Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling
Summary
Kvantitativ multiplex Immunutfelling (QMI) bruker flyt flowcytometri for følsom påvisning av forskjeller i overflod av målrettede protein-protein interaksjoner mellom to prøver. QMI kan utføres ved hjelp av en liten mengde biomaterialet, krever ikke genetisk konstruerte koder, og kan tilpasses for alle tidligere definerte protein interaksjon nettverk.
Abstract
Dynamisk protein-protein interaksjoner kontroll cellulære atferd, fra motilitet til DNA replikering til signal Transduction. Det er imidlertid teknisk vanskelig å overvåke dynamisk samhandling mellom flere proteiner i et protein interaksjons nettverk. Her presenterer vi en protokoll for kvantitativ multiplex Immunutfelling (QMI), som tillater kvantitativ vurdering av fold endringer i protein interaksjoner basert på relative fluorescens målinger av proteiner i delte komplekser oppdaget av Exposed Overflate epitopes (Fiskene). I QMI, protein komplekser fra celle lysater er immunoprecipitated på mikrosfærer, og deretter analysert med en merket antistoff for et annet protein for å kvantifisere overflod av fiskene. Immunutfelling antistoffer blir bøyd til forskjellige MagBead Spectral regioner, som tillater en strømnings flowcytometer å differensiere flere parallelle immunoprecipitations og samtidig kvantifisere mengden av sonde antistoff knyttet til hver. QMI krever ikke genetisk merking og kan utføres ved hjelp av minimale biomaterialet sammenlignet med andre immunutfelling metoder. QMI kan tilpasses for enhver definert gruppe av samspill proteiner, og har hittil blitt brukt til å karakterisere signalering nettverk i T-celler og neuronal glutamat synapser. Resultatene har ført til ny hypotese generasjon med potensielle diagnostiske og terapeutiske programmer. Denne protokollen inneholder instruksjoner for å utføre QMI, fra det første antistoff panel valget gjennom å kjøre analyser og analysere data. Den første monteringen av en QMI analysen innebærer screening antistoffer for å generere et panel, og empirisk bestemme en passende lyseringsbuffer. Den påfølgende reagens forberedelsen inkluderer covalently kopling immunutfelling antistoffer mot MagBeads, og biotinylating sonde antistoffer slik at de kan merkes med en streptavidin fluoroforen. For å kjøre analysen, er lysat blandet med MagBeads over natten, og deretter perler er delt og inkubert med forskjellige sonde antistoffer, og deretter en fluoroforen etikett, og leses av flyt flowcytometri. To statistiske tester er utført for å identifisere Fiskene som avviker betydelig mellom eksperimentelle forhold, og resultatene er visualisere ved hjelp av heatmaps eller node-Edge diagrammer.
Introduction
Dynamisk protein-protein interaksjoner utgjør den molekylære signalering kaskader og aktive strukturer som er funksjonell basis for de fleste cellulære fysiologi1. Disse prosessene er ofte avbildet som lineær signalering trasé som veksler mellom Steady stater basert på enkelt innganger, men eksperimentelle og modellering data tydelig viser at de fungerer som integrerte nettverk2,3, 4. i tilfelle av G proteiner, ulike reseptorer har ofte muligheten til å aktivere samme G protein, og en enkelt reseptor kan også aktivere mer enn én type G protein5,6. For at relativt lite antall G protein klasser spesielt modulere et stort utvalg av cellulære funksjoner som Synaptic overføring, hormon regulering, og celle migrasjon, må cellene både integrere og differensiere disse signalene4 , 5. bevis har vist at dette signalet spesifisitet, for G proteiner så vel som andre, er først og fremst avledet på grunnlag av finjusterte protein-protein interaksjoner og deres timelige dynamikk1,3, 4 andre priser , 5 andre priser , 6 andre priser , 7. fordi signalering nettverk består av dynamiske protein komplekser med flere innganger, utganger, og feedback looper, en enkelt forstyrrelsene har mulighet til å endre den samlede homøostatisk balansen i en celle fysiologi4 ,7. Det er nå allment enighet om at signalering bør undersøkes fra et nettverk perspektiv for å bedre forstå hvordan integreringen av flere innganger kontroller diskret cellulære funksjoner i helse og sykdom7,8, 9,10,11,12,13. I lys av dette, ble kvantitativ multiplex Immunutfelling (QMI) utviklet for å samle middels gjennomstrømning, kvantitative data om fold endringer i dynamiske protein interaksjon nettverk.
QMI er et antistoff-basert analyse der cellen lysat er inkubert med et panel av immunutfelling antistoffer som er covalently koplet til magnetiske perler som inneholder distinkte prosenter av fluorescerende fargestoffer. Etter å ha spesifikke antistoffer koplet til distinkte magnetiske bead klasser tillater samtidig co-immunutfelling av flere mål proteiner fra samme lysat. Etter immunutfelling (IP) er magnetiske perler inkubert med et sekund, fluoroforen sonde antistoff (eller biotinylated antistoff i forbindelse med fluoroforen-bøyd streptavidin). Co-foreninger mellom proteiner gjenkjent av hvert IP antistoff-sonde antistoff par, eller Fiskene (proteiner i delte komplekser oppdages av utsatte overflate epitopes), blir deretter oppdaget av Flow flowcytometri og kan kvantitativt sammenlignet mellom ulike eksempel vilkår14. Illustrasjoner i figur 1 viser trinnene involvert i å kjøre en QMI-analysen, inkludert et diagram av magnetiske perler med immunoprecipitated protein komplekser merket av fluorescensmerkete bøyd sonde antistoffer (figur 1C).
Følsomheten til QMI avhenger av protein konsentrasjonen av lysat i forhold til antall magnetiske perler som brukes til immunutfelling, og oppnå en oppløsning for å oppdage 10% fold endringer krever bare en liten mengde Start materiale i forhold til andre co-IP metoder14,15. For eksempel er mengden av Start materiale som brukes i QMI lik som kreves for en sandwich enzym-koblet Immunosorbentanalyse-analysen (ELISA), men flere interaksjoner er oppdaget i en enkelt QMI-analysen. QMI analyser med 20 IPs og 20 sonde mål har blitt utført med 1-5 x 105 primær T-celler isolert fra en 4 mm hud biopsi, P2 synaptosomal preparater fra en 3 mm koronale del av musen prefrontal cortex, eller 3 x 106 kultivert mus primære kortikale neurons14,16,17. Denne følsomheten gjør QMI nyttig for analyse av celler eller vev med begrenset tilgjengelighet, for eksempel kliniske prøver.
QMI kan tilpasses for alle tidligere definerte protein interaksjon nettverk (forutsatt at antistoffer er tilgjengelig), og hittil er utviklet for å analysere T celle antigen reseptor (TCR) signalosome og et delsett av proteiner på glutamatergic synapser i neurons 17 i , 18. i studier av T celle reseptor SIGNALERING, QMI ble først brukt til å identifisere stimulering-indusert endringer i Fiskene, og deretter å skille autoimmune pasienter fra en kontrollgruppe, oppdage endogene autoimmune signalering, og til slutt å generere en hypotese som involverer en ubalansert sykdom-assosiert subnettverket av interaksjoner14. Flere nylig, det samme QMI panelet ble brukt til å fastslå at thymocyte utvalg bestemmes av kvantitative snarere enn kvalitative forskjeller i TCR-Associated protein signalering19. I neurons, QMI ble brukt til å beskrive input-spesifikke omorganisering av et protein interaksjon nettverk for forskjellige typer inngangssignaler på en måte som støtter nylig nye modeller av Synaptic plastisitet17. I tillegg er dette Synaptic QMI panelet ble brukt til å identifisere forskjeller i syv musemodeller av autisme, klynge modellene i undergrupper basert på deres Fiskene biosignatures, og nøyaktig hypothesize en felles molekylær underskudd som tidligere var ugjenkjennelig i en av modellene16. En lignende tilnærming kan brukes til skjerm for andre undergrupper som kan reagere på ulike rusmiddel behandlinger, eller tildele medikamenter til spesifikke responsive undergrupper. QMI har potensielle applikasjoner innen diagnostikk, pasient under skriving og narkotika utvikling, i tillegg til grunnleggende vitenskap.
For å sette sammen et QMI antistoff panel, er første antistoff-screening og utvalgs protokoller beskrevet i avsnitt 1 nedenfor. Når antistoff paneler er identifisert, er protokoller for Bøyning av de utvalgte antistoffer mot magnetiske perler for IP, og for biotinylation av de valgte sonde antistoffer, beskrevet i avsnitt 2. Protokollen for å kjøre QMI-analysen på celle-eller vevs lysater er beskrevet i avsnitt 3. Til slutt, siden et enkelt eksperiment kan generere ~ 5 x 105 individuelle datapoints, instruksjoner og datamaskinkoder for å bistå i databehandling, analyse og visualisering er gitt i § 4. En oversikt over arbeidsflyten som er beskrevet i avsnittene 2-4, vises i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den QMI analysen krever betydelige investeringer i antistoff panel utvikling, utstyr og reagenser, men når analysen er etablert, kan man samle høy-dimensjonale data observere protein interaksjon nettverk som de reagerer på eksperimentelt-kontrollerte Stimuli. Teknisk sett krever QMI nøye pipettering og sporing av prøve-og antistoff brønn steder. Nøye merking analysen platene er nyttig, som gjør en detaljert mal av brønn steder på papir, som deretter lagres for dataanalyse. Viktigheten av å holde perlene og lys…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Tessa Davis for viktige bidrag til QMI analysen utvikling, og nåværende og tidligere medlemmer av Smith og Schrum laboratorier for teknisk veiledning og intellektuelle innspill. Dette arbeidet ble finansiert av NIMH tilskudd R01 MH113545 og r00 MH 102244.
Materials
| 96-well flat bottomed plates | Bio Rad | 171025001 | |
| 96-well PCR plates | VWR | 82006-704 | |
| Bioplex 200 System with HTF | Bio Rad | 171000205 | modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details |
| Bio-Plex Pro Wash Station | Bio Rad | 30034376 | |
| BSA | Sigma | ||
| CML beads | Invitrogen | C37481 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin | Thermo Scientific | A39256 | |
| MagPlex Microspheres | Luminex | MC12xxx-01 | xxx is the 3 digit bead region |
| Melon Gel IgG Spin Purification Kit | Thermo Scientific | 45206 | used for antibody purification |
| MES | Sigma | M3671 | |
| Microplate film, non-sterile | USA Scientific | 2920-0000 | |
| Phosphotase inhibitor cocktail #2 | Sigma | P5726 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340 | |
| Sandwich Prep Refrigerator | Norlake | SMP 36 15 | for custom refrigeration of Bioplex 200 |
| Sodium fluoride | Sigma | 201154 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| Streptavidin-PE | BioLegend | 405204 | |
| Sulfo NHS | Thermo Scientific | A39269 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152 |
References
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes and Development. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rodríguez-Jorge, O., et al. Cooperation between T cell receptor and Toll-like receptor 5 signaling for CD4. Science Signaling. 12 (577), (2019).
- Bugaj, L. J., et al. Cancer mutations and targeted drugs can disrupt dynamic signal encoding by the Ras-Erk pathway. Science. 361 (6405), (2018).
- Pawson, T. Dynamic control of signaling by modular adaptor proteins. Current Opinion in Cell Biology. 19 (2), 112-116 (2007).
- Hamm, H. E. The many faces of G protein signaling. Journal of Biological Chemistry. 273 (2), 669-672 (1998).
- Lohse, M. J., Hofmann, K. P. Spatial and Temporal Aspects of Signaling by G-Protein-Coupled Receptors. Molecular Pharmacology. 88 (3), 572-578 (2015).
- Eltschinger, S., Loewith, R. TOR Complexes and the Maintenance of Cellular Homeostasis. Trends in Cell Biology. 26 (2), 148-159 (2016).
- Papin, J. A., Hunter, T., Palsson, B. O., Subramaniam, S. Reconstruction of cellular signalling networks and analysis of their properties. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (2), 99-111 (2005).
- Komarova, N. L., Zou, X., Nie, Q., Bardwell, L. A theoretical framework for specificity in cell signaling. Molecular Systems Biology. 1, 23 (2005).
- Schrum, A. G., Gil, D. Robustness and Specificity in Signal Transduction via Physiologic Protein Interaction Networks. Clinical and Experimental Pharmacology. 2 (3), (2012).
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Computational Biology. 6 (6), 1000807 (2010).
- Ron, D., Walter, P. Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (7), 519-529 (2007).
- Bogdan, A. R., Miyazawa, M., Hashimoto, K., Tsuji, Y. Regulators of Iron Homeostasis: New Players in Metabolism, Cell Death, and Disease. Trends in Biochemical Sciences. 41 (3), 274-286 (2016).
- Smith, S. E., et al. Multiplex matrix network analysis of protein complexes in the human TCR signalosome. Science Signaling. 9 (439), 7 (2016).
- Schrum, A. G., et al. High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry. Science’s STKE. 2007 (389), (2007).
- Brown, E. A., et al. Clustering the autisms using glutamate synapse protein interaction networks from cortical and hippocampal tissue of seven mouse models. Molecular Autism. 9 (1), 48 (2018).
- Lautz, J. D., Brown, E. A., Williams VanSchoiack, A. A., Smith, S. E. P. Synaptic activity induces input-specific rearrangements in a targeted synaptic protein interaction network. Journal of Neurochemistry. 146 (5), 540-559 (2018).
- Smith, S. E., et al. Signalling protein complexes isolated from primary human skin-resident T cells can be analysed by Multiplex IP-FCM. Experimental Dermatology. 23 (4), 272-273 (2014).
- Neier, S. C., et al. The early proximal αβ TCR signalosome specifies thymic selection outcome through a quantitative protein interaction network. Science Immunology. 4 (32), (2019).
- Davis, T. R., Schrum, A. G. IP-FCM: immunoprecipitation detected by flow cytometry. Journal of Visualized Expiriments. (46), (2010).
- Smith, S. E., et al. IP-FCM measures physiologic protein-protein interactions modulated by signal transduction and small-molecule drug inhibition. PLoS One. 7 (9), 45722 (2012).
- Lautz, J., et al. Activity-dependent changes in synaptic protein complex composition are consistent in different detergents despite differential solubility. BioRXiv. , (2019).
- Langfelder, P., Horvath, S. WGCNA: an R package for weighted correlation network analysis. BMC Bioinformatics. 9, 559 (2008).
- Schrum, A. G., Gil, D., Turka, L. A., Palmer, E. Physical and functional bivalency observed among TCR/CD3 complexes isolated from primary T cells. Journal of Immunology. 187 (2), 870-878 (2011).
