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Biochemistry

मल्टीप्लेक्स्ड सह-प्रतिरक्षा का उपयोग कर प्रोटीन इंटरेक्शन नेटवर्क गतिशीलता का परिमाणीकरण

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60029
Automatic Translation
1,2, 3,4, 5, 6,7,8, 1,2,9
1Center for Integrative Brain Research, Seattle Children's Research Institute, 2Graduate Program in Neuroscience, University of Washington, 3Department of Cancer Immunology and Virology, Dana-Farber Cancer Institute, Department of Medicine, Harvard Medical School, 4Broad Institute of Harvard and MIT, 5Department of Mathematics, University of Houston, 6Department of Molecular Microbiology and Immunology, School of Medicine, University of Missouri, 7Department of Surgery, School of Medicine, University of Missouri, 8Department Bioengineering, College of Engineering, University of Missouri, 9Department of Pediatrics, University of Washington

Summary

मात्रात्मक बहुसंकेत इम्यूनोवेरीफ्ट (क्यूएमआई) दो नमूनों के बीच लक्षित प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की बहुतायत में मतभेदों के संवेदनशील पता लगाने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करता है। QMI biomaterial की एक छोटी राशि का उपयोग किया जा सकता है, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर टैग की आवश्यकता नहीं है, और किसी भी पहले से परिभाषित प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Abstract

गतिशील प्रोटीन प्रोटीन बातचीत सेलुलर व्यवहार को नियंत्रित, गतिशीलता से डीएनए प्रतिकृति के लिए संकेत transduction. हालांकि, एक प्रोटीन बातचीत नेटवर्क में कई प्रोटीन के बीच गतिशील बातचीत की निगरानी तकनीकी रूप से मुश्किल है. यहाँ, हम मात्रात्मक बहुसंकेतन इम्यूनोप्रीसेप्शन (QMI) के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो उजागर द्वारा पता लगाए गए साझा परिसरों में प्रोटीन के सापेक्ष फ्लोरोसेंट माप के आधार पर प्रोटीन इंटरैक्शन में गुना परिवर्तन के मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है सतह एपिटोप (पिसेस)। QMI में, सेल lysates से प्रोटीन परिसरों microspheres पर इम्यूनोप्रिसिटायुक्त हैं, और फिर एक अलग प्रोटीन के लिए एक लेबल एंटीबॉडी के साथ जांच के क्रम में PiSCES की बहुतायत मात्रा में. इम्यूनोप्रीसेंस एंटीबॉडी विभिन्न MagBead वर्णक्रमीय क्षेत्रों के लिए संयुग्मी हैं, जो एक प्रवाह साइटोमीटर को कई समानांतर इम्यूनोप्रीफिएशन में अंतर करने की अनुमति देता है और साथ ही प्रत्येक के साथ जुड़े जांच एंटीबॉडी की मात्रा को परिमाणित करता है। QMI आनुवंशिक टैगिंग की आवश्यकता नहीं है और अन्य इम्यूनोप्रीसिप्शन तरीकों की तुलना में कम से कम biomaterial का उपयोग किया जा सकता है। QMI प्रोटीन बातचीत के किसी भी परिभाषित समूह के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और इस प्रकार अब तक टी कोशिकाओं और न्यूरॉन ग्लूटामेट synapses में संकेतन नेटवर्क की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है. परिणाम संभावित नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के साथ नई परिकल्पना पीढ़ी के लिए नेतृत्व किया है. इस प्रोटोकॉल QMI प्रदर्शन करने के लिए निर्देश भी शामिल है, प्रारंभिक एंटीबॉडी पैनल चयन से assays चलाने और डेटा का विश्लेषण करने के लिए के माध्यम से. एक QMI परख के प्रारंभिक विधानसभा एक पैनल उत्पन्न करने के लिए एंटीबॉडी स्क्रीनिंग शामिल है, और अनुभवजन्य एक उपयुक्त lysis बफर का निर्धारण. बाद में अभिकर्मक तैयारी में MagBeads के लिए सहसंयोजक युग्मन इम्यूनोप्रीसिप्शन एंटीबॉडी, और बायोटिनलेटिंग जांच एंटीबॉडी शामिल हैं ताकि उन्हें स्ट्रेप्टाविडिन-संयोजित फ्लोरोफोर द्वारा लेबल किया जा सके। परख चलाने के लिए, lysate रात भर MagBeads के साथ मिलाया जाता है, और फिर मोती विभाजित कर रहे हैं और विभिन्न जांच एंटीबॉडी के साथ incubated, और फिर एक fluorophore लेबल, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पढ़ा. दो सांख्यिकीय परीक्षण PiSCES कि प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच काफी अलग की पहचान करने के लिए किया जाता है, और परिणाम heatmaps या नोड-एज आरेख का उपयोग कर visualized हैं.

Introduction

गतिशील प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्यक्रियाओं आणविक संकेतन cascades और गतिशील संरचनाओं है कि सबसे सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान1के कार्यात्मक आधार हैं का गठन. इन प्रक्रियाओं को अक्सर रेखीय संकेतन पथ के रूप में दर्शाया जाता है जो एकल इनपुट के आधार पर स्थिर अवस्थाओं के बीच स्विच करते हैं, लेकिन प्रयोगात्मक और मॉडलिंग डेटा स्पष्ट रूप से दर्शाते हैं कि वे एकीकृत नेटवर्क2,3केरूप में कार्य करते हैं, 4जी प्रोटीन के मामले में, विभिन्न रिसेप्टर्स अक्सर एक ही जी प्रोटीन को सक्रिय करने की क्षमता है, और एक एकल रिसेप्टर भी जी प्रोटीन5,6के एक से अधिक प्रकार सक्रिय कर सकते हैं . जी प्रोटीन वर्गों की अपेक्षाकृत छोटी संख्या के लिए आदेश में विशेष रूप से इस तरह के synaptic संचरण के रूप में सेलुलर कार्यों की एक विशाल सरणी modulate करने के लिए, हार्मोन विनियमन, और सेल प्रवास, कोशिकाओं दोनों एकीकृत और इन संकेतों में अंतर करना चाहिए4 , 5.साक्ष्य से पता चला है कि जी प्रोटीन के साथ-साथ अन्य लोगों के लिए यह संकेत विशिष्टता मुख्य रूप से पतले tuned प्रोटीन प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत और उनके लौकिक गतिशीलता1,3, के आधार पर ली जाती है 4 , 5 , 6 , 7क्योंकि संकेत नेटवर्क कई आदानों, outputs, और प्रतिक्रिया छोरों के साथ गतिशील प्रोटीन परिसरों के शामिल हैं, एक एकल क्षोभ एक सेल के शरीर क्रिया विज्ञान4 के समग्र homeostatic संतुलन को बदलने का अवसर है ,7. अब यह व्यापक रूप से सहमत है कि संकेतन एक नेटवर्क के नजरिए से जांच की जानी चाहिए ताकि बेहतर समझने के लिए कैसे कई आदानों के एकीकरण नियंत्रण स्वास्थ्य औररोग7,8में असतत सेलुलर कार्यों 9,10,11,12,13. इस के प्रकाश में, मात्रात्मक बहुसंकेतन इम्यूनोवेरीफ्ट (QMI) मध्यम throughput इकट्ठा करने के लिए विकसित किया गया था, गतिशील प्रोटीन बातचीत नेटवर्क में गुना परिवर्तन के बारे में मात्रात्मक डेटा.

क्यूएमआई एक एंटीबॉडी-आधारित परख है जिसमें सेल lysate को इम्यूनोप्रीसिप्शन एंटीबॉडी के पैनल के साथ इनक्यूबेट किया जाता है जो फ्लोरोसेंट रंगों के विशिष्ट अनुपात वाले चुंबकीय मोती के साथ सहसंयोजक रूप से युग्मित होते हैं। विशिष्ट एंटीबॉडी अलग चुंबकीय मनका वर्गों के लिए युग्मित होने के लिए एक ही lysate से कई लक्ष्य प्रोटीन के एक साथ सह-प्रतिरक्षा के लिए अनुमति देता है। इम्यूनोवर्षा (आईपी) के बाद, चुंबकीय मोती को एक दूसरे के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, फ्लोरोफोर-कंजुगेटेड जांच एंटीबॉडी (या फ्लोरोफोर-कॉन्जुगेटेड स्ट्रेपविडिटिन के साथ संयोजन के रूप में बायोटिनलेट्ड एंटीबॉडी)। प्रत्येक आईपी एंटीबॉडी-प्रोब एंटीबॉडी जोड़ी द्वारा मान्यता प्राप्त प्रोटीन के बीच सह-संबंध, या PiSCES (साझा परिसरों में प्रोटीन उजागर सतह epitopes द्वारा पता लगाया), तो प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया जाता है और मात्रात्मक विभिन्न के बीच तुलना में किया जा सकता है नमूना शर्तों14| चित्र 1 के उदाहरण ों यथावतः प्रोक्ता अनुप्रग अनुपयुक्त प्रोबेशनल ोंपलों के साथ चुंबकीय मोतियों का आरेख सहित क्यूएमआई परख चलाने में शामिल चरण दर्शाते हैं, जिनमें प्रतिरूपित प्रोटीन संकुलों के साथ चुंबकीय मोतियों का आरेख शामिल है, जो फ्लोरोसेंटी संयुग्मी जांच एंटीबॉडीद्वारालेबल किए गए हैं।

QMI की संवेदनशीलता प्रतिरक्षा के लिए इस्तेमाल किया चुंबकीय मोती की संख्या के सापेक्ष lysate के प्रोटीन एकाग्रता पर निर्भर करता है, और एक संकल्प को प्राप्त करने का पता लगाने 10% गुना परिवर्तन अन्य की तुलना में सामग्री शुरू करने की केवल एक छोटी राशि की आवश्यकता है सह-आईपीविधि14,15. उदाहरण के लिए, QMI में उपयोग की जाने वाली प्रारंभिक सामग्री की मात्रा सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोर्बेंट परख (ELISA) के लिए आवश्यक सामग्री के समान है, लेकिन एक ही QMI परख में एकाधिक इंटरैक्शन का पता लगाया जाता है. QMI 20 आईपी और 20 जांच लक्ष्य ों का उपयोग कर assays 1-5 x 105 प्राथमिक टी कोशिकाओं का उपयोग कर एक 4 मिमी त्वचा बायोप्सी से अलग किया गया है, P2 synaptomal तैयारी माउस prefrontal प्रांतस्था के एक 3 मिमी कोरोनल अनुभाग से, या 3 x 106 सुसंस्कृत माउस प्राथमिक वल्कुटीय न्यूरॉन्स14,16,17. इस संवेदनशीलता QMI सीमित उपलब्धता के साथ कोशिकाओं या ऊतक के विश्लेषण के लिए उपयोगी बनाता है, इस तरह के नैदानिक नमूने के रूप में.

QMI किसी भी पहले से परिभाषित प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (बशर्ते कि एंटीबॉडी उपलब्ध हैं), और आज तक टी सेल प्रतिजन रिसेप्टर (TCR) संकेत और न्यूरॉन्स में glutamatergic synapses में प्रोटीन का एक सबसेट का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है 17 , 18.टी सेल रिसेप्टर संकेतन के अध्ययन में, QMI पहले PiSCES में उत्तेजना प्रेरित परिवर्तन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और फिर एक नियंत्रण समूह से autoimmune रोगियों भेद करने के लिए, अंतर्जात autoimmune संकेतन का पता लगाने, और अंत में उत्पन्न करने के लिए एक परिकल्पना जिसमें असंतुलित रोग-संबद्ध उप-संवद्क्षण ों का संबंध14शामिल है। हाल ही में, उसी क्यूएमआई पैनल का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि थाइमोसाइट चयन टीसीआर-संबद्ध प्रोटीन संकेतन19में गुणात्मक अंतरों के बजाय मात्रात्मक द्वारा निर्धारित किया जाता है। न्यूरॉन्स में, QMI इनपुट संकेतों के अलग प्रकार के लिए एक प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के इनपुट-विशिष्ट पुनर्व्यवस्थित का वर्णन करने के लिए एक तरीके से जो synaptic प्लास्टिक17के नए उभरते मॉडल का समर्थन करता है इस्तेमाल किया गया था. इसके अतिरिक्त, इस synaptic QMI पैनल आत्मकेंद्रित के सात माउस मॉडल में मतभेदों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, उनके PiSCES biosignatures के आधार पर उपसमूहों में मॉडल क्लस्टर, और सही एक साझा आणविक घाटे है कि पहले से अपरिचित था hypothesize मॉडल में से एक में16| एक समान दृष्टिकोण अन्य उपसमूहों है कि विभिन्न दवा उपचार के लिए प्रतिक्रिया हो सकती है के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या विशिष्ट उत्तरदायी उपसमूहों के लिए दवाओं आवंटित. QMI बुनियादी विज्ञान के अलावा निदान में संभावित अनुप्रयोगों है, रोगी उप टाइपिंग, और दवा विकास..

एक QMI एंटीबॉडी पैनल को इकट्ठा करने के लिए, प्रारंभिक एंटीबॉडी स्क्रीनिंग और चयन प्रोटोकॉल अनुभाग 1 में वर्णित हैं, नीचे. एक बार एंटीबॉडी पैनलों की पहचान कर रहे हैं, आईपी के लिए चुंबकीय मोती के लिए चयनित एंटीबॉडी के संयोजन के लिए प्रोटोकॉल, और चयनित जांच एंटीबॉडी के biotinylation के लिए, धारा 2 में वर्णित हैं. सेल या ऊतक lysates पर QMI परख चलाने के लिए प्रोटोकॉल धारा 3 में वर्णित है. अंत में, चूंकि कोई एकल प्रयोग डेटा संसाधन, विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन में सहायता करने के लिए $5 x 105 अलग-अलग डेटापॉइंट, निर्देश और कंप्यूटर कोड जेनरेट कर सकता है, अनुभाग 4 में प्रदान किए गए हैं. अनुभाग 2-4 में वर्णित कार्यप्रवाह का ओवरव्यू चित्र 1में दिखाया गया है.

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Protocol

1. परख डिजाइन

  1. उम्मीदवार एंटीबॉडी की तैयारी
    1. ब्याज के प्रत्येक प्रोटीन के लिए, स्क्रीन करने के लिए 3 से 5 एंटीबॉडी का चयन करें। जब संभव हो, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करें जो विभिन्न प्रतीकों को पहचानते हैं। इसके अलावा एक गैर विशिष्ट नियंत्रण एंटीबॉडी शामिल हैं.
    2. Tris को दूर करने के लिए, एक 30 kDa स्पिन फिल्टर करने के लिए एंटीबॉडी जोड़कर बफर विनिमय प्रदर्शन, अपनी न्यूनतम मात्रा के लिए नीचे कताई, फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 500 $L जोड़ने, और दोहरा 3 बार. वाहक प्रोटीन को दूर करने के लिए, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एंटीबॉडी शुद्धि प्रदर्शन (विशिष्ट शुद्धि सिफारिश के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: यह किया जाता है क्योंकि वाहक प्रोटीन और मुफ्त amine समूहों के साथ बफ़र्स (जैसे Tris) COOH समूहों के साथ प्रतिक्रिया और बाद में मनका युग्मन और biotinylation प्रतिक्रियाओं बुझाने होगा. सुनिश्चित करें कि सभी एंटीबॉडी शुद्ध कर रहे हैं (कोई वाहक प्रोटीन) और प्राथमिक amines से मुक्त एक बफर में (यानी, कोई Tris).
    3. डेविस और Schrum20द्वारा वर्णित के रूप में carboxylate संशोधित लेटेक्स (CML) मोती करने के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी युगल . एंटीबॉडी के संरक्षण के लिए, 1/5 तक मनका युग्मन प्रतिक्रियाओं को नीचे स्केल करें (यानी, 3.6 x 106 मोती, जिसमें 0.2-1 मिलीग्राम/एमएल एंटीबॉडी का 10 डिग्री सेल्सियस है)।
    4. एक हेमोसाइटोमीटर (आमतौर पर $108/mL) का उपयोग करके मनका संख्याओं का अनुमान लगाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। मोती एक साल से अधिक के लिए संग्रहीत किया गया है और QMI assays में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया है, लेकिन शेल्फ जीवन या समाप्ति तिथियाँ औपचारिक रूप से स्थापित नहीं किया गया है. B/S बफर में NaN3 जीवाणु वृद्धि को रोकता है.
    5. प्रत्येक एंटीबॉडी के एक हिस्से Biotinylate (नीचे अनुभाग 2.2 देखें). 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. प्रभावी CML मनका युग्मन और धुंधला द्वारा सटीक CML मनका युग्मन और सही गिनती की पुष्टि 1 x 105 मोती एक पीई के साथ-संयुग्मी एंटीबॉडी प्रतिक्रियाशील प्रजातियों जिसमें एंटीबॉडी उठाया गया था और एक प्रवाह cytometer पर पढ़ने के लिए.
    7. streptavidin-HRP का उपयोग कर डॉट ब्लॉट द्वारा एंटीबॉडी biotinylation की पुष्टि करें।
    8. एक बार प्रयोगशाला अभिकर्मकों कि प्रभावी होने के लिए जाना जाता है उत्पन्न किया है, चरण 1.1.5 और 1.1.6 में पुष्टि करण प्रतिक्रियाओं में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में उन अभिकर्मकों का उपयोग करें.
  2. आईपी-एफसीएम द्वारा एंटीबॉडी स्क्रीनिंग (प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया गया प्रतिरक्षा)
    1. एक उचित स्क्रीनिंग lysate पर फैसला. इस और अन्य सभी पूर्व QMI स्क्रीनिंग कदम के लिए (कुछ भी इस खंड में शामिल 1: परख डिजाइन), सीमित उपलब्धता के साथ biosamples का उपयोग न करें. इसके बजाय, इस तरह के wildtype माउस ऊतक, सेल लाइनों, या सामान्य मानव दाता ऊतक है कि एक सीमित संसाधन नहीं है के रूप में एक तुलनीय नियंत्रण सामग्री का चयन करें.
      नोट: इस परख के लिए एक lysis बफर का चयन तुच्छ नहीं है, और खंड 1.5 में चर्चा की है: डिटर्जेंट चयन, साथ ही चर्चा अनुभाग के अंतिम पैरा में. मानक lysis बफ़र्स 150 एमएम NaCl, 50 एमएम Tris (पीएच 7.4), 10 एमएम सोडियम फ्लोराइड, 2 एमएम सोडियम ऑर्थोवांडेट, और प्रोटीज़ और फॉस्फेटेस अवरोधक कॉकटेल का आधार है। QMI के साथ संगत डिटर्जेंट 1% एनपी-40, 1% Digitonin, 0.1-1% Triton X-100, और 0.5-1% deoxycholate14,16,17,18,19,21शामिल हैं.
    2. जांच की जा करने के लिए प्रत्येक आईपी-प्रोब संयोजन के लिए 10 डिग्री सेल्सियस का उपयोग कर, प्रत्येक आईपी के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए lysate की कुल मात्रा की गणना। यदि स्क्रीनिंग एक्स जांच एंटीबॉडी और एक आईजीजी नियंत्रण का उपयोग कर, प्रत्येक आईपी का उपयोग करेगा (X + 1) * (10 $L) * (1.1 pipeting त्रुटि के लिए); X+1 आवश्यक आईजीजी जांच नियंत्रण के लिए खाते में है। उदाहरण के लिए, एक 3x3 एंटीबॉडी स्क्रीन में, प्रत्येक IP 44 ul का उपयोग करना चाहिए। एक आईजीजी आईपी नियंत्रण शामिल करने के लिए याद रखें (चित्र 2में उदाहरण स्क्रीनिंग सेटअप देखें)।
    3. उपयोग किया जा करने के लिए CML मनका संख्या की गणना करें। यदि आप एक्स जांच एंटीबॉडी स्क्रीनिंग कर रहे हैं, का उपयोग करें [(X +1) * 5 x 104 मोती]. आदर्श रूप में, अच्छी तरह से प्रति 5,000 मोती में परिणाम होगा gt; 2,000 मोती प्रति अच्छी तरह से प्रवाह cytometer द्वारा पढ़ा जा रहा है. उदाहरण के लिए, एक 3 x 3 एंटीबॉडी स्क्रीन में, प्रत्येक IP 20,000 मोती का उपयोग करना चाहिए, जो चरण 1.1.3 से तैयार CML मनका स्टॉक का लगभग 0.66 $L है (मोक पहले सटीकता सुनिश्चित करने के लिए एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके क्वांटीकृत किया जाना चाहिए)।
    4. प्रत्येक CML मनका की मात्रा के साथ चरण 1.2.2 से lysate की मात्रा को इनक्यूबेट करें, रात भर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ मोती को व्यवस्थित करने से रोकने के लिए। आमतौर पर, 96-वेल PCR प्लेट के पहले कॉलम में इनक्यूबेशन करें, और PCR ट्यूब स्ट्रिप कैप के साथ कैप करें.
    5. 1 मिनट के लिए 3,200 x ग्राम पर CML मोती नीचे स्पिन और सिंक पर थाली की एक एकल, तेजी से flicking द्वारा lysate हटा दें। एक छोटे से सफेद गोली प्रत्येक अच्छी तरह से दोनों से पहले और flicking के बाद के तल पर दिखाई देना चाहिए.
    6. प्रत्येक मनका-प्रोब जोड़ी के लिए 20 डिग्री सेल्सियस के बराबर करने के लिए FlyP बफर की एक मात्रा में CML मोती पुन: निलंबित; एक्स जांच एंटीबॉडी के लिए, का उपयोग करें (X + 1) * (20 $L) * (1.1 pipeting त्रुटि के लिए), कदम के समान 1.2.2. एक 3 x 3 स्क्रीन के लिए, FlyP बफर के 88 डिग्री एल में पुन: निलंबित. FlyP बफर 100 m NaCl, 50 m Tris पीएच 7.4, 1% बीएसए, 0.01% NaN3है.
    7. एक 96-वेल PCR प्लेट के कुओं (X+1) में प्रत्येक आईपी वितरित करें, जहां एक्स 20 डिग्री एल/वेल का उपयोग करके जांच की जा रही एंटीबॉडी की संख्या है। चित्र 2 एक एक उदाहरण स्क्रीनिंग सेटअप से पता चलता है.
    8. अच्छी तरह से प्रति FlyP बफर के 200 $L का उपयोग कर 2 अतिरिक्त बार धो लें। चरण 1.2.5 में के रूप में थाली स्पिन और प्रत्येक धोने के बाद धोने बफर को दूर करने के लिए थाली झटका. गोली बहुत छोटा हो जाएगा, लेकिन प्रत्येक धोने के बाद दिखाई देना चाहिए.
    9. प्रत्येक biotinylated एंटीबॉडी के लिए जांच की जा करने के लिए, के रूप में कुल मात्रा की गणना (Y+1) * 1.1 * 50 डिग्री सेल्सियस, जहां Y आईपी एंटीबॉडी की संख्या है जांच की जा रही है. FlyP बफर की इस मात्रा में एक काम एकाग्रता के लिए एक काम एकाग्रता को विलेय एंटीबॉडी, आम तौर पर एक 0.5 mg/mL स्टॉक के 1:100 कमजोर पड़ने के साथ शुरू.
    10. 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक स्तंभ के नीचे प्रत्येक पतला एंटीबॉडी वितरित करें, और सुनिश्चित करें कि CML मोती resuspended हैं.
    11. 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, या तो रोटेशन या 15 मिनट के अंतराल पर पाइपिंग के साथ यह सुनिश्चित करने के लिए कि सीएमएल मोती निलंबन में बने रहें।
    12. FlyP बफर के 200 $L में 3x धो लें, प्रत्येक धोने अपकेंद्रित्र के लिए और चरण 1.2.5 में के रूप में lysate निकालें।
    13. FlyP बफर में 1:200 Streptavidin-पीई के 50 $L में सभी CML मोती पुन: निलंबित करें।
    14. 30 मिनट के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    15. FlyP बफर के 200 $L में 3x धो लें, प्रत्येक धोने अपकेंद्रित्र के लिए और चरण 1.2.5 में के रूप में lysate निकालें।
    16. FlyP बफर के 200 $L में पुन: निलंबित करें, और उसके बाद एक प्रवाह साइटोमीटर पर चलाएँ।
  3. परख में शामिल करने के लिए एंटीबॉडी का चयन
    1. FSC-H बनाम एसएससी-एच का उपयोग कर आकार पर गेट, और FSC-H बनाम FSC-A का उपयोग कर doublets को खत्म।
    2. पीई फ्लोरोसेंट तीव्रता के हिस्टोग्राम उत्पन्न करें और परीक्षण किए गए युग्मों पर आईजीजी नियंत्रण (आईजीजी मनका-परीक्षण जांच, परीक्षण मनका-आईजीजी जांच) दोनों को अधिव्यापन करें (चित्र2)।
    3. एक मनका-प्रोब जोड़ी के लिए देखो जो शोर पर स्पष्ट संकेत देता है (चित्र 2ठ)। इसके अतिरिक्त, यह दोनों मनका और जांच के लिए एक ही एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए आदर्श नहीं है. विभेदक एपिटोप मान्यता कुछ एपिटोप कुछ प्रोटीन परिसरों में occluded किया जा सकता है क्योंकि बातचीत को देखने की संभावना को अधिकतम. यदि कोई स्वीकार्य विकल्प नहीं हैं, तो अतिरिक्त एंटीबॉडी के साथ स्क्रीन दोहराएं।
  4. एंटीबॉडी विशिष्टता की पुष्टि
    1. लक्षित लक्ष्यों के लिए एंटीबॉडी विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए, एक lysate नमूना है जिसमें लक्ष्य बाहर खटखटाया गया है का उपयोग करें; उदाहरण के लिए, एक नॉकआउट माउस या एक RNAi कक्ष पंक्ति। वैकल्पिक रूप से, एक लक्ष्य-नकारात्मक सेल लाइन से lysate का उपयोग करें जिसमें लक्ष्य प्रोटीन कृत्रिम रूप से व्यक्त किया गया है।
    2. IP-FCM को चरण 1.2 में वर्णित अनुसार निष्पादित करें, प्रयोग को फ़िट करने के लिए संशोधित करें.
  5. डिटर्जेंट चयन
    1. के रूप में डिटर्जेंट सह आईपी प्रयोगों में महत्वपूर्ण हैं, अनुभवजन्य रूप से विभिन्न विविधताओं का परीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि परख परिवर्तन का पता लगाने की अधिकतम संभावना है. शुरू करने के लिए, बातचीत के एक अपेक्षाकृत छोटे पैनल का चयन (4-8) कि एक दिया शर्त में बदलने के लिए जाना जाता है और /
    2. प्रारंभिक स्क्रीन के लिए किए गए गैर-प्रवाही, एंटीबॉडी-संयोजित CML मोती का उपयोग करना, विभिन्न lysis बफर डिटर्जेंट स्थितियों का उपयोग कर 1.2 में वर्णित के रूप में आईपी-FCM प्रदर्शन करते हैं। डिटर्जेंट स्क्रीन केवल चर के रूप में डिटर्जेंट के साथ किया जा सकता है, या प्रत्येक डिटर्जेंट के लिए विभिन्न सेल शर्तों के साथ. हमेशा दोनों मोती और जांच के लिए आईजीजी नियंत्रण का उपयोग करें, के बाद से डिटर्जेंट कभी कभी कुछ आईपी जांच संयोजन में अप्रत्याशित पृष्ठभूमि का उत्पादन.
    3. स्क्रीन से MFIs के आधार पर, ब्याज की PiSCES के लिए संकेत का अनुकूलन एक डिटर्जेंट चुनें. यह संभावना है कि कुछ समझौतेकरनेकी आवश्यकता होगी 22 .

2. मल्टीप्लेक्स अभिकर्मक तैयारी

  1. चुंबकीय मनका युग्मन
    1. चुंबकीय मनका क्षेत्र के नक्शे का उपयोग करना, पार का पता लगाने के जोखिम को कम करता है कि एक पैटर्न में उपयोग करने के लिए मनका क्षेत्रों का चयन करें. चुंबकीय मनका आम तौर पर ऊपर और सही करने के लिए धब्बा है, तो तिरछे आसन्न हैं कि मनका क्षेत्रों से बचें। Luminex वेबसाइट पर दिखाए गए मनका आरेख के हर दूसरे कॉलम से मोती की सिफारिश की जाती है (https://www.luminexcorp.com/magplex-microspheres/)
    2. पीबीएस में 0.1 मिलीग्राम/एमएल पर वाहक-मुक्त एंटीबॉडी तैयार करें (जैसा कि 1.1.2) में 250 डिग्री सेल्सियस में। बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर रखें।
    3. भंवर चुंबकीय मोती बड़े पैमाने पर, और फिर एक एम्बर microcentrifuge ट्यूब में aliquot 250 $L (photobleaching से मोती की रक्षा के लिए).
    4. चुंबकीय रूप से 60 s के लिए अलग चुंबकीय मोती और supernatant हटा दें.
    5. एमईएस बफर (50 एमएम एमईएस पीएच 6.0, 1 एमएम EDTA), भंवर, 60 s के लिए चुंबकीय रूप से अलग 250 डिग्री एल जोड़ें, और supernatant हटा दें। एमईएस बफर के 200 डिग्री एल में चुंबकीय मोतियों को दोहराएं और पुन: स्फूर्ति दीं।
    6. एक 50 मिलीग्राम /एमएल स्टॉक बनाने के लिए Sulfo-एनएचएस के एकल उपयोग ट्यूब के एक 2 मिलीग्राम करने के लिए एमईएस के 40 डिग्री एल जोड़ें।
    7. चुंबकीय मोती के लिए ताजा बनाया Sulfo-एनएचएस के 25 $L जोड़ें। भंवर.
    8. एमईएस बफर में 50 मिलीग्राम/एमएल नए सिरे से भंग EDAC [1-एथिल-3-(-3-dimethylaminopropyl) कार्बोडिमिड हाइड्रोक्लोराइड, जिसे ईडीसी भी कहा जाता है, जोड़ें। भंवर.
    9. कवर और कमरे अस्थायी, 1000 आरपीएम में 20 मिनट के लिए एक ट्यूब पकड़ लगाव के साथ एक भंवर पर हिला.
    10. चुंबकीय रूप से 60 s के लिए अलग है और supernatant हटा दें.
    11. पीबीएस, भंवर, चुंबकीय रूप से 60 s के लिए अलग 500 डिग्री एल में पुन: निलंबित और supernatant हटा दें। दोहराएँ.
    12. चरण 2.1.2 से एंटीबॉडी समाधान के 250 $L में पुन: निलंबित करें। भंवर.
    13. 1000 आरपीएम पर एक भंवर पर मिलाते हुए के साथ कमरे अस्थायी में 2 एच इनक्यूबेट।
    14. चुंबकीय मोती, भंवर, चुंबकीय रूप से 60 s के लिए अलग करने के लिए पीबीएस के 500 डिग्री एल जोड़ें, और supernatant हटा दें।
    15. बीबीएस पीएच 7.4, 0.01% NaN3में ब्लॉकिंग/स्टोरेज (बी/एस) बफर (1% बीएसए) के 750 $L जोड़ें। कवर और कमरे अस्थायी, 1000 आरपीएम में 30 मिनट इनक्यूबेट।
    16. चुंबकीय रूप से 60 s के लिए अलग है और supernatant हटा दें. B/S बफर के 100 डिग्री एल में पुन: निलंबित करें।
    17. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। मोती एक साल से अधिक के लिए संग्रहीत किया गया है और QMI assays में सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया है, लेकिन शेल्फ जीवन या समाप्ति तिथियाँ औपचारिक रूप से स्थापित नहीं किया गया है. B/S बफर में NaN3 जीवाणु वृद्धि को रोकने चाहिए.
    18. एक फ्लोरोसेंट विरोधी मेजबान प्रजातियों माध्यमिक और एक प्रवाह साइटोमीटर पर पढ़ने के साथ युग्मित चुंबकीय मोती के $0.25 डिग्री सेल्सियस धुंधला द्वारा चुंबकीय मनका युग्मन मान्य, चरण 1.1.5 के रूप में.
  2. बायोटिनिलेशन
    1. सुनिश्चित करें कि एंटीबॉडी कोई वाहक प्रोटीन के साथ पीबीएस में हैं।
    2. बायोटिनलेट किया जा करने के लिए एंटीबॉडी की कुल $g की गणना (100-200 g मल्टीप्लेक्स में उपयोग के लिए सिफारिश की, 25-50 ग्राम स्क्रीनिंग के लिए सिफारिश की).
    3. ताजा 10 एमएम सल्फो-एनएचएस-बायोटिन तैयार करें (डीडीएच2ओ के 224 डिग्री एल को जोड़कर 1 मिलीग्राम नो-वेदर ट्यूब में किया जा सकता है)।
    4. मिश्रण करने के लिए 10 एमएम सल्फो-एनएचएस-बायोटिन के 25 डिग्री ग्राम, भंवर या पिपेट को ऊपर और नीचे जोड़ें।
    5. 1 ज के लिए कमरे अस्थायी पर इनक्यूबेट।
    6. 1 h के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    7. असीमित बायोटिन को हटाने और प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 30 केडीए स्पिन फिल्टर का उपयोग करें। PBS के 500 $L जोड़ें और न्यूनतम मात्रा तक पहुँच गया है जब तक स्तंभ स्पिन। अतिरिक्त पीबीएस के 500 $L जोड़ें और 3 कुल बफर एक्सचेंजों के लिए दोहराएँ.
    8. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 1-2 डिग्री सेल्सियस के अवशोषण को मापने के द्वारा एकाग्रता का अनुमान, और फिर एंटीबॉडी एकाग्रता लाने के लिए 0.5 मिलीग्राम /
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. मात्रात्मक बहुसंकेत प्रतिरक्षा

  1. प्लेट लेआउट
    नोट: यह परख सबसे अच्छा काम करता है जब 96-अच्छी प्लेटें और 2-4 नमूना शर्तों का उपयोग कर प्रदर्शन किया.
    1. हमेशा उचित नियंत्रण चलाने के लिए (यानी, प्रेरित वी. unstimulated कोशिकाओं) एक ही थाली पर क्रम में शर्तों के बीच परिवर्तन का पता लगाने के लिए. प्रत्येक नमूने को प्लेट में क्षैतिज रूप से वितरित करें, और प्रत्येक स्तंभ का उपयोग एक अलग जांच एंटीबॉडी के लिए करें. प्रत्येक जांच के लिए तकनीकी प्रतिकृति का एक सेट पहले सेट के तुरंत बाद चलाया जाना चाहिए. किसी उदाहरण के लिए चित्र 3 देखें.
    2. ध्यान से सही प्लेट लोड हो रहा है और विश्लेषण की सुविधा के लिए प्लेट लेआउट दस्तावेज़।
  2. नमूना तैयारी और इम्यूनोप्रीसेप्शन (दिन 1)
    1. प्रोटीज़ और फॉस्फेटेज इनहिबिटर के साथ उपयुक्त डिटर्जेंट में लिज़ ऊतक या कोशिकाओं और 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट। हर समय lysate ठंड रखने के लिए ध्यान रखना।
      नोट: biomaterial और lysate प्रोटीन एकाग्रता बताते हुए की सटीक मात्रा अनुभवजन्य निर्धारित किया जाना चाहिए, और पहले से इस्तेमाल किया नमूनों के कुछ उदाहरण परिचय के तीसरे पैरा में सूचीबद्ध हैं. सामान्य तौर पर, प्रति नमूने 2 मिलीग्राम/एमएल प्रोटीन की 200 डिग्री सेल्सियस की सीमा में 20 आईपी और 20 जांच लक्ष्यों के लिए अतीत में सफल रहा है, लेकिन प्रत्येक एंटीबॉडी पैनल और सेल या ऊतक प्रकार के लिए आदर्श आदानों अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
    2. झिल्ली और मलबे को दूर करने के लिए 16,000 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे स्पिन; lysate के रूप में supernatant रखना.
    3. एक BCA परख या प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करने के लिए इसी तरह प्रदर्शन, और फिर नमूनों के बीच प्रोटीन एकाग्रता सामान्य. यदि कक्षों का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रति शर्त कक्षों की समान संख्या से प्रारंभ करें और सामान्यीकरण वैकल्पिक है.
    4. एक मास्टर चुंबकीय मनका मिश्रण है कि परख में अच्छी तरह से प्रति प्रत्येक वर्ग के 250 चुंबकीय मोती शामिल हैं तैयार करें. डेटा विश्लेषण के बाद मनका संख्या समायोजित करें ताकि भविष्य में प्रत्येक वर्ग के 110 मोती के एक औसत परविशेष रूप से अच्छी तरह से पढ़ा जाएगा।
      नोट: उदाहरण परिकलन: (नई मनका मात्रा) [ (रन औसत) / मनका संस्करणों हर 8 रन के बारे में या जरूरत के रूप में इस तरह से समायोजित किया जाना चाहिए. आमतौर पर, प्रत्येक चुंबकीय मनका के 3-4 डिग्री एल (ऊपर के रूप में तैयार) एक 2-प्लेट प्रयोग के लिए उपयोग किया जाता है।
    5. चुंबकीय जुदाई के साथ FlyP बफर में चुंबकीय मनका मिश्रण 2x धो लें, और फिर FlyP बफर में फिर से निलंबित. पुनः निलंबन के लिए, प्रति प्रति प्रति प्रति नमूना प्रति प्रति प्लेट 10 $L का उपयोग करें. FlyP बफर 100 m NaCl, 50 m Tris पीएच 7.4, 1% बीएसए, 0.01% NaN3है.
    6. चुंबकीय मनका मिश्रण को अच्छी तरह से भंवर करने के बाद, बर्फ ठंड microcentrifuge ट्यूबों (प्रति नमूना एक ट्यूब) में aliquot 10 डिग्री सेल्सियस। प्रतिरक्षा के लिए प्रत्येक ट्यूब के लिए lysate (सामान्यीकृत सांद्रता के साथ) के बराबर मात्रा में जोड़ें।
    7. अलीकोट प्रत्येक प्लेट चलाने के लिए एक ट्यूब में lysate चुंबकीय मनका मिश्रण; उदाहरण के लिए एक 2-प्लेट प्रयोग के लिए, दो ट्यूबों में lysate विभाजित. इम्यूनोएसेशन के लिए रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रोटेटर पर ट्यूब रखें, प्रकाश को बाहर रखने के लिए कवर किया जाता है।
  3. परख चल रहा है (दिन 2)
    1. प्लेट #1 के लिए lysate-चुंबकीय मनका ट्यूबों के साथ शुरू करो। चुंबकीय मोती से lysate को दूर करने के लिए एक चुंबकीय मनका रैक का प्रयोग करें, और भविष्य के विश्लेषण के लिए lysate आरक्षित. बर्फ ठंड FlyP बफर के 500 डिग्री एल में मोती 2x धो लो. ट्यूब ों को हमेशा बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. (जांचों की संख्या) * (2 तकनीकी प्रतिकृतियां) * (25 $L प्रति अच्छी तरह से) * (1.1 पाइपिंग त्रुटि के लिए) के रूप में resuspension मात्रा की गणना करें। बर्फ ठंडा FlyP बफर की गणना मात्रा में आईपी पुन: निलंबित.
    3. कोमल pipeting द्वारा चुंबकीय मोती अच्छी तरह से resssinsing के बाद, एक फ्लैट नीचे 96 अच्छी तरह से थाली भर में अच्छी तरह से 25 डिग्री एल वितरित, बर्फ पर.
    4. एक अलग 96-वेल प्लेट में, 2x काम कर एकाग्रता के लिए biotinylated जांच एंटीबॉडी पतला (काम एकाग्रता आम तौर पर 1:100 या 1:200, अनुभवजन्य निर्धारित है) FlyP बफर में इतना है कि उनके आदेश प्लेट लेआउट पर कॉलम से मेल खाता है (चित्र 3 देखें ). काम एकाग्रता पर जांच एंटीबॉडी की अंतिम मात्रा अच्छी तरह से प्रति 50 डिग्री सेल्सियस हो जाएगा, तो प्रत्येक 2x एंटीबॉडी तैयार की मात्रा होना चाहिए (25 डिग्री सेल्सियस) * (जैविक नमूनों की संख्या) * (2 तकनीकी प्रतिकृति) * (1.1 पाइपिंग त्रुटि के लिए).
    5. चुंबकीय मनका युक्त परख प्लेट में प्रत्येक जांच एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के 25 डिग्री सेल्सियस वितरित करने के लिए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करें।
    6. चुंबकीय मोती को मिलाने और पुन: निलंबित करने के लिए एक क्षैतिज प्लेट शेकर पर हिलाएं, और फिर 1 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, अंधेरे में 450 आरपीएम पर हिलते हुए।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय प्लेट वॉशर पर FlyP बफर के साथ 3x धो ओत.
    8. चुंबकीय मोतियों को 1:200 स्ट्रेप्टाविडिन-पीई के 50 डिग्री एल में पुन: निलंबित करें।
    9. मोती मिश्रण और resuspend करने के लिए हिलाओ, और फिर 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, अंधेरे में 450 आरपीएम पर मिलाते हुए।
    10. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय प्लेट वॉशर पर FlyP बफर के साथ 3x धो ओत.
    11. FlyP बफर के 125 $L में पुन: निलंबित करें।
    12. अच्छी तरह से मोती resuspend करने के लिए 900 आरपीएम पर 1 मिनट के लिए हिलाओ।
    13. रेफ्रिजरेटेड फ्लो साइटोमीटर पर चलाएँ (चित्र S1में आरेख देखें) | प्रवाह cytometer सॉफ्टवेयर में "उच्च RP1 लक्ष्य" सेटिंग का उपयोग करें, और प्रति क्षेत्र 1,000 मोती की एक रोक हालत (बहुत संख्या है कि किसी भी व्यक्ति में अच्छी तरह से होना चाहिए overshooting मशीन समय से पहले रोकने से रोकने के लिए) और नमूना मात्रा 80 $L.
    14. रन आधे रास्ते के माध्यम से रोकें और बसने को रोकने के लिए मोती resuspend.
    15. .xml स्वरूप में डेटा फ़ाइलें निर्यात करें.
    16. चरण 3.3.1 से प्रारंभ करके शेष प्लेटों के लिए प्रक्रिया दोहराएँ.

4. डेटा विश्लेषण

नोट: ANC कोड N से दो शर्तों की तुलना करने के लिए डिज़ाइन किया गया था $ 4 प्रयोगों, प्रत्येक के साथ प्रत्येक 2 तकनीकी प्रतिकृति प्रत्येक के लिए। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को चार स्वतंत्र बार प्रेरित कर रहे हैं, QMI नियंत्रण पर चार अलग अलग दिनों पर चलाया जाता है (अउत्तेजित) और प्रेरित कोशिकाओं, ऊपर के रूप में तकनीकी प्रतिकृति के साथ, और डेटा विश्लेषण नीचे वर्णित के रूप में आय.

  1. समायोज्य अल्फा कटऑफ (एएनसी) के साथ अनुकूली गैर-पैरामीट्रिक
    1. MATLAB खोलें और सक्रिय निर्देशिका को ANC प्रोग्राम घटकों वाले फ़ोल्डर और .xml फ़ाइलों को प्रवाह साइटोमीटर से निर्यात किया गया सेट करें.
    2. प्रयोगात्मक डिजाइन के विवरण को प्रतिबिंबित करने के लिए "एएनसी इनपुट" फ़ाइल भरें। पूरक फ़ाइल में शामिल उदाहरण फ़ाइल को भी प्रदान किए गए उदाहरण डेटा को चलाने के लिए पहले से भरा किया गया है.
    3. प्रोग्राम चलाएँ, जो सक्रिय निर्देशिका में .csv फ़ाइल लिखेगा. फ़ाइल रिपोर्ट PiSCES कि काफी अलग हैं, एक गलत सकारात्मक (अल्फा) स्तर पर 0.05, नियंत्रण और प्रायोगिक स्थितियों के बीच, सभी 4 प्रयोगात्मक प्रतिकृति में, या कम से कम 3/
    4. नोट 'ANC हिट,' जो PiSCES के रूप में परिभाषित कर रहे हैं कम से कम 3 प्रयोगात्मक प्रतिकृतियां में महत्वपूर्ण अंतर के साथ, के रूप में प्रतिनिधित्व किया 3/4 $4 /4 फ़ाइल में, चरण 4.3.1 में उपयोग के लिए.
  2. भारित सहसंबंध नेटवर्क विश्लेषण23 (CNA)
    1. में समाप्त होने वाले Matlab द्वारा डेटा फ़ाइल आउटपुट के स्तंभ शीर्षकों को चिपकाएं- "$MFI" में समाप्त हो रहा है। एक नया एक्सेल शीट की पहली पंक्ति में CSV". प्रयोगात्मक उपचार के लिए प्रयोग संख्या के लिए स्तंभ "प्रयोग" और "उपचार", या विश्लेषण किए जाने वाले किसी भी अन्य चर के लिए जोड़ें. इस फ़ाइल को "traits.csv" के रूप में सहेजें.
    2. R स्टूडियो खोलें और कार्य निर्देशिका वाले फ़ोल्डर के लिए सेट करें "$MFI. CSV" और "TRAITS. CSV" फ़ाइलें.
    3. R आदेश के रूप में टिप्पणी की आदेश फ़ाइल में इंगित चलाएँ और फ़ाइलों के साथ शामिल निर्देशों में विस्तृत. WCNA मॉड्यूल काफी प्रत्येक प्रयोगात्मक विशेषता के साथ सहसंबद्ध एक ग्राफिक फ़ाइल के रूप में उत्पादन कर रहे हैं, और प्रत्येक बातचीत आईपी i के सहसंबंधप्रत्येकमॉड्यूल के साथ प्रोबजे एक .csv फ़ाइल के रूप में उत्पादन है.
    4. नोट 'CNA हिट,' जो मॉड्यूल सदस्यता के साथ बातचीत के रूप में परिभाषित कर रहे हैं (एमएम) gt; 0.7 और p-lt; 0.05 एक मॉड्यूल है कि काफी ब्याज के प्रयोगात्मक चर के साथ सहसंबद्ध के रूप में पहचान की थी में सदस्यता के लिए, चरण में उपयोग के लिए 4.3.1.
  3. सकारात्मक 'हिट्स' और दृश्य
    1. ANC आउटपुट फ़ाइल (चरण 4.1.4 से) में "3/4/4 hits" सूची में प्रत्येक इंटरैक्शन के लिए, यह पहचानें कि क्या वह सहभागिता CNA आउटपुट फ़ाइल की जाँच करके "CNA हिट" भी है (चरण 4.2.6 देखें) देखें. एक नया स्तंभ बनाएँ जो इंगित करता है कि प्रत्येक ANC हिट भी CNA हिट है.
    2. चरण 4.1.3 से ANC आउटपुट स्प्रेडशीट में दिए गए मानों का औसत करके प्रत्येक ANC $ CNA हिट के लिए औसत लॉग2 फ़ो परिवर्तन मान परिकलित करें. औसत से पहले2 गुना परिवर्तन लॉग करने के लिए मान कनवर्ट करें। केवल 3/4 प्रतिकृतियों में महत्वपूर्ण थे जो सहभागिताओं के लिए, बाहरी मान हटाएँ।
    3. एक स्तंभ में एक आईपी के रूप में सूचीबद्ध प्रत्येक ANC $ CNA हिट के साथ एक स्प्रेडशीट बनाओ, दूसरे स्तंभ में एक जांच, और गुना तीसरे स्तंभ में परिवर्तन मान. Cytoscape में एक नेटवर्क के रूप में फ़ाइल आयात करके एक नोड-एज आरेख बनाने के लिए इस स्प्रेडशीट का उपयोग करें.

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Representative Results

एंटीबॉडी स्क्रीनिंग
चित्र 2 बी प्रोटीन Connexin36 के लिए एक स्क्रीन के परिणाम से पता चलता है. सबसे IP-probe संयोजन IgG नियंत्रण पर कोई संकेत का उत्पादन. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1E5 के साथ आईपी और या तो 1E5 या polyclonal एंटीबॉडी 6200 के साथ जांच आईजीजी नियंत्रण की तुलना में मनका वितरण में एक सही बदलाव पैदा करता है। यहाँ, आईपी 1E5 और जांच 6200poly आईपी और जांच के रूप में एक ही एंटीबॉडी का उपयोग कर से बचने के लिए चुना गया, दोनों एक गैर विशिष्ट प्रोटीन की संभावना को कम करने के लिए दो स्वतंत्र एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा रहा है, और सह-एसोसिएशन का उपयोग कर का पता लगाने की संभावना को बढ़ाने के लिए अलग प्रतीक. यह IgG नियंत्रण की तुलना में कम से कम 1-2 लॉग उच्च MFI के साथ एक IP-probe संयोजन का चयन करने के लिए सबसे अच्छा है, लेकिन कभी कभी कमजोर MFIs है कि लगातार नियंत्रण से अलग कर रहे हैं उत्पादन जोड़े अगर कोई विकल्प की पहचान कर रहे हैं इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्र 2 सी 1E5-6200poly संयोजन के लिए एक विशिष्टता सत्यापन प्रयोग से पता चलता है. 293 कोशिकाओं से Lysate एक Connexin36 प्लाज्मिड के साथ transfected मनका वितरण में एक $1.5-लॉग दाएँ की ओर बदलाव का उत्पादन किया, जबकि untransfected कोशिकाओं IgG नियंत्रण के साथ ओवरलैप. जब एक जोड़ी की विशिष्टता की पुष्टि, लक्ष्य प्रोटीन के बिना एक नॉकआउट जानवर या सेल लाइन से नकारात्मक नियंत्रण lysate एक MFI आईजीजी नियंत्रण के समान होना चाहिए.

बीड युग्मन
एक ठेठ चुंबकीय मनका युग्मन गुणवत्ता नियंत्रण प्रतिक्रिया एक MFI 3-4 पृष्ठभूमि के ऊपर लॉग दे जब एक माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ एक fluorophore के बीच एक चमक सूचकांक के साथ एक fluorophore के लिए दाग दे देंगे 3 और 5 (जैसे पीई या FITC के रूप में). चित्र 4 में प्रतिस्थापित किए जा रहे पुराने बैच की तुलना में एक नए चुंबकीय मनका के संयोजन की तुलना में एक विशिष्ट गुणवत्ता नियंत्रण अभिक्रिया दिखाई गई है।

डेटा विश्लेषण
प्रत्येक प्रयोग में, ANC एक उपयोगकर्ता परिभाषित नियंत्रण और प्रयोगात्मक स्थिति के बीच प्रत्येक अच्छी तरह से (यानी सभी संभव IP$Probe संयोजन) में प्रत्येक चुंबकीय मनका वर्ग के फ्लोरोसेंट वितरण की तुलना करता है। यह प्रत्येक संयोजन है कि संभावना है कि मोती Kolomogrov-Shmirnov (के एस) के आंकड़ों के आधार पर समान आबादी से नमूना किया गया है को दर्शाता है के लिए एक पीमूल्य प्रदान करता है. कार्यक्रम तो K-S p-मान की गणना करता है एक से अधिक तुलना और तकनीकी परिवर्तनशीलता (तकनीकी प्रतिकृति के बीच अंतर) के लिए लेखांकन के लिए सही द्वारा 0.05 की एक झूठी सकारात्मक दर का उत्पादन करने के लिए आवश्यक. IP-probe संयोजन (PiSCES) जिसका K-S परीक्षण p-मान सभी चार प्रयोगों में परिकलित कट-ऑफ से नीचे आता है, या कम से कम 3/4 प्रयोगों (3/4 डिग्री 4/4) की पहचान की जाती है। च-मूल्यकट-ऑफ़ के कारण इन विभिन्न स्तरों के आधार पर, कभी-कभी PiSCES की पहचान 4/4 में की जाएगी, लेकिन 3/4/4 नहीं, इसलिए अलग-अलग सूचियों की गणना की जाती है। विस्तृत ANC समीकरणों के लिए, देखें (Smith एट अल. 2016). 14 WCNA विश्लेषण और परिणामों के बारे में विवरण Langfelder एट अल द्वारा अच्छी तरह से चर्चा कर रहे हैं23

डेटा प्रस्तुति
ANC और CNA23 विश्लेषण PiSCES की पहचान करने के लिए किया जाता है कि दोनों (1) रन के कम से कम 3/4 में प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच महत्वपूर्ण गुना परिवर्तन दिखाने के लिए और (2) प्रयोगात्मक चर के साथ सहसंबद्ध है कि एक CNA मॉड्यूल से संबंधित हैं. इन उच्च विश्वास PiSCES कि दो स्वतंत्र सांख्यिकीय दृष्टिकोण द्वारा पहचाने जाते हैं ANC ] CNA PiSCES के रूप में संदर्भित कर रहे हैं. इन इंटरैक्शन को ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर Cytoscape का उपयोग करके नोड-एज आरेख के रूप में विज़ुअलाइज़ किया जा सकता है (चित्र 5क) या अनुपूरक सामग्री में शामिल R कोड और विश्लेषण निर्देशों का उपयोग करके हीटमैप के रूप में (चित्र 5b ).

Figure 1
चित्र 1 . मात्रात्मक बहुसंकेत ों इम्यूनोप्रीशंस का अवलोकन। (ं) पहले जांचे गए एंटीबॉडी को अलग-अलग अभिक्रियाओं में चुंबकीय मोतियों के विभिन्न वर्गों के साथ सहसंयोजकता से जोड़ा जाता है। (ख) रात भर, प्रोटीन परिसरों एंटीबॉडी युग्मित चुंबकीय मोती के मिश्रण का उपयोग कर प्रतिरक्षा कर रहे हैं. (ग) सह-प्रतिरक्षा प्रोटीन एक जांच एंटीबॉडी और एक फ्लोरोफोर द्वारा लेबल हैं। (घ) चुंबकीय मनकों और लेबल किए गए प्रोटीन परिसरों को साझा परिसरों में होने वाले प्रोटीनों की सापेक्ष मात्रा को निर्धारित करने के लिए रेफ्रिजरेटेड फ्लो साइटोमीटर के माध्यम से चलाया जाता है। कस्टम प्रशीतन के योजनाबद्ध विवरण के लिए चित्र S1 देखें. (ई) प्रवाह साइटोमीटर प्रबंधक सॉफ्टवेयर वर्ग द्वारा MagBeads अलग करता है और (च) प्रत्येक मनका क्षेत्र से फ्लोरोसेंट हिस्टोग्राम प्रदर्शित करता है। (छ) डेटा को .xml फ़ाइलों के रूप में निर्यात किया जाता है और दो स्वतंत्र सांख्यिकीय दृष्टिकोणों द्वारा विश्लेषण किया जाता है। केवल दोनों विश्लेषणों द्वारा पहचाने गए PiSCES heatmap और नोड-एज आरेख दृश्यावलोकन का उपयोग कर रिपोर्ट कर रहे हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . कोनेक्सिन 36 एंटीबॉडी आईपी-एफसीएम का उपयोग कर स्क्रीनिंग। (क) आईपी-एफसीएम कोनेक्सिन 36 (Cx36) सीएमएल मोती और जांच के 4x4 पैनल का उपयोग करके माउस मस्तिष्क lysate पर किया गया था। Lysate थाली की एक अलग पंक्ति में प्रत्येक CML मनका के साथ immunoprecipated था. washes के बाद, प्रत्येक मनका अपनी पंक्ति भर में वितरित किया गया था ताकि एक जांच एंटीबॉडी प्रति स्तंभ जोड़ा जा सकता है. (ख) अधिकांश एंटीबॉडी संयोजन आईजीजी पृष्ठभूमि (ग्रे, नीले) पर कोई संकेत (नारंगी) नहीं दिखाते हैं। 6200Poli जांच के साथ 1E5 आईपी स्वीकार्य सकारात्मक संकेत से पता चलता है. 1E5 मनका/प्रोब और 6200पॉली मनका/प्रोब जोड़े प्रत्येक स्वीकार्य संकेत दिखाते हैं, लेकिन मनका और जांच दोनों के लिए एक ही एंटीबॉडी का उपयोग करना आदर्श नहीं है। विभेदक एपिटोप मान्यता कुछ एपिटोप कुछ प्रोटीन परिसरों में occluded किया जा सकता है क्योंकि बातचीत को देखने की संभावना को अधिकतम. 1E5 जांच के साथ 6200Poli मनका सबसे मजबूत संकेत देता है और विशिष्टता पुष्टि लंबित मल्टीप्लेक्स परख में उपयोग करने के लिए चुना गया था। (ग) स्क्रीनिंग से चयनित Cx36 एंटीबॉडी की जोड़ी का उपयोग करते हुए आईपी-एफसीएम का प्रदर्शन 293T कोशिकाओं के lysate पर किया गया था जो Cx36 और गैर-ट्रांसफेेक्टेड नियंत्रण ों के साथ ट्रांसफेक्टेड किया गया था। Cx36-transfected कोशिकाओं से स्पष्ट संकेत है, लेकिन गैर-transfected कोशिकाओं आईजी जी मनका / कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . उदाहरण प्लेट लेआउट. एक 4-शर्त मल्टीप्लेक्स एक 96-वेल प्लेट में स्थापित किया गया है। नमूने 1-4 लगातार पंक्तियों में लोड कर रहे हैं (प्रत्येक जैविक नमूना यहाँ एक अलग रंग से प्रतिनिधित्व), और तकनीकी प्रतिकृतियां निम्न4 पंक्तियों में एक ही क्रम में लोड कर रहे हैं. एक जांच प्रति स्तंभ उपयोग किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . एक ठेठ गुणवत्ता नियंत्रण प्रतिक्रिया पुराने बैच की तुलना में एक नया MagBead के संयोजन की तुलना में बदला जा रहा है. मनका पृष्ठभूमि के ऊपर एक MFI 2-4 लॉग देता है, और नए बैच पुराने बैच के समान एक MFI है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5 . QMI synaptic PiSCES की पहचान करता है कि सुसंस्कृत cortical न्यूरॉन्स में NMDA उत्तेजना के 5 मिनट के बाद परिमाण में परिवर्तन. एक QMI प्रयोग NMDA प्रेरित बनाम unstimulated (ACSF नियंत्रण) न्यूरॉन्स की तुलना में. PiSCES कि दोनों ANC और CNA विश्लेषण द्वारा पहचान े लिए गए प्रस्तुत कर रहे हैं. (ं) ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर Cytoscape का उपयोग करके उत्पादित नोड-एज आरेख में नोड्स उन एंटीबॉडी लक्ष्यों (प्रोटीन) को इंगित करते हैं जिन्हें QMI पैनल में आईपी और जांच के रूप में शामिल किया गया था। किनारों की दिशा और NMDA उपचार और नियंत्रण के बीच गुना परिवर्तन के परिमाण का संकेत बढ़त के रंग और मोटाई के साथ, ANC ] CNA PiSCES का प्रतिनिधित्व करते हैं। PISCES कि NMDA और नियंत्रण की स्थिति के बीच नहीं बदला आंकड़ा में शामिल नहीं हैं. (ख) तापमाप-2 फलन का उपयोग करके R में उत्पादित तापमानचित्र उसी एएनसी ] CNA पिसेस का प्रतिनिधित्व करता है। ComBAT-सामान्यीकृत, लॉग2 MFI मान पंक्ति द्वारा सामान्यीकृत हैं डेटा के लिए खाते के लिए जो $ 3 लॉग तक फैला है, और प्रत्येक प्रयोगात्मक प्रतिकृति के लिए संबंधित MFI प्रत्येक रिपोर्ट किए गए PiSCES के सापेक्ष परिमाण और स्थिरता प्रदर्शित करने के लिए दिखा है। इन आंकड़ों को पुन : उत्पन्न करने के लिए आवश्यक डेटा और कोड अनुपूरक फाइलमें शामिल किए जाते हैं . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplementary Figure 1
चित्र S1: प्रवाह साइटोमेट्री प्रणाली के कस्टम प्रशीतन के आरेख। प्रवाह cytometer सरणी पाठक कमरे के तापमान पर रखा जाना चाहिए, लेकिन निचले हिस्से (माइक्रोप्लेट मंच) विश्लेषण के दौरान PISCES बनाए रखने के लिए फ्रिज में रखा जाना चाहिए. प्रवाह cytometer और सैंडविच प्रस्तुत रेफ्रिजरेटर के बारे में मॉडल जानकारी के लिए सामग्री की तालिका देखें इस्तेमाल किया. (क) ऊपरी संलग्नक और खाद्य भंडारण डिब्बे सैंडविच प्री रेफ्रिजरेटर से हटा दिए गए थे। माइक्रोप्लेट मंच धातु का समर्थन प्लास्टिक खाद्य भंडारण डिब्बे पकड़ करने के लिए मतलब पर रखा गया था। इसे फिट बनाने के लिए माइक्रोप्लेट प्लेटफार्म के प्लास्टिक आवास को हटा दिया गया था। एक कस्टम plexiglass मंच में दिखाया माप के साथ बनाया गया था (ख) रेफ्रिजरेटर के ऊपरी खोलने को कवर करने के लिए. plexiglass के साथ अछूता था 1 "2" फोम इन्सुलेशन में कटौती plexiglass के आकार से मेल करने के लिए, और इन्सुलेट टेप के साथ अंतर सील. एक छेद तो plexiglass के माध्यम से drilled प्रवाह cytometer परख पाठक से नमूना सुई जब बढ़ाया microplate मंच का उपयोग करने की अनुमति दी गई थी. एक काला युग्मन डिवाइस है कि मूल रूप से microplate मंच के शीर्ष में खराब कर दिया गया था हटा दिया गया था, और plexiglass, जो संरेखण में सहायता के ऊपर से microplate मंच में वापस खराब कर दिया. Plexiglass कवर में एक दरवाजा microplate वाहक के लिए उपयोगकर्ता का उपयोग जब यह इकाई से बाहर बढ़ा दिया है की अनुमति देता है. ध्यान दें कि प्रवाह cytometer सॉफ्टवेयर प्लेट वाहक बहुत ठंडा है कि उपयोगकर्ता को सचेत करेंगे, लेकिन उपयोगकर्ता चेतावनी ओवरराइड और ठंडा QMI प्रयोगों चला सकते हैं. (ग) एकत्रित प्रणाली का फोटो। (घ) सामने दायें कोने का विस्तार, जैसा कि (क ) plexiglass कवर और इन्सुलेशन की असेंबली दिखा रहा है। (ई) छिद्रों के ऊपर संरेखित नमूना सुई का विवरण। (च) इन्सुलेशन के मुंडा-डाउन अनुभाग का विस्तार जो इकाई के तहत एयरफ्लो की अनुमति देता है। (छ) खुले दरवाजे का विस्तार से नीचे प्रवाह साइटोमीटर माइक्रोप्लेट मंच दिखा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

QMI परख एंटीबॉडी पैनल विकास, उपकरण और अभिकर्मकों में पर्याप्त निवेश की आवश्यकता है, लेकिन एक बार परख की स्थापना की है, एक उच्च आयामी डेटा प्रोटीन बातचीत नेटवर्क देख एकत्र कर सकते हैं के रूप में वे प्रयोगात्मक नियंत्रित करने के लिए प्रतिक्रिया उत्तेजनाओं. तकनीकी तौर पर, QMI सावधान pipeting और नमूना और एंटीबॉडी अच्छी तरह से स्थानों की ट्रैकिंग की आवश्यकता है. सावधानी से परख प्लेटों लेबलिंग उपयोगी है, के रूप में कागज पर अच्छी तरह से स्थानों की एक विस्तृत टेम्पलेट बना रही है, जो तब डेटा विश्लेषण के लिए सहेजा जाता है. हर समय मोती और lysate ठंड रखने के महत्व, प्रवाह cytometer microplate वाहक में शामिल (कस्टम प्रशीतन निर्देशों के लिए चित्र S1 देखें) अतिरंजित नहीं किया जा सकता है. प्रोटीन बातचीत तेजी से कमरे के तापमान पर अलग हो जाएगा, और एक unmodified का उपयोग करने पर प्रारंभिक प्रयास, कमरे के तापमान प्रवाह cytometer कई तापमान-लैबल बातचीत की पहचान के साथ समाप्त हो गया, लेकिन उन है कि इरादा के साथ बदल नहीं उत्तेजना.

QMI एक एंटीबॉडी आधारित परख है, इसलिए एंटीबॉडी का प्रारंभिक चयन महत्वपूर्ण है। मोनोक्लोनल या रिकॉमबिनेंट एंटीबॉडी जब भी संभव हो परिणामों में परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. Polyclonals बहुत से बहुत कुछ भिन्नता दिखाने के लिए, लेकिन पेप्टाइड आधारित polyclonals एक छोटी epitope करने के लिए समय के साथ अपेक्षाकृत स्थिर होने लगते हैं. एंटीबॉडी के बड़े बैचों को खरीदने से बहाव को कम किया जा सकता है; यह वाहक मुक्त एंटीबॉडी के कस्टम-ऑर्डर के लिए भी अनुमति देता है जो तरबूज जेल और स्पिन कॉलम, और संबंधित एंटीबॉडी हानि का उपयोग करके एंटीबॉडी को शुद्ध करने की आवश्यकता को रोकता है।

यह भी ध्यान दें कि महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक संकेत का पता लगाने उपलब्ध epitopes पर निर्भर है, एक संकेत की कमी जरूरी एक बातचीत की कमी का संकेत नहीं है, एक सीमा है कि अन्य प्रोटीन बातचीत के तरीकों के साथ आम है. 14 इसके अलावा, जब एक संकेत का पता चला है, यह स्पष्ट रूप से राज्य मौसम के लिए असंभव है प्रोटीन बातचीत प्रत्यक्ष है (एक बी के साथ सूचना का आदान प्रदान) या अप्रत्यक्ष (एक एक्स और वाई के साथ बातचीत, जो तब बी के साथ बातचीत), यही वजह है कि मनाया बातचीत कर रहे हैं प्रोटीन प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) के बजाय PiSCES के रूप में संदर्भित, जो प्रत्यक्ष बाध्यकारी संकेत हो सकता है. सभी एंटीबॉडी-आधारित तरीकों की एक सीमा जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए, यह है कि एंटीबॉडी के अलावा प्रोटीन परिसरों को बाधित या स्थिर कर सकता है। पश्चिमी धब्बा के बजाय प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने की एक अन्य सीमा यह है कि एंटीबॉडी विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए आकार की जानकारी उपलब्ध नहीं है। इस सीमा को दूर करने के लिए, आईजीजी नियंत्रण प्रत्येक एंटीबॉडी जोड़ी स्क्रीनिंग में उपयोग किया जाता है, और विशिष्टता दस्तक के साथ पुष्टि की है या दस्तक में सेल लाइनों या जानवरों QMI प्रयोगों के साथ आगे बढ़ने से पहले (अनुभाग 1.4).

आईजीजी नियंत्रण QMI परख में इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं क्योंकि प्रत्येक आईजीजी पृष्ठभूमि संकेत का एक अलग स्तर पैदा करता है, यह असंभव घटाना करने के लिए सही पृष्ठभूमि मूल्य पता करने के लिए कर रही है. उदाहरण के लिए, यदि आईपी (X)]probe IgG 100 और IP IgG-probe Y की एक MFI देता है 200 की एक MFI देता है, जो पृष्ठभूमि मान आईपी X-probe Y से घटाया जाना चाहिए? इसी तरह, कभी कभी पता नहीं चल रहा बातचीत (उदा., आईपी एक्स जांच ]) nonspecific आईजीजी बातचीत की तुलना में एक कम MFI होगा. निरपेक्ष MFI संकेत नहीं जानने की इस सीमा के लिए खाते में, PiSCES केवल एक मनमाना पृष्ठभूमि स्तर से ऊपर का पता लगाया जा रहा है के लिए रिपोर्ट नहीं कर रहे हैं. इसके बजाय, केवल PiSCES कि एक दिया उत्तेजना के जवाब में परिवर्तन की सूचना दी है. जबकि उच्च MFI nonspecific शोर के कारण हो सकता है, इस शोर उत्तेजना के साथ बदलने की उम्मीद नहीं की जाएगी. इसके अलावा, एक हिस्सा (10-20%) हालत पर निर्भर बातचीत मनाया की आम तौर पर एक दूसरी विधि द्वारा पुष्टि कर रहे हैं, आम तौर पर आईपी पश्चिमी. इस पुष्टि RT-PCR के साथ उच्च थ्रूपुट आरएनए अनुक्रमण परिणामों की पुष्टि करने के लिए अनुरूप है और विश्वास QMI परिणाम ों को बढ़ाने के लिए होती है।

QMI परिणामों को प्रभावित करने वाले अभिव्यक्ति प्रभाव को अतिरिक्त परीक्षणों के बिना खारिज नहीं किया जा सकता है, क्योंकि QMI प्रोटीन के बढ़े हुए निरपेक्ष स्तर और प्रोटीन के बढ़ते होमो-मल्टीमराइजेशन के बीच अंतर नहीं करता है। अभिव्यक्ति के बारे में अनिश्चितता को कम करने के लिए, प्रयोगों कम timescales कि प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में संभावित परिवर्तन को कम करने के साथ तीव्र उपचार की स्थिति का उपयोग किया जा सकता है. अन्य तरीकों पुरानी उपचार की स्थिति या प्राथमिक रोगी के नमूने में अभिव्यक्ति प्रभाव से बाहर शासन करने के लिए आवश्यक हैं।

यह QMI के लिए एक उपयुक्त lysis बफर का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. डिटर्जेंट के बहुत कमजोर झिल्ली बरकरार छोड़ सकते हैं और एक साथ प्रोटीन है कि जटिल में नहीं हैं पकड़, जबकि भी मजबूत एक डिटर्जेंट प्रोटीन परिसरों को नष्ट कर सकते हैं. कैल्शियम या उसके chelators की उपस्थिति के रूप में अतिरिक्त कारकों नाटकीय रूप से PiSCES को प्रभावित कर सकते हैं और ध्यान से एक QMI पैनल में शामिल करने के लिए एंटीबॉडी स्क्रीनिंग से पहले विचार किया जाना चाहिए. आईपी पश्चिमी प्रयोगों के लिए, lysis शर्तों आमतौर पर एक मामला-दर-मामला आधार पर प्रत्येक PiSCES के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, लेकिन एक भी PiSCES का पता लगाने के लिए सबसे अच्छी स्थिति एक ही प्रोटीन नेटवर्क में अन्य PiSCES करने के लिए अनुवाद नहीं हो सकता है22. डिटर्जेंट चयन एक चिकन और अंडे दुविधा प्रस्तुत करता है, कि एक lysis बफर एंटीबॉडी उम्मीदवारों स्क्रीन करने के लिए आवश्यक है, लेकिन एंटीबॉडी के एक पैनल के लिए एक उपयुक्त lysis बफर के लिए स्क्रीन की जरूरत है. जबकि एक सही समाधान नहीं है, एक मोती और जांच के एक छोटे से पैनल का चयन कर सकते हैं कि विशेष हित के हैं और / शुरू में एंटीबॉडी स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया (कदम 1.1.3). एक आदर्श डिटर्जेंट दोनों PiSCES के विश्वसनीय पता लगाने और किसी दिए गए उत्तेजना के साथ ज्ञात शारीरिक प्रोटीन व्यवहार (सहयोग/वियोजन) के recapitulation के लिए अनुमति देनी चाहिए. यदि कोई चिंता है कि डिटर्जेंट झिल्ली को पूरी तरह से solubilize नहीं करता है, एक नकारात्मक नियंत्रण एंटीबॉडी जोड़ा जा सकता है कि केवल संकेत दे अगर दो प्रोटीन झिल्ली24से जुड़े थे . जब उपयुक्त lysis बफ़र्स का चयन कर रहे हैं, यहां तक कि कमजोर बातचीत में परिवर्तन - जैसे एक kinase और सब्सट्रेट के बीच उन - मज़बूती से पता लगाया जा सकता है (जैसे TCR-LCK)14.

न्यूरॉन्स और टी कोशिकाओं में QMI का उपयोग कर पिछले काम दोनों ध्यान से पिछले निष्कर्षों की पुष्टि की है ताकि QMI परिणामों की वैधता में विश्वास बढ़ाने के लिए, और नए hypotheses कि संकेत transduction और रोग रास्ते के बारे में खोजों के लिए नेतृत्व उत्पन्न. भविष्य में, QMI अन्य प्रोटीन बातचीत नेटवर्क के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और वर्तमान microsphere उपलब्ध वर्गों के साथ 500 प्रोटीन तक का विस्तार किया. QMI का उपयोग करने के लिए अध्ययन कैसे बहु प्रोटीन परिसरों के नेटवर्क उत्तेजनाओं के जवाब में परिवर्तन के रूप में वे सेलुलर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए दोनों स्वास्थ्य और रोग में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि उपज की क्षमता है.

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Disclosures

लेखकों के हित का कोई संघर्ष नहीं है खुलासा करने के लिए.

Acknowledgments

लेखकQMI परख विकास के लिए महत्वपूर्ण योगदान के लिए Tessa डेविस स्वीकार करना चाहते हैं, और वर्तमान और तकनीकी मार्गदर्शन और बौद्धिक इनपुट के लिए स्मिथ और Schrum प्रयोगशालाओं के पूर्व सदस्यों. इस काम NIMH अनुदान R01 MH113545 और R00 MH 102244 द्वारा वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well flat bottomed plates Bio Rad 171025001
96-well PCR plates VWR 82006-704
Bioplex 200 System with HTF Bio Rad 171000205 modiefied to keep partially refrigerated, see Figure S1 for details
Bio-Plex Pro Wash Station Bio Rad 30034376
BSA Sigma
CML beads Invitrogen C37481
EDTA Sigma E6758
EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin Thermo Scientific A39256
MagPlex Microspheres Luminex MC12xxx-01 xxx is the 3 digit bead region
Melon Gel IgG Spin Purification Kit Thermo Scientific 45206 used for antibody purification
MES Sigma M3671
Microplate film, non-sterile USA Scientific 2920-0000
Phosphotase inhibitor cocktail #2 Sigma P5726
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340
Sandwich Prep Refrigerator Norlake SMP 36 15 for custom refrigeration of Bioplex 200
Sodium fluoride Sigma 201154
Sodium orthovanadate Sigma 450243
Streptavidin-PE BioLegend 405204
Sulfo NHS Thermo Scientific A39269
Tris Fisher Scientific BP152

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References

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जैव रसायन अंक 150 आईपी-एफसीएम प्रोटीओमिक्स प्रोटीन बातचीत संकेतन इम्यूनोप्रीसेप्शन क्यूएमआई
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Brown, E. A., Neier, S. C., Neuhauser, C., Schrum, A. G., Smith, S. E. P. Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation. J. Vis. Exp. (150), e60029, doi:10.3791/60029 (2019).

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