Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60029
Automatic Translation
1,2, 3,4, 5, 6,7,8, 1,2,9
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

Summary

يستخدم الترسيب المناعي المتعدد الكمية (QMI) قياس التدفق الخلوي للكشف الحساس عن الاختلافات في وفرة التفاعلات المستهدفة بين البروتين والبروتين بين عينتين. يمكن إجراء QMI باستخدام كمية صغيرة من المواد الحيوية، ولا يتطلب علامات هندسية وراثيا، ويمكن تكييفها لأي شبكة تفاعل البروتين المحددة سابقا.

Abstract

تتحكم التفاعلات الديناميكية بين البروتين والبروتين في السلوك الخلوي، من الحركة إلى النسخ المتماثل للحمض النووي إلى تحويل الإشارة. ومع ذلك، فإن رصد التفاعلات الديناميكية بين البروتينات المتعددة في شبكة تفاعل البروتين أمر صعب من الناحية التقنية. هنا، نقدم بروتوكول اتونى الكمية متعددة المناعة (QMI)، والذي يسمح بالتقييم الكمي للتغيرات أضعاف في تفاعلات البروتين على أساس قياسات الفلورة النسبية من البروتينات في المجمعات المشتركة التي تم الكشف عنها من قبل يتعرض الepitopes السطحية (PiSCES). في QMI، يتم تسريع مجمعات البروتين من الليسات الخلوية المناعية على الميكروسفيرات، ومن ثم يتم فحصها بجسم مضاد مسمى لبروتين مختلف من أجل تحديد كمية وفرة PiSCES. يتم الجمع بين الأجسام المضادة الترسيب المناعي إلى مناطق الطيفية MagBead مختلفة، مما يسمح لمقياس التدفق للتمييز بين الترسيب المناعي الموازي المتعدد وتحديد كمية الأجسام المضادة للمسبار المرتبطة بكل منها في نفس الوقت. لا يتطلب QMI وضع علامات وراثية ويمكن القيام به باستخدام الحد الأدنى من المواد الحيوية مقارنة بأساليب الترسيب المناعي الأخرى. يمكن تكييف QMI لأي مجموعة محددة من البروتينات المتفاعلة، وقد استخدمت حتى الآن لوصف شبكات الإشارات في الخلايا T ونقاط الاشتباك العصبية الغلوتامات. وقد أدت النتائج إلى توليد فرضية جديدة مع التطبيقات التشخيصية والعلاجية المحتملة. يتضمن هذا البروتوكول إرشادات لتنفيذ QMI، من التحديد الأولي للوحة الأجسام المضادة حتى تشغيل الاختبارات وتحليل البيانات. التجميع الأولي لفحص QMI ينطوي على فحص الأجسام المضادة لإنشاء لوحة، وتحديد تجريبيا ً المخزن المؤقت للlysis المناسب. ويشمل إعداد الكاشف اللاحق اقتران الأجسام المضادة لهطول الأمطار المناعية إلى MagBeads، والأجسام المضادة التحقيق biotinylating بحيث يمكن وصفها من قبل الفلوروفور مترافق streptavidin. لتشغيل فحص، يتم خلط lysate مع MagBeads بين عشية وضحاها، ومن ثم يتم تقسيم الخرز وحضانة مع الأجسام المضادة التحقيق مختلفة، ومن ثم تسمية فلوروفور، وقراءة من قبل قياس التدفق. يتم إجراء اختبارين إحصائيين لتحديد PiSCES التي تختلف بشكل كبير بين الظروف التجريبية، ويتم تصور النتائج باستخدام خرائط الحرارة أو الرسومات التخطيطية على حافة العقدة.

Introduction

التفاعلات الديناميكية بين البروتين والبروتين تشكل سلاسل الإشارات الجزيئية والهياكل motile التي هي الأساس الوظيفي لمعظم علم وظائف الأعضاء الخلوية1. وغالبا ما تصور هذه العمليات على أنها مسارات الإشارات الخطية التي تحول بين الدول الثابتة على أساسمدخلات واحدة، ولكن البيانات التجريبية والنمذجة تبين بوضوح أنها تعمل كشبكات متكاملة 2،3، 4.في حالة البروتينات G, مستقبلات مختلفة غالبا ما يكون القدرة على تنشيط نفس البروتين G, ومستقبلات واحدة يمكن أيضا تنشيط أكثر من نوع واحد من البروتين G5,6. من أجل عدد صغير نسبيا من فئات البروتين G لتعديل على وجه التحديد مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية مثل انتقال متشابك, تنظيم هرمون, وهجرة الخلايا, الخلايا يجب على حد سواء دمج وتمييز هذه الإشارات4 , 5.وقد أظهرت الأدلة أن هذه الخصوصية إشارة، للبروتينات G وغيرها، وتستمد في المقام الأول على أساس التفاعلات البروتين البروتين ضبطها بدقة ودينامياتها الزمنية 1،3، 4 , 5 , 6 , 7.لأن شبكات الإشارات تتكون من مجمعات البروتين الديناميكي مع مدخلات متعددة، والمخرجات، وحلقات التغذية المرتدة، اضطراب واحد لديه الفرصة لتغيير التوازن المنزلي العام من علم وظائف الأعضاء الخلية4 ،7. ومن المتفق عليه الآن على نطاق واسع أنه ينبغي فحص الإشارات من منظور الشبكة من أجل فهم أفضل لكيفيةدمج المدخلات المتعددة يتحكم في الوظائف الخلوية المنفصلة في الصحة والمرض 7،8، 9،10،11،12،13. في ضوء ذلك، تم تطوير الكم ّي متعددة المناعة (QMI) لجمع متوسطة الإنتاجية، والبيانات الكمية حول التغيرات أضعاف في شبكات التفاعل البروتين الديناميكي.

QMI هو فحص يستند إلى الأجسام المضادة حيث يتم احتضان الليسات الخلية مع لوحة من الأجسام المضادة لهون الأمطار المناعية التي تقترن بشكل مشترك إلى الخرز المغناطيسي التي تحتوي على نسب متميزة من الأصباغ الفلورية. وجود أجسام مضادة محددة إلى جانب فئات حبة المغناطيسي متميزة يسمح لمتزامنة co-immunoprecipitation من البروتينات المستهدفة متعددة من نفس lysate. بعد هطول الأمطار المناعية (IP)، يتم احتضان الخرز المغناطيسي مع ثاني، جسم مضاد للمسبار الفلوري المترافق (أو الأجسام المضادة biotinylated جنبا إلى جنب مع streptavidin الفلوروفوري المترافق). ثم يتم الكشف عن الارتباطات المشتركة بين البروتينات المعترف بها من قبل كل زوج الأجسام المضادة للأجسام IP، أو PiSCES (البروتينات في المجمعات المشتركة التي تم الكشف عنها من قبل epitopes السطح المكشوفة)، عن طريق قياس التدفق ويمكن مقارنتها كميا بين مختلف عينة الشروط14. تُظهر الرسوم التوضيحية في الشكل 1 الخطوات التي ينطوي عليها إجراء فحص QMI، بما في ذلك رسم تخطيطي للحبات المغناطيسية مع مجمعات البروتين المُعفية المناعية التي تحمل هالاً مضادة للمسبار المترافق بشكل فلوري (الشكل1C).

حساسية QMI يعتمد على تركيز البروتين من lysate نسبة إلى عدد من الخرز المغناطيسي المستخدمة لمناعة الترسيب، وتحقيق قرار للكشف عن 10٪ أضعاف التغييرات يتطلب سوى كمية صغيرة من المواد البداية بالمقارنة مع غيرها من أساليب الملكية الفكرية المشتركة14،15. على سبيل المثال، كمية المواد الأولية المستخدمة في QMI مشابهة لتلك المطلوبة لشطيرة مرتبطة بالإنزيم المناعيSorbent الفحص (ELISA)، ولكن يتم الكشف عن تفاعلات متعددة في الفحص QMI واحد. تم إجراء فحص QMI باستخدام 20 نقطة IPs و20 هدف مسبار باستخدام 1-5 × 105 خلايا T الأولية معزولة عن خزعة الجلد 4 مم، والاستعدادات متشابك P2 من قسم الإكليل 3 مم من القشرة الأمامية للماوس، أو 3 × 106 الماوس المستزرع الابتدائي الخلايا العصبية القشرية14،16،17. هذه الحساسية تجعل QMI مفيدة لتحليل الخلايا أو الأنسجة ذات التوافر المحدود، مثل العينات السريرية.

يمكن تكييف QMI لأي شبكة تفاعل بروتين محددة مسبقًا (شريطة أن تكون الأجسام المضادة متوفرة)، وقد تم تطويرها حتى الآن لتحليل مستقبلات مستضد الخلايا T (TCR) الإشارة ومجموعة فرعية من البروتينات في نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاساتفية في الخلايا العصبية 17 سنة , 18.في دراسات إشارات مستقبلات الخلايا T، تم استخدام QMI لأول مرة لتحديد التغيرات الناجمة عن التحفيز في PiSCES، ومن ثم للتمييز بين مرضى المناعة الذاتية من مجموعة التحكم، والكشف عن إشارات المناعة الذاتية الذاتية، وأخيرا لتوليد فرضية تنطوي على شبكة فرعية غير متوازنة المرتبطة بالمرض من التفاعلات14. في الآونة الأخيرة، تم استخدام نفس لوحة QMI لتحديد أن يتم تحديد الخلايا الصعترية من خلال الاختلافات الكمية بدلا من النوعية في البروتين المرتبط بـ TCR مما يشيرإلى 19. في الخلايا العصبية، تم استخدام QMI لوصف إعادة ترتيب المدخلات المحددة لشبكة تفاعل البروتين لأنواع متميزة من إشارات الإدخال بطريقة تدعم النماذج الناشئة حديثا من اللدونة متشابك17. بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام لوحة QMI متشابك لتحديد الاختلافات في سبعة نماذج الماوس من التوحد، وتجميع النماذج في مجموعات فرعية على أساس التوقيعات الحيوية PiSCES الخاصة بهم، ويفترض بدقة العجز الجزيئي المشترك الذي لم يتم التعرف عليه سابقا في واحدة من النماذج16. ويمكن استخدام نهج مماثل لفحص المجموعات الفرعية الأخرى التي قد تستجيب لمختلف علاجات المخدرات، أو لتعيين عقاقير لمجموعات فرعية متجاوبة محددة. QMI لديها تطبيقات محتملة في التشخيص، والكتابة الفرعية للمرضى، وتطوير المخدرات، بالإضافة إلى العلوم الأساسية.

لتجميع لوحة الأجسام المضادة QMI، يتم وصف البروتوكولات الأولية لفحص الأجسام المضادة واختيارها في القسم 1 أدناه. وبمجرد تحديد ألواح الأجسام المضادة، يتم وصف بروتوكولات لاقتران الأجسام المضادة المختارة للحبات المغناطيسية للملكية الفكرية، وللتحلل الحيوي للأجسام المضادة المسبارية المختارة، في القسم 2. ويرد وصف بروتوكول تشغيل فحص QMI على الخلايا أو الأنسجة lysates في القسم 3. وأخيراً، بما أن تجربة واحدة يمكن أن تولد حوالي 5 x 105 نقاط بيانات فردية، يتم توفير التعليمات ورموز الكمبيوتر للمساعدة في معالجة البيانات وتحليلها والتصور في القسم 4. وترد في الشكل 1نظرة عامة على سير العمل الوارد وصفه في الأبواب من 2 إلى 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم الساي

  1. إعداد الأجسام المضادة المرشح
    1. لكل بروتين من الفائدة، اختر 3 إلى 5 أجسام مضادة للشاشة. عند الإمكان، استخدم الأجسام المضادة أحادية النسيلة التي تعترف بالإبالعامة المختلفة. وتشمل أيضا واحد الأجسام المضادة عنصر تحكم غير محددة.
    2. لإزالة Tris، قم بإجراء تبادل المخزن المؤقت عن طريق إضافة الجسم المضاد إلى فلتر دوران 30 كيلوDa، والدوران وصولاً إلى الحد الأدنى لحجمها، وإضافة 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)، وتكرار 3 مرات. لإزالة البروتينات الحاملة، قم بتنقية الأجسام المضادة وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (راجع جدول المواد للاطلاع على توصية تنقية محددة).
      ملاحظة: يتم ذلك لأن البروتينات الناقل والمخازن المؤقتة مع مجموعات الأمين الحرة (مثل تريس) سوف تتفاعل مع مجموعات COOH وإرواء اقتران حبة اللاحقة وردود الفعل biotinylation. تأكد من تنقية جميع الأجسام المضادة (لا البروتينات الناقل) وفي عازلة خالية من الأمينات الأولية (أي، لا تريس).
    3. زوجان كل الأجسام المضادة لcarboxylate تعديل اللاتكس (CML) الخرز كما هو موضح من قبل ديفيس وSchrum20. للحفاظ على الأجسام المضادة، قم بتقليص تفاعلات اقتران الخرز بنسبة تصل إلى 1/5 (أي 3.6 × 106 حبات مع 10 ميكرولتر من 0.2-1 ملغ / مل الأجسام المضادة).
    4. تقدير أرقام حبة باستخدام مقياس الهيموكيتومات (عادة ~ 108/ مل) وتخزينها في 4 درجة مئوية. تم تخزين الخرز لأكثر من عام واستخدم بنجاح في الاختبارات QMI، ولكن لم يتم تحديد تاريخ الصلاحية أو انتهاء الصلاحية رسميا. NaN3 في المخزن المؤقت B /S يمنع النمو البكتيري.
    5. Biotinylate جزء من كل الأجسام المضادة (انظر القسم 2.2 أدناه). يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    6. تأكيد فعالة CML حبة اقتران ودقيقة العد عن طريق تلطيخ 1 × 105 الخرز مع الأجسام المضادة PE-مترافق رد فعل على الأنواع التي تم رفع الأجسام المضادة والقراءة على مقياس التدفق.
    7. تأكيد biotinylation الأجسام المضادة بواسطة نقطة وصمة عار باستخدام streptavidin-HRP.
    8. وبمجرد أن يولد المختبر الكواشف المعروفة بأنها فعالة، استخدم تلك الكواشف كضوابط إيجابية في ردود فعل التأكيد في الخطوتين 1-1-5 و1-1-6.
  2. فحص الأجسام المضادة من قبل IP-FCM (الترسيب المناعي التي تم الكشف عنها عن طريق قياس التدفق الخلوي)
    1. اتخاذ قرار بشأن lysate الفرز المناسب. لهذا ولجميع خطوات الفحص الأخرى قبل QMI (أي شيء المدرجة في هذا القسم 1: تصميم الفحص)، لا تستخدم العينات الحيوية مع توافر محدود. بدلاً من ذلك، اختر مادة تحكم قابلة للمقارنة مثل أنسجة الماوس من النوع البري أو خطوط الخلايا أو أنسجة المتبرع البشري العادية التي ليست موردًا مقيدًا.
      ملاحظة: اختيار المخزن مؤقت lysis لهذا الاختبار ليست تافهة، وتناقش في القسم 1.5: تحديد المنظفات، وكذلك في الفقرة قبل الأخيرة من المقطع مناقشة. المخازن العازلة اللليس القياسية لديها قاعدة من 150 مل NaCl، 50 MM تريس (الحموضة 7.4)، 10 mM فلوريد الصوديوم، 2 MM أورثوفادات الصوديوم، والبروتياز وكوكتيلات مثبطات الفوسفاتيز. المنظفات المتوافقة مع QMI تشمل 1٪ NP-40، 1٪ Digitonin، 0.1-1٪ تريتون X-100، و 0.5-1٪ deoxycholate14،16،17،18،19،21.
    2. حساب الحجم الإجمالي للlysate لاستخدامها لكل IP، وذلك باستخدام 10 ميكرولتر لكل تركيبة IP-probe ليتم فحصها. إذا فحص X الأجسام المضادة التحقيق واستخدام عنصر تحكم IgG واحد، كل IP سوف تستخدم (X + 1) * (10 درجة مئوية) * (1.1 لخطأ الأنابيب)؛ X + 1 هو لحساب التحكم التحقيق IgG المطلوبة. على سبيل المثال، في شاشة الأجسام المضادة 3x3، يجب أن يستخدم كل IP 44 ul. تذكر تضمين عنصر تحكم IP IgG (راجع إعداد الفحص على سبيل المثال في الشكل 2).
    3. حساب رقم حبة CML ليتم استخدامها. إذا كنت فحص X الأجسام المضادة التحقيق، واستخدام [(X + 1) * 5 × 104 الخرز]. من الناحية المثالية، 5000 الخرز لكل بئر سوف يؤدي إلى > 2000 الخرز في قراءة جيدة من قبل مقياس السيتومتر تدفق. على سبيل المثال، في شاشة الأجسام المضادة 3 × 3، يجب على كل IP استخدام 20،000 الخرز، وهو ما يقرب من 0.66 درجة مئوية من الأرصدة حبة CML المعدة من الخطوة 1.1.3 (يجب أولاً قياس الخرز كمياً باستخدام مقياس الهيموكيتومتر لضمان الدقة).
    4. احتضان حجم lysate من الخطوة 1.2.2 مع حجم كل حبة CML ليتم فحصها من الخطوة 1.2.3، بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع تناوب لمنع الخرز من الاستقرار. عادة، إجراء الحضانة في العمود الأول من لوحة PCR 96 جيدا، وغطاء مع قبعات شريط أنبوب PCR.
    5. تدور أسفل الخرز CML في 3200 × ز لمدة 1 دقيقة وإزالة lysate من قبل واحد، نفض الغبار السريع من لوحة على الحوض. يجب أن تكون بيليه بيضاء صغيرة مرئية في الجزء السفلي من كل بئر على حد سواء قبل وبعد نفض الغبار.
    6. إعادة تعليق الخرز CML في حجم من العازلة FlyP لتساوي 20 درجة مئوية لكل زوج حبة التحقيق؛ للأجسام المضادة التحقيق X، استخدم (X +1) * (20 درجة مئوية) * (1.1 لخطأ الأنابيب)، على غرار الخطوة 1.2.2. بالنسبة لشاشة 3 × 3، قم بإعادة الإيقاف المؤقت في 88 ميكرولتر من المخزن المؤقت FlyP. الحاجز FlyP هو 100 مل NaCl، 50 mM تريس الحموضة 7.4، 1٪BSA، 0.01٪ NaN 3.
    7. توزيع كل IP عبر (X +1) الآبار من لوحة PCR 96-well، حيث X هو عدد الأجسام المضادة التحقيق التي يتم فحصها، وذلك باستخدام 20 درجة مئوية / جيدا. الشكل 2 يظهر مثال إعداد الفحص.
    8. اغسل مرتين إضافيات باستخدام 200 ميكرولتر من مخزن FlyP المؤقت لكل بئر. تدور لوحة كما هو الحال في الخطوة 1.2.5 ونفض الغبار لوحة لإزالة العازلة غسل بعد كل غسل. الكريات ستكون صغيرة للغاية، ولكن ينبغي أن تكون مرئية بعد كل غسل.
    9. لكل الأجسام المضادة biotinylated ليتم فحصها، حساب الحجم الإجمالي كما (Y + 1) * 1.1 * 50 درجة مئوية، حيث Y هو عدد الأجسام المضادة IP التي يجري فحصها. تخفيف الأجسام المضادة إلى تركيز العمل في هذا الحجم من العازلة FlyP، وعادة ما تبدأ مع 1:100 تخفيف من مخزون 0.5 ملغ / مل.
    10. توزيع كل الأجسام المضادة المخففة أسفل كل عمود من لوحة الآبار 96، وضمان إعادة تعليق الخرز CML.
    11. الحضانة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، إما مع دوران أو pipetting في فترات 15 دقيقة لضمان الخرز CML لا تزال في تعليق.
    12. اغسل 3 x في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FlyP، لكل جهاز طرد مركزي للغسيل وإزالة lysate كما هو الحال في الخطوة 1.2.5.
    13. إعادة تعليق جميع الخرز CML في 50 درجة مئوية من 1:200 Streptavidin-PE في العازلة FlyP.
    14. حضانة في 4 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة.
    15. اغسل 3 x في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FlyP، لكل جهاز طرد مركزي للغسيل وإزالة lysate كما هو الحال في الخطوة 1.2.5.
    16. إعادة تعليق في 200 μL من المخزن المؤقت FlyP ثم قم بتشغيل على مقياس تدفق.
  3. اختيار الأجسام المضادة لتضمينها في التساي
    1. بوابة على حجم باستخدام FSC-H مقابل SSC-H، والقضاء على doublets باستخدام FSC-H مقابل FSC-A.
    2. توليد الرسوم البيانية من كثافة الفلورة PE وتراكب كل من الضوابط IgG (IgG حبة اختبارالتحقيق، اختبار حبة-IgG التحقيق) على أزواج اختبار (الشكل 2).
    3. ابحث عن زوج حبة التحقيق الذي يعطي إشارة واضحة على الضوضاء (الشكل2B). بالإضافة إلى ذلك، فإنه ليس مثاليا لاستخدام نفس الجسم المضاد لكل من حبة والتحقيق. يزيد التعرف على الظهارة التفاضلية من فرص مراقبة التفاعلات لأن بعض الepitopes قد تكون مُقَلَّبة في بعض مجمعات البروتين. إذا لم تكن هناك خيارات مقبولة، كرر الشاشة مع الأجسام المضادة الإضافية.
  4. تأكيد خصوصية الأجسام المضادة
    1. لضمان خصوصية الأجسام المضادة للأهداف المقصودة، استخدم عينة lysate التي تم فيها ضرب الهدف؛ على سبيل المثال، ماوس خروج المغلوب أو خط خلية RNAi. بدلا ً من ذلك، استخدم lysate من خط الخلية السلبيالمستهدف الذي تم التعبير عن البروتين المستهدف بشكل مصطنع.
    2. تنفيذ IP-FCM كما هو موضح في الخطوة 1.2 تعديل لاحتواء التجربة.
  5. اختيار المنظفات
    1. وبما أن المنظفات حاسمة في تجارب الملكية الفكرية المشتركة، فإن اختبار الاختلافات المختلفة تجريبياً للتأكد من أن الفحص له احتمال أقصى للكشف عن التغيرات. للبدء، اختر لوحة صغيرة نسبيامن التفاعلات (4-8) التي من المعروف أن تتغير في حالة معينة و / أو ذات أهمية خاصة لدراستك.
    2. باستخدام حبات CML غير الفلورية، وكدمات الجسم المضاد للجسم المصنوعة للشاشات الأولية، قم بإجراء IP-FCM كما هو موضح في 1.2 باستخدام ظروف المنظفات العازلة المتنوعة للتخدير. يمكن إجراء شاشات المنظفات مع المنظفات كمتغير وحيد، أو مع ظروف خلية مختلفة لكل المنظفات. دائما استخدام الضوابط IgG لكل من الخرز وتحقيقات، منذ المنظفات تنتج في بعض الأحيان خلفية غير متوقعة في بعض تركيبات IP-التحقيق.
    3. استنادًا إلى مؤسسات التمويل الأصغر من الشاشة، اختر المنظفات التي تعمل على تحسين الإشارة لـ PiSCES ذات الأهمية. ومن المرجح أن بعض التنازلات سوف تحتاج إلى تقديم22.

2. إعداد كاشف متعددة

  1. المغناطيسي حبة اقتران
    1. باستخدام خريطة منطقة الخرز المغناطيسي، حدد مناطق الخرز لاستخدامها في نمط يقلل من خطر الكشف المتبادل. حبة المغناطيسي تشويه عادة صعودا وإلى اليمين، لذلك تجنب المناطق حبة التي هي متاخمة قطريا. ينصح الخرز من كل عمود آخر من الرسم التخطيطي حبة هو مبين على موقع Luminex (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/).
    2. إعداد الأجسام المضادة خالية من الناقل في 0.1 ملغ / مل في PBS (كما هو الحال في 1.1.2) في 250 درجة مئوية.
    3. دوامة الخرز المغناطيسي على نطاق واسع، ومن ثم aliquot 250 ميكرولتر في أنبوب الكهرمان (لحماية الخرز من تبييض الصور).
    4. حبات مغناطيسية منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ق وإزالة supernatant.
    5. إضافة 250 درجة مئوية من المخزن المؤقت MES (50 مل MES درجة الحموضة 6.0، 1 MM EDTA)، دوامة، منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ثانية، وإزالة supernatant. كرر وإعادة تعليق الخرز المغناطيسي في 200 درجة مئوية من المخزن المؤقت MES.
    6. إضافة 40 درجة مئوية من MES إلى 2 ملغ من أنبوب استخدام واحد من Sulfo-NHS لجعل 50 ملغ / مل الأسهم.
    7. إضافة 25 درجة مئوية من Sulfo-NHS الطازجة إلى الخرز المغناطيسي. دوامه.
    8. إضافة 25 ميكرولتر من 50 ملغ / مل المذاب حديثا EDAC [1-إيثيل-3-(-3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) هيدروكلوريد كاربوديميدي، ويسمى أيضا EDC] في المنطقة العازلة MES. دوامه.
    9. تغطية ويهز على دوامة مع مرفق أنبوب عقد لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، 1000 دورة في الدقيقة.
    10. منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ق وإزالة supernatant.
    11. إعادة تعليق في 500 درجة مئوية من PBS، دوامة، منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ثانية وإزالة supernatant. كرر.
    12. إعادة تعليق في 250 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة من الخطوة 2.1.2. دوامه.
    13. احتضان 2 ح في درجة حرارة الغرفة مع الهز على دوامة في 1000 دورة في الدقيقة.
    14. إضافة 500 درجة مئوية من PBS إلى الخرز المغناطيسي، دوامة، منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ثانية، وإزالة supernatant.
    15. إضافة 750 μL من حظر /تخزين (B / S) المخزن المؤقت (1٪ BSA فيPBS درجة الحموضة 7.4، 0.01٪ NaN 3). تغطية وحضانة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، 1000 دورة في الدقيقة.
    16. منفصلة مغناطيسيا لمدة 60 ق وإزالة supernatant. إعادة تعليق في 100 μL من B / S المخزن المؤقت.
    17. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. تم تخزين الخرز لأكثر من عام واستخدم بنجاح في الاختبارات QMI، ولكن لم يتم تحديد تاريخ الصلاحية أو انتهاء الصلاحية رسميا. يجب أن يمنع NaN3 في المخزن المؤقت B/S نمو البكتيريا.
    18. التحقق من صحة اقتران حبة المغناطيسي عن طريق تلطيخ ~ 0.25 درجة مئوية من الخرز المغناطيسي المقترنة مع الأنواع الفلورية المضادة للمضيف الثانوية والقراءة على مقياس التدفق، كما هو الحال في الخطوة 1.1.5.
  2. التبوية الحيوية
    1. تأكد من أن الأجسام المضادة في PBS مع عدم وجود بروتين الناقل.
    2. حساب مجموع ميكروغرام من الأجسام المضادة لتكون biotinylated (100-200 ميكروغرام الموصى بها للاستخدام في مضاعفات، 25-50 ميكروغرام الموصى بها للفحص).
    3. إعداد الطازجة 10 مل سلفو-NHS-البيوتين (يمكن أن يتم عن طريق إضافة 224 درجة مئوية من ddH2O إلى أنبوب 1 ملغ لا تزن).
    4. إضافة 1 ميكرولتر من 10 مل سلفو-NHS-البيوتين لكل 25 ميكروغرام من الأجسام المضادة، دوامة أو ماصة صعودا وهبوطا لخلط.
    5. حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    6. حضانة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    7. استخدام مرشح تدور 30 كيلودا لإزالة البيوتين غير منضم ووقف رد الفعل. إضافة 500 μL من PBS وتدور العمود حتى يتم الوصول إلى الحد الأدنى لحجم. إضافة 500 μL من PBS إضافية وتكرار ل3 إجمالي التبادلات المخزن المؤقت.
    8. تقدير التركيز بقياس امتصاص 1-2 ميكرولتر على مقياس الطيف الضوئي، ومن ثم إحضار تركيز الأجسام المضادة إلى 0.5 ملغم/مل.
    9. يُحفظ عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

3. الكم المتعدد المناعيةه

  1. تخطيط اللوحة
    ملاحظة: يعمل هذا النموذج بشكل أفضل عند إجراء باستخدام لوحات 96-well و 2-4 شروط العينة.
    1. قم دائمًا بتشغيل الضوابط المناسبة (أي الخلايا المحفزة ضد الخلايا غير المحفزة) على نفس اللوحة من أجل الكشف عن التغيرات بين الظروف. توزيع كل عينة أفقيا عبر لوحة، واستخدام كل عمود لجسم مضاد مسبار مختلفة. يجب تشغيل مجموعة من التكرارات التقنية لكل مسبار مباشرة بعد المجموعة الأولى. انظر الشكل 3 للحصول على مثال.
    2. توثيق تخطيط اللوحة بعناية لتسهيل تحميل اللوحة وتحليلها بدقة.
  2. إعداد العينة وهطول الأمطار المناعية (اليوم 1)
    1. الأنسجة أو الخلايا الليسية في المنظفات المناسبة مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز وحضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة. الحرص على الحفاظ على lysate الباردة في جميع الأوقات.
      ملاحظة: يجب تحديد الكمية الدقيقة لتركيز المواد الأحيائية وبروتين الليسات تجريبياً، وترد بعض الأمثلة على العينات المستخدمة سابقاً في الفقرة الثالثة من المقدمة. بشكل عام، في نطاق 200 ميكرولتر من 2 ملغ /مل بروتين لكل عينة كانت ناجحة في الماضي ل 20 IP و 20 أهداف التحقيق، ولكن يجب تحديد المدخلات المثالية لكل لوحة الأجسام المضادة ونوع الخلية أو الأنسجة تجريبيا.
    2. تدور إلى أسفل في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في 16،000 × ز لإزالة الأغشية والحطام؛ الحفاظ على supernatant كما lysate.
    3. إجراء فحص BCA أو ما شابه ذلك لتحديد تركيزات البروتين، ومن ثم تطبيع تركيز البروتين بين العينات. في حالة استخدام الخلايا، ابدأ بعدد متساوٍ من الخلايا لكل شرط وكان التطبيع اختياريًا.
    4. إعداد مزيج حبة المغناطيسي الرئيسي الذي يحتوي على ~ 250 الخرز المغناطيسي من كل فئة في بئر في فحص. ضبط أرقام حبة بعد تحليل البيانات بحيث في الاختبارات في المستقبل سيتم قراءة ما متوسطه 110 الخرز من كل فئة لكل بئر.
      ملاحظة: حساب المثال: (حجم حبة جديدة) = [(متوسط تشغيل) / 110] * (حجم حبة السابقة). وينبغي تعديل وحدات التخزين حبة بهذه الطريقة عن كل 8 أشواط أو حسب الحاجة. عادة، 3-4 ميكرولتر من كل حبة مغناطيسية (أعدت على النحو الوارد أعلاه) وتستخدم لتجربة 2-لوحة.
    5. اغسل مزيج الخرزة المغناطيسية 2x في مخزن FlyP المؤقت مع الفصل المغناطيسي، ثم قم بإعادة الإيقاف مؤقتًا في مخزن FlyP المؤقت. لإعادة التعليق، استخدم 10 ميكرولتر لكل عينة لكل طبق. الحاجز FlyP هو 100 مل NaCl، 50 mM تريس الحموضة 7.4، 1٪BSA، 0.01٪ NaN 3.
    6. بعد دوامة تماما مزيج حبة المغناطيسي، aliquot 10 € L في أنابيب الطرد المركزي الباردة الجليد (أنبوب واحد لكل عينة). إضافة كميات متساوية من lysate (مع تركيزات طبيعية) إلى كل أنبوب لهطول الأمطار المناعية.
    7. Aliquot خليط حبة lysate المغناطيسي في أنبوب واحد لكل لوحة يجري تشغيلها. على سبيل المثال لتجربة 2-لوحة، وتقسيم lysate إلى اثنين من الأنابيب. وضع أنابيب على الدوار في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها لهطول الأمطار المناعية، مغطاة للحفاظ على الضوء.
  3. تشغيل التساي (اليوم 2)
    1. تبدأ مع أنابيب حبة lysate المغناطيسي للوحة #1. استخدام رف حبة المغناطيسي لإزالة lysate من الخرز المغناطيسي، وحجز lysate للتحليل في المستقبل. غسل الخرز 2X في 500 درجة مئوية من الجليد الباردة FlyP العازلة. الحفاظ على أنابيب أنابيب دائما على الجليد أو في 4 درجة مئوية.
    2. حساب وحدة التخزين إعادة التعليق على أنها (عدد المسبارات) * (2 تكرار التقنية) * (25 درجة مئوية لكل بئر) * (1.1 لخطأ الأنابيب). إعادة تعليق IPs في الحجم المحسوب للمخزن المؤقت FlyP الباردة الجليد.
    3. بعد إعادة تعليق تماما الخرز المغناطيسي عن طريق الأنابيب لطيف، وتوزيع 25 درجة مئوية لكل بئر عبر لوحة 96 جيدا مسطحة القاع، على الجليد.
    4. في لوحة مختلفة 96 جيدا، تمييع الأجسام المضادة التحقيق biotinylated إلى تركيز العمل 2X (تركيز العمل هو عادة 1:100 أو 1:200، محددة تجريبيا) في العازلة FlyP بحيث يطابق ترتيبها الأعمدة على تخطيط لوحة (انظر الشكل 3 ). الحجم النهائي للأجسام المضادة التحقيق في تركيز العمل سيكون 50 ميكرولتر لكل بئر، وبالتالي فإن حجم كل 2X الأجسام المضادة أعدت ينبغي أن يكون (25 درجة مئوية) * (عدد العينات البيولوجية) * (2 تكرار التقنية) * (1.1 لخطأ الأنابيب).
    5. استخدام ماصة متعددة القنوات لتوزيع 25 درجة مئوية من كل تخفيف الأجسام المضادة التحقيق في لوحة فحص المغناطيسي التي تحتوي على حبة.
    6. يهز على لوحة أفقية شاكر لخلط وإعادة تعليق الخرز المغناطيسي، ومن ثم حضانة في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ويهز في 450 دورة في الدقيقة في الظلام.
    7. اغسل 3x مع عازل FlyP على غسالة لوحة مغناطيسية عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    8. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي في 50 درجة مئوية من 1:200 Streptavidin-PE.
    9. يُرج المزيج وإعادة تعليق الخرز، ثم يُقبّع عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة، ويهز عند 450 دورة في الدقيقة في الظلام.
    10. اغسل 3x مع عازل FlyP على غسالة لوحة مغناطيسية عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.
    11. إعادة تعليق في 125 μL من المخزن المؤقت FlyP.
    12. يُرج لمدة دقيقة واحدة عند 900 دورة في الدقيقة لإعادة تعليق الخرز.
    13. تشغيل على مقياس السيتومتر تدفق المبردة (انظر الرسم البياني في الشكل S1). استخدم إعداد "الهدف RP1 العالي" في برنامج مقياس السيتومتر، وحالة إيقاف 1000 حبة لكل منطقة (تجاوز كبير الرقم الذي ينبغي أن يكون في أي بئر فردي لمنع الجهاز من التوقف قبل الأوان) وحجم العينة من 80 ميكرولتر.
    14. إيقاف تشغيل في منتصف الطريق من خلال وإعادة تعليق الخرز لمنع تسوية.
    15. تصدير ملفات البيانات بتنسيق .xml.
    16. كرر عملية اللوحات المتبقية، بدءاً من الخطوة 3.3.1.

4 - تحليل البيانات

ملاحظة: تم تصميم التعليمات البرمجية ANC لمقارنة شرطين من N = 4 تجارب كل مع 2 النسخ المتماثل التقنية لكل شرط. على سبيل المثال، يتم تحفيز الخلايا أربع مرات مستقلة، يتم تشغيل QMI على أربعة أيام مختلفة على التحكم (غير محفز) والخلايا المحفزة، مع تكرار التقنية كما هو موضح أعلاه، وعائدات تحليل البيانات كما هو موضح أدناه.

  1. غير بارامترية التكيف مع قطع ألفا قابل للتعديل (ANC)
    1. افتح MATLAB وتعيين الدليل النشط إلى مجلد يحتوي على مكونات برنامج ANC وملفات .xml التي تم تصديرها من مقياس التدفق.
    2. املأ ملف "إدخال المؤتمر عن الشعب" ليعكس تفاصيل التصميم التجريبي. تم تعبئة ملف المثال المضمن في "ملف تكميلي" مسبقاً لتشغيل بيانات المثال المتوفرة أيضاً.
    3. تشغيل البرنامج الذي سيقوم بكتابة ملف .csv في الدليل النشط. تقارير الملف PiSCES التي تختلف بشكل ملحوظ، على مستوى إيجابي زائف (ألفا) من 0.05، بين التحكم والظروف التجريبية، في كافة النسخ المتماثل التجريبية 4، أو على الأقل 3/4 النسخ المتماثل.
    4. ملاحظة 'يضرب ANC،' التي يتم تعريفها على أنها PiSCES مع اختلافات كبيرة في ما لا يقل عن 3 عمليات تكرار تجريبية، ممثلة في 3/4 € 4/4 في الملف، للاستخدام في الخطوة 4.3.1.
  2. تحليل شبكة الارتباط المرجح23 (CNA)
    1. لصق تبديل عناوين الأعمدة إخراج ملف البيانات بواسطة Matlab تنتهي في "_MFI. CSV" في الصف الأول من ورقة excel جديدة. إضافة الأعمدة "تجربة" لرقم التجربة، و "العلاج"، للعلاج التجريبي، أو أي متغيرات أخرى لتحليلها. حفظ هذا الملف كـ "traits.csv".
    2. افتح Studio R وتعيين دليل العمل إلى مجلد يحتوي على "_MFI. CSV" و "الصفات. CSV" الملفات.
    3. قم بتشغيل أوامر R كما هو موضح في ملف الأمر الذي تمت تعليقه والمفصلة في الإرشادات المضمنة مع الملفات. وحدات WCNA ترتبط بشكل كبير مع كل سمة تجريبية هي الإخراج كملف رسومي، والارتباط بين كل تفاعل IPi_ProbeJ مع كل وحدة نمطية هو الإخراج كملف .csv.
    4. ملاحظة 'CNA يضرب،' التي يتم تعريفها على أنها تفاعلات مع عضوية الوحدة النمطية (MM) > 0.7 و p < 0.05 للعضوية في وحدة نمطية تم تحديدها على أنها مرتبطة بشكل كبير مع المتغير التجريبي للاهتمام، للاستخدام في الخطوة 4.3.1.
  3. "الزيارات" الإيجابية والتصور
    1. لكل تفاعل في قائمة "3/4 € 4/4 مرات الدخول" في ملف إخراج المؤتمر الوطني العام (من الخطوة 4.1.4) ، حدد ما إذا كان هذا التفاعل أيضاً "ضرب CNA" عن طريق التحقق من ملف إخراج CNA (انظر الخطوة 4.2.6). إنشاء عمود جديد يشير إلى ما إذا كان كل ضرب ANC أيضاً ضرب CNA.
    2. حساب متوسط قيمة تغيير ضعف السجل2 لكل ANC - CNA ضرب عن طريق حساب متوسط القيم المعطاة في جدول بيانات إخراج ANC "_Hits.csv" من الخطوة 4.1.3. تحويل القيم إلىتغيير 2 أضعاف قبل المتوسط. للتفاعلات التي كانت هامة في نسخ متماثل 3/4 فقط، احذف القيمة الخارجية.
    3. قم بإجراء جدول بيانات مع كل ضرب ANC - CNA مدرج كـ IP في عمود واحد، ومسبار في العمود الثاني، وقيمة تغيير الطي في العمود الثالث. استخدم جدول البيانات هذا لإنشاء رسم تخطيطي على حافة العقدة في Cytoscape عن طريق استيراد الملف كشبكة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

فحص الأجسام المضادة
الشكل 2 B يظهر نتائج شاشة للبروتين Connexin36. معظم تركيبات IP_probe تنتج أي إشارة عبر عناصر التحكم IgG. IP مع الأجسام المضادة أحادية النسيلة 1E5 والتحقيق مع إما 1E5 أو الأجسام المضادة متعددة النسيلة 6200 تنتج تحولا نحو اليمين في توزيع حبة مقارنة مع الضوابط IgG. هنا، تم اختيار IP 1E5 ومسبار 6200poly لتجنب استخدام نفس الأجسام المضادة مثل IP والمسبار، وكلاهما للحد من احتمال وجود بروتين غير محدد يتم التعرف عليه من قبل اثنين من الأجسام المضادة المستقلة، وزيادة فرصة الكشف عن الجمعيات المشتركة باستخدام الأوعظات المختلفة. من الأفضل اختيار تركيبة IP_probe مع ما لا يقل عن 1-2 سجل أعلى MFI مقارنة مع عناصر تحكم IgG، ولكن في بعض الأحيان أزواج إنتاج MFIs أضعف التي يمكن تمييزها باستمرار من عناصر التحكم يمكن استخدامها إذا لم يتم تحديد أي بدائل. الشكل 2 C يظهر تجربة التحقق من صحة خصوصية للتركيبة 1E5-6200poly. Lysate من 293 خلية transfected مع بلازميد Connexin36 أنتجت ~ 1.5-سجل التحول إلى اليمين في توزيع حبة، في حين تتداخل الخلايا غير المنقولة مع الضوابط IgG. عند التأكد من خصوصية الزوج، يجب أن يكون للتحكم السلبي في اللمعة من الحيوان بالضربة القاضية أو خط الخلية دون البروتين المستهدف MFI مشابهة لضوابط IgG.

حبة اقتران
وحبة المغناطيسي نموذجياقتران رد فعل مراقبة الجودة تعطي MFI 3-4 سجلات فوق الخلفية عندما ملطخة مع جسم مضاد ثانوي مترافق مع فلوروفور مع مؤشر السطوع بين 3 و 5 (مثل PE أو FITC). ويبين الشكل 4 رد فعل نموذجي لمراقبة الجودة يقارن اقتران حبة مغناطيسية جديدة بالمقارنة مع الدفعة القديمة التي يجري استبدالها.

تحليل البيانات
في كل تجربة، يقارن المؤتمر الأميركي - أبوالن توزيعات الفلورة لكل فئة من فئات الخرز المغناطيسي في كل بئر (أي جميع تركيبات IP_Probe الممكنة) بين عنصر تحكم محدد من قبل المستخدم وحالة تجريبية. وهو يحدد قيمة pلكل تركيبة تعكس احتمال أخذ عينات من الخرز من مجموعات متطابقة استناداً إلى إحصاءات كولوموغروف-شميرنوف (K-S). ثم يقوم البرنامج بحساب قيمة P-K المطلوبة لإنتاج معدل إيجابي زائف قدره 0.05 عن طريق تصحيح المقارنات المتعددة والمحاسبة للتباين التقني (الاختلافات بين النسخ المتماثل التقنية). يتم تحديد تركيبات IP_probe (PiSCES) التي تنخفض قيمةاختبار K-S فيها إلى أقل من الحد الأدنى المحسوب في جميع التجارب الأربع، أو على الأقل 3/4 تجارب (3/4/4). منذ p-قيمة قطع تختلف اعتمادا على هذه المستويات المختلفة من الصرامة، في بعض الأحيان سيتم تحديد PiSCES في 4/4 ولكن ليس 3/4 € 4/4، لذلك يتم حساب قوائم منفصلة. للاطلاع على المعادلات التفصيلية لـ ANC، انظر (Smith et al. 2016). (14) تناقش لانغفيلدر وآخرون بدقة تفاصيل تحليل ونتائج الجمعية الوطنية للشؤون الوطنية.

عرض البيانات
وتُجرى تحليلات المؤتمر الوطني للمرأة وCNA23 لتحديد PiSCES أن كلاً من (1) يظهران تغيرات كبيرة بين الظروف التجريبية في 3/4 على الأقل من الأشواط و(2) ينتميان إلى وحدة CNA المرتبطة بالمتغير التجريبي. ويشار إلى هذه الثقة العالية PiSCES التي تم تحديدها من قبل نهجين إحصائيين مستقلين باسم المؤتمر الوطني الوطني - CNA PiSCES. ويمكن تصور هذه التفاعلات كرسم تخطيطي على حافة العقدة باستخدام برنامج Cytoscape مفتوح المصدر (الشكل5أ)أو كخريطة حرارية باستخدام شفرة R وتعليمات التحليل المضمنة في المواد التكميلية (الشكل5ب) ).

Figure 1
الشكل 1 . نظرة عامة على الكم المتعدد المناعيه. (أ) يتم الجمع بين الأجسام المضادة التي تم فحصها مسبقًا إلى فئات مختلفة من الخرز المغناطيسي في ردود فعل منفصلة. (ب) بين عشية وضحاها، والمناعية المجمعات المناعية باستخدام خليط من الخرز المغناطيسي المقترنة بالأجسام المضادة. (ج) يتم تسمية البروتينات المُعَمَّلة بالمناعة المشتركة بواسطة جسم مضاد للمسبار وفلوروفور. (د) يتم تشغيل الخرز المغناطيسي ومجمعات البروتين المسماة من خلال مقياس السيتومتر التدفق المبردة لتحديد الكميات النسبية من البروتينات التي تحدث في المجمعات المشتركة. انظر الشكل S1 للاطلاع على التفاصيل التخطيطية للتبريد المخصص. (هـ)برنامج مدير مقياس السيتومتر يفرق بين MagBeads حسب الفئة و (و) يعرض الرسوم البيانية الفلورية من كل منطقة حبة. (ز) يتم تصدير البيانات كملفات .xml وتحليلها بواسطة نهجين إحصائيين مستقلين. يتم الإبلاغ عن PiSCES فقط التي تم تحديدها من قبل كلا التحليلين باستخدام خريطة الحرارة ومرئيات الرسم التخطيطي على حافة العقدة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 . Connexin 36 فحص الأجسام المضادة باستخدام IP-FCM. (أ) تم تنفيذ IP-FCM على lysate الدماغ الماوس باستخدام لوحة 4X4 من Connexin 36 (Cx36) CML الخرز وتحقيقات. وكان مناعي Lysate مع كل حبة CML في صف منفصل من لوحة. بعد الغسول، تم توزيع كل حبة عبر صفها بحيث يمكن إضافة جسم مضاد تحقيق واحد لكل عمود. (ب) معظم تركيبات الأجسام المضادة تظهر أي إشارة (البرتقالي) على خلفية IgG (رمادي، أزرق). يظهر IP 1E5 مع مسبار 6200Poly إشارة إيجابية مقبولة. و1E5 حبة / التحقيق و 6200Poly حبة / التحقيق أزواج كل إشارة مقبولة، ولكن ليس مثاليا لاستخدام نفس الأجسام المضادة لكل من حبة والتحقيق. يزيد التعرف على الظهارة التفاضلية من فرص مراقبة التفاعلات لأن بعض الepitopes قد تكون مُقَلَّبة في بعض مجمعات البروتين. حبة 6200Poly مع التحقيق 1E5 يعطي أقوى إشارة واختير لاستخدامها في فحص متعددة في انتظار تأكيد التحديد. (ج) تم إجراء IP-FCM باستخدام زوج من الأجسام المضادة Cx36 التي تم اختيارها من الفحص على lysate من الخلايا 293T المنقولة مع Cx36 والضوابط غير المنقولة. هناك إشارة واضحة من الخلايا Cx36-transfected، ولكن الخلايا غير المنقولة لا يمكن تمييزها عن IgG حبة / التحقيق الضوابط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 . مثال تخطيط اللوحة. يتم إعداد متعددة 4-شرط في لوحة 96 جيدا. يتم تحميل العينات 1-4 في صفوف متتالية (يتم تحميل كل عينة بيولوجية ممثلة هنا بلون مختلف)، ويتم تحميل النسخ المتماثل التقنية بنفس الترتيب في الصفوف الأربعة التالية. يتم استخدام مسبار واحد لكل عمود. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 . رد فعل نموذجي لمراقبة الجودة يقارن الاقتران من MagBead جديدة مقارنة مع دفعة القديمة التي يتم استبدالها. حبة يعطي MFI 2-4 سجلات أعلاه الخلفية، والدفعة الجديدة لديها MFI مماثلة لتلك التي من الدفعة القديمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 . QMI يحدد PiSCES متشابك أن التغيير في حجم بعد 5 دقائق من التحفيز NMDA في الخلايا العصبية القشرية المستزرعة. تجربة QMI مقارنة NMDA حفز مقابل الخلايا العصبية غير المحفزة (التحكم ACSF). وتُعرض التحليلات التي حددها كل من المؤتمر الوطني العام والمجلس الوطني للمرأة. (أ) في رسم تخطيطي على حافة العقدة تم إنتاجه باستخدام برنامج Cytoscape المفتوح المصدر، تشير العقد إلى أهداف الأجسام المضادة (البروتينات) التي تم تضمينها كـ IPs وتحقيقات في لوحة QMI. تمثل الحواف ANC وCNA PiSCES، مع لون وسمك الحافة مما يشير إلى اتجاه وحجم التغيير الطي بين العلاج والتحكم في NMDA. PiSCES التي لم تتغير بين NMDA وشروط التحكم غير مدرجة في الشكل. (ب) خريطة الحرارة المنتجة في R باستخدام وظيفة Heatmap.2 يمثل نفس ANC - CNA PiSCES. يتم تطبيع ComBAT، يتم تطبيع قيم MFI سجل2 حسب الصف لحساب البيانات التي تمتد ~ 3 سجلات، ويتم إظهار MFI النسبية لكل إجراء نسخ متماثل تجريبي لإظهار الحجم النسبي والاتساق لكل PiSCES المبلغ عنها. يتم تضمين البيانات والتعليمات البرمجية المطلوبة لإعادة إنتاج هذه الأرقام في الملف التكميلي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 1
الشكل S1: الرسومات التخطيطية للتبريد المخصص لنظام قياس التدفق. يجب الاحتفاظ بقارئ صفيف مقياس السيتومتر في درجة حرارة الغرفة، ولكن يجب تبريد الجزء السفلي (منصة الصفائح الدقيقة) للحفاظ على PiSCES أثناء التحليل. راجع جدول المواد للحصول على معلومات نموذجية حول مقياس التدفق وثلاجة إعداد السندويشات المستخدمة. (أ) تمت إزالة المرفقات العليا وصناديق تخزين المواد الغذائية من ثلاجة إعدادية شطيرة. تم وضع منصة microplate على دعامات معدنية تهدف إلى عقد صناديق تخزين المواد الغذائية البلاستيكية. تمت إزالة السكن البلاستيك من منصة microplate لجعله مناسبا. تم بناء منصة زجاج شبكي مخصص مع القياسات المبينة في (ب) لتغطية الفتحة العليا للثلاجة. تم عزل زجاج شبكي مع قطع العزل رغوة 1/2 "لتتناسب مع حجم زجاج شبكي، وأغلقت الفجوة مع الشريط العازل. ثم تم حفر حفرة من خلال زجاج شبكي للسماح للإبرة عينة من تدفق قارئ اختبار السيتومتر للوصول إلى منصة ميكروبليت عند تمديدها. تمت إزالة جهاز اقتران الأسود الذي كان في الأصل ثمل في الجزء العلوي من منصة microplate، ومشدود مرة أخرى إلى منصة ميكروبليت من فوق زجاج شبكي، مما ساعد في محاذاة. يسمح الباب في غطاء زجاج شبكي للمستخدم بالوصول إلى حامل اللوحة الدقيقة عندما يتم توسيعه خارج الوحدة. لاحظ أن برنامج مقياس الموجات الانسيابية سوف ينبه المستخدم إلى أن حامل اللوحة بارد جداً، ولكن يمكن للمستخدم تجاوز التحذير وتشغيل تجارب QMI المبردة. (ج) صورة النظام المجمعة. (د) تفاصيل الزاوية اليمنى الأمامية، كما رسمها في (أ)، تظهر الجمعية من غطاء زجاج شبكي والعزل. (هـ)تفاصيل إبرة العينة محاذاة فوق الثقوب. (و) تفاصيل القسم الحليق من العزل الذي يسمح بتدفق الهواء تحت الوحدة. (ز) تفاصيل الباب المفتوح الذي يظهر تدفق منصة ميكروبلمتر التدفق أدناه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Supplementary File
ملف تكميلي. البيانات والتعليمات البرمجية المطلوبة لإعادة إنتاج هذه الأرقام. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتطلب اختبار QMI استثمارات كبيرة في تطوير لوحة الأجسام المضادة والمعدات والكواشف، ولكن بمجرد إنشاء الفحص، يمكن للمرء جمع بيانات عالية الأبعاد لمراقبة شبكات التفاعل البروتينية لأنها تستجيب للرقابة التجريبية المحفزات. من الناحية الفنية، QMI يتطلب الأنابيب الدقيقة وتتبع مواقع العينة والأجسام المضادة جيدا. وضع العلامات بعناية لوحات الاختبار مفيد، كما هو جعل قالب مفصل من مواقع جيدا على الورق، والتي يتم حفظها بعد ذلك لتحليل البيانات. لا يمكن المبالغة في أهمية الحفاظ على الخرز وlysate الباردة في جميع الأوقات، بما في ذلك في تدفق الناقل ميكروبلمتر التدفق (انظر الشكل S1 لتعليمات التبريد المخصصة). سوف تتفكك تفاعلات البروتين بسرعة في درجة حرارة الغرفة، والمحاولات المبكرة لاستخدام غير معدلة، وسرعة تدفق درجة حرارة الغرفة مقياس السيتومتر انتهت مع تحديد العديد من التفاعلات درجة الحرارة والصفراء، ولكن ليس تلك التي تغيرت مع المقصود التحفيز.

QMI هو الفحص القائم على الأجسام المضادة، وبالتالي فإن الاختيار الأولي للأجسام المضادة أمر بالغ الأهمية. وينبغي استخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة أو المؤتلفة كلما أمكن ذلك للحد من التباين في النتائج. تظهر التعدد التشعبات الكثير إلى الكثير الاختلاف، ولكن متعدد الكلونات المستندة إلى الببتيد إلى epitope قصيرة يبدو أن تكون مستقرة نسبيا مع مرور الوقت. ويمكن التقليل من الانجراف عن طريق شراء دفعات كبيرة من الأجسام المضادة. وهذا يسمح أيضا لأوامر مخصصة من الأجسام المضادة الناقل الحرة مما يحول دون الحاجة إلى تنقية الأجسام المضادة باستخدام هلام البطيخ وأعمدة تدور، وفقدان الأجسام المضادة المرتبطة بها.

ومن المهم أيضاً ملاحظة أنه نظراً لأن الكشف عن إشارة ما يعتمد على الepitopes المتاحة، فإن عدم وجود إشارة لا يشير بالضرورة إلى عدم وجود تفاعل، وهو قيد شائع مع منهجيات التفاعل البروتينية الأخرى. 14 وعلاوة على ذلك، عندما يتم الكشف عن إشارة، فإنه من المستحيل أن الدولة بشكل لا لبس فيه الطقس تفاعل البروتين المباشر (A يتفاعل مع B) أو غير مباشر (A يتفاعل مع X و Y، والتي تتفاعل بعد ذلك مع B)، وهذا هو السبب في التفاعلات التي لوحظت هي يشار إليها باسم PiSCES بدلا من التفاعلات البروتين البروتين (PPI)، والتي قد تنطوي على الربط المباشر. ومن القيود المفروضة على جميع الأساليب المستندة إلى الأجسام المضادة التي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار أن إضافة الأجسام المضادة قد تعطل أو تستقر مجمعات البروتين. وثمة قيد آخر لاستخدام قياس التدفق السيتومتري بدلاً من البقع الغربية هو أن معلومات الحجم لتأكيد خصوصية الأجسام المضادة غير متوفرة. للتغلب على هذا القيد، يتم استخدام عناصر تحكم IgG في فحص كل زوج من الأجسام المضادة، ويتم تأكيد الخصوصية مع خطوط الخلايا أو الحيوانات قبل الشروع في تجارب QMI (القسم 1.4).

لا يتم استخدام عناصر تحكم IgG في تقييم QMI لأن كل IgG ينتج مستوى مختلف من إشارة الخلفية، مما يجعل من المستحيل معرفة قيمة الخلفية الصحيحة لطرحها. على سبيل المثال، إذا كان IP (X)_probe IgG يعطي MFI من 100 وIP IgG_probe Y يعطي MFI من 200، أي قيمة الخلفية ينبغي طرحها من IP X_probe Y؟ وبالمثل، في بعض الأحيان التفاعلات غير المكتشفة (على سبيل المثال، IP X التحقيق Z) سيكون لها MFI أقل من تفاعلات IgG غير محددة. ولحساب هذا القيد المتمثل في عدم معرفة إشارة MFI المطلقة، لا يتم الإبلاغ عن PiSCES فقط للكشف عن أعلى من مستوى الخلفية التعسفية. بدلاً من ذلك، يتم الإبلاغ فقط PiSCES أن التغيير في الاستجابة لتحفيز معين. في حين أن ارتفاع MFI يمكن أن يكون سبب الضوضاء غير محددة، وهذا الضجيج لن يتوقع أن تتغير مع التحفيز. وبالإضافة إلى ذلك، جزء (10-20٪) من التفاعلات المعتمدة على الحالة التي لوحظت يتم تأكيدها بشكل عام بطريقة ثانية، عادة IP-western. هذا التأكيد يشبه تأكيد نتائج تسلسل الحمض النووي الريبي عالية الإنتاجية مع RT-PCR ويهدف إلى زيادة الثقة نتائج QMI.

لا يمكن استبعاد تأثيرات التعبير التي تؤثر على نتائج QMI دون اختبارات إضافية، لأن QMI لا يميز بين زيادة المستويات المطلقة للبروتين وزيادة تعدد التجانس للبروتين. ولتقليل عدم اليقين فيما يتعلق بالتعبير، يمكن إجراء التجارب باستخدام ظروف العلاج الحادة ذات الجداول الزمنية القصيرة التي تقلل من التغيرات المحتملة في مستويات التعبير البروتيني. وهناك حاجة إلى طرق أخرى لاستبعاد آثار التعبير في حالات العلاج المزمن أو عينات المريض الأولية.

من الضروري تحديد مخزن مؤقت ملائم للlysis لـ QMI. ضعيفة جدا من المنظفات يمكن أن تترك الأغشية سليمة وعقد معا البروتينات التي ليست في معقدة، في حين قوية جدا المنظفات يمكن أن تدمر مجمعات البروتين. عوامل إضافية مثل وجود الكالسيوم أو chelators لها يمكن أن تؤثر بشكل كبير على PiSCES وينبغي النظر بعناية قبل فحص الأجسام المضادة لإدراجها في لوحة QMI. بالنسبة للتجارب في الغرب IP، عادة ما يتم تحسين ظروف الليسات لكل PiSCES على أساس كل حالة على حدة، ولكن أفضل الظروف للكشف عن PiSCES واحد قد لا تترجم إلى PiSCES أخرى في نفس شبكة البروتين22. اختيار المنظفات يمثل معضلة الدجاج والبيض، في أن هناك حاجة إلى عازل lysis لفحص المرشحين الأجسام المضادة، ولكن هناك حاجة إلى لوحة من الأجسام المضادة لفحص لالعازلة lysis المناسبة. في حين لا حل مثالي، يمكن للمرء أن يختار لوحة صغيرة من الخرز وتحقيقات التي هي ذات أهمية خاصة و / أو لديها جمعيات معروفة أو تفكك استجابة لالتحفيز، واختبار سلوكهم في ظل ظروف lysis مختلفة على الخرز CML تستخدم في البداية لفحص الأجسام المضادة (الخطوة 1-1-3). المنظفات المثالية ينبغي أن تسمح على حد سواء الكشف عن موثوق بها من PiSCES وخلاصة السلوك البروتين الفسيولوجي ة المعروفة (جمعية / تفكك) مع حافز معين. إذا كان هناك أي قلق من أن المنظفات لا تُسْلل الأغشية بالكامل، يمكن إضافة جسم مضاد للتحكم السلبي من شأنه أن يعطي إشارة فقط إذا تم ربط اثنين من البروتينات بواسطة الغشاء24. عند تحديد المخازن المؤقتة للتحليل المناسب، يمكن الكشف عن التغيرات في التفاعلات الضعيفة حتى - مثل تلك التي بين الكيناز والركائز - بشكل موثوق (على سبيل المثال TCR-LCK)14.

وقد أكد العمل السابق باستخدام QMI في الخلايا العصبية والخلايا T على حد سواء بعناية النتائج السابقة من أجل زيادة الثقة في صحة نتائج QMI، وولدت فرضيات جديدة أدت إلى اكتشافات حول نقل الإشارات ومسارات المرض. في المستقبل، يمكن تكييف QMI مع شبكات التفاعل البروتينية الأخرى وتوسيع ما يصل إلى 500 بروتين مع فئات ميكروسفير الحالية المتاحة. استخدام QMI لدراسة كيفية تغير شبكات المجمعات متعددة البروتين استجابة للمحفزات لأنها تتحكم في العمليات الخلوية لديه القدرة على تقديم رؤى هامة في كل من الصحة والمرض.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

Acknowledgments

يرغب المؤلفون في الاعتراف بـ Tessa Davis لمساهماتها الهامة في تطوير تحليل QMI، والأعضاء الحاليين والسابقين في مختبرات سميث وشروم للتوجيه التقني والمدخلات الفكرية. تم تمويل هذا العمل من خلال منح NIMH R01 MH113545 و R00 MH 102244.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
  2. Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
  3. Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
  4. Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
  5. Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
  6. Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
  7. Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
  8. Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
  9. Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
  10. Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
  11. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
  12. Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
  13. Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
  14. Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
  15. Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science's STKE. 2007 (389), (2007).
  16. Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
  17. Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
  18. Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
  19. Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
  20. Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
  21. Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
  22. Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
  23. Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
  24. Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 150، IP-FCM، البروتيوميات، تفاعل البروتين، الإشارة، هطول الأمطار المناعية، QMI
القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Brown, E. A., Neier, S. C.,… More

Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter