bir doku sertliği kullanın. Ancak, bu mekanik girdilerin hissi ve yanıt sağlayan moleküler mekanizmalar büyük ölçüde bilinmeyen kalır1,2,3,4,5, 6.000 , 7 .
Hücrelerin fiziksel çevresel ipuçlarına yanıt verme mekanizmalarını incelemek için, alt tabakanın alt tabakadaki katılığı veya sertliği manipüle edilmelidir. 2000 yılında, Chun-Min Lo, Yu-Li Wang ve meslektaşları değişen mekanik ipuçları için bireysel bir hücrenin hareketli yanıt doğrudan deforme ekstrasellüler matriks (ECM) kaplı poliakrilamid germe tarafından test edilebilir böylece bir test8 geliştirdi hücrelerin kaplandığı hidrojeller. Hücreler daha sert yüzeylere göç etmek için önemli bir tercih sergilerler, bu fenomen “durotaksis” olarak adlandırılır.
2000 yılında orijinal raporundan bu yana, birçok diğer teknikler durotaksis çalışmaları için istihdam edilmiştir. Dik sertlik degradeleri polistiren boncuklar9 veya sert polimer direkleri 10 gibi sert özellikleri üzerinde jeller döküm tarafından imal edilmiştir veya mekanik oluşturmak için bir cam kapakları11 kenarlarında substrat polimerize tarafından ‘ adım-sınırlar’. Alternatif olarak, sığ ama sabit sertlik gradyanları ile hidrojeller mikroakışkan cihazlar12tarafındanoluşturulan crosslinker gradyanları 12,13 veya yan yana hidrojel çözelti damlacıkları gibi çeşitli yöntemler tarafından imal edilmiştir farklı sertlik8, veya doğrusal sertlik gradyan oluşturmak için dereceli UV ışık maruziyeti ile tedavi fotoreaktif crosslinker ile hidrojeller14,15. Bu teknikler zaman içinde kitlesel durotaktik hücresel hareketi araştırmak için büyük etkisi kullanılmıştır. Ancak, tipik olarak bu özellikler hücre kaplaması öncesinde imal edilir ve özellikleri mekanik degradelerin örneklemesi için rastgele hücre hareketine güvenerek deney boyunca tutarlı kalır. Bu tekniklerin hiçbiri akut mekanik uyaranlara yanıt olarak hücresel davranışta hızlı değişikliklerin gözlemleneme elverişli değildir.
Mekanik ortamdaki akut değişikliklere hücresel tepkileri gözlemlemek için, tek hücreli durotaksis tahlilleri çeşitli avantajlar sunar. Bu tahlillerde, tek tek hücrelere, altta yatan substratı cam bir mikropipetle hücreden çekerek akut, mekanik bir uyarıcı verilir ve bu da hücre-matris geriliminin yön gradyanı nı ortaya çıkarır. Geçiş hızı veya yönü gibi hareketli davranıştaki değişiklikler daha sonra canlı hücre faz kontrast mikroskobu ile gözlenir. Bu yaklaşım, gerilim degradesinin yönünün ve büyüklüğünün hızlı, yinelemeli manipülasyonuna ve buna bağlı olarak değerlendirilmesine olanak sağladığından, mekanik uyaranlar ve hücre göçü arasındaki neden-sonuç ilişkilerinin doğrudan gözlemleni kolaylaştırır. gerçek zamanlı hücresel tepkiler. Ayrıca, bu yöntem, mechanosensing ve dahil olduğundan şüphelenilen proteinlerin miktarı, aktivitesi veya hücre altı lokalizasyonu değişiklikleri görselleştirmek için floresan füzyon proteinleri veya biyosensörler ifade hücreleri mekanik olarak uyarmak için kullanılabilir ve durotaksis.
Bu teknik durotaksis8,16 çalışma grupları tarafından istihdam edilmiştir ve burada Howe Laboratuvarı tarafından SKOV-3 yumurtalık kanseri hücrelerinin durotaktik davranışı ve moleküler mekanizmaları incelemek için adapte olduğu gibi tanımlanmıştır underly durotaxis17. Ayrıca, değiştirilmiş bir yöntem hücre kültürü yüzeyine yakın floresan mikroküreler tek, hatta tabaka ile hidrojellerin imalatı için açıklanmıştır; mikropipet tarafından üretilen gerinim gradyanlarının görselleştirilmesini ve optimizasyonunu kolaylaştırır ve çile kuvvet mikroskobu ile hücre kontraktilliğinin değerlendirilmesini sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada gösterildiği tekrarlanabilir, tek hücreli durotaksis titreşme akut mekanik ipuçlarına yanıt olarak bir hücrenin göç davranışını değiştirmek için yeteneğinin değerlendirilmesi sağlar. Bu teknik aynı zamanda floresan mikroskobu ve uygun füzyon proteinleri veya biyosensörler ile birlikte mekanik stimülasyon saniye içinde veya daha uzun bir zaman ölçeği sırasında hücre altı sinyalizasyon ve sitoskeletal olayları incelemek için kullanılabilir durotaktik hareket. Bir hücrenin çevresi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiçbiri.
Materials
| Acrylamide 40 % | National Diagnostic | EC-810 | |
| Ammonium Persulfate | Fisher | BP179-25 | |
| BD20A High frequency generator | Electro Technic Products | 12011A | 115 V - Handheld Corona Wand |
| Bind Silane (y-methacryloxypropyltrimethoxysilane) ( | Sigma Aldrich | M6514 | |
| Bis-acrylamide 2% | National Diagnostic | EC-820 | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Bransonic | 40 kHz frequency | |
| Coarse Manipulator | Narshige | MC35A | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM without phenol red | Sigma Aldrich | D5030 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | PC-10 | |
| Epidermal Growth Factor | Peprotech | AF-100-15 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Fetal Bovine Serum (Qualified One Shot) | Gibco | A31606-02 | |
| Fibronectin | EMD Millipore | FC010 | |
| Fluospheres Carboxylate 0.2 um | Invitrogen | F8810, F8807, F8811 | |
| Fugene 6 | Roche | 1815091 | 1.5 ug DNA / 6uL fugene 6 per 35mm dish |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Chemical | A38SI-212 | |
| Glass Bottom Dish | CellVis | D60-60-1.5-N | |
| Glass Coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72224-01 | 22 mm, #1.5 |
| HCl | JT Baker | 9535-03 | |
| Hellmanex III Special cleaning concentrate | Sigma Aldrich | Z805939 | Used at 2% in ddH2O for cleaning coverslips |
| HEPES powder | Sigma Aldrich | H3375 | Make 50mM HEPES buffer, pH 8.5 |
| Intelli-Ray 400 Shuttered UV Flood Light | Uviton International | UV0338 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | A417-4 | |
| Microforge | Narshige | MF900 | |
| Micromanipulator | Narshige | MHW3 | |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich | M5904 | |
| Nanopure Life Science UV/UF System | Barnstead | D11931 | ddH2O |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| OptiMEM | Invitrogen | 31985062 | |
| Parafilm M | Bemis Company, Inc | PM-992 | |
| PBS | 139 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 28.6 mM Na2HPO4, 1.6 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Platelet Derived Growth Factor-BB (PDGF-BB) | Sigma Aldrich | P4056 | |
| Ref52 | Rat embryonic fibroblast cell line; Culture in DMEM + 10% FBS | ||
| Ringer's Buffer | 134 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2.4 mM CaCl2, 20 mM HEPES, 5 mM D-Glucose, pH 7.4 | ||
| SKOV-3 | American Type Culture Collection | Culture in DMEM + 10% FBS | |
| Sulfo-SANPAH | Covachem | 12414-1 | |
| Tabletop Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281-50 |
References
- Acerbi, I., et al. Human breast cancer invasion and aggression correlates with ECM stiffening and immune cell infiltration. Integrative Biology (Camb. 7 (10), 1120-1134 (2015).
- Mekhdjian, A. H., et al. Integrin-mediated traction force enhances paxillin molecular associations and adhesion dynamics that increase the invasiveness of tumor cells into a three-dimensional extracellular matrix. Molecular Biology of the Cell. 28 (11), 1467-1488 (2017).
- Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
- Lange, J. R., Fabry, B. Cell and tissue mechanics in cell migration. Experimental Cell Research. 319 (16), 2418-2423 (2013).
- Davidson, L. A., Oster, G. F., Keller, R. E., Koehl, M. A. Measurements of mechanical properties of the blastula wall reveal which hypothesized mechanisms of primary invagination are physically plausible in the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Developmental Biology. 209 (2), 221-238 (1999).
- Li, D., et al. Role of mechanical factors in fate decisions of stem cells. Regenerative Medicine. 6 (2), 229-240 (2011).
- Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression. Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).
- Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Kuo, C. H., Xian, J., Brenton, J. D., Franze, K., Sivaniah, E. Complex stiffness gradient substrates for studying mechanotactic cell migration. Advanced Materials. 24 (45), 6059-6064 (2012).
- Breckenridge, M. T., Desai, R. A., Yang, M. T., Fu, J., Chen, C. S. Substrates with engineered step changes in rigidity induce traction force polarity and durotaxis. Cell and Molecular Bioengineering. 7 (1), 26-34 (2014).
- Goreczny, G. J., Wormer, D. B., Turner, C. E. A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro. Journal of Visualized Experiments. (102), e52949 (2015).
- Hartman, C. D., Isenberg, B. C., Chua, S. G., Wong, J. Y. Vascular smooth muscle cell durotaxis depends on extracellular matrix composition. Proceedings of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 113 (40), 11190-11195 (2016).
- Vincent, L. G., Choi, Y. S., Alonso-Latorre, B., del Alamo, J. C., Engler, A. J. Mesenchymal stem cell durotaxis depends on substrate stiffness gradient strength. Biotechnology Journal. 8 (4), 472-484 (2013).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PLoS One. 7 (10), e46107 (2012).
- Martinez, J. S., Lehaf, A. M., Schlenoff, J. B., Keller, T. C. Cell durotaxis on polyelectrolyte multilayers with photogenerated gradients of modulus. Biomacromolecules. 14 (5), 1311-1320 (2013).
- Plotnikov, S. V., Pasapera, A. M., Sabass, B., Waterman, C. M. Force fluctuations within focal adhesions mediate ECM-rigidity sensing to guide directed cell migration. Cell. 151 (7), 1513-1527 (2012).
- McKenzie, A. J., et al. The mechanical microenvironment regulates ovarian cancer cell morphology, migration, and spheroid disaggregation. Scientific Reports. 8 (1), 7228 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Grashoff, C., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- McKenzie, A. J., Campbell, S. L., Howe, A. K. Protein kinase A activity and anchoring are required for ovarian cancer cell migration and invasion. PLoS One. 6 (10), e26552 (2011).
- Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods in Cell Biology. 83, 29-46 (2007).
- Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. High-resolution traction force microscopy. Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).
- Knoll, S. G., Ali, M. Y., Saif, M. T. A novel method for localizing reporter fluorescent beads near the cell culture surface for traction force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (91), 51873 (2014).
