Summary
Il sistema di analisi dell'angiogenesi sferoide di co-cultura tridimensionale è progettato per imitare l'angiogenesi fisiologica. Gli sferoidi della co-coltura sono formati da due precursori di cellule vascolari umane, ECFC e MSC, e incorporati nel gel di collagene. Il nuovo sistema è efficace per valutare i modulatori angiogenici e fornisce informazioni più rilevanti allo studio in vivo.
Abstract
Gli studi nel campo dell'angiogenesi sono stati aggressivamente in crescita negli ultimi decenni con il riconoscimento che l'angiogenesi è un segno distintivo di più di 50 diverse condizioni patologiche, come l'artrite reumatoide, l'oculopatia, le malattie cardiovascolari e la metastasi tumorale. Durante lo sviluppo del farmaco di angiogenesi, è fondamentale utilizzare sistemi di analisi in vitro con tipi di cellule appropriate e condizioni adeguate per riflettere il processo di angiogenesi fisiologica. Per superare i limiti degli attuali sistemi di analisi dell'angiogenesi in vitro utilizzando principalmente cellule endoteliali, abbiamo sviluppato un sistema di analisi speroide a co-coltura tridimensionale (3D). Gli sferoidi della co-coltura sono stati prodotti da due precursori di cellule vascolari umane, la colonia endoteliale che forma cellule (ECFC) e le cellule staminali mesenchimale (MSC) con un rapporto di 5 a 1. Gli sferoidi ECC-MSC sono stati incorporati nella matrice del collagene di tipo I per imitare l'ambiente extracellulare in vivo. È stato utilizzato un registratore cellulare in tempo reale per osservare continuamente la progressione della germogliazione angiogenica dagli sferoidi per la tecnica di etichettatura fluorescente a cellule vive per trarre la localizzazione di ogni tipo di cellula durante la formazione del germoglio. Il potenziale angiogenico è stato quantificato contando il numero di germogli e misurando la lunghezza cumulativa dei germogli generati dai singoli sferoidi. Sono stati analizzati cinque sferoidi selezionati casualmente per gruppo sperimentale. Gli esperimenti di confronto hanno dimostrato che gli sferoidi ECFC-MSC mostravano un maggior numero di germogli e una lunghezza cumulativa del germoglio rispetto agli sferoidi solo ECFC. Bevacizumab, un inibitore dell'angiogenesi approvato dalla FDA, è stato testato con il sistema di analisi sferoide di co-cultura appena sviluppato per verificare il suo potenziale per lo screening di farmaci anti-angiogenici. Il valore IC50 per gli sferoidi ECFC rispetto agli sferoidi ecFC era più vicino all'effettiva concentrazione plasmatica di bevacizumab ottenuta dal modello murino tumorale xenotrapianto. Il presente studio suggerisce che il sistema di analisi dell'angiogenesi sferoide degli ECC-MSC 3D è rilevante per l'angiogenesi fisiologica e può prevedere un'efficace concentrazione di plasma prima degli esperimenti sugli animali.
Introduction
Si prevede che circa 500 milioni di persone in tutto il mondo beneficeranno della terapia di modulazione angiogenesi per malattie associate alla malformazione vascolare come l'artrite reumatoide, l'oculopatia, le malattie cardiovascolari e la metastasi tumorale1. Così, lo sviluppo di farmaci che controllano l'angiogenesi è diventato un importante settore di ricerca nell'industria farmaceutica. Durante il processo di sviluppo del farmaco, lo studio sugli animali in vivo è necessario per esplorare gli effetti dei farmaci candidati sulle funzioni fisiologiche e sulle interazioni sistemiche tra gli organi. Tuttavia, le questioni etiche e di costo hanno accresciuto le preoccupazioni relative agli esperimenti sugli animali2. Pertanto, sono necessari sistemi di analisi in vitro migliorati per ottenere dati più accurati e prevedibili che portino a un migliore processo decisionale prima degli esperimenti sugli animali. Gli attuali saggi di angiogenesi in vitro di solito misurano la proliferazione, l'invasione, la migrazione o la formazione di strutture tubolari di cellule endoteliali (EC) seminate in piastre di coltura bidimensionali (2D)3. Questi saggi di angiogenesi 2D sono rapidi, semplici, quantitativi e convenienti, e hanno contribuito in modo significativo alla scoperta di farmaci che modulano l'angiogenesi. Restano tuttavia da migliorare diverse questioni.
Tali sistemi di analisi in vitro 2D non possono riflettere complessi eventi a più fasi di angiogenesi che si verifica in condizioni fisiologiche in vivo, portando a risultati imprecisi che causano discrepanze tra i dati di analisi in vitro e gli esiti delle sperimentazioni cliniche4. Le condizioni di coltura 2D inducono anche il cambiamento dei fenotipi cellulari. Ad esempio, dopo la proliferazione in piastre di coltura 2D, gli EC hanno un fenotipo cellulare debole come si manifesta con l'espressione ridotta di CD34 e diversi segnali che governano le risposte cellulari5,6. Per superare i limiti dei sistemi di analisi dell'angiogenesi basata sulla cultura 2D, sono stati sviluppati sistemi di analisi dell'angiogenesi sferoide tridimensionali (3D) (3D). La germogliazione seguita dalla formazione di strutture tubolari da sferoidi formati da EC riflette i processi di neo-vascolarizzazione in vivo7,8. Così, l'angiogenesi sferoide 3D è stato considerato un sistema di analisi efficace per lo screening di potenziali farmaci pro- o anti-angiogenesi.
La maggior parte dei saggi di angiogenesi sferoide 3D utilizzano solo EC, principalmente cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) o cellule endoteliali microvascolari umane (HDMEC) per concentrarsi sulla risposta cellulare delle EC durante l'angiogenesi. Tuttavia, i capillari del sangue sono composti da due tipi di cellule: EC e periciti. L'interazione bidirezionale tra EC e periciti è fondamentale per una corretta integrità e funzione vascolare. Diverse malattie, come l'ictus ereditario, la retinopatia diabetica e la malformazione venosa, sono associate a una densità di periciti alterata o a una diminuzione dell'attaccamento pericito all'endotelio9. I periciti sono anche noti come un elemento chiave del processo angiogenico. I periciti vengono reclutati per stabilizzare le strutture delle navi di nuova formazione da parte dei PEC. A questo proposito, l'angiogenesi degli sferoidi monocoltura non incorpora periciti7,10. Pertanto, gli sferoidi di co-cultura formati da EC e periciti possono fornire un approccio prezioso per imitare più da vicino gli eventi angiogenici fisiologici.
Il presente studio mirava a sviluppare un test di angiogenesi sferida di co-cultura 3D con una combinazione di cellule formanti cellule di colonia endoteliale umana (ECFC) e cellule staminali mesenchiche (MSC) per riflettere più da vicino l'angiogenesi in vivo. Il sistema sferoide di co-cultura come assemblaggio rappresentazione in vitro di un normalevaso sanguigno è stato istituito per la prima volta da Korff et al. Hanno combinato HUVEC e cellule muscolari lisce dell'arteria ombelicale umana (HUSMC), e hanno dimostrato che la co-cultura di due cellule vascolari mature ha diminuito il potenziale di germogliazione. ECs maturi (HUVEC) sono noti per perdere progressivamente la loro capacità di proliferare e differenziare, che influenza negativamente le loro risposte di angiogenesi12,13. Le cellule perivascolari mature (HUSMC) possono causare l'inattivazione delle cellule endoteliali attraverso l'abrogazione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) reattività11. La differenza principale tra Korff e il nostro sistema di sferoide co-culturale è il tipo di cellule utilizzate. Abbiamo applicato due precursori vascolari, ECFC e MSC, per stabilire un sistema di analisi dell'angiogenesi appropriato per lo screening e l'indagine degli agenti pro-o-anti-angiogenici. Gli ECFC sono il precursore degli EC. Gli ECFC hanno una solida capacità di proliferazione rispetto ai14EC maturi, che consentono di superare la limitazione delle EC. Gli ECFC contribuiscono alla formazione di nuovi vasi in molte condizioni patofisiologiche postnatali15,16,17. Le MSC sono cellule staminali pluripotenti che hanno la capacità di differenziarsi in periciti, contribuendo così all'angiogenesi18,19.
Nei rapporti precedenti, ECFC e MSC hanno mostrato effetti sinergici sulla formazione di tubi in vitro20, in vivo neo-vascolarizzazione21,22, e una migliore riperfusione dei tessuti ischemici23,24. Nel presente studio, ECFC e MSC sono stati utilizzati per formare sferoidi di co-cultura e incorporati nel gel di collagene di tipo I per riflettere un ambiente 3D in vivo. Il collagene è considerato come uno dei principali costituenti della matrice extracellulare (ECM) che circonda gli EC25. L'ECM svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del comportamento cellulare26. Il protocollo di analisi qui proposto può essere eseguito facilmente e rapidamente entro due giorni utilizzando tecniche di laboratorio comuni. Per un monitoraggio efficace delle celle durante il processo di germogliazione, ogni tipo di cellula può essere etichettato e monitorato in modo fluorescente utilizzando un registratore di celle in tempo reale. Il nuovo sistema di analisi degli sferoidi di cocultura 3D è progettato per aumentare la sensibilità per valutare i potenziali modulatori angiogenici e per fornire informazioni prevedibili prima dello studio in vivo.
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Protocol
Gli ECFC umani sono stati isolati dal sangue periferico umano come descritto in un precedente rapporto27. In breve, lo strato di cellule mononucleari è stato separato dall'intero sangue usando il Ficoll-Paque Plus, e coltivato nel mezzo corretto fino a quando non sono apparse le colonie endoteliali. Le colonie sono state raccolte e gli ECFC sono stati isolati utilizzando perline magnetiche rivestite CD31. Le MSC sono state isolate dalla frazione di cellula mononucleare aderente (MNC) del midollo osseo adulto umano. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della Duksung Women's University (IRB n. 2017-002-01).
1. Cultura cellulare
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Preparazione di ECFC e MSC medie e piastre di strato
- Preparare il mezzo di crescita delle cellule endoteliali MV2 (ECGM-MV2, ad eccezione dell'idrocortisone) integrato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% glutamina-penicillina-streptomicina (GPS).
- Preparare la crescita delle cellule staminali mesenchymal medio-2 (MSCGM-2) contenente 10% FBS e 1% GPS.
- Per la coltura ECFC, rivestire le piastre di coltura cellulare con soluzione di gelatina dell'1%. Per preparare la soluzione di gelatina dell'1%, sciogliere 1 g di polvere di gelazione in 500 mL di PBS con l'agitatore magnetico e sterilizzare con l'autoclave. Le piastre possono essere rivestite con una soluzione di gelatina di 3 mL/60 mm, 5 mL/100 mm o 15 mL/150 mm di soluzione di gelatina dell'1%. Incubare piastre rivestite per 15 min in un'incubatrice a coltura cellulare (37 e 5% di CO2). Dopo di che, rimuovere la restante soluzione di gelatina dell'1% per aspirazione e lavare le piastre rivestite una volta con PBS.
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ECFC e MSC in crescita
- Seme 1 x 106 ECFC su piastre da 150 mm rivestite di gelatina dell'1% e crescono utilizzando ECGM-MV2 (10% FBS, 1% GPS) in un'incubatrice di coltura cellulare (37oC e 5% CO2) a 80-90% di confluenza. Utilizzare eCFC ai numeri di passaggio 7-10 per ottenere risultati coerenti.
- Seme 1 x 106 MSC su piastre non rivestite da 150 mm e coltivazione utilizzando MSCGM-2 in un'incubatrice a coltura cellulare (37oC e 5% CO2) fino all'80-90% di confluenza. Utilizzare MSC ai numeri di passaggio 7-10 per ottenere risultati coerenti.
2. Preparazione dell'1,2% w/v Soluzione di meticellulosa
- Misurare 6 g di cellulosa metilica in una bottiglia di vetro da 500 mL e sterilizzare in un'autoclave.
- Riscaldare ECGM-MV2 (senza FBS e GPS) a 60 gradi centigradi per 20 minuti e aggiungere 250 mL di ECGM-MV2 riscaldato alla polvere di cellulosa metilica sterilizzata. Per mantenere le condizioni sterili, eseguire il processo all'interno del cofano di flusso.
- Aggiungere una barra di agitazione magnetica sterilizzata e mescolare la soluzione per 20 min sull'agitatore magnetico fino a quando la cellulosa metilico è completamente bagnata e dispersa in modo uniforme senza grumi. Aggiungere 250 mL di freddo (4 gradi centigradi) ECGM-MV2 (senza FBS e GPS) sotto la condizione sterile e mescolare per ulteriori 10 min sulla stirrer magnetica. Quindi, raffreddare la soluzione in frigorifero (4 gradi centigradi) durante la notte.
NOT: La metilcellulosa è un polimero di carboidrati che si scioglie bene a temperature fredde a causa del gonfiore e della successiva idratazione. - Il giorno successivo, aliquota la soluzione in un tubo da 50 mL e centrifuga a 5.000 x g per 3 h a 4 gradi centigradi. Prendere la soluzione supernatante viscosa chiara e conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso fino a 3-6 mesi.
NOT: Il sedimento può contenere fibre residue di cellulosa, quindi prendere delicatamente la soluzione supernatante lasciando dietro di sé almeno 5 mL di volume. Questo volume può essere regolato in base alle condizioni sperimentali.
3. Generazione e incorporamento di solo ECFC, solo MSC e ECC-MSCs Spheroids
Giorno 1
- Preparazione della sospensione delle celle ECC e MSC
- Lavare gli ECFC e le MSC confluenti all'80-90% aggiungendo la salina tamponata da fosfato (PBS) senza calcio e magnesio e aspirato.
- Per staccare gli ECFC e gli MSC dalla piastra di coltura, incubarli rispettivamente con 0,05% trypsin-EDTA per 3 min e 5 min in un'incubatrice di coltura cellulare (37oC e 5% CO2),rispettivamente in un incubatore di colture cellulari.
- Inattivare la trypsin aggiungendo il supporto DMEM contenente 10% FBS e 1% GPS. Pipette le cellule su e giù per creare una sospensione a cella singola.
- Sedimentare le cellule centrifugando a 282 x g per 5 min a RT.
- Rimuovere il supernatante e sospendere nuovamente le cellule nel rispettivo mezzo.
- Etichettatura di CFC e MSC con tintura fluorescente
NOT: Eseguire l'etichettatura della membrana cellulare degli ECFC con PKH67 (verde) e MSC con colorante fluorescente PKH26 (rosso) seguendo le istruzioni del produttore con leggermente modifiche come segue.- Lavare le cellule due volte con il mezzo senza siero per rimuovere FBS.
NOT: Proteine e lipidi in FBS riduce l'efficace concentrazione di tintura per l'etichettatura delle cellule mediante legame. - Contare ECFC e MSC utilizzando un emocitometro al microscopio e trasferire 3 x 106 ECFC e 2 x 106 MSC in microtubi da 2 mL.
NOT: Queste sono le densità cellulari ottimali per l'etichettatura delle cellule con coloranti. L'uso di un gran numero di cellule causa una colorazione scarsa ed eterogenea, mentre l'uso di troppo poche cellule produce un recupero di cellule inadeguate. - Centrifugare i tubi a 100 x g per 5 min a RT per ottenere un pellet cellulare. Aspirare con attenzione il supernatante lasciando non più di 15-25 -L di volume residuo.
- Ri-sospendere ECFC e MSC in 250 - L di Diluent C dal kit di tintura. Pipette pipette le sospensioni cellulari per garantire una completa dispersione.
NOT: Diluente C è un sale fisiologico, e può ridurre l'efficienza di colorazione formando micelle. Pertanto, non lasciare che le cellule stanno in C diluente a lungo, e non vortice i tubi. - Preparare la soluzione di colorazione per gli ECFC aggiungendo da 5 a 250 L di Diluent C (concentrazione finale di 20 M) e per le MSC aggiungendo da 3 a L di PKH26 a 250L di Diluent C (concentrazione finale di 12 M).
NOT: Le concentrazioni finali di tinture sono diverse dalle raccomandazioni del produttore. L'alta concentrazione porterebbe all'agglomerazione delle cellule e alla tossicità cellulare. Bassa concentrazione non sarebbe sufficiente per la colorazione. - Aggiungete 250 di sospensione cellulare ECFC a 250 L di soluzione di tintura PKH67 e 250 l di MSC a 250 -L della soluzione di tintura PKH26. Mescolare immediatamente le cellule con coloranti pipeting su e giù e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Per ottenere risultati migliori, coprire il tubo con un foglio di alluminio e mettere su uno shaker per garantire una miscelazione sufficiente durante la colorazione.
- Interrompere il processo di colorazione aggiungendo 0,5 mL di FBS alla sospensione cellulare macchiata, quindi incubare per 1 min per consentire a FBS di legare coloranti non legati in eccesso. Sedimentare le cellule macchiate centrifugando a 100 x g per 5 min.
NOT: I pellet ECFC e MSC sono rispettivamente di colore giallo chiaro e rosa. - Rimuovere con attenzione il supernatante e lavare le cellule due volte con mezzo completo per rimuovere il tinrito in eccesso. Centrifugare i tubi a 100 x g per 5 min e ri-sospendere il pellet in 2 mL di ogni mezzo completo.
- Lavare le cellule due volte con il mezzo senza siero per rimuovere FBS.
- Generazione di sferoidi ECFC, MSC o ECFC-MSC
NOT: Applicare la tecnica di sporge da appendere per generare sferoidi come descritto in precedenza28. I passaggi per la preparazione degli sferoidi sono riportati di seguito.- Contare gli ECFC e gli MSC macchiati.
- Sospendere gli ECFC macchiati, le MSC o gli ECFC, i CSC in ECGM-MV2 contenenti la soluzione di Metilcellulosa del 20% e il 5% FBS. Preparare a una densità di cellule di 4 x 104 celle/mL per ECFC o MSC (25 -L di sospensione cellulare contiene 1.000 celle). Per la sospensione a due celle di ECFC e MSC, preparare ad una densità di cellule di 2 x 104 celle/mL ECFC e 0,4 x 104 celle/mL MSC (25 -L contiene 500 ECFC e 100 MSC).
NOT: Il rapporto tra ECFC e MSC non deve superare 5:1. Un maggior numero di MSC potrebbe portare a un'eccessiva migrazione e a una morfologia irregolare del germoglio. Un numero minore di MSC potrebbe causare una scarsa interazione tra le cellule, producendo una scarsa germogliazione. - Preparare un'unità di idratazione aggiungendo 15 mL di PBS nel fondo di una piastra di coltura di 150 mm.
- Trasferire la sospensione cellulare nel serbatoio rettangolare in polistirolo sterilizzato per l'uso di pipetta multicanale. Disperdere le sospensioni delle cellule in modo uniforme con il pipeting.
- Depositare 25 gocce di sospensione cellulare sul coperchio di una piastra di coltura da 150 mm utilizzando una pipetta multicanale (circa 100 gocce/copertura della piastra da 150 mm). Invertire il coperchio su un'unità di idratazione riempita di PBS e incubare in un'incubatrice a coltura cellulare per 24 ore.
NOT: La soluzione di metilcellulosa fornisce una viscosità adeguata alla soluzione di sospensione. Quando il metodo di goccia appollaiata è stato eseguito senza soluzione di metilcellulosa, le gocce sono state facilmente scivolate verso il basso quando la copertura è stata invertita (Figura supplementare 1). Inoltre, dopo una notte di incubazione, gli sferoidi non erano perfettamente formati senza soluzione di metilcellulosa. Questo risultato indica che la corretta viscosità mediante soluzione di metilcellulosa è necessaria per formare una forma rotonda degli sferoidi.
Giorno 2
- Incorporamento di sferoidi nel gel di collagene neutralizzato
- Caldo FBS e ECGM-MV2 (senza FBS e GPS) in un bagno d'acqua (37 gradi centigradi). Mettere la soluzione di metilcellulosa fredda su un banco di lavoro per portare a temperatura ambiente.
- Mettere una piastra di 24 pozze in un'incubatrice a coltura cellulare (37 gradi centigradi) per il riscaldamento.
- Tagliare le punte di pipette appuntite da 1 mL da 3-5 mm a sferoidi aspirati e sospensioni viscose, come la soluzione di metilcellulosa e il collagene di tipo I, comodamente e con precisione.
- Preparare 3 mg/mL neutrizzato tipo I gel di collagene sul ghiaccio seguendo le istruzioni del produttore di gel di collagene di tipo I.
NOT: La neutralizzazione deve essere eseguita sul ghiaccio per evitare la gelazione del collagene a temperatura ambiente. Per un pozzo di una piastra di 24 pozze, sono necessari 500 l di collagene neutralizzato. Preparare sempre 1 mL di volume extra di collagene. Gel di collagene può essere utilizzato fino a 2-3 h dopo la neutralizzazione se tenuto sul ghiaccio. - Raccogliere gli sferoidi risciacquando il coperchio contenente sferoidi con 5 mL di PBS. Raccogliere la soluzione sospesa allo speroide in un tubo conico da 50 mL. Risciacquare il coperchio con 5 mL di PBS per ottenere gli sferoidi rimanenti.
NOT: Durante il raccolto, osservare da vicino per confermare l'esistenza di sferoidi. Per una maggiore ispezione visiva, trasferire circa 50-100 l'l di soluzione sospesa allo sferoide sul vetro scorrevole e controllare la forma rotonda degli sferoidi al microscopio. - Spollare gli sferoidi centrifugando a 282 x g per 5 min. Scartare con attenzione il supernatante senza disturbare gli sferoidi lasciando dietro di sé non più di 100-200 luna di volume residuo.
- Toccare delicatamente sulla parete del tubo in modo che gli sferoidi siano liberamente sospesi nella soluzione residua da 100 a 200 .L rimanente.
- Aggiungere al tubo contenente sferoidi e MV2 del 5% FBS e il 40% di metilcellulosa. Il volume aggiunto viene determinato in base a circa 100 sferoidi/mL. Mescolare delicatamente la sospensione sferoide con la pipista con una punta di pipetta smussata da 1 mL.
NOT: La soluzione di metilcellulosa è ampiamente utilizzata come agente di sospensione che non consente asferoidi sedimentari. La concentrazione di FBS dovrebbe essere del 5%. Una maggiore concentrazione di FBS provoca un anormale germoglio a causa di fattori di crescita eccessivi. La minore concentrazione di FBS non può mantenere condizioni di salute per le cellule. - Mescolare la soluzione spheroid-sospensione e neutralizzato-tipo I collagene gel (3 mg/mL) ad un rapporto 1:1 sul ghiaccio. Utilizzare una punta contundente da 1 mL di pipette per evitare la rottura di sferoidi.
NOTA: per un pozzo di 24 pozzelle è necessario 1 mL della soluzione di gel di collagene che sospende gli sferoidi. Rendere una soluzione di sospensione mista supplementare, se possibile. - Se le proprietà angiogeniche di qualsiasi agente o sostanza chimica devono essere testate, trasferire 1 mL della soluzione di gel di collagene sferoide-sospensione in un microtubo da 1 mL e aggiungere agenti o sostanze chimiche seguite da una leggera miscelazione con una punta di pipetta da 1mL smussata.
NOT: Il volume di agente e sostanza chimica può sommare a 200 mL, che diluisce la concentrazione di gel di collagene di tipo I da 1,5 mg/mL a 1,25 mg/mL, ma non influisce sulla polimerizzazione del gel di collagene di tipo I. Aggiungi lo stesso volume di veicolo agli sferoidi di controllo. - Aggiungere la soluzione di gel di collagene sombente sferoide in pozzi di una piastra preriscaldata di 24 pozze (0,9 mL/pozzo) mediante pipettaggio, quindi incubare per 30 min in un'incubatrice di coltura cellulare per la polimerizzazione.
NOT: Durante il processo di incorporamento dello sferoide, non disturbare il gel agitando la piastra. - Coprire il gel di collagene sospendente dello speroide aggiungendo 100 -L di ECGM-MV2 contenente 2,5% FBS con/senza VEGF. Per gli sferoidi eCFC, stimolare le cellule con aggiunta esogena di VEGF (concentrazione finale di 50 ng/mL) per formare germogli adeguati. Gli sferoidi ECFC-MSC non richiedono stimolazione esogena da parte di fattori di crescita.
- Posizionare la piastra in un registratore di celle in tempo reale installato in un'incubatrice a coltura cellulare (37 e 5% di CO2)e concentrarsi in modo casuale su 5-10 sferoidi (obiettivo 10x). Monitorare la formazione di germogli di ogni sferoidi con etichetta a fluorescenza ogni 1 h per 24 h senza alcun disturbo.
4. Quantitate Spheroid Sprouting
- Importare i file di immagine nel software ImageJ per quantificare il numero di germogli e misurare la lunghezza di ogni germoglio. Per gli sferoidi co-culturali, etichetta gli ECFC con coloranti fluorescenti verdi prima di produrre sferoidi. Quindi, misurare il numero e la lunghezza dei germogli macchiati con fluorescenza verde (Figura supplementare 2). Sono stati quantificati cinque sferoidi selezionati casualmente per gruppo sperimentale.
NOT: I germogli sono strutture allungate in modo collaborativo formate da diversi ECFC che si estendono fuori dagli sferoidi. La lunghezza del germoglio viene misurata come la lunghezza dal punto di origine dei germogli dalla superficie degli sferoidi alla punta dei germogli. - Esprimi i valori come mezzi : SEM di almeno tre esperimenti indipendenti. Determinare la differenza statisticamente significativa in base a ANOVA unidirezionale per più confronti o al test tdi Student per i confronti accoppiati.
NOTA: P è considerato statisticamente significativo.
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Representative Results
Sono stati effettuati esperimenti di confronto utilizzando sferoidi monocolturali (solo ECFC) e sferoidi co-culturali (ECCCS-MSC) per esaminare se le MSC svolgono un ruolo considerevole nell'angiogenesi mediata da ECFC. La formazione di germogli da ogni sferoide è stata monitorata per 24 h da un registratore cellulare in tempo reale in grado di catturare la progressione della germogliazione angiogenica dagli sferoidi. Il potenziale angiogenico è stato quantificato contando il numero di germogli e misurando la lunghezza cumulativa dei germogli generati dai singoli sferoidi. Sono stati analizzati cinque sferoidi selezionati casualmente per gruppo sperimentale. Per gli sferoidi ECC, il numero di germogli e la lunghezza cumulativa dei germogli erano significativamente più elevati rispetto a quelli degli sferoidi solo ECFC in tutti i punti temporali (Figura 1A-C). Il numero di sprout e la lunghezza degli Sferoidi ECFC sono aumentati continuamente di 12 h, ma il numero e la lunghezza degli sferoidi solo ECFC sono aumentati di 6 h e non sono cambiati nei punti temporali successivi (Figura 1B,C). Inoltre, i germogli formati dagli sferoidi ECC-MSCs erano più spessi e più resistenti di quelli formati dagli sferoidi ecFC con/senza trattamento VEGF(Figura 1Ae Video supplementare 1A,B,D). Gli sferoidi solo MSCs non formavano germogli, ma mostravano una migrazione individuale di MSC al di fuori degli sferoidi(Figura 1A e Video supplementare 1C). Questi risultati dimostrano il contributo significativo delle MSC, precursori periciti, all'angiogenesi cellulare degli ECFC. Le MSC sono note per secernere vari fattori di crescita29 che possono stimolare gli ECFC a formare germogli e strutture tubolari.
Gli ECCC sono stati etichettati con coloranti verde-fluorescente e le MSC sono state etichettate con coloranti rosso-fluorescente prima di combinarsi per generare sferoidi ECC-MSC. Insieme alla registrazione in tempo reale, questa tecnica di etichettatura a fluorescenza delle cellule vive può monitorare i movimenti cellulari di ECFC e MSC durante la formazione del germoglio. L'imaging fluorescente ha mostrato che le strutture di germogli mediati da ECFC erano coperte da MSC(Figura 2 e Video supplementare 2). Ciò suggerisce che le MSC combinate funzionano come cellule perivascolari durante la formazione del germoglio, che migliorano la stabilità del germoglio e la durata dalla stretta associazione tra due cellule vascolari.
Il sistema di analisi sferoide di co-cultura appena sviluppato è stato testato con bevacizumab, un inibitore dell'angiogenesi approvato dalla FDA, per verificarne il potenziale per lo screening dei farmaci anti-angiogenici. Gli sferoidi ECFC pretrattati con bevacizumab hanno mostrato una diminuzione del numero di germogli e della lunghezza cumulativa del germoglio in modo dipendente dalla dose rispetto agli sferoidi di controllo ECFC e MSC (Figura 3A,B). In esperimenti paralleli, gli sferoidi solo ECFC pretrattati con bevacizumab seguiti dalla stimolazione con VEGF (50 ng/mL) hanno mostrato anche una diminuzione del numero di germogli indotta da VEGF e della lunghezza cumulativa del germoglio in modo dipendente dalla dose (Figura 3C,D) . Da notare che i valori di IC50 di bevacizumab per inibire la lunghezza cumulativa del germoglio negli ECC: sferoidi MSC erano 46 volte superiori a quelli degli sferoidi solo ECFC (Tabella 1). Questo risultato implica fortemente che è necessaria una maggiore concentrazione per inibire la formazione vascolare fisiologicamente rilevante da parte di ECFC e MSC rispetto alla concentrazione necessaria per inibire solo la formazione vascolare mediata dalla CE.
Successivamente, è stato eseguito un modello di tumore xenotrapianto con trattamento bevacizumab per rivelare quale sistema sferoide fornisce dati prevedibili in correlazione con la concentrazione efficace al plasma in vivo. La linea cellulare glioblastoma U87MG-Red-FLuc, di origine umana, è stata iniettata sottocutaneamente a topi immuno-carenti. Dopo aver confermato la formazione del tumore a 1 settimana, i topi sono stati suddivisi casualmente in 3 gruppi che hanno ricevuto diversi trattamenti: controllo (0 mg/kg), dose bassa (1 mg/kg) e dose elevata (30 mg/kg). La crescita del tumore è stata significativamente inibita nel gruppo di 30 mg/kg rispetto al gruppo di controllo (Figura supplementare 3A). Il gruppo trattato con 1 mg/kg ha mostrato una tendenza alla diminuzione del tumore, ma non c'era differenza statistica rispetto al gruppo di controllo. La concentrazione di plasma per topi a 3 settimane di trattamento con bevacizumab è stata di 568,0,40,02 g/mL a 30 mg/kg e 38,1,0,72 g/mL a 1 mg/kg(Figura supplementare 3B). In particolare, la concentrazione di plasma di bevacizumab che mostrava un'efficace inibizione (568,0,40,62 g/mL a 30 mg/kg per il trattamento di 3 settimane) è stata raggiunta da vicino dagli sferoidi ECC-MSC (1261,5-214,49 g/mL) ma non da sferoidi ECC-solo (27,0 9,97 g/mL). Pertanto, il sistema di analisi dell'angiogenesi sferoide ECC può essere considerato come un sistema di analisi adatto per prevedere una concentrazione efficace del plasma prima degli esperimenti sugli animali.
Figura 1: formazione di germogli da ECFC-only, solo MSC, e eCC - sferidi MSC. (A) Immagini rappresentative della formazione di germogli da eCFC-only, MSCs-only e ECC -MSC sferoidi incorporati nel gel di collagene di tipo I a 0, 6, 12, 18 e 24 h (barra di scala 100 m). (B) Grafico quantitativo del numero di germogli formato solo da ECFC e sferidi ECCS (media-SEM, n - 3). (C) Grafico quantitativo della lunghezza cumulativa dei germogli, formato solo da ECFC e da sferoidi ECC (media-SEM, n - 3). : indica una differenza significativa tra solo ECFC e ECC, sferidi MSC allo stesso tempo (p - 0,05). : indica una differenza significativa tra i gruppi indicata da una parentesi quadra (p 0,05). Questa cifra è stata modificata da una precedente pubica30. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: localizzazione di ECFC e MSC in strutture di germogli. Immagini rappresentative che mostrano le posizioni di due tipi di cellule nelle strutture del germoglio dopo 24 h. ECFC e MSC sono stati etichettati fluorescentmente con PKH67 (verde) e PKH26 (rosso), ed eseguito 3D ECC-MSCs sreroe angiogenesi saggio. Le frecce indicano che le MSC erano coperte da strutture di germogli mediati da ECFC (barra di scala di 100 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Effetto inibitorio del bevacizumab sulla formazione di germogli da ECFC e sferoidi ecFC- solo. Gli ECFC e gli sferoidi solo ECFC sono stati trattati con bevacizumab, e la formazione di germogli è stata monitorata per 24 h.(B) Il grafico quantitativo della lunghezza cumulativa del germoglio proveniente dall'ECC- MSCs sferoidi trattati con bevacizumab (media-SEM, n . 3). (C) Grafico quantitativo del numero di germogli provenienti da sferoidi ecFC stimolati dal VEGF trattati con bevacizumab (media-SEM, n . (D) Grafico quantitativo della lunghezza cumulativa del germoglio degli sferoidi eclamidi stimolati dal VEGF trattati con bevacizumab (media-SEM, n . : indica una differenza significativa rispetto al gruppo di controllo (barra bianca) (p 0,05). : indica una differenza significativa rispetto al gruppo trattato con VEGF (barra nera) (p - 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| ora (h) |
IC50 (g/mL) di Avastin | valore p | |
| ECFC-solo sferoide | ECFC - Sferoide MSC | ||
| 6 | 94,62 x 38,53 | 3058.21 - 373.31 | 0.003 |
| 12 | 58,61 x 17,80 | 2006 - 484,73 | 0.015 |
| 18 | 83,38 x 54,54 | 1509,51 - 483,88 | 0.042 |
| 24 | 27,04 : 9,97 | 1261,51 - 214,49 | 0.0045 |
Tabella 1: IC50 valori di bevacizumab per l'inibizione della lunghezza cumulativa del germoglio in solo ECFC o ECC - MSCs sferidi. Gli sferoidi solo ECFC sono stati trattati con bevacizumab seguito dalla stimolazione con VEGF (50 ng/mL), necessaria per la formazione di germogli da sferoidi solo ECFC. Gli sferoidi ECC-MSC sono stati trattati con bevacizumab senza stimolazione VEGF. Entrambi gli sferoidi incorporati nel gel di collagene di tipo I, e la formazione di germogli da ogni sferoide è stato osservato per 24 h utilizzando un registratore cellulare in tempo reale. I dati sono rappresentati come media : SEM (n - 3).
Figura supplementare 1: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 2: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 3: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il presente studio introduce un sistema di analisi dell'angiogenesi in vitro migliorato utilizzando sferoidi di co-coltura formati da due progenitori di cellule vascolari umane, ECFC e MSC. Il sistema sferoide co-cultura può imitare la formazione di germogli vascolari in vivo, l'interazione e l'incorporazione tra cellule endoteliali e periciti. Rispetto ad altri saggi di angiogenesi in vitro che riflettono solo l'angiogenesi mediata dalle EC, questo sistema di analisi co-culturale è più rappresentativo della cascata multifase dell'angiogenesi fisiologica, tra cui l'interazione cellulare, la germogliazione, la formazione di tubi, e la maturazione della nave. Questo sistema di analisi di nuova creazione assomiglia anche al microambiente extracellulare in vivo seminando sferoidi in gel di collagene di tipo I. Suggeriamo che il sistema di analisi dell'angiogenesi degli sferoidi di cocoltura 3D sia affidabile, ripetibile, facilmente quantificabile e, soprattutto, fisiologicamente rilevante.
Durante l'esecuzione del saggio sferoide co-cultura, è essenziale incorporare sferoidi in gel con adeguata concentrazione di collagene di tipo i e FBS neutralizzato. La migliore concentrazione finale di collagene di tipo neutralizzato I è 1,5 mg/mL, e la percentuale di FBS è 2.5%. Negli esperimenti preliminari, concentrazioni più elevate di collagene hanno provocato gel rigido e ostacolato la qualità e la quantità di germogli provenienti da sferoidi. Concentrazioni minori di collagene hanno prodotto gel morbido e fragile che non riusciva a mantenere l'integrità degli sferoidi. Analogamente, quantità più elevate di FBS hanno causato germogli di lettoria da sferoidi a livello basale indipendentemente dalla stimolazione del fattore angiogenico. La minore concentrazione di FBS ha portato a cattive condizioni di cellule. Per risultati coerenti e riproducibili, deve essere incorporato un numero adeguato di sferoidi (circa 50 sferoidi/pozzo). Più di 50 sferoidi/bene potrebbero portare a una stretta vicinanza di sferoidi all'interno del pozzo, che può influenzare in modo anormale la qualità e la quantità di germogli generati.
È fondamentale mantenere il collagene di tipo I in condizioni refrigerate durante la neutralizzazione e mescolare i passaggi con la sospensione sferoide perché il collagene può coagulare a temperatura ambiente, risultando in una matrice irregolare. Durante la miscelazione della sospensione sferoide con la soluzione di collagene, si consiglia di utilizzare 1 mL di punta pipetta con 3-5 mm tagliati all'estremità per fare un foro largo. Ciò consente una facile gestione della soluzione di collagene viscoso e protegge gli sferoidi dalla rottura. L'agitazione della piastra dopo l'incorporamento della soluzione di collagene sospeso allo sferoide potrebbe disturbare l'integrità del gel e provocare rotture che possono ostacolare la normale generazione di germogli.
Nell'esempio di sferoide co-culturale che utilizza ECFC e MSC, è necessario mantenere il rapporto 5:1. L'uso di un maggior numero di MSC provoca la diffusione intorno allo sferoide a causa del fenotipo migratorio delle MSC, che può influenzare la generazione ideale del germoglio. Un numero inferiore di MSC non è sufficiente a stimolare la germogliazione degli ECFC e a coprire correttamente i germogli. Inoltre, è essenziale controllare le condizioni delle cellule durante la crescita. Se si osserva una scarsa germogliazione, si consiglia di utilizzare altri passaggi sani delle cellule. Per ottenere risultati migliori, si raccomanda vivamente l'uso di ECFC e MSC al passaggio inferiore a 10.
Qui, presentiamo un sistema di saggi di angiogenesi 3D migliorato utilizzando sferoidi co-cultura che catturano da vicino l'angiogenesi. Rispetto ai sistemi di analisi 2D a cellula singola, questo sistema di analisi sferoide co-culturale riflette risposte cellulari più fedeli tra due tipi di cellule vascolari per formare strutture tubolari in condizioni fisiologiche. Tuttavia, questo sistema rimane troppo semplificato rispetto al complesso processo in più fasi dell'angiogenesi in vivo. La generazione vascolare in vivo di solito si verifica attraverso l'interazione multipla di vari altri tipi di cellule, tra cui cellule epiteliali, fibroblasti, cellule immunitarie e anche proteine ECM abbondanti. Le applicazioni future di questo nuovo sistema includono l'introduzione di altri tipi di cellule e l'ECM per riflettere più precisamente l'angiogenesi fisiologica e/o patologica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione (17172MFDS215) del Ministero della sicurezza alimentare e della droga, dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea(NRF) finanziata dal governo coreano (MSIP) (2017R1A2B4005463) e dal Basic Science Research Program attraverso il National Research Foundation of Korea (NRF) finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA (1x) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) | Gibco | 21600-010 | PBS (10x) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1x) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
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