Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

doi: 10.3791/60017 Published: August 17, 2019

Summary

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Abstract

ATPase enzymen maken gebruik van de vrije energie opgeslagen in adenosinetrifosfaat om een grote verscheidenheid van endergonische biochemische processen in vivo te katalyseren die niet spontaan zouden optreden. Deze eiwitten zijn cruciaal voor in wezen alle aspecten van het cellulaire leven, met inbegrip van metabolisme, celdeling, reacties op veranderingen in het milieu en beweging. Het protocol hier gepresenteerd beschrijft een Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase assay die is aangepast aan de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecule ATPase remmers. De assay is toegepast op cardiale en skeletspier myosine II, twee actin gebaseerde moleculaire motor ATPases, als een bewijs van principe. De hydrolyse van ATP is gekoppeld aan de oxidatie van NADH door enzymatische reacties in de assay. Ten eerste wordt de door de ATPase gegenereerde ADP geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK). PK katalyseert de overgang van fosfoenolpyruvate (PEP) naar pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH), wat de oxidatie van NADH parallel katalyseert. Zo is de afname van de ATP-concentratie direct gecorreleerd aan de afname van de concentratie NADH, die wordt gevolgd door verandering in de intrinsieke fluorescentie van NADH. Zolang PEP beschikbaar is in het reactiesysteem, blijft de ADP-concentratie zeer laag, waardoor remming van het ATPase-enzym door zijn eigen product wordt vermeden. Bovendien blijft de ATP-concentratie vrijwel constant, wat lineaire tijdvakken oplevert. De fluorescentie wordt continu bewaakt, waardoor een eenvoudige schatting van de kwaliteit van de gegevens mogelijk is en helpt bij het filteren van mogelijke artefacten (bijvoorbeeld als gevolg van samengestelde neerslag of thermische veranderingen).

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Myosins zijn mechanochemische energie transducers die adenosinetrifosfaat (ATP) hydrolyseren om richtings bewegingen te genereren langs de filamenten van het actine cytoskelet in eukaryoten1,2. Ze hebben zowel structureel als kinetisch aangepast aan hun verschillende intracellulaire functies, zoals het transport van organellen, spiercontractie of de aanmaak van cytoskelet spanning1,2. De myosin superfamilie wordt vertegenwoordigd door ~ 40 myosin genen die behoren tot ~ 12 verschillende myosin klassen in het menselijk genoom3,4. Leden van de myosin klassen spelen verschillende rollen in een zeer diverse set van aandoeningen, zoals verschillende kankers, neurologische aandoeningen, skelet myopathieën, en Hypertrofische cardiomyopathie5,6. Gezien het grote aantal fysiologische en pathologische functies van deze moleculaire motoren, het is niet verwonderlijk dat ze steeds meer worden erkend als drugs doelen voor een verscheidenheid van voorwaarden7. Er is recentelijk aanzienlijke vooruitgang geboekt in de ontdekking van nieuwe myosine-remmers8,9,10 en Activators11, en om de eigenschappen van bestaande te verbeteren12, 13 , 14 , 15.

De Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is al lange tijd gebruikt om de ATPase-activiteit van verschillende enzymen te meten, zoals de sarcoplasmorische reticulum CA2 + pomp ATPase16, de DNA-reparatie ATPase RAD5417, de AAA + ATPase P9718 of de microtubulus motor kinesin19. Bij de assay wordt een ATP-regeneratiecyclus gebruikt. De adenosine difosfaat (ADP) gegenereerd door de ATPase wordt geregenereerd naar ATP door pyruvaat kinase (PK), die transformeert één molecule van fosfoenolpyruvate (PEP) pyruvaat parallel. Vervolgens wordt pyruvaatverlaagd tot lactaat door lactaat dehydrogenase (LDH). Dat, op zijn beurt, oxiderende een molecuul van NADH naar NAD. Daarom is de afname van de NADH-concentratie als functie van de tijd gelijk aan de ATP-hydrolysesnelheid. De ATP-regeneratiecyclus houdt de ATP-concentratie bijna constant en de ADP-concentratie laag zolang PEP beschikbaar is. Dit resulteert in lineaire tijd cursussen, waardoor het eenvoudig is om de initiële reactiesnelheden te bepalen en helpt bij het voorkomen van product remming door ADP19. Hoewel de NADH-gekoppelde ATPase-assay al is aangepast aan een 96-well formaat20, maken de hoge reactievolumes (~ 150 μL) het relatief duur vanwege de hoge vraag van reagentia, waardoor het minder vatbaar is voor een snelle screening van grote aantallen Verbindingen. Alternatieve methoden, zoals de Malachiet groene assay19,21, die berust op de opsporing van het fosfaat dat wordt geproduceerd door het ATPase-enzym, bleken geschikter te zijn voor miniaturisatie en screening met hoge doorvoer22 , 23 , 24. een eindpunt test heeft echter meer kans om beïnvloed te worden door verschillende artefacten (hieronder besproken), die onontdekt kunnen blijven bij afwezigheid van voltijdse cursussen.

Hier is de NADH-gekoppelde ATPase-assay geoptimaliseerd voor de semi-hoge doorvoer screening van kleine molecuul remmers. Skelet en cardiale spier myosine II en de myosin-remmers blebbistatine8, para-aminoblebbistatine13 en para-nitroblebbistatine12 worden gebruikt om de kracht van de test aan te tonen, die gebaseerd is op NADH fluorescentie als uitlezen. Dit protocol is vatbaar voor screening van projecten gericht op elke ADP-producerende enzymen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. voorbereiding van voorraadoplossingen en reagentia

  1. Bereid dithiotreïtol (DTT) stockoplossing door kristallijne DTT in gedestilleerd water op te lossen tot een eindconcentratie van 1000 mm. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  2. Bereid ATP-voorraadoplossing door het oplossen van kristallijne ATP in gedestilleerd water tot een eindconcentratie van 100 mM. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  3. Bereid 10x NADH buffer met 70 mM 3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur (MOPS), 10 mM MgCl2, 0,9 mm ethyleenglycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, n ′, n′-tetraazijnzuur (EGTA), en 3 mm Nan3. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Bewaren bij 4 °C.
  4. Bereid 1x myosin buffer met 10 mM MOPS en 0,1 mM EGTA. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Bewaren bij 4 °C. Voeg bovine serumalbumine (BSA) en DTT toe aan een eindconcentratie van 0,1% (w/v%) respectievelijk 1 mM, voor gebruik.
  5. Bereid 1x actine buffer met 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl2en 3 mm Nan3. Stel de pH in op 7,0 met 1 M NaOH-oplossing. Bewaren bij 4 °C. Voeg BSA en DTT toe aan een eindconcentratie van 0,1% (w/v%) respectievelijk 1 mM, voor gebruik.
  6. Bereid NADH stockoplossing door het oplossen van kristallijne NADH in 10x NADH buffer tot een uiteindelijke concentratie van 5,5 mM. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  7. Bereid PEP-voorraadoplossing voor door kristallijne PEP in 10x NADH-buffer op te lossen tot een eindconcentratie van 50 mM. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  8. Bereid LDH-voorraadoplossing door gelyofiliseerd LDH-poeder op te lossen in een mengsel van glycerol en 10x NADH-buffer (50%: 50%) tot een eindconcentratie van 2000 U/mL. Centrifugeer de oplossing om alle aanwezige onopgeloste eiwitten te verwijderen (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Breng het supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  9. Bereid de PK stockoplossing door het oplossen van gelyofiliseerd PK poeder in een mengsel van glycerol en 10x NADH buffer (50%: 50%) tot een eindconcentratie van 10000 U/mL. Centrifugeer de oplossing om alle aanwezige onopgeloste eiwitten te verwijderen (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Breng het supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis. Aliquot en bewaren bij-20 °C.
  10. Reconstitueer de gelyofiliseerd cardiale en skeletspier myosin II monsters door toevoeging van 100 μL gedestilleerd water voor het verkrijgen van 10 mg/ml stamoplossingen overeenkomend met ~ 37,9 μm en ~ 40,8 μM myosine concentraties (monomere), respectievelijk. Raadpleeg de instructies van de fabrikant voor meer informatie.
  11. Bereid F-actin van konijnen spier aceton poeder zoals beschreven door Pardee en Spudich25.

2. meten van ATPase-activiteiten en remmende effecten van kleine molecuul remmers

  1. Maak een samengestelde plaat.
    1. Los verbindingen van belang in kwalitatief hoogwaardig dimethylsulfoxide (DMSO).
    2. Maak vijftien stappen seriële 1:2 verdunningen vanaf 10 mM samengestelde concentratie in DMSO.
    3. Breng de monsters over in een 384-goed polypropyleen plaat in drievaten (12,5 μL elk) met behulp van een meerkanaals pipet. Gebruik twee rijen op de samengestelde plaat voor één samengestelde (in plaats van drie kolommen) om het aantal putten mogelijk beïnvloed door de randeffecten te minimaliseren. Gebruik de laatste drie putjes in de tweede rij voor elke verbinding als negatieve controle (alleen DMSO). Gebruik de eerste en laatste rij op de plaat niet voor samengestelde verdunningen.
    4. Breng pure DMSO over naar de putjes van de eerste rij (gereserveerd voor NADH kalibratie).
    5. Gebruik de laatste rij voor positieve controle.
      Opmerking: para-aminoblebbistatin bij een concentratie van 4 mm in DMSO werd hier gebruikt.
  2. Bereid 4500 μL van 20 μM verdunde actine oplossing voor elke test plaat (384-well Black-Wall polystyreen microplaat) door het verdunnen van de actine stockoplossing in de actine buffer. Meng de oplossing grondig door het pipetteren op en neer 30x met behulp van een 5 mL pipet om viscositeit en heterogeniteit te verminderen door het breken van actine filamenten. Centrifugeer de oplossing om eventueel neergeprecipiteerd eiwit aanwezig te verwijderen (7.197 x g, 20 °c, 10 min). Breng het supernatant voorzichtig over in een schone centrifugebuis.
  3. Bereid de Master mix met LDH en PK enzymen ("enzym mix"). Combineer voor elke test plaat 171,4 μL LDH-oplossing, 171,4 μL PK-oplossing en 3189,3 μL of 3252,9 μL myosine-buffer voor assays waarbij respectievelijk cardiale of skeletspier myosine II wordt gecombineerd in een conische centrifugebuis van 15 mL. Voeg geen myosin op dit punt om aggregatie en neerslag te voorkomen.
  4. Bereid de Master mix met alle ondergronden ("substraat mix"). Combineer voor elke plaat 162,1 μL ATP, 162,1 μL PEP en 324,1 μL NADH-oplossing in een conische centrifugebuis van 15 mL. Voeg actine niet toe op dit punt om aggregatie en neerslag te voorkomen.
  5. Maak zeven stappen seriële 1:2 verdunningen van NADH voor kalibratie vanaf 250 μM.
    1. Meng 12,3 μL NADH stockoplossing met 257,7 μL myosin buffer in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
    2. Aliquot 135 μL myosin buffer in zeven 1,5 mL micro centrifugebuizen.
    3. Breng 135 μL oplossing van de eerste buis naar de tweede en meng door pipetteren. Herhaal dit tot de 7-ste buis is bereikt.
    4. Gebruik de laatste buis als no-NADH Control (alleen buffer).
  6. Gebruik een pipet met 8 kanalen en breng 20 μL van de NADH-kalibratieoplossingen over in de eerste rij van de test plaat in triplicaten.
  7. Voeg 68 μL cardiale of 4,2 μL skeletspier myosine II toe aan het enzym mengsel. Vortex kort.
  8. Met uitzondering van de eerste rij, Doseer met behulp van een geautomatiseerde dispenser 8,4 μL van de bereide myosin-enzym mix in elke put van de test plaat.
  9. Breng 100 nL van oplossingen van de samengestelde plaat naar de test plaat met enzym mengsel met behulp van een geautomatiseerd vloeistof behandelingssysteem uitgerust met een 100 nL PIN gereedschaps hoofd.
  10. Schud de test plaat gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur bij 1200 TPM met behulp van een microplaat Shaker.
  11. Voeg 4.052 μL van de gecentrifugeerde actine-oplossing toe aan de substraat combinatie. Vortex kort.
  12. Verdeel 11,6 μL van de actin-substraat mix in elke put van de test plaat (behalve de eerste rij) om de enzymatische reactie te starten met behulp van een geautomatiseerde dispenser.
  13. Schud de test plaat gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur bij 1200 TPM met behulp van een microplaat Shaker.
  14. Centrifugeer de test plaat bij 101 x g gedurende 30 sec.
  15. Zorg ervoor dat de binnentemperatuur van de plaat lezer is gestabiliseerd bij 25 °C. Laad de plaat en schud voor nog eens 30 sec. Deze schud stap is nodig om de vorm van het vloeibare oppervlak in elke put vergelijkbaar te maken en zorgt ervoor dat de plaat de meettemperatuur kan bereiken.
  16. Record NADH fluorescentie gedurende 30 min het scannen van de plaat in 45 s intervallen. Gebruik een 380 nm, 10 nm bandbreedte excitatie filter en een 470 nm, 24 nm bandbreedte-emissie filter in combinatie met een 425 nm cut-off dichroïde spiegel. Voer de meting uit in de hoge-concentratie modus. Optimaliseer het aantal flitsen, de gain van de detector, de afmetingen van de plaat en de meet hoogte voordat u de assays uitvoert.
    Opmerking: de uiteindelijke testcondities zijn 300 nM cardiale/20 nM skeletspieren myosine II, 10 μM actin, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP in een buffer met 10 mM MOPS (pH = 7,0), 2 mM MgCl2 , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO en 1 mM DTT. Het totale volume is 20 μL/goed. De hoogste uiteindelijke samengestelde concentratie is 50 μM. 20 μM para-aminoblebbistatine in 0,5% DMSO dient als de positieve controle en 0,5% DMSO alleen is de negatieve controle. Alle metingen worden uitgevoerd in triplicaten.

3. gegevens analyseren

  1. Plot de waargenomen fluorescentie intensiteit tegen de tijd voor elke put.
  2. Voer eenvoudige lineaire regressie uit om de helling en het onderscheppen van de fluorescentie reacties voor elke put te bepalen. De helling is evenredig met de consumptie snelheid van ATP (NADH), terwijl het snijpunt evenredig is aan de NADH-concentratie aan het begin van de meting (t = 0 s).
  3. Bouw een ijkcurve voor NADH door het aftekenen te plotten verkregen voor de eerste rij van de plaat tegen de concentratie van NADH. Zorg ervoor dat de onderschept lineair afhankelijk zijn van de NADH-concentratie.
    Opmerking: de onderschept schatten de reële fluorescentie intensiteiten bij t = 0 s met veel meer vertrouwen dan het gemiddelde van de intensiteit van de ruwe fluorescentie op t ≈ 0 s.
  4. Voer eenvoudige lineaire regressie uit om de helling en het onderscheppen van de NADH kalibratie lijn te verkrijgen.
    Opmerking: het snijpunt beschrijft het fluorescentie-achtergrond signaal (geen NADH aanwezig), terwijl de helling overeenkomt met de geëxtregeerde/theoretische fluorescentie intensiteit van een 1 M NADH-oplossing in dat specifieke experiment.
  5. Verdeel de helling van de fluorescentie respons verkregen voor de rest van de putjes door de helling van de NADH kalibratie lijn om fluorescentie veranderingen te converteren naar ATP verbruikspercentages.
  6. Plot de ATP-verbruikspercentages tegen de concentratie van de remmer.
  7. Om remmende constanten te bepalen, moet u de juiste statistische software gebruiken om de dosis-responsgegevens aan te passen aan de volgende kwadratische vergelijking die overeenkomt met een eenvoudig één-op-één bindend evenwichtsmodel:
    Equation 1
    waarbij y het ATP verbruikspercentage is, ymin het ATP verbruiks tarief int de afwezigheid van remmer, ymax is het theoretische ATP verbruikspercentage bij 100% remming, KI is de remmende constante , [E]t en [I]t zijn de totale concentratie van het enzym (myosin) en inhibitor, respectievelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De standaardkaart voor screening-experimenten wordt weergegeven in Figuur 1. De eerste en laatste rij zijn gereserveerd voor NADH kalibratie en positieve controle (20 μM para-aminoblebbistatine, 0,5% DMSO), respectievelijk. De resterende rijen (B naar O) worden gebruikt om de remmende activiteit van verbindingen te testen. Hier worden vijftien stappen seriële 1:2 verdunningen vanaf 10 mM samengestelde concentratie in DMSO bereid en overgebracht van de samengestelde plaat naar de test plaat, zodanig dat de hoogste uiteindelijke samengestelde concentratie 50 μM (in 0,5% DMSO) op de test plaat is. Twee rijen worden gebruikt voor het verkrijgen van een dosis-responscurve voor één samengestelde (48 data Points/compound). Merk op dat de plaat layout kaarten opnieuw ontworpen kunnen worden om de specifieke doelstellingen van een bepaald project te ondersteunen. Bijvoorbeeld, als het doel was om single-point screening gegevens te verkrijgen voor een groot aantal verbindingen, kon men 112 verbindingen testen op een enkele 384-goed plaat met behulp van dezelfde lay-out voor positieve controle en NADH kalibratie (berekenen met triplicates voor elke samengestelde). Het is altijd aangeraden om een minimum van 3 data Points voor één samengestelde (of voor elke concentratie) en om te voorkomen dat het gebruik van de putjes langs de randen van de plaat voor een samengestelde, als deze data Points kunnen worden beïnvloed door de randeffecten. Om het belang van randeffecten te schatten, moet u altijd eerst een volledige plaat met negatieve controle uitvoeren.

De fluorescentie intensiteiten hebben een lineaire afhankelijkheid van de concentratie van NADH zoals weergegeven in Figuur 2a. De helling van de lineaire pasvorm wordt gebruikt tijdens data-analyse om fluorescentie veranderingen in reactiesnelheden om te zetten. Merk op dat de ruwe fluorescentie-intensiteit die voor elke put van de NADH-kalibratie is verkregen, eerst door lineaire regressie wordt geanalyseerd (een vergelijkbare analyse wordt weergegeven in Figuur 2b, C voor samengestelde gegevens). Deze sporen worden naar verwachting exponentieel verval in de loop van de tijd als gevolg van fotobleaching van de fluorophore. Fotobleaching is echter erg traag en daarom kunnen de onbewerkte gegevens worden geanalyseerd door lineaire passingen. De helling en het snijpunt van deze passingen komen overeen met de initiële snelheid van de fotobleaching en de intensiteit van de fluorescentie bij t = 0 s, respectievelijk. De onderschept van deze lineaire passingen worden gebruikt in plaats van het gemiddelde van de onbewerkte fluorescentie leest op t = 0 s om de NADH kalibratiecurve te construeren omdat de onderschept worden geschat op basis van meer gegevens en daarom zijn de bijbehorende fouten veel kleiner.

Figuur 2b,C toont aan dat ongeacht de gebruikte myosin of de aanwezigheid van de remmer, de tijdvakken lineair zijn in het tijdvenster van de metingen. De hoogste (50 μM) en laagste (0 μM) remmer-concentraties corresponderen respectievelijk met ~ 100% en 0% remming. Houd er rekening mee dat als gevolg van de hoeveelheid onbewerkte gegevens, de werkelijke analyse lijkt chaotisch als weergegeven op een enkel paneel. Daarom zijn deze panelen vereenvoudigd om het proces beter te visualiseren. Het gemiddelde van de Lees intensiteit van de ruwe fluorescentie werd berekend voor alle parallelle experimenten (triplicaten voor elke concentratie) en omgezet naar de NADH concentraties hier. Er worden slechts 3 remmers concentraties getoond. In de reële analyse wordt elke ruwe fluorescentie-intensiteit trace (48/compound getest) eerst geanalyseerd door lineaire regressie en vervolgens worden de hellingen omgezet in ATP verbruikspercentages.

Het is altijd raadzaam om aan te tonen dat de reactiepercentages lineair veranderen met de enzym concentratie, zoals weergegeven in figuur 2D en figuur2e voor respectievelijk SKELET en cardiale spier myosine II. Op basis van de lineaire passingen kan de uiteindelijke assay concentratie van het enzym eenvoudig worden geschat. Een reactiesnelheid van ~ 5 x 10-8 MS-1 wordt bijvoorbeeld aanbevolen voor tijdvakken van 30 minuten. Als een activator wordt gebruikt in de reactie mengsels (zoals actine hier), het wordt aanbevolen om de experimenten uit te voeren, zowel in de aanwezigheid en afwezigheid van de activator om ervoor te zorgen dat het verwachte effect (activering) aanwezig is. De voorwaarden en de procedure moeten het definitieve protocol zo nauwkeurig mogelijk volgen. Hier werd eerst een verdunningsreeks myosin bereid in de myosin-buffer in acht micro centrifuge-buizen. Vervolgens werd een mengsel van LDH-en PK-enzymen toegevoegd. Ten slotte werden de reacties gestart door het toevoegen van substraat mix aan elke buis parallel, met behulp van een multichannel pipet. Reactie mixen werden onmiddellijk overgebracht naar één rij van de test plaat in triplicaten. Als actine afwezig was, werd actine buffer in plaats daarvan gebruikt. Er zijn geen andere parameters gewijzigd (Zie de aantekening van stap 2,16 in het protocol voor de definitieve assay-voorwaarden).

Afbeelding 2F toont ATP verbruikspercentages verkregen voor meerdere negatieve en positieve controle Reacties (halve plaat elk). Deze gegevens kunnen worden vergeleken op basis van de Z ' waarde of "screening Window coëfficiënt"26, wat een veelgebruikte statistische parameter is om de kwaliteit van de hoge doorvoer testen te schatten. Het vergelijkt de positieve en negatieve controles door zowel de middelen als de standaarddeviaties in aanmerking te nemen:

Equation 2,

waar σn, σp en μn, μp de standaarddeviaties en middelen van de negatieve en positieve controles zijn, respectievelijk. De twee populaties zijn goed gescheiden als de Z ' waarde daalt tussen 0,5 en 1. A Z ' = 0,78 hier verkregen toont aan dat de test als uitstekend26kan worden beschouwd.

Om aan te tonen dat de test kan worden gebruikt om remmende constanten te bepalen, hebben de kleine molecule myosin-remmer blebbistatine8 en twee analogen, para-nitroblebbistatin12 en para-aminoblebbistatine13 hier gekozen, zoals weergegeven in Figuur 3a en Figuur 3b. Blebbistatine is een niet-concurrerende, allosterische myosine remmer27,28. Eén molecule van blebbistatin bindt aan één motor domein van myosin en blokkeert de ATPase-cyclus door het myosin-ADP-fosfaat complex27,28te stabiliseren. Daarom werden de remmende effecten van blebbistatin derivaten gemodelleerd met behulp van een eenvoudig, één-op-één bindend model hier (zie stap 3,7 in het Protocol). Merk op dat dit model mogelijk niet van toepassing was als de ATP-verbruikspercentages geen lineaire afhankelijkheid van myosin-concentratie hadden aangetoond (Zie figuur 2D,E). De kinetische waterige oplosbaarheid van blebbistatine, para-nitroblebbistatine en para-aminoblebbistatine is gerapporteerd als 426 μm, 3,6 μM en 9,3 μm, respectievelijk13. Er werden geen afwijkingen in het signaal waargenomen bij of onder de gemelde oplosbaarheid in onze experimenten; Er verschenen echter verschillende artefacten wanneer blebbistatine of para-nitroblebbistatine boven hun gerapporteerde oplosbaarheids waarden werd gebruikt, zoals weergegeven in Figuur 4. Daarom is het signaal dat is geregistreerd bij concentraties die hoger zijn dan de oplosbaarheid, in deze gevallen uitgesloten van de gegevensanalyse. Para-aminoblebbistatine is zeer goed oplosbaar, en daarom was oplosbaarheid in dat geval geen beperkende factor.

Ten slotte is het altijd aan te bevelen om te testen of de remmende effecten van positieve treffers specifiek zijn voor het doel-ATPase-enzym. Het gekoppelde reactiesysteem maakt gebruik van twee andere enzymen, LDH en PK, en remming van een van deze zou resulteren in een vals positief signaal. Het uitvoeren van de ATPase-test met een niet-verwant ATPase-enzym kan helpen om deze valse positieve hits te filteren (voor verdere aanbevelingen, zie discussie). Para-aminoblebbistatine en apyrase, een ATP hydrolyserende ENZYM dat ADP en anorganisch fosfaat29produceerde, werden hier als voorbeeld gebruikt om een dergelijk controle-experiment aan te tonen, zoals weergegeven in Figuur 5.

Figure 1
Figuur 1 : Indeling van de test plaat. Zeven stappen seriële 1:2 verdunningen van NADH vanaf 250 μM-concentratie wordt bereid en vervolgens in rij A in drievat voor kalibratie (zwart naar groen kleur verloop) afgeleverd. De laatste drie putjes van rij A bevatten alleen myosin-buffer (geen NADH-controle, wit). De laatste rij (P) wordt gebruikt voor de positieve controle (20 μM para-aminoblebbistatine; rood). Een typische dosis-respons-experiment vereist twee rijen (bijvoorbeeld B en C). Daarom kunnen 7 dosis-respons experimenten parallel worden uitgevoerd op een enkele 384-put (weergegeven door blauwe tot witte kleurverlopen). Elk monster wordt als triplicaten geladen. Hier beginnen de hoogste uiteindelijke samengestelde concentraties bij 50 μM (in 0,5% DMSO). De laatste drie putjes van elke tweede rij zijn gereserveerd voor de negatieve controle (geen compound, 0,5% DMSO alleen; cyaan). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : Representatieve ATPase-gegevens. A) eentweeledige verdunningsreeks van NADH werd voorbereid en overgebracht naar de eerste rij van elke meet plaat. De intensiteit van de fluorescentie werd gedurende 30 minuten geregistreerd en de onbewerkte gegevens werden geanalyseerd door eenvoudige lineaire regressie. Het snijpunt van elke regressielijn werd uitgezet tegen de concentratie van NADH. Merk op dat in een ideaal geval de intensiteit van de fluorescentie bij t = 0 s eenvoudig kan worden gebruikt om de kalibratie lijn te verkrijgen. Hoewel de onbewerkte fluorescentie gegevens zeer luidruchtig zijn, geven de onderschept een nauwkeurige schatting van de intensiteit van de fluorescentie bij t = 0 s en de bijbehorende standaardfout (weergegeven als foutbalken) is erg klein. (B,C) Representatieve fluorescentie intensiteit sporen van de skelet (B) en cardiale (C) spier myosine II ATPase reacties werden geregistreerd in de aanwezigheid van verschillende niveaus (Zie insets) van para-aminoblebbistatine. Voor het gemak vertegenwoordigen gegevenspunten en foutbalken respectievelijk het gemiddelde van drie onafhankelijke metingen en de bijbehorende standaarddeviatie. Eenvoudige lineaire regressie werd uitgevoerd (ononderbroken lijnen) om reactiesnelheden te verkrijgen. Merk op dat een typische dosis-respons-experiment bestaat uit 15 verschillende remmers concentraties en negatieve controle in triplicaten op de meet plaat (Zie Figuur 1) en de lineaire regressie wordt individueel uitgevoerd voor elke fluorescentie Trace intensiteit. Voor het gemak worden hier slechts 3 verschillende concentraties getoond. (D,E) Basale (rode) en actin-geactiveerde (blauw) ATPase-percentages werden bepaald voor verschillende skelet (D) en cardiale (E) spier myosine II concentraties. De ATPase-tarieven vertonen een lineaire afhankelijkheid van de myosine-concentratie. F) positieve (rode) en negatieve (blauwe) besturingselementen (elk halve plaat) werden parallel uitgevoerd op een 384-well-test plaat en de z-factor (z ') werd berekend om de kwaliteit van de ATPase-test te beoordelen. Een Z ' waarde van 0,78 duidt op een betrouwbare assay met zeer goed gescheiden positieve en negatieve controles. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 : Dosis-respons curves en analyse van remmende constanten. Cardiale (A) en skelet (B) spier myosine II werden gebruikt voor het testen van de remmende activiteit van blebbistatine, para-aminoblebbistatine en para-nitroblebbistatine. ATPase-tarieven (blauw) werden verkregen door eenvoudige lineaire regressie toe te passen op de onbewerkte fluorescentie gegevens. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van de fitting en werden gebruikt als wegingsfactoren tijdens het monteren van een kwadratische vergelijking (zie stap 3,7 in het Protocol) die een eenvoudig evenwichts bindend model (rood) representeren. Gegevens verkregen boven de oplosbaarheid werd beïnvloed door artefacten en uitgesloten van analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 : Oplosbaarheid-gerelateerde artefacten. A) sporen van fluorescentie intensiteit voor blebbistatine verkregen bij een ATPase-assay met behulp van skeletspieren MYOSIN II vertonen lineair afnemende signaal afhankelijk van de hoeveelheid aanwezige remmer (blauw). Echter, wanneer blebbistatine werd gebruikt boven de oplosbaarheid (50 μM initiële blebbistatine concentratie), een toename van het signaal werd waargenomen (rood), hoogstwaarschijnlijk te wijten aan de vorming van fel fluorescerende blebbistatine kristallen13. B) in het geval van para-nitroblebbistatine, een niet-fluorescerende analogon van blebbistatine12, werden de ruwe fluorescentie-intensiteit sporen normaal (afnemend). Echter, het hoogste niveau van remming was veel lager dan verwacht (op basis van de positieve controle). Daarom werden alleen de reactiepercentages verkregen onder oplosbaarheid (blauw) opgenomen in de gegevensanalyse. Reactiepercentages verkregen boven de oplosbaarheid (rood) afwijken van de vastgestelde dosis-responscurve (groen), aangezien de neerslag de hoeveelheid (concentratie) van de in de oplossing resterende remmer beperkt. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5 : Remmende effecten van para- aminoblebbistatine in skeletspieren myosin II en apyrase ATPase assays. Para-aminoblebbistatine remde skeletspieren MYOSINE II met een KI van 1,7 μM, terwijl er geen remming werd waargenomen toen apyrase29 werd gebruikt als een ATPase in hetzelfde gekoppelde reactiesysteem. Dit experiment toont duidelijk aan dat para-aminoblebbistatine specifiek is voor myosine en geen REMMING van PK of LDH, dus het gedetecteerde remmende effect is geen artefact. Apyrase werd gebruikt bij een concentratie van 0,5 nM. Er was geen myosine of actine aanwezig en de reactie werd uitgevoerd in een buffer met 100 mM MOPS (pH = 7,0), 3 mM CaCl2, 2 mm MgCl2, 3 mm Nan3, 1 mm DTT en 0,1% BSA. Er zijn geen andere wijzigingen aangebracht in het protocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritieke stappen in het Protocol

Optimaliseer de plaat indeling door meerdere platen met alleen negatieve controle uit te voeren (ATPase-reactie zonder remmer). Inspecteer de resultaten zorgvuldig op patronen in reactiesnelheden. Deze kunnen bijvoorbeeld voortvloeien uit randeffecten en/of onvolkomenheden in de hydrofiele oppervlaktecoating van "niet-bindende" platen. Als een patroon wordt waargenomen, wijzigt u het plaat type en/of de plaat indeling om de artefacten te minimaliseren. Bijvoorbeeld, een typische dosis-responscurve (16 concentraties met triplicaten, 48 punten totaal) kan ofwel gerangschikt worden in drie kolommen of twee rijen op een 384-well plaat. Deze regelingen opleveren respectievelijk 6 en 4 Data Points, die waarschijnlijk worden beïnvloed door randeffecten. Daarom heeft de rijregeling altijd de voorkeur.

Wijzigingen en probleemoplossing

Merk op dat de waargenomen fluorescentie responsen lineair moeten zijn gedurende de volledige tijd-verloop van de reactie. Niet-lineariteiten kunnen optreden in de eerste paar minuten als gevolg van thermische veranderingen of in de laatste paar minuten als gevolg van het bereiken van evenwicht. Als er niet-lineariteiten aanwezig zijn, kan men de reactieparameters aanpassen (bijv., verdunde myosine, verander de meettemperatuur) of beperk de analyse tot het lineaire deel van de gegevens.

Niet-lineariteiten kunnen ook aanwezig zijn aan het begin van de reacties als de binding van de remmer aan het ATPase-enzym traag is (optredend gedurende minuten). In dit geval wordt verwacht dat de reactie na verloop van tijd vertraagt naarmate het enzym-remmer complex zich ophoveert. Inincuberen van de test plaat voordat u de substraat combinatie toevoegt om dit probleem te voorkomen.

De testcondities moeten zo worden gekozen dat het lineaire deel van de reacties langer is dan 15 minuten. Kortere lineaire delen komen overeen met minder nuttige datapunten (< 20, omdat het scannen van het hele plaatje ~ 45 seconden duurt). Daarom, de lineaire past rendement minder betrouwbare hellingen (reactiesnelheid) met veel hogere standaardfouten. Aan de andere kant wordt het niet aanbevolen om kinetische leesbewerkingen langer dan ~ 120 minuten te verkrijgen. Dergelijke experimenten kunnen worden beïnvloed door eiwit denaturatie of concentratieveranderingen als gevolg van oplosmiddel verdamping. Deze criteria kunnen het meest gemakkelijk worden bereikt door de myosine-concentratie aan te passen.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de reacties gekatalyseerd door PK en LDH geen snelheidsbeperking zijn in het gekoppelde reactiesysteem. Controle-experimenten uitgevoerd zonder de ATPase van belang of op hoge niveaus van een krachtige ATPase-remmer zou geen (of weinig) activiteit vertonen. De toevoeging van ADP zou echter resulteren in een snelle afname van het signaal als LDH en PK actief zijn en correct werken. Het percentage NADH-verbruik wordt naar verwachting zeer hoog in dit controle-experiment, dus het is van cruciaal belang om zo snel mogelijk te beginnen met de detectie nadat de reactie is geïnitieerd door de toevoeging van ADP.

Het wordt altijd aanbevolen om de waargenomen ATPase-percentages die boven de oplosbaarheid van de remmer zijn verkregen uit de gegevensanalyse uit te sluiten. Aangezien de oplosbaarheid afhangt van de temperatuur, zuiverheid van de verbinding en verschillen in de samenstelling van de oplossing, wordt het ten zeerste aanbevolen om het te meten onder omstandigheden die sterk lijken op de werkelijke omstandigheden (temperatuur, buffer, enz.) onder de ATPase-test wordt uitgevoerd. Een poging om kleine molecuul remmers boven de oplosbaarheid te gebruiken kan leiden tot neerslag die de resultaten kan beïnvloeden (Zie Figuur 4). Neerslag beperkt de concentratie van de stof op of nabij oplosbaarheid. Daarom kunnen de tarieven van de ATPase niet verder worden verlaagd door meer remmer toe te voegen. Met behulp van een goede positieve controle die toont ~ 100% remming, daarom, kan helpen om dergelijke anomalieën in het signaal te identificeren, zelfs als de oplosbaarheid onbekend is. Een groot verschil tussen de waargenomen reactiesnelheid van de positieve controle en de reactiesnelheid die behoren tot het maximale remmings niveau (IMax), bepaald door montage, is altijd een goede indicatie van het probleem. Geleidelijke uitsluiting van meer en meer gegevens van de analyse en/of het gebruik van de positieve controle als ikMax en houden het vast tijdens het montage proces totdat een betere pasvorm wordt verkregen wordt aanbevolen in dergelijke gevallen. De neerslag van de remmer kan ook resulteren in sterke lichtverstrooiing en kan ook de optische eigenschappen van de remmer veranderen, wat leidt tot abnormaal hoge waargenomen signaal intensiteiten aan het begin van reacties en/of toenemende signalen na verloop van tijd. Onbewerkte gegevens moeten altijd zorgvuldig worden geïnspecteerd en de betrokken concentraties moeten worden uitgesloten van de analyse.

Beperkingen van de methode

De uiteindelijke testconcentratie voor ATPases met een laag aantal omzet (bijv. cardiale spier myosine II) moet hoog zijn (enkele honderden nM) om meetbare reactiepercentages te bereiken binnen het tijdsvenster van de test (30 − 120 minuten). Daarom is het misschien belangrijk om het quadratische bindings model te gebruiken voor de analyse van dosis-respons curven. Andere bindende modellen (hyperbolische, heuvel) zijn meestal niet geschikt voor de analyse van dergelijke gegevens. Bovendien stelt de concentratie van de ATPase een ondergrens aan het bereik van meetbare remmende constanten, omdat de dosisrespons curves in de praktijk niet te onderscheiden zijn als gevolg van de aanwezigheid van experimentele fouten als de KI dicht bij of kleiner is dan de concentratie van de ATPase.

Verschillen in samengestelde potenties moeten altijd worden gekwantificeerd door dosis-respons experimenten uit te voeren en de remmende constanten te bepalen. Hoewel single point screening gegevens deze verschillen in theorie weerspiegelt, zou de niet-lineariteit van de reacties, samen met de experimentele fout, het uiterst moeilijk maken om een dergelijke analyse uit te voeren. Single Point screening experimenten moeten worden ontworpen om zelfs de relatief zwakke remmers met een hoog vertrouwen vast te leggen door te kiezen voor een geschikte remmer concentratie en een vooraf gedefinieerd drempel respons niveau om onderscheid te maken tussen actieve en inactieve Verbindingen.

Vaststellen dat de verschillen tussen de remmende constanten statistisch significant zijn, wordt het best uitgevoerd door de vergelijking voor niet-lineaire regressie opnieuw te schrijven om pKi (-LogkI) te bepalen in plaats van Ki, aangezien PKi normaal gedistribueerd, terwijl KI niet30is. De onzekerheid voor pKi is symmetrisch, terwijl het niet symmetrisch is voor Ki31. Betrouwbaarheidsintervallen kunnen worden berekend voor pKi en t-test of variantieanalyse (ANOVA) kunnen worden gebruikt om te bepalen of de middelen van PKi -metingen significant verschillend zijn. Echter, voorzichtigheid moet worden betracht bij het uitvoeren van een dergelijke statistische test als ze veronderstellen homoscedasticity (dezelfde variantie van gegevens in groepen). Men kan hogere variantie verwachten geassocieerd met pKI wanneer een volledige dosis-responscurve niet kan worden verkregen als gevolg van samengestelde oplosbaarheid problemen. In dit geval moeten andere geschikte statistische tests worden gebruikt die geen gelijke varianties (bijv. de t-toets van Welch) aannemen.

Elke verbinding die PK of LDH remt, zou een vals positief signaal geven in de NADH-gekoppelde ATPase-assay. Sommige van deze valse positieven kunnen worden geïdentificeerd door het uitvoeren van de test met een niet-verbonden ADP-producerende enzym. In dit geval kan geen remming voor echte positieve treffers worden verwacht, tenzij de remmer een ATP-analoge binding aan beide enzymen is. Om een dergelijke analyse aan te tonen, hebben we een ATPase-assay uitgevoerd met para-aminoblebbistatine en apyrase, een ATP-hydrolyserende enzym dat geen verband zou houden met myosines (Zie Figuur 5). Als alternatief kan een andere functionele assay die specifiek is voor het enzym van belang, of een andere ATPase-assay die geen gebruik maakt van PK en LDH, worden uitgevoerd om onderscheid te maken tussen reële en valse positieve treffers (bijv. de Malachiet groene test).

Meting en analyse van de kinetiek van de intensiteit van de fluorescentie in alle putjes vereisen een plaat lezer die snel genoeg is om de hele plaat te scannen in minder dan ~ 90 − 60 seconden.

Betekenis van de methode met betrekking tot bestaande/alternatieve methoden

In tegenstelling tot de "traditionele" extinctie-gebaseerde uitlezing16,17,18,19,20, de gemodificeerde NADH-gekoppelde ATPase assay hier gepresenteerd berust op NADH fluorescentie. Dit maakt de assay gevoeliger, waardoor de gebruiker de excitatie lichtintensiteit kan verminderen en daarmee NADH of de remmers tegen fotochemische ontleding beschermt.

Hoewel de assay over het algemeen niet geschikt is voor het hanteren van een groot aantal monsters32, is de kleine reactievolumes die hier zijn bereikt (20 μL) in een 384-well formaat vatbaar voor semi-hoge doorvoer screenings toepassingen, in het bijzonder Als de bepaling van remmende constanten wordt overwogen.

Alternatieve methoden zijn meestal afhankelijk van de detectie van het anorganische fosfaat dat door het ATPase-enzym wordt geproduceerd. Zo kan [γ-32P] ATP worden gebruikt als substraat voor de ATPase en vervolgens kan het bevrijde anorganische fosfaat worden gemeten op basis van de radioactiviteit. De test is gevoelig; het vereist echter de behandeling van radioactieve stoffen en de resterende ATP moet worden gescheiden van het anorganische fosfaat (bijvoorbeeld door adsorptie van ATP op houtskool)33. In de bovengenoemde Malachiet groene test, reageert fosfaat met molybdaat onder zure omstandigheden en het resulterende fosfaolybdaat complex bindt de Malachiet groene kleurstof waardoor een verschuiving in het absorptiespectrum19,21, 22,23,24. Deze methode vereist ook het afschrikken van de ATPase-reactie; Daarom wordt het meestal gebruikt als eindpunt-Assay, vooral in hoge doorvoer indeling. In tegenstelling tot de continue monitoring van de ATPase-reactie in de NADH-gekoppelde Assay, veronderstelt een eindpunt test simpelweg lineaire tijd cursussen en kan artefacten die leiden tot niet-lineariteiten niet onthullen. Verbindingen interactie met Malachiet groen of het complex gevormd kan ook leiden tot artefacten21. Bovendien is de Malachiet groene test zeer gevoelig voor fosfaat besmetting24. Daarentegen is de NADH-gekoppelde assay niet gevoelig voor ADP-besmetting omdat ADP (dat altijd aanwezig is op verschillende niveaus in ATP-monsters) snel wordt omgezet in ATP door PK aan het begin van de reactie. Er is geen behoefte aan afschrikken of scheiden van de producten. Een andere fluorometrische test voor het meten van de ATPase-percentages is al ontwikkeld door de ATP-hydrolyse te koppelen aan de reactie gekatalyseerd door nucleoside fosforylase34. Deze assay maakt echter geen gebruik van een ATP-regeneratiecyclus, waardoor de bepaling van de initiële reactiesnelheid veel uitdagender kan zijn.

Toekomstige toepassingen of richtingen van de methode

Veel enzymen die vertrouwen op ATPase activiteit zijn onderzocht als potentiële drug targets. Deze omvatten cytoskelet motorische eiwitten die behoren tot de kinesin35 en dynein families36 en het DNA helicases37, die allemaal de Terminal Effectors in diverse signalering trajecten. De hier beschreven bepaling kan gemakkelijk worden geoptimaliseerd voor geneesmiddelen ontdekking en ontwikkelingsprojecten waarbij elk enzym een reactie waarbij ADP een product is, katalyseert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door een subsidie van het National Institute of neurologische aandoeningen en beroerte en National Institute on drug abuse NS096833 (CAM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17, (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125, (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12, (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6, (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8, (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39, (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43, (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299, (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351, (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1, (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53, (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3'-hydroxyblebbistatin and (S)-3'-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15, (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71, (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277, (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24, (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321, (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7, (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169, (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327, (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279, (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12, (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31, (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161, (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52, (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307, (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266, (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment? Oncotarget. 7, (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11, (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. Jr New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).
Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).More

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter