Summary
O sistema esferóide tridimensional do ensaio da angiogênese da cocultura é projetado imitar a angiogênese fisiológica. Os esferoides da co-cultura são dados forma por dois precursores vasculares humanos da pilha, por ecfcs e por MSCS, e incorporados no gel do colagénio. O novo sistema é eficaz para avaliar moduladores angiogênicos e fornece informações mais relevantes para o estudo in vivo.
Abstract
Estudos no campo da angiogênese têm sido agressivamente crescendo nas últimas décadas com o reconhecimento de que a angiogênese é uma marca registrada de mais de 50 diferentes condições patológicas, como a artrite reumatóide, oculopatia, doenças cardiovasculares e metástase tumoral. Durante o desenvolvimento da angiogênese, é crucial o uso de sistemas de ensaio in vitro com tipos de células apropriadas e condições adequadas para refletir o processo de angiogênese fisiológica. Para superar as limitações de sistemas de ensaio de angiogênese in vitro atuais usando principalmente células endoteliais, desenvolvemos um sistema de ensaio de sprouting de cocultura (3D) de cortura em 3 dimensões. Os esferoides da cocultura foram produzidos por dois precursores vasculares humanos da pilha, as pilhas de formação da colônia endothelial (ecfcs) e as pilhas de haste mesenquimais (MSCS) com uma relação de 5 a 1. Os esferóides ECFCs + MSCs foram incorporados na matriz de colágeno tipo I para imitar o ambiente extracelular in vivo. Um registrador de pilha tempo real foi utilizado para observar continuamente a progressão do sprouting angiogênico dos esferoides para 24 h. a técnica de rotulagem fluorescente da pilha viva foi aplicada igualmente para tratar a localização de cada tipo da pilha durante a formação do sprout. O potencial angiogênico foi quantificado contando o número de brotos e medindo o comprimento acumulado de brotos gerados a partir de esferóides individuais. Cinco esferóides selecionados aleatoriamente foram analisados por grupo experimental. Experimentos de comparação demonstraram que os esferóides ECFCs + MSCs mostraram maior número de brotos e comprimento acumulado do broto em comparação com os esferóides somente com ECFCs. Bevacizumab, um inibidor da angiogênese aprovado pela FDA, foi testado com o sistema de ensaio de cocultura recém-desenvolvida para verificar seu potencial para a tela de drogas antiangiogênicas. O valor do IC50 para esferóides ecfcs + MSCS comparados com os esferóides somente com ecfcs foi mais próximo da concentração plasmática efetiva de bevacizumab obtida do modelo de camundongo do tumor do Xenoenxerto. O presente estudo sugere que o sistema de ensaio de angiogênese esferóide 3D ECFCs + MSCs é relevante para a angiogênese fisiológica e pode prever uma concentração plasmática efetiva antes de experimentos com animais.
Introduction
Aproximadamente 500 milhões pessoas em todo o mundo deverão se beneficiar da terapia moduladora da angiogênese para doenças associadas à malformação vascular, como artrite reumatóide, oculopatia, doenças cardiovasculares e metástases tumorais1. Assim, o desenvolvimento de fármacos que controlam a angiogênese tornou-se uma importante área de pesquisa na indústria farmacêutica. Durante o processo de desenvolvimento de fármacos, o estudo animal in vivo é necessário para explorar os efeitos dos candidatos a drogas sobre funções fisiológicas e interações sistêmicas entre órgãos. No entanto, as questões éticas e de custo aumentaram as preocupações em relação aos experimentos com animais2. Portanto, os sistemas de ensaio in vitro melhorados são necessários para obter dados mais precisos e previsíveis que levam à melhor tomada de decisão antes dos experimentos com animais. Os ensaios atuais de angiogênese in vitro geralmente medem a proliferação, invasão, migração ou formação de estruturas tubulares de células endoteliais (ECs) semeadas em placas de cultura bidimensionais (2D)3. Estes ensaios de angiogênese 2D são rápidos, simples, quantitativos e rentáveis, e contribuíram significativamente para a descoberta de fármacos moduladores de angiogênese. No entanto, continuam a ser melhoradas várias questões.
Tais sistemas de ensaio in vitro 2D não podem refletir eventos complexos em várias etapas da angiogênese que ocorre em condições fisiológicas in vivo, levando a resultados imprecisos que causam discrepâncias entre os dados do ensaio in vitro e os desfechos do ensaio clínico4. as condições de cultura 2D também induzem a mudança de fenótipos celulares. Por exemplo, após a proliferação em placas da cultura 2D, o ECS tem um phenotype celular fraco como manifestado pela expressão reduzida de CD34 e por diversos sinais que governam respostas celulares5,6. Para superar as limitações do 2D sistemas cultura-baseados do ensaio da angiogênese, os sistemas tridimensionais do ensaio da angiogênese do esferóide (3D) foram desenvolvidos. A brotação seguida de formação de estruturas tubulares de esferóides formados por ECS refletem os processos de neovascularização in vivo7,8. Assim, o ensaio de angiogênese esferóide 3D tem sido considerado um sistema de ensaio eficaz para a triagem de drogas pró-ou antiangiogénese potencial.
A maioria dos ensaios de angiogênese esferóide 3D utilizam apenas ECs, principalmente células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) ou células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HDMECs) para se concentrar na resposta celular dos ECs durante a angiogênese. No entanto, os capilares sanguíneos são compostos por dois tipos de células: ECs e pericytes. A elaboração da interação bidirecional entre ECS e pericitos é fundamental para a integridade e a função vascular apropriadas. Várias doenças, como AVC hereditário, retinopatia diabética e malformação venosa, estão associadas à densidade de pericyte alterada ou à diminuição do apego de pericyte ao endotélio9. Os pericytes também são conhecidos como um elemento-chave do processo angiogênico. Os pericytes são recrutados para estabilizar estruturas de vasos recém-formadas por ECs. Neste sentido, o ensaio de angiogênese esferóide de mono-cultura não incorpora pericitos7,10. Conseqüentemente, os esferoides da cocultura formados por ECS e por pericitos podem fornecer uma aproximação valiosa para imitar mais pròxima eventos angiogênicos fisiológicos.
O presente estudo objetivou desenvolver um ensaio de angiogênese de cocultura em 3D com uma combinação de células de conformação de colônias endoteliais humanas (ECFCs) e células-tronco mesenquimais (MSCs) para refletir mais de perto na angiogênese in vivo. O sistema esferóide da co-cultura como um conjunto in vitro da respresentação de um vaso sanguíneo normal foi estabelecido primeiramente por korff et al. em 200111. Combinaram HUVECs e pilhas humanas do músculo liso da artéria do cordão umbilical (HUSMCs), e demonstraram que a cocultura de duas pilhas vasculares maduras diminuiu o potencial sprouting. Os ECS maduros (HUVECs) são conhecidos por perder progressivamente sua capacidade de proliferar ediferenciar, oque afeta negativamente suasrespostas deangiogênese12,13. Células perivasculares maduras (HUSMCs) podem causar inativação de células endoteliais através da revogação da responsividade do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)11. A principal diferença entre korff e nosso sistema de cocultura esferóide é o tipo de célula usado. Nós aplicamos dois precursores vasculares, ECFCs e MSCs, para estabelecer um sistema apropriado do ensaio da angiogênese para telar e investigar agentes pró-ou-antiangiogénicos. Os ECFCs são o precursor dos ECs. Os ECFCs têm uma capacidade de proliferação robusta em comparação com os ECs14maduros, que permitem superar a limitação do ECS. Os ecfcs contribuem para a formação de novos vasos em muitas condições fisiopatológicas pós-natais15,16,17. As MSCS são células-tronco pluripotentes que têm a capacidade de se diferenciar em pericytes, contribuindo assim para a angiogênese18,19.
Em relatos prévios, ecfcs e MSCS mostraram efeitos sinergéticos na formação de tubos in vitro20, na neovascularização invivo 21,22, e melhoraram a reperfusão de tecidos isquêmicos,23. No presente estudo, ECFCs e MSCs foram utilizados para formar esferóides de cocultura e embutidos em gel de colágeno tipo I para refletir um ambiente in vivo 3D. O colágeno é considerado como um dos principais constituintes da matriz extracelular (ECM) ao redor do ECs25. O ECM desempenha um papel crítico na regulação do comportamento celular26. O protocolo de ensaio proposto aqui pode ser realizado de forma fácil e rápida no prazo de dois dias, utilizando técnicas laboratoriais comuns. Para o seguimento eficaz da pilha durante o processo sprouting, cada tipo da pilha pode cDNAs ser etiquetado e monitorado usando um registrador da pilha do tempo real. O sistema novo-estabelecido do ensaio da angiogênese do esferóide da co-cultura 3D é projetado aumentar a sensibilidade para avaliar moduladores angiogênico potenciais e fornecer a informação previsível adiantado do estudo in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os ECFCs humanos foram isolados do sangue periférico humano como descrito em um relatório precedente27. Momentaneamente, a camada mononucleares da pilha foi separada do sangue inteiro usando o Ficoll-Paque mais, e cultivado no meio apropriado até que o endothelial-como colônias foram aparecido. As colônias foram coletadas e os ECFCs foram isolados usando grânulos magnéticos revestidos por CD31. As MSCs foram isoladas da fração de células mononucleares aderentes (MNC) da medula óssea adulta humana. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de revisão institucional da Duksung Women ' s University (IRB no. 2017-002-01).
1. cultura de células
-
Preparando ECFCs e MSCs médio e placas de revestimento
- Prepare o meio de crescimento de células endoteliais MV2 (ECGM-MV2, exceto a Hidrocortisona) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de glutamina-penicilina-estreptomicina (GPS).
- Prepare o crescimento de células-tronco mesenquimais médio-2 (MSCGM-2) contendo 10% de FBS e 1% de GPS.
- Para a cultura ECFC, cubra as placas de cultura celular com 1% de solução de gelatina. Para preparar 1% de solução de gelatina, dissolva 1 g de pó de geladura em 500 mL de PBS com o agitador magnético e esterilize com autoclave. As chapas podem ser revestidas com 3 ml/60 mm, 5 mL/100 mm ou 15 mL/150 mm de solução de gelatina a 1%. Incubar placas revestidas por 15 min em uma incubadora de cultura celular (37 ° c e 5% CO2). Depois, retire a solução de gelatina 1% remanescente por aspiração e lave as placas revestidas uma vez com PBS.
-
Crescentes ECFCs e MSCs
- Semente 1 x 106 ecfcs em 1% gelatina-revestido 150 mm placas, e crescer usando ecgm-MV2 (10% FBS, 1% GPS) em uma incubadora de cultura celular (37 ° c e 5% co2) para 80-90% confluência. Use ECFCs nos números de passagem 7-10 para obter resultados consistentes.
- Semente 1 x 106 MSCS em placas não-revestidas de 150 milímetros, e cresce usando MSCGM-2 em uma incubadora da cultura de pilha (37 ° c e 5% co2) à confluência de 80-90%. Use MSCs em números de passagem 7-10 para obter resultados consistentes.
2. preparação de 1,2% w/v solução de metilcelulose
- Meça 6 g de celulose de metilo em um frasco de vidro de 500 mL e esterilize em uma autoclave.
- Aqueça ECGM-MV2 (sem FBS e GPS) em 60 ° c por 20 min, e adicione 250 mL de ECGM-MV2 aquecido ao pó de celulose metílico esterilizado. Para manter condições estéreis, realize o processo dentro da capa do fluxo.
- Adicione uma barra de agitação magnética esterilizada e misture a solução por 20 min no agitador magnético até que a celulose de metilo seja completamente molhada e uniformemente dispersa sem caroços. Adicionar 250 mL de frio (4 ° c) ECGM-MV2 (sem FBS e GPS) a condição estéril e misture por um adicional de 10 min no agitador magnético. Em seguida, Chill a solução em um refrigerador (4 ° c) durante a noite.
Nota: Metilcelulose é um polímero de carboidratos que se dissolve bem em temperaturas frias devido ao inchaço e subsequente hidratação. - No dia seguinte, alíquota a solução em um tubo de 50 ml e Centrifugue em 5.000 x g para 3 h em 4 ° c. Tome a solução viscosa desobstruída do sobrenadante e armazene-a em 4 ° c até o uso por até 3-6 meses.
Nota: O sedimento pode conter fibra de celulose residual, de modo a tomar suavemente a solução sobrenadante deixando para trás pelo menos 5 mL de volume. Este volume pode ser ajustado de acordo com as condições experimentais.
3. geração e incorporação de esferóides somente ECFCs, MSCs e ECFCs-MSCs
Dia 1
- Preparando a suspensão de células ECFCs e MSCs
- Lave os ECFCs e MSCs confluentes de 80-90% adicionando soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) sem cálcio e magnésio, e aspirar.
- Para desanexar ECFCs e MSCs da placa de cultura, incubar-os com 0, 5% tripsina-EDTA por 3 min e 5 min em uma incubadora de cultura celular (37 ° c e 5% CO2), respectivamente, em uma incubadora de cultura celular.
- Inative a tripsina adicionando meio DMEM contendo 10% FBS e 1% GPS. Pipeta as células para cima e para baixo para criar uma única célula de suspensão.
- Sedimento das células por centrifugação em 282 x g por 5 min em RT.
- Retire o sobrenadante e Resuspenda as células no respectivo meio.
- Rotulagem de ECFCs e MSCs com corante fluorescente
Nota: Realize a rotulagem da membrana celular de ECFCs com PKH67 (verde) e MSCs com corante fluorescente PKH26 (vermelho) seguindo as instruções do fabricante com um pouco de modificações como se segue.- Lave as células duas vezes com meio livre de soro para remover FBS.
Nota: Proteínas e lipídios em FBS reduz a concentração de corante eficaz para a rotulagem de células por ligação. - Contagem ecfcs e MSCS usando um hemocitômetro o microscópio, e transfira 3 x 106 ecfcs e 2 x 106 MSCS em 2 ml de micro-tubos.
Nota: Estas são as densidades celulares ideais para a rotulagem de células com corantes. O uso de um grande número de pilhas causa a mancha pobre e heterogênea, visto que o uso de poucas pilhas rende a recuperação pobre das pilhas. - Centrifugue os tubos a 100 x g durante 5 min em RT para obter um pellet celular. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante, não deixando mais de 15-25 μL de volume residual.
- Re-suspender ECFCs e MSCs em 250 μL de diluente C do kit de corante. Pipeta delicadamente a suspensão da pilha para assegurar a dispersão completa.
Nota: O diluente C é um sal fisiológico e pode reduzir a eficiência de coloração da tintura formando micelas. Portanto, não deixe que as células fiquem em C diluente por muito tempo, e não vórtice os tubos. - Prepare a solução de coloração para ECFCs adicionando 5 μL de PKH67 a 250 μL de diluente C (concentração final de 20 μM) e para MSCs adicionando 3 μL de PKH26 a 250 μL de diluente C (concentração final de 12 μM).
Nota: As concentrações finais de corante são diferentes das recomendações do fabricante. A concentração elevada conduziria ao aglutelamento da pilha e à toxicidade da pilha. A baixa concentração não seria suficiente para manchar. - Adicionar 250 μL de suspensão de células ECFCs a 250 μL de solução corante PKH67 e 250 μL de MSCs a 250 μL de solução corante PKH26. Misture imediatamente as células com corantes por pipetagem para cima e para baixo e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Para melhores resultados, cubra o tubo com folha de alumínio e coloque em uma coqueteleira para garantir a mistura suficiente durante a coloração.
- Pare o processo de coloração adicionando 0,5 mL de FBS à suspensão de células manchadas e, em seguida, incubar por 1 min para permitir que a FBS vincule o excesso de corante não acoplado. Sedimento das células manchadas por centrifugação em 100 x g por 5 min.
Nota: ECFCs e MSCs pelotas são luz amarela e rosa, respectivamente, após a coloração. - Retire cuidadosamente o sobrenadante e lave as células duas vezes com meio completo para remover o excesso de corante. Centrifugue os tubos a 100 x g durante 5 min e resuspenda o pellet em 2 ml de cada meio completo.
- Lave as células duas vezes com meio livre de soro para remover FBS.
- Gerando esferóides ECFC, MSC ou ECFC + MSC
Nota: Aplique a técnica suspensa de suspensão para gerar esferóides como descrito anteriormente28. As etapas para a preparação de esferoides são dadas abaixo.- Conte os ECFCs manchados e os MSCs.
- Suspender ECFCs manchado, MSCs ou ECFCs + MSCs em ECGM-MV2 contendo solução de metilcelulose a 20% e 5% FBS. Prepare-se para uma densidade celular de 4 x 104 células/ml para ECFCs ou MSCS (25 μL de suspensão celular contém 1.000 células). Para a suspensão de duas células de ECFCs e MSCs, prepare-se em uma densidade celular de 2 x 104 células/ml ecfcs e 0,4 x 104 células/ml MSCS (25 ΜL contém 500 ecfcs e 100 MSCS).
Nota: A proporção de ECFCs para MSCs não deve exceder 5:1. Um número maior de MSCs poderia levar à migração excessiva e à morfologia irregular do sprout. Um número menor de MSCs pode causar má interação entre as células, produzindo brotações ruins. - Prepare uma unidade de hidratação adicionando 15 mL de PBS na parte inferior de uma placa de cultura de 150 mm.
- Transfira a suspensão celular para o reservatório retangular de poliestireno esterilizado para o uso de pipeta multicanal. Dispersar a suspensão das células uniformemente por pipetagem.
- Deposite 25 μL de gotas de suspensão celular na tampa de uma placa de cultura de 150 mm usando uma pipeta multicanal (aproximadamente 100 gotas/tampa da chapa de 150 mm). Inverta a tampa sobre uma unidade de hidratação cheia de PBS e incubar em uma incubadora da cultura da pilha por 24 h.
Nota: Solução de metilcelulose fornece uma viscosidade adequada para a solução de suspensão. Quando o método de queda de suspensão foi realizado sem solução de metilcelulose, as gotas foram facilmente deslizadas quando a tampa foi invertida (Figura 1 suplementar). Além disso, após a incubação durante a noite, os esferóides não foram perfeitamente formados sem solução de metilcelulose. Este resultado indica que a viscosidade adequada pela solução de metilcelulose é necessária para formar a forma redonda dos esferóides.
Dia 2
- Esferóides de embeding no gel neutralizado do colagénio
- FBS morno e ECGM-MV2 (sem FBS e GPS) em um banho de água (° c 37). Coloc a solução fria do metilcelulose em um banco de trabalho para trazer à temperatura ambiente.
- Coloc uma placa de 24 poços em uma incubadora da cultura de pilha (° c 37) para aquecer-se.
- Corte as pontas de pipeta pontiagudas de 1 mL 3-5 mm para aspirar esferóides e suspensões viscosas, como solução de metilcelulose e colágeno tipo I, confortavelmente e com precisão.
- Prepare o gel de colágeno tipo I neutralizado de 3 mg/mL no gelo seguindo as instruções do fabricante do gel de colágeno tipo I.
Nota: A neutralização deve ser realizada no gelo para evitar a geladura do colágeno à temperatura ambiente. Para um poço de uma placa de 24 poços, 500 μL de colágeno neutralizado é necessário. Prepare sempre 1 mL de volume extra de colágeno. O gel do colagénio pode ser usado até 2-3 h após a neutralização se mantido no gelo. - Colha os esferóides enxaguando a cobertura contendo esferóides com 5 mL de PBS. Colete a solução spheroid-suspendida em um tubo cônico de 50 mL. Volte a enxaguar a tampa com 5 mL de PBS para obter os esferóides restantes.
Nota: Durante a colheita, observar atentamente para confirmar a existência de esferóides. Para uma inspeção mais visual, transfira aproximadamente 50-100 μl da solução spheroid-suspendida no vidro da corrediça, e verific a forma redonda dos esferoides o microscópio. - Sedimento os esferóides por centrifugação em 282 x g por 5 min. descarte o sobrenadante cuidadosamente sem perturbar os esferóides deixando para trás não mais de 100-200 μL de volume residual.
- Bata delicadamente na parede do tubo de modo que os esferoides estejam suspensos livremente na solução residual restante de 100-200 μl.
- Adicionar ECGM-MV2 contendo 5% FBS e solução de metilcelulose 40% para o tubo contendo esferóide. O volume adicionado é determinado com base em aproximadamente 100 spheroids/mL. Misture suavemente a suspensão esferoidal introduzindo pipetagem com uma ponta de pipeta de 1 mL sem corte.
Nota: A solução de metilcelulose é amplamente utilizada como um agente suspendendo que não permite que os esferóides sequem. A concentração de FBS deve ser de 5%. A concentração mais elevada de FBS causa o sprouting anormal devido aos fatores de crescimento excessivos. Menor concentração de FBS não pode manter condições saudáveis para as células. - Misture o spheroid-solução da suspensão e neutralizou-tipo mim gel do colagénio (3 mg/mL) em uma relação 1:1 no gelo. Use uma ponta de pipeta de 1 mL sem corte para evitar a quebra de esferóides.
Nota: 1 ml de esferóides-solução de gel de colágeno suspendendo é necessária para um poço de uma placa de 24 poços. Se possível, faça uma solução de suspensão mista extra. - Se as propriedades angiogênicas de qualquer agente (s) ou produto químico (s) precisarem ser testados, transfira 1 mL da solução de gel de colágeno esferóide-suspendendo em um micro-tubo de 1 mL e adicione agentes (s) ou químicos (s) seguidos por uma mistura suave com uma ponta de pipeta 1mL sem corte.
Nota: O volume do agente e do produto químico pode somar a 200 mL, que dilui o tipo mim concentração do gel do colagénio de 1,5 mg/mL a 1,25 mg/mL, mas não afeta a polimerização do gel do colagénio do tipo I. Adicione o mesmo volume de veículo para os esferóides de controle. - Adicione a solução de gel de colágeno esferóide-suspendendo em poços de uma placa pré-aquecida de 24 poços (0,9 mL/poço) por pipetagem e, em seguida, incubar por 30 min em uma incubadora de cultura celular para polimerização.
Nota: Durante o processo de incorporação do esferóide, não perturbe o gel agitando a placa. - Cubra o gel de colágeno esferóide-suspendendo adicionando 100 μL de ECGM-MV2 contendo 2,5% de FBS com/sem VEGF. Para esferóides ECFC-only, estimular as células com adição exógena de VEGF (concentração final de 50 ng/mL) para formar brotos adequados. Os esferoides de ecfc + MSC não exigem a estimulação exógena por nenhuns fatores de crescimento.
- Coloc a placa em um registrador de pilha tempo real instalado em uma incubadora da cultura de pilha (° c 37 e 5% co2), e focalize aleatòria em 5-10 esferoides (lente objetiva 10x). Monitore a formação sprouting de cada esferoides fluorescência-etiquetados cada 1 h por 24 h sem nenhum distúrbio.
4. quantitate sprouting spheroid
- Importe os arquivos de imagem para o software ImageJ para quantificar o número de brotos e medir o comprimento de cada broto. Para os spheroids da cocultura, ECFCs da etiqueta com tintura fluorescente verde antes de fazer spheroids. Em seguida, medir o número e o comprimento dos brotos manchados com fluorescência verde (Figura suplementar 2). Cinco esferóides selecionados aleatoriamente foram quantificados por grupo experimental.
Nota: Sprouts são estruturas colaborativamente alongadas formadas por vários ECFCs estendendo-se de esferóides. O comprimento do sprout é medido como o comprimento do ponto da origem dos brotos da superfície dos esferoides à ponta dos brotos. - Expresse os valores como médias ± SEM de pelo menos três experimentos independentes. Determine a diferença estatisticamente significante por ANOVA unidirecional para comparações múltiplas ou teste tde Student para comparações pareadas.
Nota: P ≤ 0, 5 é considerado estatisticamente significante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os experimentos de comparação foram realizados usando esferóides de mono-cultura (somente ECFCs) e esferóides de cocultura (ECFCs + MSCs) para examinar se os MSCs desempenham um papel considerável na angiogênese mediada pelo ECFCs. A formação de sprouting de cada esferóide foi monitorada por 24 h por um registrador de pilha tempo real que pudesse capturar a progressão do sprouting angiogênico dos spheroids. O potencial angiogênico foi quantificado contando o número de brotos e medindo o comprimento acumulado de brotos gerados a partir de esferóides individuais. Foram analisados cinco esferóides selecionados aleatoriamente por grupo experimental. Para os esferóides ECFCs + MSCs, o número de brotos e o comprimento acumulado do broto foram significativamente mais elevados em comparação com os esferóides de apenas ECFCs em todos os tempos-pontos (Figura 1A-C). O número e o comprimento do sprout de esferóides de ECFCs + MSCs aumentaram continuamente por 12 h, mas o número e o comprimento dos esferóides de ECFCs aumentaram por 6 h e não foram alterados em pontos de tempo posteriores (Figura 1B, C). Além disso, brotos formados por esferóides ECFCs + MSCs foram mais grossos e mais duráveis do que aqueles formados por esferóides ECFCs-apenas com/sem tratamento com VEGF (Figura 1A, e vídeo suplementar 1a, B, D). Esferoides somente MSCS não formam brotos, mas mostraram migração individual de MSCS fora dos esferóides (Figura 1A e vídeo suplementar 1C). Estes resultados demonstram a contribuição significativa de MSCs, precursores do pericyte, à angiogênese celular de ECFCs. As MSCs são conhecidas por secretar vários fatores de crescimento29 que podem estimular ECFCs a formar brotos e estruturas tubulares.
ECFCs foram rotulados com corante verde-fluorescente e MSCs foram rotulados com corante vermelho-fluorescente antes de combinar para gerar esferóides ECFCs + MSCs. Juntamente com a gravação em tempo real, esta técnica de rotulagem de fluorescência de células ao vivo pode rastrear os movimentos celulares de ECFCs e MSCs durante a formação de brotos. A imagem latente fluorescente mostrou que as estruturas ECFCs-negociadas do sprout estiveram cobertas com os MSCs (Figura 2 e vídeo suplementar 2). Isto sugere que a função combinada de MSCs como pilhas perivascular durante a formação do sprout, que realça a estabilidade e a durabilidade do sprout pela Associação apertada entre duas pilhas vasculares.
O sistema recentemente desenvolvido do ensaio do esferóide da cocultura foi testado com o bevacizumab, um inibidor FDA-approved da angiogênese, para verificar seu potencial para telar drogas antiangiogênicas. Os esferóides ECFCs + MSCs pré-tratados com bevacizumab mostraram diminuição do número de brotos e comprimento acumulado do broto de forma dose-dependente em comparação com os esferóides de controle ECFCs + MSCs (Figura 3a, B). Em experimentos paralelos, os esferóides apenas com ECFCs pré-tratados com bevacizumab seguido de estimulação com VEGF (50 ng/mL) também mostraram diminuição do número de brotos VEGF-induzidos e comprimento acumulado do broto de forma dose-dependente (Figura 3C, D) . Da nota, os valores do IC50 de bevacizumab para inibir o comprimento acumulado do sprout em esferóides de ecfcs + de MSCS eram 46 vezes maiores do que aquele em esferoides do ecfcs-somente (tabela 1). Este resultado implica fortemente que uma maior concentração é necessária para inibir a formação vascular fisiologicamente relevante por ECFCs e MSCs em comparação com a concentração necessária para inibir apenas a formação vascular mediada pela CE.
Em seguida, um modelo do rato do tumor do xenograft foi executado com o tratamento do bevacizumab para revelar que o sistema esferóide fornece dados previsíveis que correlacionar com in vivo a concentração do plasma eficaz. A linha de pilha Human-derivada do glioblastoma U87MG-Red-Fluc foi injetada por via subcutânea aos ratos imune-deficientes. Após a confirmação da formação tumoral em 1 semana, os camundongos foram divididos aleatoriamente em 3 grupos que receberam diferentes tratamentos: controle (0 mg/kg), dose baixa (1 mg/kg) e dose alta (30 mg/kg). O crescimento tumoral foi significativamente inibido no grupo tratado com 30 mg/kg em relação ao grupo controle (complementar Figura 3A). O grupo tratado com 1 mg/kg apresentou tendência para diminuição tumoral, mas não houve diferença estatística em relação ao grupo controle. A concentração plasmática de camundongo em 3 semanas de tratamento com bevacizumab foi 568.0 ± 40.62 μg/mL a 30 mg/kg e 38,1 ± 0,72 μg/mL a 1 mg/kg (Figura complementar 3B). Notavelmente, a concentração plasmática de bevacizumab com inibição efetiva (568.0 ± 40.62 μg/mL a 30 mg/kg para tratamento de 3 semanas) foi atingida de perto por esferóides ECFCs + MSCs (1261.5 ± 214.49 μg/mL), mas não apenas esferóides de ECFCs (27.0 ± 9.97 μg/mL). Assim, o sistema do ensaio da angiogênese esferóide de ecfcs + MSCS pode ser considerado como um sistema apropriado do ensaio para prever a concentração eficaz do plasma adiantado de experiências animais.
Figura 1: formação de Sprout de spheroids de ecfcs-only, somente MSCS e ecfcs + MSCS. (A) imagens representativas de formação de brotos de esferóides somente ecfcs, somente MSCS e ecfcs + MSC embutidos em gel de colágeno tipo I em 0, 6, 12, 18 e 24 h (barra de escala = 100 μm). (B) gráfico quantitativo de número de brotos formado a partir de esferóides ecfcs e ecfcs + MSCS (média ± sem, n = 3). (C) gráfico quantitativo do comprimento acumulado do broto formado a partir de esferóides ecfcs e ecfcs + MSCS (média ± sem, n = 3). * indica diferença significativa entre apenas ecfcs e ecfcs + MSCS esferoides ao mesmo tempo-pontos (p ≤ 0, 5). # indica diferença significativa entre os grupos indicados por um colchete (p ≤ 0, 5). Este número foi modificado a partir de uma pubicação anterior30. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: localização de ECFCs e MSCs em estruturas germinais. As imagens representativas que mostram posições de dois tipos da pilha em estruturas do sprout após 24 h. ecfcs e MSCS foram etiquetadas cDNAs com PKH67 (verde) e PKH26 (vermelho), respectivamente, e executaram o ensaio do angiogênese do esferóide de ecfcs + MSCS 3D. As setas mostram que as MSCs foram cobertas com estruturas de brotos mediadas por ECFCs (barra de escala = 100 μm). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: efeito inibitório do bevacizumab na formação de brotos de esferóides ecfcs + MSCs e ecfcs. Ecfcs + MSCS e ecfcs-somente os esferoides foram tratados com o bevacizumab, e a formação do sprout foi monitorada para 24 h. (B) gráfico quantitativo do comprimento acumulado do sprout dos esferoides de ecfcs + de MSCS tratados com o bevacizumab (média ± sem, n = 3). (C) gráfico quantitativo do número de brotos de esferóides com ECFCs estimulados pelo VEGF tratados com bevacizumab (média ± sem, n = 3). (D) gráfico quantitativo do comprimento acumulado do broto de esferóides apenas com ECFCs estimulados pelo VEGF tratados com bevacizumab (média ± sem, n = 3). * indica diferença significativa do grupo controle (barra branca) (p ≤ 0, 5). # indica diferença significativa do grupo tratado com VEGF (barra preta) (p ≤ 0, 5). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tempo h |
IC50 (μg/ml) de Avastin | valor de p | |
| Esferóide somente ecfcs | Ecfcs + MSCS esferóide | ||
| 6 | 94,62 ± 38,53 | 3058,21 ± 373,31 | 0, 3 |
| 12 | 58,61 ± 17,80 | 2006 ± 484,73 | 0, 15 |
| 18 | 83,38 ± 54,54 | 1509,51 ± 483,88 | 0, 42 |
| 24 | 27, 4 ± 9,97 | 1261,51 ± 214,49 | 0, 45 |
Tabela 1: IC50 valores de bevacizumab para a inibição do comprimento acumulado do sprout em ambos os ECFCs ou Ecfcs + MSCS spheroids. Os esferoides de ecfcs-somente foram tratados com o bevacizumab seguido pela estimulação com VEGF (50 ng/ml), que é exigido para a formação do sprout dos esferoides do ecfcs-somente. Os esferoides de ecfcs + MSCS foram tratados com o bevacizumab sem estimulação de VEGF. Ambos os esferoides encaixaram no tipo mim gel do colagénio, e a formação do sprout de cada esferóide foi observada para 24 h usando um registrador de pilha tempo real. Os dados são representados como média ± SEM (n = 3).
Complementar Figura 1: Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 2: Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 3: Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo suplementar 1a: Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo suplementar 1b: Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo suplementar 1C: Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo suplementar 1D: Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Vídeo suplementar 2: Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Clique com o botão direito do mouse para baixar.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O presente estudo apresenta um melhor sistema de ensaio de angiogênese in vitro utilizando esferóides de cocultura formados por dois progenitores de células vasculares humanas, ecfcs e MSCS. o sistema esferóide da co-cultura pode imitar in vivo a formação vascular do sprout, que é realizado pela interação e incorporação entre células endoteliais e pericytes. Comparado a outros ensaios in vitro de angiogênese que refletem apenas a angiogênese mediada pelo ECs, este sistema de ensaio de cocultura é mais representativo da cascata multipasso da angiogênese fisiológica, incluindo interação celular, brotação, formação de tubos, e maturação dos vasos. Este sistema recém-estabelecido do ensaio igualmente assemelha-se ao microambiente extracelular in vivo semeando esferoides no tipo gel do colagénio de I. Nós sugerimos que o sistema do ensaio da angiogênese do esferóide da cocultura 3D seja de confiança, repetível, facilmente quantifiable, e o mais importante fisiologicamente relevante.
Ao executar o ensaio do esferóide da cocultura, é essencial incorporar esferoides no gel com concentração apropriada de tipo neutralizado mim colagénio e FBS. A melhor concentração final de colágeno tipo I neutralizado é de 1,5 mg/mL, e a percentagem de FBS é de 2,5%. Nas experiências preliminares, as concentrações mais elevadas de colagénio conduziram ao gel duro e dificultaram a qualidade e a quantidade de brotos que originam dos spheroids. As concentrações menores do colagénio renderam o gel macio e frágil que não poderia manter a integridade dos spheroids. Similarmente, umas quantidades mais elevadas de FBS causaram sprouting pletórico dos esferoides a nível básico independentemente da estimulação angiogênica do fator. A concentração inferior de FBS conduziu às condições más das pilhas. Para resultados consistentes e reprodutíveis, um número apropriado de esferóide deve ser incorporado (aproximadamente 50 spheroids/poço). Mais de 50 esferóides/poço poderia levar à proximidade dos esferóides dentro do poço, o que pode anormalmente afetar a qualidade e quantidade de brotos gerados.
É fundamental manter o colágeno tipo I em condições refrigeradas durante a neutralização e etapas de mistura com a suspensão esferoidal porque o colágeno pode coagular à temperatura ambiente, resultando em uma matriz irregular. Ao misturar a suspensão esferoidal com solução de colágeno, recomenda-se usar 1 mL de ponta de pipeta com 3-5 mm de corte no final para fazer buraco largo. Isto permite a manipulação fácil da solução viscoso do colagénio e protege esferoides da ruptura. A agitação da placa após ter incorporado a solução spheroid-suspendida do colagénio poderia perturbar a integridade do gel e resultar na ruptura que pode dificultar a geração normal do sprout.
No ensaio do esferóide da cocultura usando ecfcs e MSCS, a relação 5:1 deve ser mantida. O uso de um número maior de MSCS causa espalhar em torno do esferóide devido ao phenotype migratório de MSCS, que pode afetar a geração ideal do sprout. Um número menor de MSCS é insuficiente para estimular ecfcs sprouting e cobrir os brotos corretamente. Além disso, é essencial verificar as condições das células durante o crescimento. Se a sprouting pobre é observada, recomenda-se usar outra passagens saudáveis das células. Para o melhor resultado, o uso de ECFCs e MSCs na passagem menos de 10 é recomendado fortemente.
Aqui, nós apresentamos um sistema melhorado do ensaio da angiogênese 3D usando os esferoides da cocultura que capturam pròxima a angiogênese in vivo. Comparado com os 2D sistemas da única pilha do ensaio, este sistema do ensaio do esferóide da cocultura reflete umas respostas mais fielmente celulares entre dois tipos vasculares da pilha para dar forma a estruturas tubulares em circunstâncias fisiológicas. No entanto, este sistema permanece supersimplificado em comparação com o complexo processo multipasso da angiogênese in vivo. A geração vascular in vivo geralmente ocorre por meio da interação múltipla de vários outros tipos de células, incluindo pilhas epiteliais, fibroblastos, células imunes e também proteínas de ECM abundantes. Futuras aplicações deste novo sistema incluem a introdução de outros tipos de células e o ECM para refletir mais precisamente a angiogênese fisiológica e/ou patológica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada por uma subvenção (17172MFDS215) do Ministério da segurança alimentar e drogas, a Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) subsídio financiado pelo governo da Coréia (MSIP) (2017R1A2B4005463), e do programa de pesquisa científica básica através da Fundação Nacional de pesquisa da Coréia (NRF) financiada pelo Ministério da educação (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA (1x) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) | Gibco | 21600-010 | PBS (10x) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1x) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
- Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
- Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
- Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
- Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
- Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
- Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
- Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
- Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
- Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
- Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
- Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).
