JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biochemistry

En semi-High-gennemløb tilpasning af NADH-koblede ATPase assay til screening små molekyle hæmmere

Published: August 17, 2019
doi:
10.3791/60017
, , , ,
1Department of Molecular Medicine,The Scripps Research Institute, 2Department of Neuroscience,The Scripps Research Institute, 3Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI,National Institutes of Health

Summary

En nicotinamid-adenin dinucleotid (NADH)-koblet ATPase-analyse er blevet tilpasset til halvhøj gennemløbs screening af små molekyle myosin-hæmmere. Denne kinetiske analyse køres i et 384-brønd mikroplade format med samlet reaktions volumen på kun 20 μL pr. brønd. Platformen bør gælde for stort set alle ADP-producerende enzymer.

Abstract

ATPase enzymer udnytte den frie energi lagret i adenosin trifosfat at katalysere en bred vifte af endergonic biokemiske processer in vivo, der ikke ville forekomme spontant. Disse proteiner er afgørende for væsentlige alle aspekter af cellulære liv, herunder metabolisme, celledeling, reaktioner på miljømæssige ændringer og bevægelse. Protokollen præsenteres her beskriver en nicotinamid adenin dinucleotid (NADH)-koblet ATPase assay, der er blevet tilpasset til semi-høj gennemløb screening af små molekyle ATPase hæmmere. Analysen er blevet anvendt til hjerte-og skeletmuskulatur myosin II, to actin-baserede molekylære motor ATPases, som et bevis på princippet. Hydrolyse af ATP er koblet til oxidation af NADH ved enzymatiske reaktioner i analysen. For det første er ADP genereret af ATPase regenereret til ATP af pyruvatkinase (PK). PK katalyserer overgangen af fosfoenolpyruvat (PEP) til pyruvat parallelt. Efterfølgende, pyruvat er reduceret til laktat af lactat dehydrogenase (LDH), som katalyserer oxidation af NADH parallelt. Således, faldet i ATP koncentration er direkte korreleret til faldet i NADH koncentration, som efterfølges af ændring af den iboende fluorescens af NADH. Så længe der findes PEP i reaktionssystemet, er ADP-koncentrationen fortsat meget lav, hvilket forhindrer, at ATPase-enzymet hæmmes af sit eget produkt. Desuden er ATP-koncentrationen stadig næsten konstant, hvilket giver lineære tids kurser. Fluorescensen overvåges kontinuerligt, hvilket gør det let at anslå datakvaliteten og hjælper med at bortfiltrere potentielle artefakter (f. eks. som følge af sammensatte udfældning eller termiske ændringer).

Introduction

Myosins er mekaniske kemiske energi transducere, der hydrolyserer adenosin trifosfat (ATP) til at generere retningsbestemt bevægelse langs filamenterne af actin cytoskelet i eukaryoter1,2. De har både strukturelt og kinetisk tilpasset deres forskellige intracellulære funktioner, såsom transport af organeller, muskelsammentrækning eller generering af cytoskelet spænding1,2. Myosin super Family er repræsenteret ved ~ 40 myosin gener, der tilhører ~ 12 forskellige myosin klasser i det menneskelige genom3,4. Medlemmer af myosin klasser spiller forskellige roller i en meget forskelligartet sæt af lidelser, såsom flere kræftformer, neurologiske lidelser, skelet myopatier, og hypertrofisk kardiomyopati5,6. I betragtning af det store antal fysiologiske og patologiske funktioner i disse molekylære motorer, er det ikke overraskende, at de bliver mere og mere anerkendt som Drug mål for en række betingelser7. Der er gjort betydelige fremskridt for nylig i opdagelsen af nye myosin-hæmmere8,9,10 og aktivatorer11, og for at forbedre egenskaberne for de eksisterende12, 13 , 14 , 15.

Nicotinamid-adenin dinucleotid (NADH)-koblet ATPase-assay har længe været anvendt til at måle ATPase-aktiviteten af forskellige enzymer, såsom sarcoplasmisk reticulum ca2 + pumpe ATPase16, DNA-reparationen ATPase Rad5417, AAA + ATPase p9718 eller mikrotubulen motorisk kinesin19. Analysen anvender en ATP-regenereringscyklus. Adenosindiphosphat (ADP) genereret af ATPase regenereres til ATP af pyruvatkinase (PK), som forvandler et molekyle af phosphoenolpyruvat (PEP) til pyruvat parallelt. Efterfølgende reduceres pyruvat til laktat ved lactat dehydrogenase (LDH). Det, til gengæld, oxiderer et molekyle af NADH til NAD. Derfor er faldet i NADH-koncentrationen som en funktion af tid lig med ATP Hydrolysehastigheden. ATP-regenererings cyklussen holder ATP-koncentrationen næsten konstant, og ADP-koncentrationen er lav, så længe PEP er tilgængelig. Dette resulterer i lineære tids kurser, hvilket gør det enkelt at bestemme de indledende reaktions rater og hjælper med at undgå produkt hæmning af ADP19. Selv om den NADH-koblede ATPase-analyse allerede er blevet tilpasset til et 96-Well-format20, gør de høje reaktions volumener (~ 150 μl) det relativt dyrt på grund af den høje efterspørgsel efter reagenser, hvorved det bliver mindre modtagelig for hurtig screening af et stort antal Forbindelser. Alternative metoder, såsom malachite grøn assay19,21, som bygger på påvisning af fosfat produceret af ATPase enzym, blev vist sig mere egnet til miniaturisering og High-gennemløb screening22 , 23 , 24. det er dog mere sandsynligt, at en endepunkts analyse påvirkes af flere artefakter (diskuteret nedenfor), som kan forblive uopdagede i fravær af fuldtids kurser.

Her, den NADH-koblede ATPase assay er blevet optimeret til semi-høj gennemløb screening af små molekyle hæmmere. Skelet-og hjertemusklen myosin II og myosin-inhibitorer blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 og para-nitroblebbistatin12 anvendes til at PÅVISE analysens effekt, som er afhængig af NADH Fluorescens som en udlæser. Denne protokol kan anvendes til screening af projekter, der fokuserer på alle ADP-producerende enzymer.

Protocol

1. klargøring af stamopløsninger og reagenser Forbered ditiotreitol (DTT) stamopløsning ved at opløse krystallinsk DTT i destilleret vand til en endelig koncentration på 1000 mm. Justér pH til 7,0 med 1 M NaOH opløsning. Opbevares ved-20 °C. Forbered ATP stamopløsning ved at opløse krystallinsk ATP i destilleret vand til en endelig koncentration på 100 mM. Justér pH til 7,0 med 1 M NaOH opløsning. Opbevares ved-20 °C. Forbered 10x NADH buffer indeholdende 70 mM 3-(N-morpholino)…

Representative Results

Det typiske plade kort, der anvendes til screening af eksperimenter, er vist i figur 1. Den første og sidste række er forbeholdt NADH kalibrering og positiv kontrol (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), hhv. De resterende rækker (B til O) anvendes til at teste forbindelsers hæmmende aktivitet. Her tilberedes og overføres femten-trins serie 1:2 fortyndinger, der starter fra 10 mM sammensat koncentration i DMSO, fra den sammensatte plade til…

Discussion

Kritiske trin i protokollen

Optimer plade layoutet ved at køre flere plader med kun negativ kontrol (ATPase-reaktion uden inhibitor). Undersøg resultaterne omhyggeligt for mønstre i reaktionshastigheder. For eksempel kan disse opstå fra kanteffekter og/eller ufuldkommenheder i hydrofile overfladebelægning af “ikke bindende” plader. Hvis der observeres et mønster, skal du ændre plade type og/eller plade layout for at minimere artefakterne. For eksempel kan en typisk dosi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra det nationale Institut for neurologiske lidelser og slagtilfælde og National Institute on Drug Abuse NS096833 (CAM).

Materials

384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3′-hydroxyblebbistatin and (S)-3′-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?. Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).

Tags

ATPase AssayNADH-coupledSemi-high-throughput ScreeningActinMyosin IIEnzyme InhibitorsCalibrationPositive And Negative Controls

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image