JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

Published: August 17, 2019
doi:
10.3791/60017
, , , ,
1Department of Molecular Medicine,The Scripps Research Institute, 2Department of Neuroscience,The Scripps Research Institute, 3Laboratory of Molecular Physiology, NHLBI,National Institutes of Health

Summary

En nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH)-kopplad ATPas-analys har anpassats till semihigh genomströmning screening av små molekyler myosin-hämmare. Denna kinetiska analys körs i ett 384-väl mikroplattformat med totala reaktions volymer på endast 20 μL per brunn. Plattformen bör vara tillämplig på praktiskt taget alla ADP-producerande enzym.

Abstract

ATPas enzymer utnyttja den fria energi som lagras i adenosintrifosfat att katalysera en mängd olika endergonic biokemiska processer in vivo som inte skulle inträffa spontant. Dessa proteiner är avgörande för i huvudsak alla aspekter av cellulära liv, inklusive metabolism, celldelning, svar på miljöförändringar och rörelse. Det protokoll som presenteras här beskriver en nikotinamid-adenin-dinukleotid (NADH)-kopplad ATPas-analys som har anpassats till semi-High genomströmning screening av små molekyler ATPas hämmare. Analysen har tillämpats på hjärt-och skelettmuskulaturen myosin II: s, två Actin-baserade molekylära motor ATPases, som ett bevis på princip. Hydrolys av ATP är kopplad till oxidation av NADH genom enzymatiska reaktioner i analysen. Först, ADP genereras av ATPas regenereras till ATP av pyruvatkinas (PK). PK katalyserar övergången av fosfoenolpyruvat (PEP) till Pyruvat parallellt. Därefter, pyruvat reduceras till laktat av laktatdehydrogenas (LDH), som katalyserar oxidation av NADH parallellt. Sålunda, minskningen i ATP koncentrationen är direkt korrelerad till minskningen i NADH koncentration, som följs av förändring till den inneboende fluorescensen av NADH. Så länge som PEP finns i Reaktionssystemet förblir ADP-koncentrationen mycket låg, vilket undviker hämning av enzymet ATPas av sin egen produkt. Dessutom förblir ATP koncentrationen nästan konstant, vilket ger linjära tidsförlopp. Fluorescensen övervakas kontinuerligt, vilket möjliggör enkel uppskattning av kvaliteten på data och hjälper till att filtrera bort potentiella artefakter (t. ex. till följd av sammansatt nederbörd eller termiska förändringar).

Introduction

Myosins är mechanochemical energigivare som hydrolysera adenosintrifosfat (ATP) att generera riktad rörelse längs glödtrådar av aktin cytoskelettet i Eukaryoter1,2. De har både strukturellt och Kinetically anpassas till deras olika intracellulära funktioner, såsom transport av organeller, muskelkontraktion eller generering av cytoskeletala spänningar1,2. Den myosin superfamiljen representeras av ~ 40 myosin gener som tillhör ~ 12 distinkta myosin klasser i den mänskliga arvsmassan3,4. Medlemmar av myosin klasserna spelar olika roller i en mycket varierande uppsättning av sjukdomar, såsom flera cancerformer, neurologiska sjukdomar, skelett myopatier, och hypertrofisk kardiomyopati5,6. Med tanke på det stora antalet fysiologiska och patologiska funktioner av dessa molekylära motorer, är det inte förvånande att de blir alltmer erkända som narkotika mål för en mängd olika villkor7. Betydande framsteg har gjorts nyligen i upptäckten av nya myosin-hämmare8,9,10 och aktivatorer11, och för att förbättra egenskaperna hos de befintliga12, 13 , fjorton , 15.

Den nikotinamid adenin–dinukleotid (NADH)-kopplad ATPas-analys har länge använts för att mäta ATPas aktivitet av olika enzymer, såsom sarkoplasmatiska nätmagen ca2 + pump ATPas16, DNA reparation ATPas Rad5417, AAA + ATPas p9718 eller mikrotubuli motor kinesinet19. Analysen sysselsätter en ATP förnyelsecykel. Adenosindifosfat (ADP) som genereras av ATPas regenereras till ATP av pyruvatkinas (PK), som omvandlar en molekyl av fosfoenolpyruvat (PEP) till Pyruvat parallellt. Därefter reduceras pyruvat till laktat genom laktatdehydrogenas (LDH). Det, i sin tur, oxiderar en molekyl av NADH till NAD. Minskningen av NADH-koncentrationen som en funktion av tiden är därför lika med ATP-Hydrolyshastigheten. ATP-regenereringscykeln håller ATP-koncentrationen nästan konstant och ADP-koncentrationen låg så länge som PEP är tillgänglig. Detta resulterar i linjära tidsförlopp, vilket gör det enkelt att fastställa de initiala reaktions frekvenserna och hjälper till att undvika produkt hämning av ADP19. Även om den NADH-kopplade ATPas-analysen redan har anpassats till en 96-brunn format20, den höga reaktions volymer (~ 150 μl) gör det relativt dyrt på grund av den höga efterfrågan av reagenser, göra det mindre mottaglig för snabb screening av ett stort antal Föreningar. Alternativa metoder, såsom den malakit gröna analysen19,21, som förlitar sig på upptäckten av fosfat som produceras av enzymet ATPas, var bevisat mer lämpade för miniatyrisering och hög genomflöde screening22 , 23 , 24. en Endpoint-analys är dock mer sannolikt att påverkas av flera artefakter (diskuteras nedan), som kan förbli oupptäckta i avsaknad av heltids kurser.

Här, den NADH-kopplade ATPas-analysen har optimerats för semi-High genomströmning screening av småmolekylära hämmare. Skelett-och hjärtmuskeln myosin II: s och myosin-hämmare blebbistatin8, para-aminoblebbistatin13 och para-nitroblebbistatin12 används för att demonstrera kraften i analysen, som förlitar sig på NADH fluorescens som en avläsning. Detta protokoll är mottagligt för screening projekt inriktade på alla ADP-producerande enzymer.

Protocol

1. beredning av stamlösningar och reagenser Bered Ditiotreitol (dTT) stamlösning genom att lösa upp kristallint DTT i destillerat vatten till en slutlig koncentration av 1000 mm. Justera pH till 7,0 med 1 M NaOH-lösning. Och förvara vid-20 ° c. Förbered ATP stamlösning genom att lösa kristallint ATP i destillerat vatten till en slutlig koncentration av 100 mM. Justera pH till 7,0 med 1 M NaOH-lösning. Och förvara vid-20 ° c. Förbered 10X NADH buffert som innehåller 70 mM 3-(N-m…

Representative Results

Den typiska plattlayoutkartan som används för screening experiment visas i figur 1. Den första och sista raden är reserverade för NADH kalibrering och positiv kontroll (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), respektive. De återstående raderna (B till O) används för att testa den hämmande aktiviteten av föreningar. Här, femton-steg Serial 1:2 utspädningar från 10 mM sammansatta koncentration i DMSO bereds och överförs från den sam…

Discussion

Kritiska steg i protokollet

Optimera plattan layout genom att köra flera plattor med negativ kontroll endast (ATPas reaktion utan inhibitor). Inspektera resultaten noggrant för mönster i reaktionshastigheter. Dessa kan till exempel bero på kanteffekter och/eller brister i den hydrofila ytbeläggningen på “icke-bindande” plåtar. Om ett mönster observeras, ändra platttyp och/eller plattlayout för att minimera artefakterna. Till exempel, en typisk dos-responskurva (16 ko…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av ett bidrag från det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke och nationella institutet för drogmissbruk NS096833 (CAM).

Materials

384-well Low Flange Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3575
ATP (Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate) Sigma A7699
Aurora FRD-IB Dispenser Aurora Discovery, Inc. 00017425
Biomek NXP Multichannel Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter A31841
Blebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
BSA (Bovine Serum Albumin, Protease-Free) Akron Biotech AK1391 
Centrifuge 5430 R, refrigerated, with Rotor FA-35-6-30 Eppendorf 022620663
Centrifuge 5430, non-refrigerated, with Rotor A-2-MTP Eppendorf 022620568
DMSO (Dimethyl sulfoxide)  Sigma D2650
DTT (DL-Dithiothreitol)  Sigma D5545
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 384-format; 8-channel Thermo Scientific 4672010
E1 ClipTip Multichannel Pipette; 96-format; 8-channel Thermo Scientific 4672080
EGTA (Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid)  Sigma E3889
EnVision 2104 Multilabel Plate Reader PerkinElmer 2104-0010
Glycerol  Sigma G2025
LDH (L-Lactic Dehydrogenase from rabbit muscle) Sigma L1254
MgCl2.6H2O (Magnesium chloride hexahydrate)  Sigma M2670
Microplate Shaker VWR   12620-926 
Microplate, 384 well, PP, Small Volume, Deep Well, Natural Greiner Bio-One 784201
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid)  Sigma M1254
Myosin Motor Protein (full length) (Bovine cardiac muscle) Cytoskeleton  MY03
Myosin Motor Protein (full length) (Rabbit skeletal muscle) Cytoskeleton  MY02
NADH (β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt hydrate) Sigma N8129
NaN3 (Sodium azide)  Sigma 71289
NaOH (Sodium hydroxide)  Sigma S8045
Optical Filter CFP 470/24nm (Emission) PerkinElmer 2100-5850 Barcode 240
Optical Filter Fura2 380/10nm (Excitation) PerkinElmer 2100-5390 Barcode 112
Optical Module: Beta Lactamase PerkinElmer 2100-4270 Barcode 418
OriginPro 2017 software OriginLab N/A
para-Aminoblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
para-Nitroblebbistatin AMRI N/A Custom synthesis
PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monopotassium salt) Sigma P7127
PK (Pyruvate Kinase from rabbit muscle) Sigma P9136
Rabbit Muscle Acetone Powder Pel Freez Biologicals 41995-2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heissler, S. M., Sellers, J. R. Kinetic Adaptations of Myosins for Their Diverse Cellular Functions. Traffic. 17 (8), 839-859 (2016).
  2. Hartman, M. A., Spudich, J. A. The myosin superfamily at a glance. Journal of Cell Science. 125 (Pt 7), 1627-1632 (2012).
  3. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  4. Sebe-Pedros, A., Grau-Bove, X., Richards, T. A., Ruiz-Trillo, I. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole-genome approach. Genome Biology and Evolution. 6 (2), 290-305 (2014).
  5. Newell-Litwa, K. A., Horwitz, R., Lamers, M. L. Non-muscle myosin II in disease: mechanisms and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 8 (12), 1495-1515 (2015).
  6. He, Y. M., Gu, M. M. Research progress of myosin heavy chain genes in human genetic diseases. Yi Chuan. 39 (10), 877-887 (2017).
  7. Rauscher, A. A., Gyimesi, M., Kovacs, M., Malnasi-Csizmadia, A. Targeting Myosin by Blebbistatin Derivatives: Optimization and Pharmacological Potential. Trends in Biochemical Sciences. 43 (9), 700-713 (2018).
  8. Straight, A. F., et al. Dissecting temporal and spatial control of cytokinesis with a myosin II Inhibitor. Science. 299 (5613), 1743-1747 (2003).
  9. Sirigu, S., et al. Highly selective inhibition of myosin motors provides the basis of potential therapeutic application. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), E7448-E7455 (2016).
  10. Green, E. M., et al. A small-molecule inhibitor of sarcomere contractility suppresses hypertrophic cardiomyopathy in mice. Science. 351 (6273), 617-621 (2016).
  11. Morgan, B. P., et al. Discovery of omecamtiv mecarbil the first, selective, small molecule activator of cardiac Myosin. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (9), 472-477 (2010).
  12. Kepiro, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).
  13. Varkuti, B. H., et al. A highly soluble, non-phototoxic, non-fluorescent blebbistatin derivative. Scientific Reports. 6, 26141 (2016).
  14. Verhasselt, S., et al. Discovery of (S)-3′-hydroxyblebbistatin and (S)-3′-aminoblebbistatin: polar myosin II inhibitors with superior research tool properties. Organic and Biomolecular Chemistry. 15 (9), 2104-2118 (2017).
  15. Verhasselt, S., Roman, B. I., Bracke, M. E., Stevens, C. V. Improved synthesis and comparative analysis of the tool properties of new and existing D-ring modified (S)-blebbistatin analogs. European Journal of Medicinal Chemistry. 136, 85-103 (2017).
  16. Warren, G. B., Toon, P. A., Birdsall, N. J., Lee, A. G., Metcalfe, J. C. Reconstitution of a calcium pump using defined membrane components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (3), 622-626 (1974).
  17. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. Rad54 protein exerts diverse modes of ATPase activity on duplex DNA partially and fully covered with Rad51 protein. Journal of Biological Chemistry. 277 (48), 46205-46215 (2002).
  18. Hanzelmann, P., Schindelin, H. Structural Basis of ATP Hydrolysis and Intersubunit Signaling in the AAA+ ATPase p97. Structure. 24 (1), 127-139 (2016).
  19. Hackney, D. D., Jiang, W. Assays for kinesin microtubule-stimulated ATPase activity. Methods in Molecular Biology. 164, 65-71 (2001).
  20. Kiianitsa, K., Solinger, J. A., Heyer, W. D. NADH-coupled microplate photometric assay for kinetic studies of ATP-hydrolyzing enzymes with low and high specific activities. Analytical Biochemistry. 321 (2), 266-271 (2003).
  21. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  22. Henkel, R. D., VandeBerg, J. L., Walsh, R. A. A microassay for ATPase. Analytical Biochemistry. 169 (2), 312-318 (1988).
  23. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  24. Rule, C. S., Patrick, M., Sandkvist, M. Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization. Journal of Visualized Experiments. (114), 54305 (2016).
  25. Pardee, J. D., Spudich, J. A. Purification of muscle actin. Methods in Cell Biology. 24, 271-289 (1982).
  26. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  27. Kovacs, M., Toth, J., Hetenyi, C., Malnasi-Csizmadia, A., Sellers, J. R. Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin II. Chem Journal of Biological Chemistry. 279 (34), 35557-35563 (2004).
  28. Allingham, J. S., Smith, R., Rayment, I. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Nature Structural & Molecular Biology. 12 (4), 378-379 (2005).
  29. Kettlun, A. M., et al. Purification and Characterization of 2 Isoapyrases from Solanum-Tuberosum Var Ultimus. Phytochemistry. 31 (11), 3691-3696 (1992).
  30. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. British Journal of Pharmacology. 161 (6), 1219-1237 (2010).
  31. Motulsky, H. J., Neubig, R. R. Analyzing binding data. Current Protocols in Neuroscience. 52 (1), 7.5.1-7.5.65 (2010).
  32. Sehgal, P., Olesen, C., Moller, J. V. ATPase Activity Measurements by an Enzyme-Coupled Spectrophotometric Assay. Methods in Molecular Biology. 1377, 105-109 (2016).
  33. Solinger, J. A., Lutz, G., Sugiyama, T., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. D. Rad54 protein stimulates heteroduplex DNA formation in the synaptic phase of DNA strand exchange via specific interactions with the presynaptic Rad51 nucleoprotein filament. Journal of Molecular Biology. 307 (5), 1207-1221 (2001).
  34. Banik, U., Roy, S. A continuous fluorimetric assay for ATPase activity. Biochemistry Journal. 266 (2), 611-614 (1990).
  35. Xiao, Y. X., Yang, W. X. KIFC1: a promising chemotherapy target for cancer treatment?. Oncotarget. 7 (30), 48656-48670 (2016).
  36. See, S. K., et al. Cytoplasmic Dynein Antagonists with Improved Potency and Isoform Selectivity. ACS Chemical Biology. 11 (1), 53-60 (2016).
  37. Datta, A., Brosh, R. M. New Insights Into DNA Helicases as Druggable Targets for Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 5, 59 (2018).

Tags

ATPase AssayNADH-coupledSemi-high-throughput ScreeningActinMyosin IIEnzyme InhibitorsCalibrationPositive And Negative Controls

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors. J. Vis. Exp. (150), e60017, doi:10.3791/60017 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image