Summary
Tredimensionell Co-Culture sfäroid angiogenes assay system är utformat för att efterlikna fysiologisk angiogenes. Samkulturspheroids bildas av två humana vaskulära cellprekursorer, ECFCs och MSCs, och inbäddade i kollagen gel. Det nya systemet är effektivt för att utvärdera angiogena modulatorer, och ger mer relevant information till in vivo-studien.
Abstract
Studier inom angiogenes har ökat aggressivt under de senaste decennierna med erkännandet att angiogenes är ett kännetecken för mer än 50 olika sjukdomstillstånd, såsom reumatoid artrit, oculopati, hjärt-kärlsjukdomar , och tumörmetastaser. Under angiogenes läkemedelsutveckling, det är viktigt att använda in vitro-analyssystem med lämpliga celltyper och korrekta villkor för att återspegla fysiologisk angiogenes processen. För att övervinna begränsningar av nuvarande in vitro angiogenesen assay system med främst endotelceller, utvecklade vi en 3-dimensionell (3D) Co-Culture sfäroid groning assay system. Samkulturspheroids producerades av två humana vaskulära cellprekursorer, endoteliala kolonibildande celler (ECFCs) och mesenkymala stamceller (MSCs) med ett förhållande på 5 till 1. ECFCs + MSCs spheroids var inbäddade i typ I kollagen matris för att efterlikna den in vivo extracellulära miljön. En realtid cell Recorder utnyttjades för att kontinuerligt Observera utvecklingen av angiogena groning från spheroids för 24 h. levande cell fluorescerande märkning teknik tillämpades också för att tarmkanalen lokalisering av varje celltyp under spira bildas. Angiogen potential kvantifierades genom att räkna antalet groddar och mäta den kumulativa längden av groddar som genereras från de enskilda spheroids. Fem slumpmässigt utvalda spheroids analyserades per experimentell grupp. Jämförelse experiment visade att ECFCs + MSCs spheroids visade större spira och kumulativ spira längd jämfört med ECFCs-bara spheroids. Bevacizumab, en FDA-godkänd angiogeneshämmare, testades med den nyutvecklade Co-Culture sfäroid assay system för att kontrollera dess potential att avskärma antiangiogena läkemedel. IC50 värde för ecfcs + MSCS spheroids jämfört med ecfcs-bara spheroids var närmare den effektiva plasmakoncentrationen av bevacizumab erhållits från xenograft tumör musmodell. Den nuvarande studien tyder på att 3D ecfcs + MSCS sfäroid angiogenes assay system är relevant för fysiologisk angiogenes, och kan förutsäga en effektiv plasmakoncentration i förväg av djurförsök.
Introduction
Cirka 500 000 000 personer världen över förväntas dra nytta av angiogenes-modulerande terapi för vaskulär missbildning-associerade sjukdomar såsom reumatoid artrit, oculopathy, hjärt-kärlsjukdomar, och tumörmetastaser1. Således har utvecklingen av läkemedel som styr angiogenes blivit ett viktigt forskningsområde inom läkemedelsindustrin. Under läkemedelsutveckling, in vivo Djurstudier är nödvändigt att undersöka effekterna av läkemedelskandidater på fysiologiska funktioner och systemiska interaktioner mellan organ. Men etiska och kostnadsfrågor har ökat oron när det gäller djurförsök2. Därför behövs förbättrade in vitro-analyssystem för att få mer exakta och förutsägbara data som leder till bättre beslutsfattande innan djurförsök. Nuvarande in vitro angiogeneshassays mäter vanligtvis proliferation, invasion, migration, eller tubulär struktur bildning av endotelceller (ECs) seedade i tvådimensionella (2D) kultur tallrikar3. Dessa 2D angiogenes analyser är snabba, enkla, kvantitativa och kostnadseffektiva, och har avsevärt bidragit till upptäckten av angiogenes-modulerande läkemedel. Flera frågor återstår dock att förbättra.
Sådana 2D in vitro-analyssystem kan inte återspegla komplexa flerstegshändelser av angiogenes som uppträder i in vivo fysiologiska tillstånd, vilket leder till felaktiga resultat som orsakar avvikelser mellan in vitro-analysdata och resultat från kliniska prövningar4. 2D odlingsförhållanden inducerar också förändringen av cellulära fenotyper. Till exempel, efter spridning i 2D kultur plattor, ECs har en svag cellulär fenotyp som manifesteras genom minskat uttryck av CD34 och flera signaler som reglerar cellulära svar5,6. För att övervinna begränsningarna i 2D-kulturbaserade angiogeneshämmare system, har tredimensionella (3D) sfäroid angiogenes analyssystem utvecklats. Sprouting följt av tubulär struktur formation från spheroids bildas av ECs reflektera in vivo Neo-vascularization processer7,8. Sålunda, den 3D sfäroid angiogenes analysen har ansetts vara ett effektivt analyssystem för screening potentiella Pro-eller anti-angiogenes läkemedel.
De flesta 3D sfäroid angiogenes analyser utnyttjar endast ECs, främst mänskliga navel venen endotelceller (HUVECs) eller Human dermal mikrovaskulära endotelceller (HDMECs) att fokusera på cellulär respons av ECs under angiogenes. Emellertid, blod kapillärer består av två celltyper: ECs och pericyter. Att utveckla dubbelriktad interaktion mellan ECs och pericyter är avgörande för korrekt vaskulär integritet och funktion. Flera sjukdomar, såsom ärftlig stroke, diabetesretinopati, och venös missbildning, är förknippade med förändrade pericytbiologi densitet eller minskade pericytbiologi fastsättning till endotelet9. Pericyter är också känd som en viktig del av angiogena processen. Pericyter rekryteras för att stabilisera nybildade fartygs strukturer av ECs. I detta avseende, mono-kultur sfäroid angiogenes analysen inte innehåller pericyter7,10. Därför kan Co-Culture spheroids bildas av ECs och pericyter ge en värdefull metod för att närmare efterlikna fysiologiska angiogena händelser.
Den nuvarande studien syftade till att utveckla en 3D-Co-kultur sfäroid angiogenicitetsanalys med en kombination av humana endoteliala kolonibildande celler (ecfcs) och mesenkymala stamceller (MSCS) för att närmare reflektera in vivo angiogenes. Co-Culture sfäroid system som en in vitro-representation församling av ett normalt blodkärl fastställdes först av Korff et al. i 200111. De kombinerade huvecs och mänskliga navel Strängs glatta muskelceller (husmcs), och visade att samodling av två mogna vaskulära celler minskade groning potential. Mogna ECs (huvecs) är kända för att successivt förlora sin förmåga att förgöra och differentiera, vilket negativt påverkar deras angiogenes svar12,13. Mogna perivaskulära celler (husmcs) kan orsaka endotelceller cell inaktivering genom upphävande av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) lyhördhet11. Den största skillnaden mellan korffs och vår co-Culture sfäroid system är de celltyper som används. Vi tillämpade två vaskulära prekursorer, ECFCs och MSCs, att etablera en ordentlig angiogenes assay system för att avskärma och undersöka Pro-eller-antiangiogena medel. ECFCs är föregångaren till ECs. ECFCs har robust spridnings kapacitet jämfört med mature ECs14, vilket gör det möjligt att övervinna begränsningen av ECS. Ecfcs bidrar till ny fartygs bildning i många postnatal patofysiologiska tillstånd15,16,17. MSCS är pluripotenta stamceller som har förmågan att differentiera till pericyter, vilket bidrar till angiogenes18,19.
I tidigare rapporter, ecfcs och MSCS visade synergistiska effekter på in vitro-rör bildas20, in vivo Neo-vascularization21,22, och förbättrad reperfusion av ischemiska vävnader23,24. I den nuvarande studien användes ECFCs och MSCs för att bilda samkulturspheroider och bäddas in i typ I kollagen gel för att återspegla en in vivo 3D-miljö. Kollagen betraktas som en viktig beståndsdel i den extracellulära matrisen (ECM) kring ECs25. ECM spelar en kritisk roll i regleringen av cellens beteende26. Det analysprotokoll som föreslås här kan enkelt och snabbt utföras inom två dagar med hjälp av vanliga laboratorietekniker. För effektiv cell spårning under groning-processen kan varje celltyp fluorescerande märkas och övervakas med hjälp av en realtids cells inspelare. Den nyinrättade 3D Co-Culture sfäroid angiogenes assay system är utformat för att öka känsligheten för att utvärdera potentiella angiogena modulatorer och att ge förutsägbar information i förväg i in vivo studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humana ECFCs isolerades från mänskligt perifert blod enligt beskrivningen i en tidigare rapport27. Kortfattat, mononukleära cell skiktet var separerad från hela blodet med hjälp av Ficoll-Paque plus, och odlade i rätt medium tills endothelial-liknande kolonier dök upp. Kolonier samlades in och ECFCs isolerades med hjälp av CD31-belagda magnetiska pärlor. MSCs isolerades från den anhängare mononukleära cellen (MNC) fraktion av Human Adult benmärg. Studieprotokollet godkändes av den institutionella prövnings nämnden för Duksung Women ' s University (IRB nr 2017-002-01).
1. cell odling
-
Förbereda ECFCs och MSCs medium och Coat tallrikar
- Förbered endotelceller tillväxtmedium MV2 (ECGM-MV2, utom hydrokortison) kompletteras med 10% foster bovint serum (FBS) och 1% glutamin-penicillin-streptomycin (GPS).
- Förbered mesenkymala stamcells tillväxtmedium-2 (MSCGM-2) som innehåller 10% FBS och 1% GPS.
- För ECFC-kulturen, belägga cell odlings plattorna med 1% gelatinlösning. För att bereda 1% gelatin lösning, lös 1 g gelation pulver i 500 mL PBS med magnetomröraren, och sterilisera med autoklav. Plattorna kan beläggas med 3 mL/60 mm, 5 mL/100 mm, eller 15 mL/150 mm 1% gelatinlösning. Inkubera belagda plattor i 15 min i en cellkultur inkubator (37 ° c och 5% CO2). Efter då, ta bort resterande 1% gelatin lösning genom aspiration och tvätta de belagda plattorna en gång med PBS.
-
Växande ECFCs och MSCs
- Utsäde 1 x 106 ecfcs på 1% gelatin-belagda 150 mm plattor, och växa med ecgm-mv2 (10% FBS, 1% GPS) i en cellkultur inkubator (37 ° c och 5% Co2) till 80-90% confluency. Använd ECFCs vid passage nummer 7-10 för att få konsekventa resultat.
- Utsäde 1 x 106 MSCS på icke-belagda 150 mm plattor, och växa med hjälp av mscgm-2 i en cellkultur inkubator (37 ° c och 5% Co2) till 80-90% confluency. Använd MSCs vid passage nummer 7-10 för att få konsekventa resultat.
2. beredning av 1,2% w/v metylcellulosa lösning
- Mät 6 g metylcellulosa i en 500 mL glas flaska och sterilisera i en autoklav.
- Värm ECGM-MV2 (utan FBS och GPS) vid 60 ° c i 20 min, och tillsätt 250 mL uppvärmd ECGM-MV2 till steriliserat metylcellulosa-pulver. För att bibehålla sterila förhållanden, utföra processen inuti flödes kåpan.
- Tillsätt en steriliserad magnetisk rör stång och blanda lösningen i 20 minuter på magnetomröraren tills metylcellulosan är grundligt fuktad och jämnt dispergerad utan klumpar. Tillsätt 250 mL kallt (4 ° c) ECGM-MV2 (utan FBS och GPS) under det sterila tillståndet och blanda i ytterligare 10 minuter på magnetomröraren. Sedan kyla lösningen i ett kylskåp (4 ° c) över natten.
Anmärkning: Metylcellulosa är en kolhydrat polymer som löses upp väl i svala temperaturer på grund av svullnad och efterföljande hydrering. - Nästa dag, alikvot lösningen i en 50 mL tub och centrifugera vid 5 000 x g för 3 h vid 4 ° c. Ta den klara viskösa supernatanten lösningen och förvara vid 4 ° c tills den används i upp till 3-6 månader.
Anmärkning: Sedimentet kan innehålla kvarvarande cellulosafibrer, så försiktigt ta supernatanten lösning lämnar efter minst 5 mL volym. Denna volym kan justeras enligt experimentella förhållanden.
3. generering och inbäddning av endast ECFCs, MSCs-Only och ECFCs-MSCs spheroids
Dag 1
- Förbereda ECFCs och MSCs cellsuspension
- Tvätta 80-90% konfluenta ecfcs och MSCS genom att tillsätta fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan kalcium och magnesium, och aspirera.
- För att lossa ECFCs och MSCs från odlingsplattan, inkubera dem med 0,05% trypsin-EDTA under 3 min och 5 min i en cell odlings inkubator (37 ° c och 5% CO2) i en cell odlings inkubator.
- Inaktivera trypsin genom att lägga till DMEM medium som innehåller 10% FBS och 1% GPS. Pipettera cellerna uppåt och nedåt för att skapa en enda cellsuspension.
- Sediment cellerna genom centrifugering vid 282 x g för 5 min vid RT.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna i respektive medium.
- Märkning ECFCs och MSCs med fluorescerande färgämne
Anmärkning: Utför cellmembran märkning av ECFCs med PKH67 (grön) och MSCs med PKH26 (röd) fluorescerande färgämne enligt tillverkarens anvisningar med något modifieringar enligt följande.- Tvätta cellerna två gånger med serumfritt medium för att ta bort FBS.
Anmärkning: Proteiner och lipider i FBS minskar den effektiva färg koncentrationen för märknings celler genom bindning. - Räkna ECFCs och MSCs med hjälp av en hemocytometern under Mikroskop, och överföra 3 x 106 ecfcs och 2 x 106 MSCS i 2 ml mikro-rör.
Anmärkning: Dessa är de optimala cell tätheter för märknings celler med färgämnen. Användning av ett stort antal celler orsakar dålig och heterogen färgning, medan användning av för få celler ger dåliga celler återhämtning. - Centrifugera rören vid 100 x g i 5 minuter vid RT för att erhålla en cellpellet. Sug försiktigt upp supernatanten och lämna inte mer än 15-25 μL av restvolymen.
- Re-suspendera ECFCs och MSCs i 250 μL spädningsvätska C från Dye Kit. Pipettera försiktigt cellsuspensionen för att säkerställa fullständig dispersion.
Anmärkning: Spädningsvätska C är ett fysiologiskt salt, och kan minska Färgnings effektiviteten av färgämne genom att bilda miceller. Därför, låt inte cellerna stå i spädningsvätska C för länge, och inte Vortex rören. - Bered infärgnings lösningen för ECFCs genom att tillsätta 5 μL PKH67 till 250 μL spädningsvätska C (slutkoncentration av 20 μM) och för MSCs genom tillsats av 3 μL PKH26 till 250 μL spädningsvätska C (slutlig koncentration på 12 μM).
Anmärkning: De slutliga färgämnes koncentrationerna skiljer sig från tillverkarens rekommendationer. Hög koncentration skulle leda till cell klumpar och cell toxicitet. Låg koncentration skulle inte räcka för färgning. - Tillsätt 250 μL ECFCs-cellsuspension till 250 μL PKH67 Dye-lösning, och 250 μL MSCs till 250 μL PKH26 Dye-lösning. Blanda omedelbart cellerna med färgämnen genom att Pipettera upp och ner och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. För bättre resultat, täck röret med aluminiumfolie och placera på en shaker för att säkerställa tillräcklig blandning under färgning.
- Stoppa infärgningsprocessen genom att tillsätta 0,5 mL FBS till den färgade cellsuspensionen, och sedan Inkubera i 1 min för att tillåta FBS att binda överflödigt obundna färgämne. Sediment de färgade cellerna genom centrifugering på 100 x g i 5 min.
Anmärkning: ECFCs och MSCs pellets är ljusgula och rosa, respektive, efter färgning. - Ta försiktigt bort supernatanten och tvätta cellerna två gånger med komplett medium för att avlägsna överflödigt färgämne. Centrifugera rören vid 100 x g i 5 min och återsuspendera pelleten i 2 ml av varje komplett medium.
- Tvätta cellerna två gånger med serumfritt medium för att ta bort FBS.
- Generera ECFC, MSC eller ECFC + MSC spheroids
Anmärkning: Applicera hängande droppe teknik för att generera spheroids som beskrivits tidigare28. Stegen för beredning av spheroids ges nedan.- Räkna de färgade ECFCs och MSCs.
- Suspendera färgade ECFCs, MSCs eller ECFCs + MSCs i ECGM-MV2 innehållande 20% metylcellulosa lösning och 5% FBS. Bered vid en celltäthet av 4 x 104 celler/ml för ECFCs eller MSCS (25 μl cellsuspension innehåller 1 000 celler). För två cellsuspension av ECFCs och MSCs, Förbered vid en celltäthet av 2 x 104 celler/ml ecfcs och 0,4 x 104 cell/ml MSCS (25 μl innehåller 500 ecfcs och 100 MSCS).
Anmärkning: Förhållandet mellan ECFCs och MSCs bör inte överstiga 5:1. Ett större antal MSCs kan leda till överdriven migration och oregelbunden spira morfologi. Ett mindre antal MSCs kan orsaka dålig interaktion mellan celler, vilket ger dålig Sprouting. - Förbered en vätskebalans enhet genom att tillsätta 15 mL PBS i botten av en 150 mm odlings platta.
- Överför cellsuspensionen till den steriliserade polystyren rektangulära behållaren för användning av flerkanalspipett. Skingra cellerna suspensionen jämnt genom pipettering.
- Deponera 25 μL droppar cellsuspension på locket på en 150 mm odlings platta med hjälp av en flerkanalspipett (cirka 100 droppar/locket på 150 mm plattan). Vänd locket över en PBS-fylld hydreringsenhet och inkubera i en cellkultur inkubator för 24 h.
Anmärkning: Metylcellulosa lösning ger en ordentlig viskositet till suspensionen lösningen. När hängande Drop metoden utfördes utan metylcellulosa lösning, droppar var lätt halkade ner när locket var inverterad (kompletterande figur 1). Dessutom, efter övernattning inkubation, var spheroids inte perfekt bildas utan metylcellulosa lösning. Detta resultat indikerar att korrekt viskositet av metylcellulosa lösning är nödvändig för att bilda runda formen av spheroids.
Dag 2
- Embeding spheroids i neutraliserad kollagen gel
- Varma FBS och ECGM-MV2 (utan FBS och GPS) i ett vattenbad (37 ° c). Placera kall metylcellulosa lösning på en arbetsbänk för att få rumstemperatur.
- Placera en 24-brunn tallrik i en cellkultur inkubator (37 ° c) för uppvärmning.
- Skär den spetsiga 1 mL pipettspetsarna 3-5 mm för att aspirera spheroids och trögflytande suspensioner, såsom metylcellulosa-lösning och typ I-kollagen, bekvämt och korrekt.
- Förbered 3 mg/mL neutraliserad typ I kollagen gel på is efter typ I kollagen gel tillverkarens instruktion.
Anmärkning: Neutralisering bör utföras på is för att undvika gelering av kollagen vid rumstemperatur. För en brunn av en 24-brunn plattan, 500 μL av neutraliserat kollagen behövs. Förbered alltid 1 mL extra volym kollagen. Kollagen gel kan användas upp till 2-3 h efter neutralisering om den hålls på is. - Skörda spheroiderna genom att skölja locket som innehåller spheroids med 5 mL PBS. Samla spheroid-suspenderad lösning i ett 50 mL koniskt rör. Skölj locket igen med 5 mL PBS för att få de kvarvarande spheroiderna.
Anmärkning: Under skörden, noga observera att bekräfta förekomsten av spheroids. För mer visuell inspektion, överföra ca 50-100 μL av spheroid-upphängd lösning på glas glaset, och kontrollera den runda formen av sfäroid under mikroskopet. - Sediment spheroids genom centrifugering vid 282 x g i 5 min. Kassera supernatanten försiktigt utan att störa spheroiderna som lämnar kvar högst 100-200 μl restvolym.
- Knacka försiktigt på tubens vägg så att sfäoiderna är fritt upphängda i resterande 100-200 μL kvarvarande lösning.
- Tillsätt ECGM-MV2 innehållande 5% FBS och 40% metylcellulosa lösning till det sfäroid-innehållande röret. Den tillförde volymen bestäms baserat på cirka 100 spheroids/mL. Blanda försiktigt sfäroid suspensionen genom att Pipettera med en trubbig 1 ml pipettspets.
Anmärkning: Metylcellulosa lösning används ofta som en suspendering agent som inte tillåter spheroids till sediment. Koncentrationen av FBS bör vara 5%. Högre FBS koncentration orsakar onormal groning på grund av överdriven tillväxtfaktorer. Lägre FBS koncentration kan inte bibehålla sunda tillstånd för celler. - Blanda spheroid-suspension lösning och neutraliserad-typ I kollagen gel (3 mg/mL) på en 1:1 förhållande på is. Använd en trubbig 1 mL pipett tips för att undvika att bryta spheroids.
Anmärkning: 1 ml av spheroids-uppehåll kollagen gel lösning krävs för en brunn av en 24-brunn tallrik. Gör en extra blandad suspension lösning om möjligt. - Om de angiogena egenskaperna hos någon agent (er) eller kemisk (s) måste testas, överför 1 mL av sfäroid-suspendera kollagen gellösningen i en 1 mL Micro-Tube och tillsätt agent (er) eller kemisk (s) följt av mild blandning med en trubbig 1 ml pipett spets.
Anmärkning: Volymen av agent och kemisk kan summera till 200 mL, som späd typ I kollagen gel koncentrationen från 1,5 mg/mL till 1,25 mg/mL, men påverkar inte typ I kollagen gel polymerisation. Tillsätt samma volym av fordonet till kontrollen spheroids. - Tillsätt spheroid-uppehåll kollagen gel lösning i brunnar av en förvärmda 24-brunn plattan (0,9 mL/brunn) genom pipettering, och sedan Inkubera i 30 min i en cellkultur inkubator för polymerisation.
Anmärkning: Under sfäroid inbäddnings processen, stör inte gelen genom att agitera plattan. - Täck sfäroid-suspendera kollagen gel genom att tillsätta 100 μL av ECGM-MV2 som innehåller 2,5% FBS med/utan VEGF. För ECFC-bara spheroids, stimulera cellerna med EXOGEN tillsats av VEGF (slutlig koncentration av 50 ng/mL) för att bilda ordentliga groddar. ECFC + MSC spheroids inte kräver exogena stimulering av några tillväxtfaktorer.
- Placera plattan i en realtid cell brännaren installeras i en cellkultur inkubator (37 ° c och 5% CO2), och slumpmässigt fokusera på 5-10 spheroids (10X objektiv). Övervaka groning bildandet av varje Fluorescence-märkta spheroids varje 1 h för 24 h utan några störningar.
4. kvantitera spheroid sprouting
- Importera bildfiler till ImageJ programvara för att kvantifiera antalet groddar och mäta längden på varje spira. För co-Culture spheroids, etikett ECFCs med grön fluorescerande färg innan du gör spheroids. Mät sedan antalet och längden på groddar färgade med grön fluorescens (kompletterande figur 2). Fem slumpmässigt utvalda spheroids kvantifierades per experimentell grupp.
Anmärkning: Groddar är samarbeta långsträckta strukturer som bildas av flera ECFCs sträcker sig ur spheroids. Spira längd mäts som längden från den punkt av groddar ursprung från ytan av spheroids till spetsen av groddar. - Uttrycka värdena som medel ± SEM av åtminstone tre oberoende experiment. Bestäm den statistiskt signifikanta skillnaden med enkelriktad ANOVA för multipla jämförelser eller Students t-test för ihopparade jämförelser.
Anmärkning: P ≤ 0,05 anses statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Jämförelse experiment utfördes med hjälp av mono-kultur spheroids (ECFCs-Only) och co-Culture spheroids (ECFCs + MSCs) att undersöka om MSCs spelar en betydande roll i ECFCs-medierad angiogenes. Groning bildas från varje sfäroid övervakades för 24 h av en realtid cell Recorder som skulle kunna fånga utvecklingen av angiogena groning från spheroids. Angiogen potential kvantifierades genom att räkna antalet groddar och mäta den kumulativa längden av groddar som genereras från enskilda spheroids. Fem slumpmässigt utvalda spheroids per experimentell grupp analyserades. För ECFCs + MSCs-spheroids var antalet groddar och den kumulativa GRO längden betydligt högre än för ecfcs-endast spheroids vid alla tidpunkter (figur 1a-C). Sprout antal och längd av ECFCs + MSCs spheroids ökat kontinuerligt för 12 h, men antalet och längden av ECFCs-endast spheroids ökade för 6 h och inte ändras vid senare tidpunkter (figur 1B, C). Dessutom groddar bildas av ECFCs + MSCs spheroids var tjockare och mer hållbara än de som bildas av ECFCs-bara spheroids med/utan VEGF behandling (figur 1A, och kompletterande video 1a, B, D). MSCs-endast spheroids inte bildas groddar men visade individuell migration av MSCs utanför spheroids (figur 1A och kompletterande video 1c). Dessa resultat visar på betydande bidrag av MSCS, pericytbiologi prekursorer, till cellulära angiogenes av ecfcs. MSCs är kända för att utsöndra olika tillväxtfaktorer29 som kan stimulera ECFCs att bilda groddar och rörformiga strukturer.
ECFCs var märkta med grön-fluorescerande färgämne och MSCs var märkta med röd-fluorescerande färg innan kombinera för att generera ECFCs + MSCs spheroids. Tillsammans med realtidsinspelning kan denna märkning av levande cellfluorescens-teknik spåra cellulära rörelser av ECFCs och MSCs under spira formation. Fluorescerande avbildning visade att ECFCs-medierade GRO strukturer täcktes med MSCs (figur 2 och kompletterande video 2). Detta tyder på att kombinerade MSCs fungerar som perivaskulära celler under spira bildas, som förbättrar spira stabilitet och hållbarhet genom den snäva Association mellan två vaskulära celler.
Den nyutvecklade Co-Culture sfäroid assay system testades med bevacizumab, en FDA-godkänd angiogeneshämmare, för att kontrollera dess potential att avskärma antiangiogena läkemedel. Ecfcs + MSCS spheroids som förbehandlats med bevacizumab uppvisade minskat GRO-antal och kumulativ GRO-längd på ett dosberoende sätt jämfört med kontroll ecfcs + MSCS spheroids (figur 3a, B). I parallella experiment uppvisade ecfcs-endast spheroids som förbehandlats med bevacizumab följt av stimulering med VEGF (50 ng/ml) också minskat VEGF-inducerad GRO-antal och kumulativ spira längd på ett dosberoende sätt (figur 3C, D) . Observera att IC50 -värdena för bevacizumab för att hämma den kumulativa spira längden i ecfcs + MSCS spheroids var 46 gånger större än i ecfcs-endast spheroids (tabell 1). Detta resultat innebär starkt att högre koncentration behövs för att hämma fysiologiskt relevant vaskulär bildning av ECFCs och MSCs jämfört med den koncentration som behövs för att hämma endast EG-medierad vaskulär bildning.
Nästa, en xenograft tumör musmodell utfördes med bevacizumab behandling för att avslöja vilket sfäroid systemet ger förutsägbara data korrelera med in vivo effektiv plasmakoncentration. Mänsklig-härledd glioblastoma U87MG-röd-FLuc cell lina var subkutant injicerat till immun-brist musen. Efter att ha bekräftat tumör bildning vid 1 vecka, möss delades slumpmässigt in i 3 grupper som fick olika behandlingar: kontroll (0 mg/kg), låg dos (1 mg/kg), och hög dos (30 mg/kg). Tumörtillväxt hämmade signifikant i den 30 mg/kg-behandlade gruppen jämfört med kontrollgruppen (kompletterande figur 3A). Den 1 mg/kg-behandlade gruppen visade en tendens till tumör minskning, men det fanns ingen statistisk skillnad jämfört med kontrollgruppen. Plasmakoncentrationen av mus vid 3 veckors behandling med bevacizumab var 568.0 ± 40.62 μg/mL vid 30 mg/kg och 38,1 ± 0,72 μg/mL vid 1 mg/kg (tilläggs figur 3b). Plasmakoncentrationen av bevacizumab som visar en effektiv hämning (568.0 ± 40.62 μg/mL vid 30 mg/kg för 3 veckors behandling) uppnåddes i synnerhet av ECFCs + MSCs spheroids (1261.5 ± 214.49 μg/mL) men inte enbart spheroids med ECFCs (27,0 ± 9.97 μg/mL). Sålunda, den ecfcs + MSCS sfäroid angiogenes assay system kan betraktas som ett lämpligt analyssystem för att förutsäga effektiv plasmakoncentration i förväg av djurförsök.
Figur 1: Sprout-bildning från endast ECFCs-, MSCS-och ecfcs + MSCS spheroids. A) representativa bilder av spira från endast ecfcs-, MSCS-och ecfcs + MSC-spheroids inbäddade I typ i-kollagen-gel vid 0, 6, 12, 18 och 24 h (skalbar = 100 μm). B) kvantitativ kurva över GRO-talet som bildas från endast ecfcs och ecfcs + MSCS spheroids (medelvärde ± SEM, n = 3). C) kvantitativ kurva över ackumulerad spira som bildas från endast ecfcs och ecfcs + MSCS spheroids (medelvärde ± SEM, n = 3). * indikerar signifikant skillnad mellan ECFCs-Only och ECFCs + MSCs spheroids vid samma tidpunkter (p ≤ 0,05). # indikerar signifikant skillnad mellan grupper som indikeras med en hakparentes (p ≤ 0,05). Denna siffra har modifierats från en tidigare pubication30. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: lokalisering av ECFCs och MSCs i GRO strukturer. Representativa bilder som visar platser för två celltyper i spira strukturer efter 24 h. ecfcs och MSCS var överföras märkta med PKH67 (grön) och PKH26 (röd), respektive, och utfört 3D ecfcs + MSCS sfäroid angiogenes assay. Pilar visar att MSCs täcktes med ECFCs-medierade spira strukturer (Scale bar = 100 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: inhiberande effekt av bevacizumab på spira bildning från ecfcs + MSCs och ecfcs-endast spheroids. Ecfcs + MSCS och ecfcs-endast spheroids behandlades med bevacizumab, och gro formation övervakades för 24 h. (B) kvantitativ kurva över ackumulerad spira från ecfcs + MSCS spheroids behandlade med bevacizumab (medelvärde ± SEM, n = 3). C) kvantitativ kurva över GRO-nummer från VEGF-stimulerade ecfcs-endast spheroids som behandlats med bevacizumab (medelvärde ± SEM, n = 3). Dkvantitativ kurva över ackumulerad spira från VEGF-stimulerad ECFCs-endast spheroids som behandlats med bevacizumab (medelvärde ± SEM, n = 3). * indikerar signifikant skillnad från kontrollgrupp (vit stapel) (p ≤ 0,05). # indikerar signifikant skillnad från VEGF-behandlad grupp (svart bar) (p ≤ 0,05). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tid h |
IC50 (μg/ml) av Avastin | p-värde | |
| ECFCs-endast sfäroid | Ecfcs + MSCS sfäroid | ||
| 6 | 94,62 ± 38,53 | 3058,21 ± 373,31 | 0,003 |
| 12 | 58,61 ± 17,80 | 2006 ± 484,73 | 0,015 |
| 18 | 83,38 ± 54,54 | 1509,51 ± 483,88 | 0,042 |
| 24 | 27,04 ± 9,97 | 1261,51 ± 214,49 | 0,0045 |
Tabell 1: IC50 -värden för bevacizumab för hämning av den kumulativa GRO-längden i antingen ecfcs-eller ecfcs + MSCS-spheroids. ECFCs-endast spheroids behandlades med bevacizumab följt av stimulering med VEGF (50 ng/mL), vilket krävs för spira bildning från ECFCs-bara spheroids. ECFCs + MSCs spheroids behandlades med bevacizumab utan VEGF-stimulering. Både spheroids inbäddade i typ I kollagen gel, och spira formation från varje sfäroid observerades för 24 h med hjälp av en realtid cell Recorder. Data representeras som medelvärde ± SEM (n = 3).
Kompletterande figur 1: Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 3: Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1a: Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande Video 1B: Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande video 1c: Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande video 1d: Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Kompletterande video 2: Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuvarande studien införa en förbättrad in vitro angiogenes assay system som utnyttjar Co-Culture spheroids bildas av två mänskliga vaskulär cell progenitorer, ecfcs och MSCS. co-Culture sfäroid system kan efterlikna in vivo vaskulär spira bildas, vilket är åstadkommas genom interaktion och inkorporering mellan endotelceller och pericyter. Jämfört med andra in vitro-analyser av angiogenes som endast återspeglar ECs-medierad angiogenes är detta Co-Culture-analyssystem mer representativt för i flera steg-kaskaden av fysiologisk angiogenes, inklusive cellulär interaktion, Sprouting, rör bildning, och farkostens mogning. Detta nyligen etablerade analyssystem liknar också den in vivo extracellulära mikromiljön genom att seedera spheroids i typ I kollagen gel. Vi föreslår att 3D Co-Culture sfäroid angiogenes assay system är tillförlitlig, repeterbar, lätt kvantifierbar, och viktigast fysiologiskt relevant.
När du utför den Co-Culture sfäroid analysen, är det viktigt att bädda spheroids i gel med lämplig koncentration av neutraliserade typ I kollagen och FBS. Den bästa slutliga koncentrationen av neutraliserat typ I-kollagen är 1,5 mg/mL, och andelen FBS är 2,5%. I de preliminära experimenten resulterade högre koncentrationer av kollagen i styv gel och försvårade kvaliteten och mängden groddar som härstammar från spheroids. Mindre koncentrationer av kollagen gav mjuk och bräcklig gel som inte kunde bibehålla integriteten hos spheroids. På samma sätt orsakade högre mängder FBS plethoric groning från spheroids på basal nivå oberoende av angiogen faktor stimulering. Lägre FBS koncentration ledde till dåliga tillstånd av celler. För konsekventa och reproducerbara resultat, ett korrekt antal sfäroid bör bäddas in (om 50 spheroids/brunn). Mer än 50 spheroids/brunn kunde leda till nära närhet av spheroids inom brunnen, som kan onormalt påverka det kvalitets-och antalet av groddar genererat.
Det är viktigt att bibehålla typ i-kollagen i kylda förhållanden under neutralisering och blandnings steg med sfäroid suspensionen eftersom kollagen kan koagulera vid rumstemperatur, vilket resulterar i en oregelbunden matris. Samtidigt blanda sfäroid suspensionen med kollagen lösning, det rekommenderas att använda 1 ml pipett spets med 3-5 mm skära i slutet för att göra breda hål. Detta möjliggör enkel hantering av den trögflytande kollagen lösningen och skyddar spheroids från bristning. Agitation av plattan efter inbäddning spheroid-suspenderade kollagen lösning kan störa integriteten av gelen och resultera i brott som kan hämma normal spira generation.
I Co-Culture sfäroid-analys med ecfcs och MSCS bör förhållandet 5:1 bibehållas. Användning av ett större antal MSCs orsakar spridning runt sfäroid på grund av den flyttande fenotyp av MSCs, som kan påverka idealisk spira generation. Ett mindre antal MSCS är otillräckligt för att stimulera ecfcs groning och täcka groddar ordentligt. Dessutom är det viktigt att kontrollera cell förhållanden under tillväxt. Om dålig groning observeras, det rekommenderas att använda en annan friska passager av cellerna. För bättre resultat rekommenderas användning av ECFCs och MSCs vid passage mindre än 10 starkt.
Här presenterar vi en förbättrad 3D angiogenes analyssystem med hjälp av co-Culture spheroids att nära fånga in vivo angiogenes. Jämfört med 2D Single cell assay system, denna Co-kultur sfäroid analyssystem återspeglar mer troget cellulära svar mellan två vaskulära celltyper att bilda rörformiga strukturer i fysiologiska förhållanden. Emellertid, detta system är fortfarande förenklad jämfört med den komplexa flera steg process av in vivo angiogenes. Vaskulär generation in vivo uppstår oftast genom flera interaktioner mellan olika andra celltyper, inklusive epitelceller, fibroblaster, immunceller, och även riklig ECM proteiner. Framtida tillämpningar av detta nya system inkluderar införande av andra celltyper och ECM för att mer exakt återspegla den fysiologiska och/eller patologiska angiogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av ett bidrag (17172MFDS215) från ministeriet för livsmedels-och läkemedels säkerhet, National Research Foundation of Korea (NRF) Grant finansieras av Koreas regering (MSIP) (2017R1A2B4005463), och det grundläggande forskningsprogrammet genom National Research Foundation of Korea (NRF) finansierat av undervisningsministeriet (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA (1x) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) | Gibco | 21600-010 | PBS (10x) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1x) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International journal of experimental pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
- Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
- Fina, L., et al. Expression of the CD34 gene in vascular endothelial cells. Blood. 75 (12), 2417-2426 (1990).
- Delia, D., et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro. Blood. 81 (4), 1001-1008 (1993).
- Korff, T., Augustin, H. G. Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. Journal of Cell Science. 112 (19), 3249-3258 (1999).
- Korff, T., Augustin, H. G. Integration of endothelial cells in multicellular spheroids prevents apoptosis and induces differentiation. The Journal of cell biology. 143 (5), 1341-1352 (1998).
- Gaengel, K., Genové, G., Armulik, A., Betsholtz, C. Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29 (5), 630-638 (2009).
- Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature Materials. 9 (2), 90-93 (2010).
- Korff, T., Kimmina, S., Martiny-Baron, G., Augustin, H. G. Blood vessel maturation in a 3-dimensional spheroidal coculture model: direct contact with smooth muscle cells regulates endothelial cell quiescence and abrogates VEGF responsiveness. FASEB Journal. 15 (2), 447-457 (2001).
- Gumkowski, F., Kaminska, G., Kaminski, M., Morrissey, L. W., Auerbach, R. Heterogeneity of mouse vascular endothelium. In vitro studies of lymphatic, large blood vessel and microvascular endothelial cells. Journal of Vascular Research. 24 (1-2), 11-23 (1987).
- Asif, A. R., Oellerich, M., Armstrong, V. W., Hecker, M., Cattaruzza, M. T-786C polymorphism of the NOS-3 gene and the endothelial cell response to fluid shear stress-a proteome analysis. Journal of Proteome Research. 8 (6), 3161-3168 (2009).
- Melero-Martin, J. M., et al. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109 (11), 4761-4768 (2007).
- Ingram, D. A., et al. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104 (9), 2752-2760 (2004).
- Murasawa, S., Asahara, T. Endothelial progenitor cells for vasculogenesis. Physiology (Bethesda). 20, 36-42 (2005).
- Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K., Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy. Nature Review Cancer. 2 (11), 826-835 (2002).
- Shi, S., Gronthos, S. Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp. Journal of Bone and Mineral Research. 18 (4), 696-704 (2003).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Lee, H., Kang, K. T. Advanced tube formation assay using human endothelial colony forming cells for in vitro evaluation of angiogenesis. Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 22 (6), 705-712 (2018).
- Melero-Martin, J. M., et al. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circulation Research. 103 (2), 194-202 (2008).
- Kang, K. T., Allen, P., Bischoff, J. Bioengineered human vascular networks transplanted into secondary mice reconnect with the host vasculature and re-establish perfusion. Blood. 118 (25), 6718-6721 (2011).
- Kang, K. T., Coggins, M., Xiao, C., Rosenzweig, A., Bischoff, J. Human vasculogenic cells form functional blood vessels and mitigate adverse remodeling after ischemia reperfusion injury in rats. Angiogenesis. 16 (4), 773-784 (2013).
- Kang, K. T., Lin, R. Z., Kuppermann, D., Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Endothelial colony forming cells and mesenchymal progenitor cells form blood vessels and increase blood flow in ischemic muscle. Scientific Reports. 7 (1), 770 (2017).
- Paupert, J., Sounni, N. E., Noel, A. Lymphangiogenesis in post-natal tissue remodeling: lymphatic endothelial cell connection with its environment. Molecular Aspects of Medicine. 32 (2), 146-158 (2011).
- Lu, P., Weaver, V. M., Werb, Z. The extracellular matrix: a dynamic niche in cancer progression. Journal of Cell Biology. 196 (4), 395-406 (2012).
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods in Enzymology. 445, 303-329 (2008).
- Laib, A. M., et al. Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo. Nature Protocols. 4 (8), 1202-1215 (2009).
- Leuning, D. G., et al. The cytokine secretion profile of mesenchymal stromal cells is determined by surface structure of the microenvironment. Scientific Reports. 8 (1), 7716 (2018).
- Shah, S., Kang, K. T. Two-Cell Spheroid Angiogenesis Assay System Using Both Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 26 (5), 474-480 (2018).
