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Developmental Biology

त्रि-आयामी एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली को-कल्चर स्फरॉइड्स का उपयोग करते हुए एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने वाले सेल और मेसेन्काइमल स्टेम सेल

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60032
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 2, 2, 2, 1
1College of Pharmacy, Duksung Innovative Drug Center, Duksung Women's University, 2Korea Drug Development Platform using Radio-isotope, Korea Institute of Radiological & Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

त्रि-आयामी सह-संस्कृति गोलाभ एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली को शारीरिक एंजियोजेनेसिस की नकल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। सह संस्कृति गोलभॉइड दो मानव संवहनी सेल अग्रदूतों, ईसीएफसी और एमएससी द्वारा गठित कर रहे हैं, और कोलेजन जेल में एम्बेडेड. नई प्रणाली एंजियोजेनिक न्यूनाधिक मूल्यांकन के लिए प्रभावी है, और विवो अध्ययन में अधिक प्रासंगिक जानकारी प्रदान करता है.

Abstract

एंजियोजेनेसिस के क्षेत्र में अध्ययन आक्रामक रूप से मान्यता के साथ पिछले कुछ दशकों में बढ़ रहा है कि एंजियोजेनेसिस 50 से अधिक विभिन्न रोग स्थितियों की एक पहचान है, जैसे रूमेटोइड गठिया, ऑकुलोपैथी, हृदय रोग , और ट्यूमर मेटास्टेसिस। एंजियोजेनेसिस दवा के विकास के दौरान, यह शारीरिक angiogenesis प्रक्रिया को प्रतिबिंबित करने के लिए उपयुक्त सेल प्रकार और उचित स्थितियों के साथ इन विट्रो परख प्रणालियों में उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। मुख्य रूप से endothelial कोशिकाओं का उपयोग कर विट्रो एंजियोजेनेसिस परख प्रणालियों में वर्तमान की सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एक 3 आयामी (3 डी) सह संस्कृति गोलाभ परख प्रणाली विकसित की है। सह-संस्कृति गोलभॉइड दो मानव संवहनी सेल अग्रदूतों, endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs) और mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) 5 से 1 के अनुपात के साथ द्वारा उत्पादित किया गया. ईसीएफसी + एमएससी स्फीरोइड टाइप में एम्बेडेड थे मैं कोलेजन मैट्रिक्स में विवो extracellular वातावरण की नकल करने के लिए। एक वास्तविक समय सेल रिकॉर्डर लगातार 24 एच के लिए अधोभ से एंजियोजेनिक अंकुरित की प्रगति का निरीक्षण करने के लिए उपयोग किया गया था लाइव सेल फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीक भी अंकुरित गठन के दौरान प्रत्येक सेल प्रकार के स्थानीयकरण पथ के लिए लागू किया गया था। स्प्राउट्स की संख्या की गणना करके और व्यक्तिगत स्फीरों से उत्पन्न स्प्राउट्स की संचयी लंबाई को मापने के द्वारा एंजियोजेनिक क्षमता का परिमाण निर्धारित किया गया था। पांच बेतरतीब ढंग से चयनित गोलभड़ियों प्रयोगात्मक समूह प्रति विश्लेषण किया गया. तुलना प्रयोगों से पता चला है कि ईसीएफसी + एमएससी स्रूपॉइड्स ने ईसीएफसी-केवल गोलभॉइड की तुलना में अधिक अंकुरित संख्या और संचयी अंकुरित लंबाई दिखाई। Bevacizumab, एक एफडीए को मंजूरी दे दी एंजियोजेनेसिस अवरोध करनेवाला, नव विकसित सह संस्कृति गोलाभ परख प्रणाली के साथ परीक्षण किया गया था विरोधी angiogenic दवाओं स्क्रीन करने के लिए अपनी क्षमता को सत्यापित करने के लिए. ईसीएफसी + एमएससी के लिए आईसी50 मूल्य केवल ईएफसी एस बी एस की तुलना में स्फीरोइड, जेनोग्रैफ्ट ट्यूमर माउस मॉडल से प्राप्त बेवासिजुमाब की प्रभावी प्लाज्मा एकाग्रता के करीब था। वर्तमान अध्ययन से पता चलता है कि 3 डी ईसीएफसी + एमएससी स्फीरोइड एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली शारीरिक एंजियोजेनेसिस के लिए प्रासंगिक है, और पशु प्रयोगों के अग्रिम में एक प्रभावी प्लाज्मा एकाग्रता की भविष्यवाणी कर सकते हैं।

Introduction

दुनिया भर में लगभग 500 मिलियन लोगों को संवहनी विकृति-संवारे गठिया, ऑकुलोपैथी, हृदय रोगों, और ट्यूमर मेटास्टेसिस1जैसे संवहनी विकृति-संवदेषित रोगों के लिए एंजियोजेनेसिस-मॉडुलन थेरेपी से लाभ होने की उम्मीद है। इस प्रकार, दवाओं है कि angiogenesis नियंत्रण का विकास दवा उद्योग में एक महत्वपूर्ण अनुसंधान क्षेत्र बन गया है. दवा विकास प्रक्रिया के दौरान, विवो पशु अध्ययन में शारीरिक कार्यों और अंगों के बीच प्रणालीगत बातचीत पर दवा उम्मीदवारों के प्रभाव का पता लगाने के लिए आवश्यक है। हालांकि, नैतिक और लागत मुद्दों पशु प्रयोगों2के बारे में चिंताओं में वृद्धि हुई है. इसलिए, इन विट्रो परख प्रणालियों में सुधार के लिए पशु प्रयोगों से पहले बेहतर निर्णय लेने के लिए अग्रणी अधिक सटीक और उम्मीद के मुताबिक डेटा प्राप्त करने की जरूरत है. इन विट्रो एंजियोजेनेसिस परख में आम तौर पर प्रसार को मापने, आक्रमण, प्रवास, या endothelial कोशिकाओं के ट्यूबलर संरचना गठन (ईसी) दो आयामी (2 डी) संस्कृति प्लेटों3में बीज. ये 2 डी एंजियोजेनेसिस परख त्वरित, सरल, मात्रात्मक, और लागत प्रभावी हैं, और एंजियोजेनेसिस-मॉडुलन दवाओं की खोज में महत्वपूर्ण योगदान दिया है। हालांकि, कई मुद्दों में सुधार किया जा करने के लिए रहते हैं।

इस तरह के 2 डी इन विट्रो परख प्रणालियों में एंजियोजेनेसिस की जटिल बहु-चरण घटनाओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकता जो विवो शारीरिक स्थितियों में होता है, जिससे गलत परिणाम होते हैं जो इन विट्रो परख डेटा और नैदानिक परीक्षण परिणामों के बीच विसंगतियों का कारण बनते हैं4। 2 डी संस्कृति की स्थिति भी सेलुलर phenotypes के परिवर्तन प्रेरित. उदाहरण के लिए, 2D संस्कृति प्लेटों में प्रसार के बाद, ECs एक कमजोर सेलुलर phenotype CD34 की कम अभिव्यक्ति और कई संकेत है कि सेलुलर प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित द्वारा प्रकट के रूप मेंहै 5,6. 2 डी संस्कृति आधारित एंजियोजेनेसिस परख प्रणालियों की सीमाओं को दूर करने के लिए, तीन आयामी (3 डी) गोलाभ एंजियोजेनेसिस सिस्टम विकसित किया गया है। ईसीएस द्वारा बनाए गए गोलोभों से ट्यूबलर संरचना के गठन के बाद अंकुरित होना विवो नव-संवहनी प्रक्रियाओं7,8 में प्रतिबिंबित होताहै। इस प्रकार, 3 डी स्फरॉइड एंजियोजेनेसिस परख संभावित समर्थक या विरोधी एंजियोजेनेसिस दवाओं की जांच के लिए एक प्रभावी परख प्रणाली माना गया है।

अधिकांश 3 डी गोलाभ एंजियोजेनेसिस परख केवल ईसी का उपयोग, मुख्य रूप से मानव नाभि शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECS) या मानव dermal microvascular endothelial कोशिकाओं (HDMECs) एंजियोजेनेसिस के दौरान ईसी की सेलुलर प्रतिक्रिया पर ध्यान केंद्रित करने के लिए. हालांकि, रक्त केशिकाओं दो प्रकार के सेल से बना रहे हैं: ईसी और pericytes. ईसी और pericytes के बीच द्वि-दिशात्मक बातचीत विस्तार उचित संवहनी अखंडता और समारोह के लिए महत्वपूर्ण है. वंशानुगत स्ट्रोक, मधुमेह रेटिनोपैथी, और शिरापरक विकृति जैसे कई रोग, बदल पेरिसाइट घनत्व के साथ जुड़े हुए हैं या एंडोथेलियम9के प्रति पेरिसाइट लगाव में कमी आई है। पेरिसाइट्स को एंजियोजेनिक प्रक्रिया के एक प्रमुख तत्व के रूप में भी जाना जाता है। ईसी द्वारा नवगठित पोत संरचनाओं को स्थिर करने के लिए पेरिसाइट्स की भर्ती की जाती है। इस संबंध में, एक-संस्कृति स्फिरॉइड एंजियोजेनेसिस परख में परिक्षा7,10को शामिल नहीं किया गया है। इसलिए, ईसी और pericytes द्वारा गठित सह संस्कृति गोलाभ अधिक बारीकी से शारीरिक angiogenic घटनाओं की नकल करने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान कर सकते हैं.

वर्तमान अध्ययन मानव endothelial कॉलोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs) और mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (एमएससी) के संयोजन के साथ एक 3 डी सह संस्कृति गोलाभ एंजियोजेनेसिस परख विकसित करने के उद्देश्य से और अधिक बारीकी से विवो एंजियोजेनेसिस में प्रतिबिंबित करने के लिए। एक सामान्य रक्त वाहिका के एक इन विट्रो प्रतिनिधित्व विधानसभा के रूप में सह संस्कृति गोलभॉइड प्रणाली पहली बार 200111में Korff एट अल द्वारा स्थापित किया गया था। वे HUVECs और मानव नाभि धमनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (HUSMCs) संयुक्त, और प्रदर्शन किया है कि दो परिपक्व संवहनी कोशिकाओं के सह संस्कृति अंकुरित क्षमता में कमी आई. परिपक्व ईसी (एचयूवीसी) उत्तरोत्तर बढ़ने और अंतर करने की अपनी क्षमता खोने के लिए जाना जाता है, जो उनके एंजियोजेनेसिस प्रतिक्रियाओं12,13को नकारात्मक रूप से प्रभावित करता है। परिपक्व परिसंवहनी कोशिकाओं (HUSMCs) संवहनी endothelial विकास कारक (VEGF) प्रतिक्रिया11के निराकरण के माध्यम से endothelial सेल निष्क्रियता पैदा कर सकता है. Korff और हमारे सह संस्कृति गोलभॉइड प्रणाली के बीच मुख्य अंतर सेल प्रकार का इस्तेमाल किया है. हम दो संवहनी अग्रदूतों, ईसीएफसी और एमएससी लागू, स्क्रीन और समर्थक या विरोधी एंजियोजेनिक एजेंटों की जांच करने के लिए एक उचित एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली स्थापित करने के लिए। ईसीएफसी ईसीएस के अग्रदूत हैं। ईसीएफसी में परिपक्व ईसी14की तुलना में मजबूत प्रसार क्षमता है, जो ईसी की सीमा को पार करने में सक्षम है। ईसीएफसी कई प्रसवोत्तर रोग विज्ञान की स्थिति15,16,17में नए पोत निर्माण में योगदान देते हैं . एमएससी pluripotent स्टेम सेल है कि pericytes में अंतर करने की क्षमता है, जिससे एंजियोजेनेसिस18,19में योगदान कर रहे हैं.

पिछली रिपोर्टों में, ईसीएफसी और एमएससी ने विट्रो ट्यूब गठन20में , विवो नव-वास्कुलराइजेशन21,22, और इस्कीमिक ऊतकों के बेहतर रिपरफ्यूजन23,24में सहक्रियाशील प्रभाव दिखाया था . वर्तमान अध्ययन में, ईसीएफसी और एमएससी सह-संस्कृति स्फीरोइड बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था और एक विवो 3 डी वातावरण को प्रतिबिंबित करने के लिए प्रकार मैं कोलेजन जेल में एम्बेडेड। कोलेजन को ईसीएस25के आस-पास के बाह्यकोशिक मैट्रिक्स (ईसीएम) के प्रमुख घटक के रूप में माना जाता है। ईसीएम सेल व्यवहार26को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है . यहाँ प्रस्तावित परख प्रोटोकॉल आसानी से और जल्दी से आम प्रयोगशाला तकनीकों का उपयोग कर दो दिनों के भीतर किया जा सकता है. अंकुरित प्रक्रिया के दौरान प्रभावी सेल ट्रैकिंग के लिए, प्रत्येक सेल प्रकार फ्लोरोसेंट लेबल किया जा सकता है और एक वास्तविक समय सेल रिकॉर्डर का उपयोग कर नजर रखी. नव स्थापित 3 डी सह संस्कृति गोलाभ एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली संभावित एंजियोजेनिक न्यूनाधिक मूल्यांकन के लिए संवेदनशीलता बढ़ाने के लिए और विवो अध्ययन में अग्रिम में उम्मीद के मुताबिक जानकारी प्रदान करने के लिए बनाया गया है।

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Protocol

मानव ईसीएफसी को मानव परिधीय रक्त से अलग किया गया जैसा कि पिछली रिपोर्ट27में वर्णित किया गया था . संक्षेप में, मोनोन्यूक्लियर सेल परत फिकॉल-पाक प्लस का उपयोग करपूरे रक्त से अलग किया गया था, और उचित माध्यम में सुसंस्कृत जब तक endothelial की तरह कालोनियों दिखाई दे रहे थे। कालोनियों एकत्र किए गए थे और ईसीएफसी सीडी 31 लेपित चुंबकीय मोती का उपयोग कर अलग थे। एमएससी मानव वयस्क अस्थि मज्जा के अनुयायी मोनोन्यूक्लियर सेल (एमएनसी) अंश से अलग थे। अध्ययन प्रोटोकॉल Duksung महिला विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था (IRB No. 2017-002-01).

1. सेल संस्कृति

  1. ईसीएफसी और एमएससी मध्यम और कोट प्लेटों की तैयारी
    1. एंडोथेलियल सेल विकास माध्यम MV2 तैयार करें (ECGM-MV2, hydrocortisone को छोड़कर) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% glutamine-penicillin-streptomycin (जीपीएस) के साथ पूरक.
    2. मेसेन्काइमल स्टेम सेल ग्रोथ मीडियम-2 (एमएससीजीएम-2) तैयार करें जिसमें 10% एफबीएस और 1% जीपीएस शामिल हैं।
    3. ECFC संस्कृति के लिए, 1% जिलेटिन समाधान के साथ सेल संस्कृति प्लेटों कोट. 1% जिलेटिन समाधान तैयार करने के लिए, पीबीएस के 500 एमएल में 1 ग्राम जेलेशन पाउडर को चुंबकीय उत्तेजक के साथ भंग करें, और ऑटोक्लेव के साथ बाँझ करें। प्लेट्स को 3 एमएल/60 मिमी, 5 एमएल/100 मिमी, या 15 एमएल/150 मिमी 1% जिलेटिन समाधान के साथ लेपित किया जा सकता है। एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट लेपित प्लेटें (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2)। उसके बाद, आकांक्षा द्वारा शेष 1% जिलेटिन समाधान निकालें और लेपित प्लेटों को पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
  2. बढ़ रहा है ईसीएफसी और एमएससी
    1. बीज 1 x 106 ECFCs पर 1% जिलेटिन लेपित 150 मिमी प्लेटें, और ECGM-MV2 (10% FBS, 1% जीपीएस) एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) का उपयोग कर बढ़ने 80-90% संगम. संगत परिणाम प्राप्त करने के लिए मार्ग संख्या 7-10 पर ECFCs का उपयोग करें।
    2. बीज 1 x 106 MSCs गैर लेपित 150 मिमी प्लेटों पर, और एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में एमएससीजीएम -2 का उपयोग कर हो जाना (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2) 80-90% संगम के लिए। संगत परिणाम प्राप्त करने के लिए मार्ग संख्या 7-10 पर एमएससी का उपयोग करें।

2. 1.2% w/v मेथिलसेलुलोस समाधान की तैयारी

  1. एक 500 एमएल कांच की बोतल में 6 ग्राम मिथाइल सेलूलोज़ को मापें और एक ऑटोक्लेव में बाँझ।
  2. हीट ईसीजीएम-MV2 (FBS और जीपीएस के बिना) 20 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर, और गर्म ECGM-MV2 के 250 एमएल जोड़ने के लिए बाँझ मिथाइल सेलूलोज़ पाउडर. बाँझ शर्तों को बनाए रखने के लिए, प्रवाह हुड के अंदर प्रक्रिया को पूरा करें।
  3. एक बाँझ चुंबकीय हलचल पट्टी जोड़ें और चुंबकीय उत्तेजक पर 20 मिनट के लिए समाधान मिश्रण जब तक मिथाइल सेलूलोज़ अच्छी तरह से गीला है और समान रूप से कोई गांठ के साथ बिखरे हुए. बाँझ हालत के तहत ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) ईसीजीएम-MV2 (FBS और जीपीएस के बिना) के 250 एमएल जोड़ें और चुंबकीय उत्तेजक पर एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए मिश्रण। फिर, एक रेफ्रिजरेटर (4 डिग्री सेल्सियस) में रात भर समाधान ठंडा.
    नोट: मिथाइलसेलुलोस एक कार्बोहाइड्रेट बहुलक है जो सूजन और बाद में जलयोजन के कारण ठंडे तापमान में अच्छी तरह से घुल जाता है।
  4. अगले दिन, एक 50 एमएल ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में समाधान 5,000 x g पर 3 एच के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर समाधान। स्पष्ट चिपचिपा supernatant समाधान ले लो और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर जब तक अप करने के लिए उपयोग 3-6 महीने.
    नोट: तलछट अवशिष्ट सेलूलोज़ फाइबर हो सकता है, तो धीरे से मात्रा के कम से कम 5 एमएल पीछे छोड़ने supernatant समाधान ले. इस खंड प्रयोगात्मक शर्तों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है.

3. केवल ईसीएफसी, एमएससी और ईसीएफसी-एमएससी स्फीरोइड की पीढ़ी और एम्बेडिंग

1 दिन

  1. ईसीएफसी और एमएससी सेल निलंबन की तैयारी
    1. कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) जोड़कर 80-90% confluent ईसीएफसी और एमएससी धो लें, और aspirate.
    2. ECFCs और एमएससी को संस्कृति की प्लेट से अलग करने के लिए, उन्हें सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 3 मिनट और 5 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन-EDTA के साथ इनक्यूबेट करें (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2),क्रमशः, एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में।
    3. 10% FBS और 1% जीपीएस युक्त DMEM माध्यम जोड़कर trypsin निष्क्रिय करें। एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    4. आरटी में 5 मिनट के लिए 282 x ग्राम पर अपकेंद्रण द्वारा कोशिकाओं को तलदद।
    5. सुपरनेंट निकालें, और संबंधित माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  2. फ्लोरोसेंट डाई के साथ ईसीएफसी और एमएससी की लेबलिंग
    नोट: PKH67 (हरा) और PKH26 (लाल) फ्लोरोसेंट डाई के साथ एमएससी के साथ ECFCs की सेल झिल्ली लेबलिंग प्रदर्शन थोड़ा संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के बाद निम्नानुसार.
    1. FBS को हटाने के लिए सीरम मुक्त माध्यम से कोशिकाओं को दो बार धो लें।
      नोट: FBS में प्रोटीन और लिपिड बाध्यकारी द्वारा लेबलिंग कोशिकाओं के लिए प्रभावी डाई एकाग्रता कम कर देता है.
    2. माइक्रोस्कोप के नीचे एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके ईसीएफसी और एमएससी की गणना करें, और 2 एमएल माइक्रो-ट्यूब में 3 x 106 ईसीएफसी और 2 x 106 एमएससी स्थानांतरित करें।
      नोट: ये रंगों के साथ लेबलिंग कोशिकाओं के लिए इष्टतम सेल घनत्व हैं. कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या का उपयोग गरीब और विषम धुंधला का कारण बनता है, जबकि बहुत कम कोशिकाओं का उपयोग गरीब कोशिकाओं वसूली पैदावार.
    3. एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रीफ्यूज। अति-संवत् को अवशिष्ट आयतन के 15-25 डिग्री सेल्सियस से अधिक न छोड़ने पर सावधानी पूर्वक प्रेरित करें।
    4. डाई किट से डिल्यूंट सी के 250 जेडएल में ईसीएफसी और एमएससी को पुन: निलंबित करें। पूर्ण फैलाव सुनिश्चित करने के लिए सेल निलंबन को धीरे से पिपेट करें।
      नोट: Diluent सी एक शारीरिक नमक है, और micelles के गठन से डाई के धुंधला दक्षता को कम कर सकते हैं. इसलिए, कोशिकाओं को लंबे समय तक diluent C में खड़े न होने दें, और ट्यूबों को भंवर न करें।
    5. ईसीएफसी के लिए धुंधला समाधान को 5 डिग्री सेल्सियस जोड़कर डिल्यूंट सी (20 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता) और एमएससी के लिए 3 डिग्री सेल्सियस को मिलाकर डिल्यूंट सी के 250L (अंतिम सांद्रता 12 डिग्री सेल्सियस ) को जोड़कर।
      नोट: अंतिम डाई सांद्रता निर्माता की सिफारिशों से अलग हैं. उच्च एकाग्रता सेल clumping और सेल विषाक्तता के लिए नेतृत्व करेंगे. कम एकाग्रता धुंधला के लिए पर्याप्त नहीं होगा.
    6. ईसीएफसी सेल निलंबन के 250 डिग्री सेल्सियस को PKH67 डाई समाधान के 250 डिग्री सेल्सियस और एमएससी के 250 डिग्री एल को PKH26 डाई समाधान के 250 डिग्री सेल्सियस में जोड़ें। तुरंत ऊपर और नीचे पाइपिंग और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट द्वारा रंगों के साथ कोशिकाओं को मिश्रण। बेहतर परिणाम के लिए, धुंधला के दौरान पर्याप्त मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी और एक शेकर पर जगह के साथ ट्यूब को कवर.
    7. दाग सेल निलंबन करने के लिए FBS के 0.5 एमएल जोड़कर धुंधला प्रक्रिया बंद करो, और फिर FBS अतिरिक्त असीमित डाई बाध्य करने के लिए अनुमति देने के लिए 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट. 5 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर अपकेंद्रण द्वारा दाग कोशिकाओं तलछट.
      नोट: ECFCs और एमएससी छर्रों हल्के पीले और गुलाबी हैं, क्रमशः, धुंधला करने के बाद.
    8. ध्यान से supernatant निकालें और अतिरिक्त डाई को दूर करने के लिए पूरा माध्यम के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें। 5 मिनट के लिए 100 x ग्राम पर ट्यूब ों को सेंट्रीफ्यूज करें और प्रत्येक पूर्ण माध्यम के 2 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. ECFC, एमएससी या ECFC + एमएससी स्फ़रॉइड जनरेट कर रहा है
    नोट: पहलेबताए गए अनुसार स्रूपभियों को उत्पन्न करने के लिए हैंगिंग ड्रॉप तकनीक लागू करें . गोलभों की तैयारी के लिए चरण नीचे दिए गए हैं।
    1. दाग ECFCs और एमएससी की गणना.
    2. ईसीजीएम-एमवी2 में दागी ईसीएफसी, एमएससी या ईसीएफसी+ एमएससी को निलंबित करें जिसमें 20% मेथिलसेलुलोस समाधान और 5% एफबीएस शामिल हैं। ईसीएफसी या एमएससी के लिए 4 x 104 कोशिकाओं/एमएल के सेल घनत्व पर तैयारी करें (सेल निलंबन के 25 डिग्री सेल्सियस में 1,000 सेल शामिल हैं)। ईसीएफसी और एमएससी के दो सेल निलंबन के लिए, 2 x 104 सेल/एमएल ईसीएफसी और 0.4 x 104 सेल/एमएल एमएससी (25 जेडएल में 500 ईसीएफसी और 100 एमएससी) के सेल घनत्व पर तैयारी करें।
      नोट: एमएससी के लिए ईसीएफसी का अनुपात 5:1 से अधिक नहीं होना चाहिए। एमएससी की एक बड़ी संख्या अत्यधिक प्रवास और अनियमित अंकुरित आकारिकी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. एमएससी की एक छोटी संख्या कोशिकाओं के बीच गरीब बातचीत का कारण बन सकता है, गरीब अंकुरित उपज.
    3. पीबीएस के 15 एमएल को 150 मिमी संस्कृति प्लेट के तल में जोड़कर जलयोजन इकाई तैयार कीजिए।
    4. मल्टीचैनल पिपेट के उपयोग के लिए बंध्याकरण पॉलीस्टाइरीन आयताकार जलाशय में सेल निलंबन को स्थानांतरित करें। पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं के निलंबन को समान रूप से फैलाएं।
    5. एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर एक 150 मिमी संस्कृति प्लेट के कवर पर सेल निलंबन के 25 डिग्री एल बूँदें जमा (लगभग 100 बूँदें / एक पीबीएस से भरे जलयोजन इकाई पर कवर उलटा और 24 एच के लिए एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट।
      नोट: मिथाइलसेलुलोस समाधान निलंबन समाधान के लिए एक उचित चिपचिपापन प्रदान करता है। जब हैंगिंग ड्रॉप विधि मिथाइलसेलुलोस समाधान के बिना किया गया था, बूँदें आसानी से नीचे फिसल गया था जब कवर उलटा था (पूरक चित्र 1). इसके अलावा, रात भर ऊष्मायन के बाद, मिथाइलसेलुलोस समाधान के बिना गोलोइड पूरी तरह से नहीं बनाए गए थे। इस परिणाम से संकेत मिलता है कि मिथाइलसेलुलोस समाधान द्वारा उचित चिपचिपापन गोलोइड के गोल आकार बनाने के लिए आवश्यक है।

2 दिन

  1. बेअसर कोलेजन जेल में एम्बेडिंग अगोलीय
    1. गर्म FBS और ECGM-MV2 (FBS और जीपीएस के बिना) एक पानी स्नान में (37 डिग्री सेल्सियस). कमरे के तापमान को लाने के लिए एक कार्य बेंच पर ठंडे मिथाइलसेलुलोस समाधान रखें।
    2. वार्मिंग के लिए एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) में एक 24-वेल प्लेट रखें।
    3. नुकीले 1 एमएल पिपेट टिप्स 3-5 मिमी को एस्पायरेट स्फीरॉइड्स और चिपचिपा निलंबन, जैसे मिथाइलसेलुलोस समाधान और टाइप मैं कोलेजन, आराम से और सही।
    4. तैयार 3 mg/mL बेअसर प्रकार मैं प्रकार मैं कोलेजन जेल निर्माता के निर्देश के बाद बर्फ पर कोलेजन जेल.
      नोट: कमरे के तापमान पर कोलेजन के जेलेशन से बचने के लिए बर्फ पर तटस्थकियारण किया जाना चाहिए। एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से करने के लिए, तटस्थ कोलेजन के 500 डिग्री एल की जरूरत है. हमेशा कोलेजन के 1 एमएल अतिरिक्त मात्रा तैयार करते हैं। कोलेजन जेल अप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है 2-3 एच तटस्थीकरण के बाद अगर बर्फ पर रखा.
    5. पीबीएस के 5 एमएल के साथ गोलोइड युक्त कवर को rinsing द्वारा गोलोइड फसल। 50 एमएल शंकुन तली में गोलभॉइड-निलंबित विलयन लीजिए। शेष गोलाभ प्राप्त करने के लिए पीबीएस के 5 एमएल के साथ कवर को फिर से साफ़ करें।
      नोट: कटाई के दौरान, गोलोइड के अस्तित्व की पुष्टि करने के लिए बारीकी से निरीक्षण करें। अधिक दृश्य निरीक्षण के लिए, स्लाइड कांच पर लगभग 50-100 डिग्री सेल्सियस स्फिलॉयड-निलंबित समाधान स्थानांतरित करें, और माइक्रोस्कोप के नीचे स्फीरॉइड के गोल आकार की जांच करें।
    6. 5 मिनट के लिए 282 x ग्राम पर अपकेंद्रण द्वारा गोलाभ को तलदकरें. अवशिष्ट मात्रा के 100-200 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं छोड़ने वाले अफ़ीमों को परेशान किए बिना सुपरनॉटेंट को सावधानी से छोड़ दें।
    7. ट्यूब की दीवार पर धीरे से टैप करें ताकि शेष 100-200 डिग्री एल अवशिष्ट समाधान में गोलिता मुक्त रूप से निलंबित कर दिया जाए।
    8. 5% एफबीएस और 40% मिथाइलसेलुलोस समाधान से युक्त ईसीजीएम-MV2 को गोलिॉइड युक्त ट्यूब में जोड़ें। जोड़ा गया वॉल्यूम लगभग 100 स्रूपभियों/एमएल के आधार पर निर्धारित किया जाता है। धीरे से एक कुंद 1 एमएल पिपेट टिप के साथ pipeting द्वारा गोलोइड निलंबन मिश्रण.
      नोट: मिथाइलसेलुलोस समाधान व्यापक रूप से एक निलंबित एजेंट के रूप में प्रयोग किया जाता है जो गोलिओं को तलछट की अनुमति नहीं देता है। FBS एकाग्रता 5% होना चाहिए. उच्च FBS एकाग्रता अत्यधिक वृद्धि कारकों के कारण असामान्य अंकुरित का कारण बनता है. कम FBS एकाग्रता कोशिकाओं के लिए स्वस्थ स्थिति बनाए रखने नहीं कर सकते.
    9. मिश्रण गोलभड़-निलंबन समाधान और बेअसर-प्रकार मैं कोलेजन जेल (3 mg/mL) बर्फ पर एक 1:1 अनुपात पर। एक कुंद 1 एमएल पिपेट टिप का प्रयोग करें गोलोइड के तोड़ने से बचने के लिए।
      नोट: एक 24 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से के लिए गोलिता-निलंबित कोलेजन जेल समाधान के 1 एमएल आवश्यक है। यदि संभव हो तो एक अतिरिक्त मिश्रित निलंबन समाधान करें।
    10. यदि किसी भी एजेंट (ओं) या रासायनिक (ओं) के angiogenic गुण का परीक्षण किया जा करने की आवश्यकता है, एक 1 एमएल माइक्रो ट्यूब में गोलिका-निलंबित कोलेजन जेल समाधान के 1 एमएल हस्तांतरण और एजेंट (ओं) या रासायनिक (ओं) एक कुंद 1mL पिपेट टिप के साथ कोमल मिश्रण के बाद जोड़ें।
      नोट: एजेंट और रासायनिक की मात्रा 200 एमएल तक योग कर सकते हैं, जो प्रकार मैं कोलेजन जेल एकाग्रता से पतला 1.5 mg/mL करने के लिए 1.25 mg/mL, लेकिन प्रकार मैं कोलेजन जेल बहुलकीकरण को प्रभावित नहीं करता है। नियंत्रण गोलाभ के लिए वाहन की एक ही मात्रा जोड़ें।
    11. पाइपिंग द्वारा एक पूर्व-वार्म्ड 24-वेल प्लेट (0.9 एमएल/वेल) के कुओं में स्फीरॉइड-स्प्रेशनल कोलेजन जेल समाधान जोड़ें, और फिर बहुलकीकरण के लिए सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: गोलिभ embedding प्रक्रिया के दौरान, थाली आंदोलन करके जेल परेशान मत करो.
    12. ECGM-MV2 के 100 $L जोड़कर गोलोइड-सस्पेंड कोलेजन जेल को कवर करें जिसमें 2.5% एफबीएस के साथ/ ईसीएफसी केवल गोलिता के लिए, उचित अंकुरित बनाने के लिए VEGF (50 एनजी/एमएल की अंतिम एकाग्रता) के exogenous अतिरिक्त के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें। ईसीएफसी + एमएससी स्रूपॉइड किसी भी विकास कारक द्वारा exogenous उत्तेजना की आवश्यकता नहीं है।
    13. एक वास्तविक समय सेल रिकॉर्डर एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2)में स्थापित में थाली प्लेस, और बेतरतीब ढंग से 5-10 गोलभॉइड (10x उद्देश्य लेंस) पर ध्यान केंद्रित। प्रत्येक फ्लोरोसेंट-लेबल अरूप के अंकुरित गठन की निगरानी किसी भी अशांति के बिना 24 एच के लिए हर 1 एच।

4. क्वांटिट स्फ़रॉइड स्प्राउटिंग

  1. ImageJ सॉफ्टवेयर के लिए छवि फ़ाइलों को आयात अंकुरित की संख्या की मात्रा और प्रत्येक अंकुरित की लंबाई को मापने के लिए। सह-संस्कृति गोलोइड के लिए, उपभक्त बनाने से पहले हरे फ्लोरोसेंट डाई के साथ ईसीएफसी लेबल करें। फिर, हरी फ्लोरोसेंट के साथ दाग अंकुरित अंकुरित की संख्या और लंबाई को मापें (पूरक चित्र 2)। पांच बेतरतीब ढंग से चयनित गोलभड़ियों को प्रायोगिक समूह के अनुसार परिमाणित किया गया।
    नोट: स्प्राउट्स कई ईसीएफसी द्वारा बनाई गई सहयोगात्मक लम्बी संरचनाएं हैं जो अभी-अभी चलरही से बाहर फैली हुई हैं। अंकुरित लंबाई को स्प्राउट्स की सतह से अंकुरित की नोक तक अंकुरित मूल के बिंदु के रूप में मापा जाता है।
  2. मूल्यों को कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों का अर्थ है के रूप में व्यक्त करें। एकाधिक तुलना के लिए एक तरह से ANOVA द्वारा सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर का निर्धारण या युग्मित तुलना के लिए छात्र के t-परीक्षण.
    नोट:P $ 0.05 सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता है.

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Representative Results

तुलना प्रयोगों मोनो संस्कृति स्रूपभ (केवल ईसीएफसी) और सह संस्कृति गोलाभ (ECFCs + एमएससी) का उपयोग कर जांच करने के लिए कि क्या एमएससी ECFCs-मध्यस्थ एंजियोजेनेसिस में काफी भूमिका निभाते हैं प्रदर्शन किया गया. प्रत्येक गोलभड़ से गठन अंकुरित एक वास्तविक समय सेल रिकॉर्डर है कि गोलोइड से एंजियोजेनिक अंकुरित की प्रगति पर कब्जा कर सकता द्वारा 24 एच के लिए निगरानी की गई थी। स्प्राउट्स की संख्या की गणना करके और व्यक्तिगत स्फीरों से उत्पन्न स्प्राउट्स की संचयी लंबाई को मापने के द्वारा एंजियोजेनिक क्षमता का परिमाण निर्धारित किया गया था। प्रयोगात्मक समूह प्रति पांच बेतरतीब ढंग से चयनित गोलभड़ियों का विश्लेषण किया गया। ईसीएफसी+एमएससी स्फीरोइड के लिए, सभी समय-बिंदुओं पर ईसीएफसी+केवल गोलाभ की तुलना में स्प्राउट्स और संचयी स्प्राउट लंबाई की संख्या काफी अधिक थी (चित्र 1ए-सी)। ECFCs+MSCs के अंकुरित संख्या और लंबाई में लगातार 12 घंटे की वृद्धि हुई है, लेकिन ईसीएफसी की संख्या और लंबाई केवल 6 एच के लिए बढ़ी है और बाद में समय-बिंदुओं में नहीं बदली (चित्र 1B,C)। इसके अतिरिक्त, ईसीएफसी द्वारा बनाए गए स्प्राउट्स + एमएससी स्फीरोइड ईसीएफसी द्वारा बनाए गए गोलों की तुलनामें मोटे और अधिक टिकाऊ थे, केवल वेगफ उपचार के साथ/ एमएससी केवल गोलाभ स्प्राउट्स नहीं बना था लेकिन गोलाभ के बाहर एमएससी का अलग-अलग प्रवास दिखाया गया था (चित्र 1ए और पूरक वीडियो 1C)। इन परिणामों एमएससी के महत्वपूर्ण योगदान को प्रदर्शित करता है, pericyte अग्रदूतों, ECFCs के सेलुलर एंजियोजेनेसिस के लिए. एमएससी विभिन्न विकासकारकों को स्रावित करने के लिए जाना जाता है 29 जो ईसीएफसी को अंकुरित और ट्यूबलर संरचनाओं के रूप में प्रोत्साहित कर सकते हैं।

ईसीएफसी+ एमएससी स्रूपभित करने के लिए संयोजन से पहले ईसीएफसी को हरे-फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया गया था और एमएससी को लाल-फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया गया था। वास्तविक समय रिकॉर्डिंग के साथ साथ, इस लाइव सेल फ्लोरोसेंट लेबलिंग तकनीक अंकुरित गठन के दौरान ईसीएफसी और एमएससी के सेलुलर आंदोलनों को ट्रैक कर सकते हैं। फ्लोरिसेंट इमेजिंग से पता चला कि ईसीएफसी-मध्यस्थ अंकुरित संरचनाओं को एमएससी के साथ कवर किया गया था (चित्र 2 और पूरक वीडियो 2)। यह सुझाव है कि संयुक्त एमएससी अंकुरित गठन के दौरान perivascular कोशिकाओं के रूप में कार्य करते हैं, जो अंकुरित स्थिरता और स्थायित्व दो संवहनी कोशिकाओं के बीच तंग सहयोग से बढ़ाने.

नव विकसित सह संस्कृति गोलाभ परख प्रणाली bevacizumab के साथ परीक्षण किया गया था, एक एफडीए को मंजूरी दे दी एंजियोजेनेसिस अवरोध करनेवाला, विरोधी angiogenic दवाओं स्क्रीन करने के लिए अपनी क्षमता को सत्यापित करने के लिए. ईसीएफसी +एमएससी स्फीरॉइड्स के साथ पूर्व व्यवहार किया गया बेवसिजुमाब से पता चला कि नियंत्रण ईसीएफसी + एमएससी स्फीरोइड की तुलना में खुराक-निर्भर तरीके से अंकुरित संख्या और संचयी अंकुरित लंबाई में कमी आई है। समानांतर प्रयोगों में, ईसीएफसी-केवल गोलभड़ियों के साथ व्यवहार किया जाता है जिसके बाद वेगफ (50 एनजी/एमएल) के साथ उत्तेजना के बाद यह भी कम VEGF-प्रेरित अंकुरित संख्या और संचयी अंकुरित लंबाई एक खुराक-निर्भर तरीके से दिखाई देती है (चित्र 3सी, डी) . नोट की, ईसीएफसी में संचयी अंकुरित लंबाई को बाधित करने के लिए बेवैसिजुमाब के आईसी50 मान + एमएससी स्फीरोइड्स ईसीएफसी में केवल गोलाभ (तालिका 1) से 46 गुना अधिक थे। यह परिणाम दृढ़ता से अर्थ है कि उच्च एकाग्रता केवल ईसी मध्यस्थता संवहनी गठन को बाधित करने के लिए आवश्यक एकाग्रता के साथ तुलना में ईसीएफसी और एमएससी द्वारा शारीरिक रूप से प्रासंगिक संवहनी गठन को बाधित करने के लिए आवश्यक है।

अगले, एक xenograft ट्यूमर माउस मॉडल bevacizumab उपचार के साथ प्रदर्शन किया गया था पता चलता है जो गोलभॉइड प्रणाली vivo प्रभावी प्लाज्मा एकाग्रता में के साथ संबंधित उम्मीद के मुताबिक डेटा प्रदान करते हैं. मानव व्युत्पन्न ग्लियोब्लास्टोमा U87MG-लाल-FLuc सेल लाइन प्रतिरक्षा कमी चूहों के लिए subcutaneously इंजेक्शन था. 1 सप्ताह में ट्यूमर गठन की पुष्टि करने के बाद, चूहों को बेतरतीब ढंग से 3 समूहों में विभाजित किया गया था जो विभिन्न उपचार प्राप्त करते थे: नियंत्रण (0 मिलीग्राम/किग्रा), कम खुराक (1 मिलीग्राम/किग्रा), और उच्च खुराक (30 मिलीग्राम/किग्रा)। नियंत्रण समूह की तुलना में 30 मिलीग्राम/किलोग्राम उपचारित समूह में ट्यूमर का विकास काफी हद तक बाधित था(पूरक चित्र 3क)। 1 मिलीग्राम/किलोग्राम-उपचारित समूह ने ट्यूमर में कमी की प्रवृत्ति दिखाई, लेकिन नियंत्रण समूह की तुलना में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं था। बेवासिज़ुमाब उपचार के 3 सप्ताह में माउस प्लाज्मा सांद्रता 568.0 $40.62 ग्राम/एमएल पर 30 मिलीग्राम/kg और 38.1 $0.72 g/mL पर 1 मिलीग्राम/kg(पूरक चित्र 3B) थी। विशेष रूप से, bevacizumab के प्लाज्मा एकाग्रता प्रभावी निषेध दिखा (568.0 $40.62 $g/mL पर 30 मिलीग्राम/kg 3 सप्ताह के उपचार के लिए) बारीकी से ECFCs द्वारा प्राप्त किया गया था + MSCs spheroids (1261.5]214.49 g/mL) लेकिन नहीं ECFCs-spheroids (27.9.9.9.9.m). इस प्रकार, ईसीएफसी + एमएससी स्फीरोइड एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली को पशु प्रयोगों के अग्रिम में प्रभावी प्लाज्मा एकाग्रता की भविष्यवाणी करने के लिए एक उपयुक्त परख प्रणाली के रूप में माना जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: केवल ईसीएफसी, एमएससी, और ईसीएफसी + एमएससी स्फिरोइड से स्प्राउट गठन। (ए) ईसीएफसी से अंकुरित गठन के प्रतिनिधि चित्र केवल, एमएससी केवल और ईसीएफसी + एमएससी स्फीरोइड प्रकार में एम्बेडेड मैं कोलेजन जेल में 0, 6, 12, 18, और 24 एच (स्केल बार $ 100 $m)। (बी)केवल ईसीएफसी और ईसीएफसी+ एमएससी स्फीरोइड्स (माध्यम एसईएम, एन ] 3) से बने अंकुरित संख्या का मात्रात्मक ग्राफ। (ग)केवल ईसीएफसी और ईसीएफसी+ एमएससी स्फीरोइड्स (माध्यम एसईएम, द ] 3) से निर्मित संचयी अंकुरित लंबाई का मात्रात्मक ग्राफ। * केवल ईसीएफसी और ईसीएफसी + एमएससी एक ही समय-बिंदुओं पर गोलाभ के बीच महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है (p $0.05)। एक ब्रैकेट द्वारा इंगित समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है (च $ 0.05).। यह आंकड़ा पिछले30से संशोधित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: अंकुरित संरचनाओं में ईसीएफसी और एमएससी का स्थानीयकरण। 24 एच ईसीएफसी और एमएससी के बाद अंकुरित संरचनाओं में दो सेल प्रकारों के स्थानों को दर्शाने वाली प्रतिनिधि छवियों को क्रमशः PKH67 (हरा) और PKH26 (लाल) के साथ लेबल किया गया था, और 3 D ECFCs+MS spheroid एंजियोजेनेसिस परख का प्रदर्शन किया। तीर से पता चलता है कि एमएससी ECFCs-मध्यस्थ अंकुरित संरचनाओं के साथ कवर किया गया (स्केल बार $ 100 $m). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ईसीएफसी + एमएससी और ईसीएफसी से अंकुरित गठन पर बेवासिजुमाब का अवरोधक प्रभाव केवल गोलभॉइड। ईसीएफसी + एमएससी और ईसीएफसी-केवल गोलाभियों के साथ इलाज किया गया था, और अंकुरित गठन 24 ज के लिए निगरानी की गई थी (बी) ईसीएफसी से संचयी अंकुरित लंबाई के मात्रात्मक ग्राफ + एमएससी स्फीरॉइड्स को बेवैज़ुमाब (मतलबजेडईएम, एन जेड 3) के साथ इलाज किया गया था। (ग)वीजीएफ-उत्तेजित ईसीएफसी से अंकुरित संख्या का मात्रात्मक ग्राफ केवल बेवसिज़ुमाब के साथ उपचारित (मतलब ईएम, द ] 3)। (घ)वीजीएफ-उत्तेजित ईसीएफसी से संचयी अंकुरित लंबाई का मात्रात्मक ग्राफ केवल बेवासिज़ुमाब के साथ उपचारित (मतलब एसईएम, द ] 3)। * नियंत्रण समूह (सफेद पट्टी) से महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है (च $ 0.05). VEGF-उपचारित समूह (काली पट्टी) (p ] 0.05) से महत्वपूर्ण अंतर इंगित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समय
(ज)		 अवाटिन का आईसी50 (जेडजी/ पी-मान
ईसीएफसी केवल अफ़ीम ईसीएफसी+एमएससी स्फरॉइड
6 94.62 ] 38.53 3058.21 ] 373.31 0.003
12 58.61 ] 17.80 2006 - 484.73 0.015
18 83.38 ] 54.54 1509.51 ] 483.88 0.042
24 27.04 ] 9.97 1261.51 ] 214.49 0.0045

तालिका 1: या तो ECFCs में संचयी अंकुरित लंबाई के निषेध के लिए bevacizumab के IC 50 मान केवल या ECFCs + एमएससी अफलियाभ. ईसीएफसी-केवल स्फीरोइड का इलाज बीवैज़ुमाब के साथ किया गया था जिसके बाद वीजीएफ (50 एनजी/एमएल) के साथ उत्तेजना के बाद, जो ईसीएफसी से केवल स्फीरॉइड्स के अंकुरित गठन के लिए आवश्यक है। ईसीएफसी + एमएससी स्फीरोइड वीजीएफ उत्तेजना के बिना bevacizumab के साथ इलाज किया गया। दोनों गोहरॉइड प्रकार मैं कोलेजन जेल में एम्बेडेड, और प्रत्येक गोहरॉइड से गठन अंकुरित एक वास्तविक समय सेल रिकॉर्डर का उपयोग कर 24 एच के लिए मनाया गया था। Data माध्य के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं - SEM (द र् 3)।

Supplemental Figure 1
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Supplemental Figure 2
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Supplemental Figure 3
पूरक चित्र 3: कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Supplemental Video 1A
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Supplemental Video 1B
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Supplemental Video 1C
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Supplemental Video 1D
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Supplemental Video 2
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Discussion

वर्तमान अध्ययन में एक उन्नत इन विट्रो एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली का उपयोग करते हुए दो मानव संवहनी सेल संतति, ईसीएफसी और एमएससी द्वारा गठित सह-संस्कृति गोलाभ प्रणाली का उपयोग किया जा सकता है। सह-संस्कृति गोलाभ प्रणाली विवो संवहनी स्प्राउट गठन में नकल कर सकती है, जो है एंडोथेलियल कोशिकाओं और pericytes के बीच बातचीत और समावेश द्वारा पूरा. विट्रो एंजियोजेनेसिस परख है कि केवल ईसी-मध्यस्थ एंजियोजेनेसिस को प्रतिबिंबित करने के लिए अन्य की तुलना में, इस सह संस्कृति परख प्रणाली सेलुलर बातचीत सहित शारीरिक एंजियोजेनेसिस के multistep झरना के अधिक प्रतिनिधि है, अंकुरित, ट्यूब गठन, और पोत परिपक्वता. इस नव स्थापित परख प्रणाली भी प्रकार मैं कोलेजन जेल में गोलो से बोने से इन विवो extracellular microenvironment जैसा दिखता है. हमारा सुझाव है कि 3 डी सह संस्कृति गोलाभ एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली विश्वसनीय है, repeatable, आसानी से परिमाणीकरणीय, और सबसे महत्वपूर्ण बात शारीरिक रूप से प्रासंगिक.

सह संस्कृति गोलोइड परख प्रदर्शन करते समय, यह बेअसर प्रकार मैं कोलेजन और FBS के उचित एकाग्रता के साथ जेल में गोलोइड एम्बेड करने के लिए आवश्यक है. बेअसर प्रकार मैं कोलेजन का सबसे अच्छा अंतिम एकाग्रता 1.5 mg/mL है, और FBS का प्रतिशत 2.5% है. प्रारंभिक प्रयोगों में, कोलेजन की उच्च सांद्रता कठोर जेल के परिणामस्वरूप हुई और गोलोइड से उत्पन्न अंकुरित स्प्राउट्स की गुणवत्ता और मात्रा में बाधा उत्पन्न हुई। कोलेजन की कम सांद्रता नरम और नाजुक जेल है कि गोलोइड की अखंडता को बनाए रखने नहीं कर सका उपज. इसी प्रकार, एफबीएस की उच्च मात्रा के कारण एनिजेनिक कारक उत्तेजना पर ध्यान दिए बिना बेसल स्तर पर गोलोइडों से अधिक मात्रा में अंकुरित होता है। कम FBS एकाग्रता कोशिकाओं की खराब स्थिति के लिए नेतृत्व किया. सुसंगत और पुन: उत्पादनीय परिणामों के लिए, गोलाभ की एक उचित संख्या एम्बेडेड होना चाहिए (के बारे में 50 गोलाभ / 50 से अधिक गोलभों/अच्छी तरह से अच्छी तरह से भीतर अगोलीय की निकटता के करीब हो सकता है, जो असामान्य रूप से उत्पन्न अंकुरित अंकुरित की गुणवत्ता और मात्रा को प्रभावित कर सकता है।

यह तटस्थीकरण के दौरान ठंडा परिस्थितियों में प्रकार मैं कोलेजन बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है और गोलिकाइड निलंबन के साथ कदम मिश्रण क्योंकि कोलेजन कमरे के तापमान पर थक्का कर सकते हैं, एक अनियमित मैट्रिक्स में जिसके परिणामस्वरूप. कोलेजन समाधान के साथ गोलभस निलंबन मिश्रण करते समय, यह व्यापक छेद बनाने के लिए अंत में 3-5 मिमी कटौती के साथ 1 एमएल पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। यह चिपचिपा कोलेजन समाधान के आसान हैंडलिंग सक्षम बनाता है और टूटना से गोलिता की रक्षा करता है। स्फीरॉइड-निलंबित कोलेजन समाधान को एम्बेड करने के बाद प्लेट का आंदोलन जेल की अखंडता को परेशान कर सकता है और इसके परिणामस्वरूप टूटना हो सकता है जो सामान्य अंकुरित पीढ़ी को बाधित कर सकता है।

ईसीएफसी और एमएससी का उपयोग करते हुए सह-संस्कृति गोलभपरॉइड परख में 5:1 अनुपात बनाए रखा जाना चाहिए। एमएससी की एक बड़ी संख्या का उपयोग एमएससी के प्रवासी phenotype, जो आदर्श अंकुरित पीढ़ी को प्रभावित कर सकते हैं के कारण अराउंडॉइड के आसपास फैल कारण बनता है. एमएससी की एक छोटी संख्या ईसीएफसी अंकुरित को प्रोत्साहित करने और अंकुरित को ठीक से कवर करने के लिए अपर्याप्त है। इसके अलावा, यह विकास के दौरान सेल की स्थिति की जांच करने के लिए आवश्यक है। यदि गरीब अंकुरित मनाया जाता है, तो कोशिकाओं के एक और स्वस्थ मार्ग का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। बेहतर परिणाम के लिए, 10 से कम मार्ग पर ईसीएफसी और एमएससी के उपयोग की पुरजोर सिफारिश की जाती है।

यहाँ, हम सह संस्कृति गोलाभ है कि बारीकी से विवो एंजियोजेनेसिस में कब्जा का उपयोग कर एक बेहतर 3 डी एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली पेश करते हैं। 2 डी एकल सेल परख प्रणाली के साथ तुलना में, इस सह संस्कृति spheroid परख प्रणाली शारीरिक स्थितियों में ट्यूबलर संरचनाओं के रूप में दो संवहनी सेल प्रकार के बीच और अधिक ईमानदारी से सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित. हालांकि, इस प्रणाली vivo angiogenesis में की जटिल बहु कदम प्रक्रिया की तुलना में oversimplified रहता है. विवो में संवहनी पीढ़ी आमतौर पर विभिन्न अन्य प्रकार के कई बातचीत के माध्यम से होता है, उपकला कोशिकाओं सहित, फाइब्रोब्लास्ट, प्रतिरक्षा कोशिकाओं, और भी प्रचुर मात्रा में ECM प्रोटीन. इस नई प्रणाली के भविष्य के अनुप्रयोगों में अन्य सेल प्रकार और ईसीएम की शुरूआत शामिल है ताकि शारीरिक और/या रोगजनक एंजियोजेनेसिस को अधिक सटीक रूप से प्रतिबिंबित किया जा सके।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध के लिए खाद्य एवं औषधि सुरक्षा मंत्रालय से एक अनुदान (17172MFDS215), कोरिया सरकार (MSIP) (2017R1A2B4005463) द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (NRF) अनुदान, और बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से समर्थित किया गया था राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन ऑफ कोरिया (एनआरएफ) शिक्षा मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित (2016R1A6A1A03007648).।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin EDTA (1x) Gibco 25300-054
Bevacizumab Roche NA Commercial name: Avastin
Dulbecco Modified Eagle Medium Gibco 11885-084 DMEM
Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) Gibco 21600-010 PBS (10x)
Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) Corning 21-031-CVR PBS (1x)
Endothelial cell Growth medium MV2 kit Promocell C-22121 ECGM-MV2
Fetal bovine serum (FBS) Atlas FP-0500A FBS
Gelatin BD Sciences 214340
L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin Gibco 10378-016 GPS
Mesenchymal stem cell growth medium-2 Promocell C-28009 MSCGM-2
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0512
PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI26 PKH26
PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits Sigma-Aldrich MINI67 PKH67
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881
Type I collagen gel Corning 354236
Vascular endothelial growth factor A R&D 293-VE-010 VEGF

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 151 एंजियोजेनेसिस सह-संस्कृति गोलाभ एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने की कोशिकाएं मेसेनकाइमल स्टेम सेल टाइप आई कोलेजन जेल अंकुरित बेवसीजुमाब
त्रि-आयामी एंजियोजेनेसिस परख प्रणाली को-कल्चर स्फरॉइड्स का उपयोग करते हुए एंडोथेलियल कॉलोनी बनाने वाले सेल और मेसेन्काइमल स्टेम सेल
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Shah, S., Lee, H., Park, Y. H., Jeon, E., Chung, H. K., Lee, E. S., Shim, J. H., Kang, K. T. Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (151), e60032, doi:10.3791/60032 (2019).

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