Summary
3차원 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 생리적 혈관신생을 모방하도록 설계된다. 공배양 스페로이드는 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, ECFC 및 MSC에 의해 형성되고, 콜라겐 겔에 내장된다. 새로운 시스템은 혈관 신생 변조기를 평가하는 데 효과적이며 생체 내 연구에 보다 관련성이 있는 정보를 제공합니다.
Abstract
혈관신생 분야의 연구는 혈관신생이 류마티스 관절염, 후암병증, 심혈관 질환과 같은 50가지 이상의 병리학적 상태의 특징이라는 인식과 함께 지난 수십 년 동안 공격적으로 성장해 왔습니다. 및 종양 전이. 혈관 신생 약물 개발 동안, 생리 적 혈관 신생 과정을 반영하기 위해 적절한 세포 유형과 적절한 조건을 가진 시험관 내 분석 시스템을 사용하는 것이 중요합니다. 주로 내피 세포를 이용한 현재 체외 혈관신생 분석 시스템의 한계를 극복하기 위해 3차원(3D) 공동 배양 스페로이드 발아 분석 시스템을 개발했습니다. 공배양 스페로이드는 5 대 1의 비율로 두 개의 인간 혈관 세포 전구체, 내피 콜로니 형성 세포(ECFC) 및 중간엽 줄기 세포(MSCs)에 의해 생산되었다. ECFC+MSCs 스페로이드는 생체 내 세포외 환경을 모방하기 위해 타입 I 콜라겐 매트릭스에 내장되었다. 실시간 세포 레코더는 24시간 동안 구형으로부터 의 혈관신생 발아의 진행을 지속적으로 관찰하기 위해 활용되었다. 혈관 신생 전위는 새싹의 수를 계산하고 개별 스페로이드에서 생성 된 콩나물의 누적 길이를 측정하여 정량화되었다. 무작위로 선택된 5개의 스페로이드를 실험군당 분석하였다. 비교 실험은 ECFC + MSCs 스페로이드가 ECFC 전용 스페로이드에 비해 더 큰 새싹 수와 누적 싹 길이를 보였다는 것을 보여주었습니다. 베바시주맙은 FDA 승인 혈관신생 억제제로서 새로 개발된 공동 배양 스페로이드 분석 시스템으로 항혈관신생 약물을 스크리핑할 수 있는 가능성을 검증했습니다. ECFC 전용 스페로이드에 비해 ECFC+MSCs 스페로이드에 대한 IC50 값은 이종이식 종양 마우스 모델으로부터 수득된 베바시주맙의 유효 혈장 농도에 가까웠다. 본 연구는 3D ECFC+MSCs 스페로이드 혈관신생 분석 시스템이 생리적 혈관신생과 관련이 있음을 시사하며, 동물 실험에 앞서 효과적인 혈장 농도를 예측할 수 있다.
Introduction
전 세계적으로 약 5억 명이 류마티스 관절염, 이종병증, 심혈관 질환 및 종양 전이와 같은 혈관 기형 관련 질환에 대한 혈관신생 조절요법의혜택을 받을 것으로 예상된다 1. 따라서 혈관신생을 조절하는 약물의 개발은 제약 산업에서 중요한 연구 분야가 되고 있다. 약물 개발 과정에서 생체 내 동물 연구는 생리 적 기능과 장기 간의 전신 상호 작용에 대한 약물 후보의 효과를 탐구할 필요가 있습니다. 그러나, 윤리적 및 비용 문제는 동물 실험에 대한 우려를 증가2. 따라서, 동물 실험 전에 더 나은 의사 결정으로 이어지는 더 정확하고 예측 가능한 데이터를 얻기 위해 시험관 내 분석 시스템이 개선되었습니다. 현재 체외 혈관신생 분석기는 일반적으로 2차원(2D) 배양판3에 시드된 내피세포(ECs)의 증식, 침범,이동 또는 관형 구조 형성을 측정한다. 이러한 2D 혈관신생 분석은 빠르고, 간단하고, 양적이며, 비용 효율적이며, 혈관신생 조절 약물의 발견에 크게 기여했다. 그러나 몇 가지 문제는 여전히 개선되어야 합니다.
이러한 2D 체외 분석 시스템은 생체외 생리학적 조건에서 발생하는 혈관신생의 복잡한 다단계 사건을 반영할 수 없으며, 시험관내 분석 데이터와 임상 시험 결과 사이의 불일치를 유발하는 부정확한 결과를 초래한다4. 2D 배양 조건은 또한 세포 표현형의 변화를 유도한다. 예를 들어, 2D 배양 플레이트에서 증식 후, ECs는 CD34의 감소된 발현 및 셀룰러 반응을 제어하는 여러신호에의해 나타나는 약한 세포 표현형을 갖는다5,6. 2D 배양계 혈관신생 분석 시스템의 한계를 극복하기 위해, 3차원(3D) 스페로이드 혈관신생 분석 시스템이 개발되었다. 발아 후 ECs에 의해 형성된 스페로이드로부터의 관형 구조 형성은 생체 내 신혈관화 과정7,8. 따라서, 3D 스페로이드 혈관신생 분석기는 잠재적인 프로-또는 항혈관신생 약물을 스크리닝하기 위한 효과적인 분석 시스템으로 간주되고 있다.
대부분의 3D 스페로이드 혈관신생 분석사는 혈관신생 동안 ECs의 세포 반응에 초점을 맞추기 위해 주로 인간 배꼽 내피 세포(HUVECs) 또는 인간 진피 미세혈관 내피 세포(HDMECs)만을 활용합니다. 그러나, 혈액 모세 혈관은 두 가지 세포 유형으로 구성 됩니다:ECs와 pericytes. EC와 pericytes 사이의 정교한 양방향 상호 작용은 적절한 혈관 무결성 및 기능에 매우 중요합니다. 유전성 뇌졸중, 당뇨망막병증 및 정맥기형과 같은 여러 질병은 내피에 대한 변경된 후피세포 밀도 또는 감소된 회음부 부착과 관련이있다 9. Pericytes는 또한 혈관 신생 프로세스의 핵심 요소로 알려져 있습니다. PERICYTES는 EC에 의해 새로 형성 된 선박 구조를 안정화하기 위해 모집된다. 이와 관련하여, 모노배양 스페로이드 혈관신생 분석제는7,10을포함하지 않는다. 따라서, ECs 및 pericytes에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드는 생리적 혈관신생 사건을 보다 밀접하게 모방하는 귀중한 접근법을 제공할 수 있다.
본 연구는 생체 내 혈관신생에 보다 밀접하게 반영하기 위해 인간 내피 콜로니 형성 세포(ECFC)와 중간엽 줄기 세포(MSCs)의 조합으로 3D 공동 배양 스페로이드 혈관신생 분석기를 개발하는 것을 목표로 하였다. 정상 혈관의 시험관내 표현 어셈블리로서 공동 배양 스페로이드 시스템은 2001년11년에Korff et al.에 의해 처음 설립되었다. 그(것)들은 HUVECs및 인간 배꼽 동맥 평활근 세포를 결합하고 (HUSMC), 2개의 성숙한 혈관 세포의 공동 배양이 발아 잠재력을 감소한다는 것을 설명했습니다. 성숙한 ECs(HUVECs)는 점진적으로 증식및 분화능력을 상실하는 것으로 알려져 있으며, 이는 그들의 혈관신생 반응에 부정적인 영향을 미치는12,13. 성숙한 분방 세포(HUSMC)는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 반응성(VEGF)의 제거를 통해 내피 세포 불활성화를 일으킬 수있다(11). Korff와 우리의 공동 배양 스페로이드 시스템의 주요 차이점은 사용되는 세포 유형입니다. 우리는 두 개의 혈관 전구체, ECFC 및 MSC를 적용하여 적절한 혈관 신생 분석 시스템을 확립하여 프로 또는 항 혈관 신생 제제를 선별하고 조사했습니다. ECFC는 EC의 선구자입니다. ECFC는 성숙한 EC14에비해 강력한 확산 용량을 가지며, 이는 EC의 한계를 극복할 수 있게 합니다. ECFC는 많은 산후 병리생리학적 조건에서 새로운 혈관 형성에기여15,16,17. 미세포는 pericytes로 분화하는 능력을 가진 다능성 줄기 세포이며, 이에 의해 혈관신생 에 기여18,19.
이전 보고서에서, ECFC 및 MSCs는 생체외 관형성(20)및 생체내 신혈관화21,22,허혈성 조직의 재관류 개선에 대한 상승효과를 보였다(23,24). 본 연구에서, ECFC 및 MSC는 생체 내 3D 환경을 반영하기 위해 동배전 스페로이드를 형성하고 타입 I 콜라겐 겔에 내장된 것을 사용하였습니다. 콜라겐은 ECs25를둘러싼 세포외 기질(ECM)의 주요 성분으로 간주된다. ECM은 세포 행동 조절에 중요한 역할을 한다26. 여기에서 제안된 분석 프로토콜은 일반적인 실험실 기술을 사용하여 2 일 안에 쉽고 빠르게 수행 될 수 있습니다. 발아 과정 동안 효과적인 세포 추적을 위해, 각 세포 유형은 실시간 세포 레코더를 사용하여 형광 표지 및 모니터링될 수 있다. 새로 설립된 3D 공동 배양 스페로이드 혈관 신생 분석 시스템은 잠재적인 혈관 신생 변조기 를 평가하기위한 감도를 높이고 생체 내 연구에 앞서 예측 가능한 정보를 제공하도록 설계되었습니다.
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Protocol
인간 ECFC는 이전 보고서27에기재된 바와 같이 인간 말초 혈액으로부터 분리되었다. 간략하게, 단핵 세포층을 Ficoll-Paque Plus를 사용하여 전혈로부터 분리하였고, 내피유사 콜로니가 출현할 때까지 적절한 배지에서 배양하였다. 콜로니를 수집하고 ECFC는 CD31 코팅 된 자기 구슬을 사용하여 분리되었습니다. 중퇴세포는 인간 성인 골수의 부착단핵세포(MNC) 분획으로부터 분리되었다. 연구 프로토콜은 덕성여자대학교(IRB No. 2017-002-01)의 기관심사위원회의 승인을 받았습니다.
1. 세포 배양
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ECFC 및 중간 및 코트 플레이트 준비
- 내피 세포 성장 배지 MV2 (ECGM-MV2, 하이드로 코르티손 제외)를 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 글루타민 - 페니실린 - 스트렙 토마이신 (GPS)으로 보충하십시오.
- 중간엽 줄기 세포 성장 배지-2 (MSCGM-2)를 10% FBS 및 1% GPS를 함유하는 준비.
- ECFC 배양을 위해, 1% 젤라틴 용액으로 세포 배양 판을 코팅한다. 1% 젤라틴 용액을 준비하려면 자기 교반기로 PBS 500 mL에 겔화 분말 1 g을 용해시키고 오토클레이브로 살균하십시오. 플레이트는 3 mL/ 60mm, 5 mL/ 100mm 또는 1% 젤라틴 용액의 15 mL/150 mm로 코팅할 수 있습니다. 세포 배양 인큐베이터에서 15분 동안 코팅된 플레이트를 배양한다(37°C 및 5%CO2). 그 후, 남은 1% 젤라틴 용액을 포부로 제거하고 코팅된 플레이트를 PBS로 한 번 세척한다.
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성장하는 ECFC 및 EFC
- 종자 1 x 106 ECFC는 1% 젤라틴 코팅 150 mm 플레이트에, 세포 배양 인큐베이터(37°C 및 5%CO2)에서ECGM-MV2(10% FBS, 1% GPS)를 사용하여 80-90% 동률을 이용하여 성장한다. 일관된 결과를 얻으려면 통로 번호 7-10에서 ECFC를 사용합니다.
- 시드 1 x 106 MC는 코팅되지 않은 150 mm 플레이트상에서, 세포 배양 인큐베이터(37°C 및 5%CO2)에서MSCGM-2를 사용하여 80-90% 동률로 성장한다. 일관된 결과를 얻으려면 통로 번호 7-10에서 자식 을 사용합니다.
2. 메틸셀룰로오스 용액 1.2% 제조
- 500 mL 유리 병에 메틸 셀룰로오스 6 g을 측정하고 오토 클레이브에서 살균하십시오.
- ECGM-MV2(FBS 및 GPS 제외)를 60°C에서 20분 동안 가열하고 가열된 ECGM-MV2 250 mL를 첨가하여 살균된 메틸 셀룰로오스 분말을 가열합니다. 멸균 상태를 유지하려면 유동 후드 내부의 공정을 수행하십시오.
- 살균 된 자기 교반 막대를 추가하고 메틸 셀룰로오스가 완전히 젖은 덩어리없이 고르게 분산 될 때까지 자기 교반기에서 20 분 동안 용액을 섞습니다. 멸균 상태에서 250 mL의 차가운 (4 °C) ECGM-MV2 (FBS 및 GPS 제외)를 추가하고 자기 교반기에서 추가로 10 분 동안 혼합하십시오. 이어서, 용액을 밤새 냉장고(4°C)에서 식힌다.
참고: 메틸셀룰로오스는 부종과 후속 수분 공급으로 인해 시원한 온도에서 잘 용해되는 탄수화물 폴리머입니다. - 다음날, 용액을 50 mL 튜브및 원심분리기에서 5,000 x g에서 4°C에서 3시간 동안 알리쿼트한다. 투명한 점성 초월액을 취하고 최대 3-6개월 동안 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
참고: 침전물 잔류 셀룰로오스 섬유를 포함 할 수있다, 그래서 부드럽게 부피의 적어도 5 mL 뒤에 떠나 상상 용액을. 이 부피는 실험 조건에 따라 조정할 수 있습니다.
3. ECFC 전용, MSC 전용 및 ECFC-MSC 스페로이드 생성 및 포함
1일차
- ECFC 및 EFC 셀 서스펜션 준비
- 칼슘과 마그네슘없이 인산완충식염수(PBS)를 첨가하여 80-90% 동급 ECFC및 EFC를 세척하고 흡인합니다.
- 배양 판으로부터 ECFC 및 MSC를 분리하기 위해, 세포 배양 인큐베이터(37°C 및 5%CO2)에서각각 0.05% 트립신-EDTA로 배양하고 세포 배양 인큐베이터에서 각각 배양한다.
- 10% FBS 및 1% GPS를 포함하는 DMEM 매체를 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 셀을 위아래로 파이펫하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다.
- RT에서 5 분 동안 282 x g에서 원심 분리하여 세포를 퇴적시하십시오.
- 상급체를 제거하고, 각각의 배지에서 세포를 다시 현탁한다.
- 형광염료로 ECFC 및 MC 라벨 부착
참고: PKH67(녹색) 및 PKH26(적색) 형광 염료를 가진 ECFC의 세포막 라벨링을 다음과 같이 약간 수정하여 제조업체의 지시에 따라 수행합니다.- 세포를 혈청 프리 배지로 두 번 세척하여 FBS를 제거합니다.
참고: FBS에 있는 단백질 및 지질은 결합에 의하여 세포를 표지하기 위한 효과적인 염료 농도를 감소시킵니다. - 현미경으로 혈세포계를 사용하여 ECFC와 MFC를 계산하고 3 x 106 ECFC 및 2 x 106 MCC를 2 mL 마이크로 튜브로 전송합니다.
참고: 이들은 염료로 세포를 표지하기 위한 최적 세포 밀도입니다. 많은 수의 세포를 사용하면 가난하고 이질적인 얼룩이 생기지만 너무 적은 세포를 사용하면 세포가 회복되지 않습니다. - 100 x g에서 튜브를 RT에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포 펠릿을 얻습니다. 조심스럽게 잔류 부피의 더 이상 15-25 μL을 떠나 상급을 흡인.
- 염료 키트에서 희석C의 250 μL에서 ECFC 및 MFC를 다시 일시 중단합니다. 완벽한 분산을 보장하기 위해 셀 서스펜션을 부드럽게 피펫합니다.
참고: 희석제 C는 생리적 염이며, 미셀을 형성함으로써 염료의 염색 효율을 감소시킬 수 있다. 따라서 세포가 희석제 C에 오랫동안 방치하지 말고 튜브를 소용돌이치지 마십시오. - PKH67 ~250 μL의 희석제 C(최종 농도 20 μM)를 추가하여 ECFC에 염색 용액을 준비하고, PKH26의 3 μL을 250 μL(최종 농도 12 μM)에 추가하여 EFc를 준비합니다.
참고: 최종 염료 농도는 제조업체의 권장 사항과 다릅니다. 높은 농도는 세포 응집 및 세포 독성으로 이어질 것입니다. 낮은 농도는 염색에 충분하지 않을 것입니다. - 250 μL의 ECFC 셀 현탁액을 PKH67 염료 용액의 250 μL에 추가하고, PKH26 염료 용액의 250 μL에 250 μL의 MsC를 추가합니다. 즉시 상하 파이펫팅하여 염료와 세포를 혼합하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 더 나은 결과를 얻으려면 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 셰이커에 놓아 염색 중에 충분한 혼합을 하십시오.
- 염색 된 세포 현탁액에 0.5 mL의 FBS를 첨가하여 염색 과정을 중지한 다음 FBS가 과도한 언바운드 염료를 결합 할 수 있도록 1 분 동안 배양하십시오. 염색된 세포를 100 x g에서 5분 동안 원심분리하여 퇴적시한다.
참고: ECFC 및 MSC 펠릿은 염색 후 각각 밝은 노란색과 분홍색입니다. - 조심스럽게 상한제를 제거하고 여분의 염료를 제거하기 위해 완전한 배지로 세포를 두 번 씻으하십시오. 튜브를 100 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 각 완전한 배지의 2 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
- 세포를 혈청 프리 배지로 두 번 세척하여 FBS를 제거합니다.
- ECFC, MSC 또는 ECFC+MSC 스페로이드 생성
참고: 앞서28에설명된 바와 같이 스페로이드를 생성하기 위해 매달기 놓기 기술을 적용한다. 스페로이드 를 준비하기위한 단계는 다음과 같습니다.- 스테인드 ECFC 및 EFC를 계산합니다.
- 20% 메틸셀룰로오스 용액과 5% FBS를 함유한 ECGM-MV2에서 스테인드 ECFC, MsC 또는 ECFC+MSC를 일시 중단합니다. ECFC 또는 MsC에 대해 4 x 104 셀/mL의 세포 밀도에서 준비합니다(25 μL의 세포 현탁액은 1,000개의 세포를 포함합니다). ECFC와 MsC의 두 개의 세포 현탁액의 경우, 2 x 104 셀/mL ECFC 및 0.4 x 104 셀/mL ML MC(25 μL에는 500개의 ECFC 및 100개의 MBC가 포함되어 있음)의 셀 밀도로 준비합니다.
참고: ECFC와 MsC의 비율은 5:1을 초과해서는 안 됩니다. 많은 수의 MSC가 과도한 마이그레이션과 불규칙한 새싹 형태로 이어질 수 있습니다. 중간 나무의 작은 수는 세포 사이의 가난한 상호 작용을 일으킬 수 있습니다., 가난한 발아 를 산출. - 150 mm 배양 플레이트의 바닥에 15 mL의 PBS를 추가하여 수화 유닛을 준비합니다.
- 멀티 채널 파이펫의 사용을 위해 멸균 폴리스티렌 직사각형 저장소로 셀 현탁액을 전송합니다. 파이펫팅하여 셀 현탁액을 고르게 분산시.
- 다중 채널 파이펫을 사용하여 150mm 배양 플레이트의 덮개에 셀 현탁액 25 μL 방울을 증착합니다 (150mm 플레이트의 약 100 방울 / 덮개). PBS 충전 수화 유닛위에 커버를 반전시키고 24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 배양한다.
참고: 메틸셀룰로오스 용액은 현탁액에 적절한 점도를 제공합니다. 메틸셀룰로오스 용액 없이 교수형 투하 방법을 수행했을 때, 커버가 반전되었을 때 방울이 쉽게 아래로 미끄러졌다(보충도 1). 더욱이, 하룻밤 배양 후, 스페로이드는 메틸셀룰로오스 용액 없이 완벽하게 형성되지 않았다. 이 결과는 메틸셀룰로오스 용액에 의한 적절한 점도가 스페로이드의 둥근 모양을 형성하는 데 필요하다는 것을 나타낸다.
2일차
- 중화 콜라겐 젤에 스페로이드 포함
- 수조 (37 °C)에서 따뜻한 FBS 및 ECGM-MV2 (FBS 및 GPS 제외). 차가운 메틸셀룰로오스 용액을 실온으로 가져오기 위해 작업대위에 놓습니다.
- 온난화를 위해 세포 배양 인큐베이터(37°C)에 24웰 플레이트를 놓습니다.
- 뾰족한 1 mL 파이펫 팁을 3-5mm 잘라 스페로이드와 점성 현탁액, 메틸셀룰로오스 용액 및 타입 I 콜라겐과 같은 점성 현탁액을 편안하고 정확하게.
- 3 mg/mL 중화 타입 I 콜라겐 젤을 얼음에 넣어 1형 콜라겐 젤 제조사의 지시에 따라 준비합니다.
참고: 실온에서 콜라겐의 겔화를 피하기 위해 얼음에 중화를 수행해야합니다. 24웰 플레이트 중 하나에 는 중화 콜라겐 500 μL이 필요합니다. 항상 콜라겐의 1 mL 여분의 볼륨을 준비합니다. 콜라겐 젤은 얼음위에 보관하면 중화 후 2-3시간까지 사용할 수 있습니다. - PBS 의 5 mL로 스페로이드를 포함하는 덮개를 헹구어 스페로이드를 수확하십시오. 50 mL 원엽 튜브에서 스페로이드 부유 용액을 수집합니다. 나머지 스페로이드를 얻기 위해 PBS의 5 mL로 커버를 다시 헹구고.
참고: 수확하는 동안, 밀접하게 스페로이드의 존재를 확인하기 위해 관찰. 더 많은 육안 검사를 위해 슬라이드 유리에 스페로이드 부유 용액의 약 50-100 μL을 옮기고 현미경으로 스페로이드의 둥근 모양을 확인하십시오. - 282 x g에서 5 분 동안 원심분리하여 스페로이드를 퇴적시. 잔류 부피의 100-200 μL 이하를 남기지 않고 스페로이드를 방해하지 않고 조심스럽게 상급물을 폐기하십시오.
- 나머지 100-200 μL 잔류 용액에 스페로이드가 자유롭게 매달려 있도록 튜브의 벽을 부드럽게 두릅니다.
- 5% FBS 및 40% 메틸셀룰로오스 용액을 함유하는 ECGM-MV2를 스페로이드 함유 튜브에 첨가합니다. 추가된 부피는 약 100개의 스페로이드/mL을 기준으로 결정됩니다. 무딘 1 mL 파이펫 팁으로 파이펫팅하여 스페로이드 현탁액을 부드럽게 섞습니다.
참고: 메틸셀룰로오스 용액은 스페로이드가 퇴적되는 것을 허용하지 않는 서식 제로 널리 사용됩니다. FBS 농도는 5%여야 합니다. 높은 FBS 농도 는 과도한 성장 인자로 인해 비정상적인 발아를 일으킵니다. 낮은 FBS 농도 세포에 대 한 건강 한 상태를 유지할 수 없습니다. - 스페로이드-현탁액과 중화형 I 콜라겐 젤(3 mg/mL)을 얼음에 1:1 비율로 섞습니다. 스페로이드가 파손되지 않도록 무딘 1mL 파이펫 팁을 사용하십시오.
참고: 24웰 플레이트 중 1웰에 스페로이드-서스펜딩 콜라겐 젤 용액 1 mL이 필요합니다. 가능하면 추가 혼합 서스펜션 솔루션을 만드십시오. - 임의의 제제 또는 화학물질의 혈관신생 성질을 시험해야 하는 경우, 스페로이드 현탁 콜라겐 젤 용액의 1 mL를 1 mL 마이크로 튜브에 옮기고 에이전트(들) 또는 화학물질(들)을 첨가한 다음 무딘 1mL 파이펫 팁으로 부드럽게 혼합한다.
참고: 약제 및 화학물질의 부피는 200 mL로 합산될 수 있으며, 이는 I형 콜라겐 겔 농도를 1.5 mg/mL에서 1.25 mg/mL로 희석하지만, 타입 I 콜라겐 겔 중합에는 영향을 미치지 않는다. 컨트롤 스페로이드에 동일한 부피의 차량을 추가합니다. - 스페로이드-서스테인콜라겐 젤 용액을 파이펫팅에 의해 미리 온난한 24웰 플레이트(0.9 mL/well)의 우물에 넣고 중합을 위해 세포 배양 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 스페로이드 임베딩 과정에서 플레이트를 교반하여 겔을 방해하지 마십시오. - VEGF가 있는/없이 2.5% FBS를 함유한 ECGM-MV2 100 μL을 첨가하여 스페로이드 현탁 콜라겐 젤을 덮습니다. ECFC 전용 스페로이드의 경우, VEGF(최종 농도 50 ng/mL)를 첨가하여 세포를 자극하여 적절한 새싹을 형성합니다. ECFC+MSC 스페로이드는 임의의 성장 인자에 의한 외인성 자극을 필요로 하지 않는다.
- 플레이트를 세포 배양 인큐베이터(37°C 및 5%CO2)에설치된 실시간 세포 레코더에 놓고 무작위로 5-10개의 스페로이드(10x 대물 렌즈)에 초점을 맞춥니다. 각 형광 표지 된 스페로이드의 발아 형성을 모니터링1 시간 마다 24 어떤 방해없이 시간.
4. 스페로이드 발아 정량
- 이미지 파일을 ImageJ 소프트웨어로 가져와 새싹의 수를 정량화하고 각 새싹의 길이를 측정합니다. 공동 배양 스페로이드의 경우, 스페로이드를 만들기 전에 녹색 형광 염료로 ECPC에 라벨을 붙입니다. 이어서, 녹색 형광으로 얼룩진 새싹의 수와 길이를 측정한다(보충도 2). 무작위로 선택된 5개의 스페로이드를 실험군당 정량화하였다.
참고: 새싹은 스페로이드에서 연장되는 몇몇 ECFC에 의해 형성된 협력적으로 길쭉한 구조물입니다. 새싹의 길이는 새싹의 표면에서 새싹의 끝까지 새싹의 기원의 지점에서 길이로 측정된다. - 값을 적어도 3개의 독립적인 실험의 ±SEM을 의미한다고 표현한다. 다중 비교를 위한 단방향 ANOVA 또는 페어링된 비교를 위한 학생의 t-test에의한 통계적으로 유의한 차이를 결정합니다.
참고: P ≤ 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.
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Representative Results
비교 실험은 중간 혈관 신생에 있는 MsCs가 상당한 역할을 하는지 검토하기 위하여 단 배양 스페로이드 (ECFC 전용) 및 공동 배양 스페로이드 (ECFC+MSCs)를 사용하여 수행되었습니다. 각 스페로이드로부터발아형성은 스페로이드로부터 의 혈관신생 발아의 진행을 포착할 수 있는 실시간 세포 레코더에 의해 24시간 동안 모니터링되었다. 혈관 신생 전위는 새싹의 수를 계산하고 개별 스페로이드에서 생성 된 콩나물의 누적 길이를 측정하여 정량화되었다. 실험군당 무작위로 선택된 스페로이드 5마리를 분석하였다. ECFC+ MSCs 스페로이드의 경우, 새싹의 수와 누적 새싹 길이는 모든 시점에서 ECFC 전용 스페로이드에 비해 상당히 높았습니다(그림 1A-C). ECFC+ MSCs 스페로이드의 새싹 수와 길이는 12시간 동안 지속적으로 증가했지만 ECFC 전용 스페로이드의 수와 길이는 6시간 동안 증가했으며 이후 시점에서 변경되지않았습니다(그림 1B,C). 또한, ECFC + MSCs 스페로이드에 의해 형성 된 새싹은 VEGF 처리가있는 ECFC 전용 스페로이드에 의해 형성 된 것보다 두껍고 내구성이 뛰어났습니다(그림 1A및 보충 비디오 1A, B, D). MSCs 전용 스페로이드는 새싹을 형성하지 않았지만 스페로이드 외부에서 MSC의 개별 이동을 보였다(그림 1A 및 보충 비디오 1C). 이러한 결과는 ECFC의 세포 혈관 신생에 대한 MSC, pericyte 전구체의 중요한 기여를 보여줍니다. 미새식스는 새싹과 관형 구조를 형성하기 위해 ECFC를 자극할 수 있는 다양한 성장인자(29)를 분비하는 것으로 알려져 있다.
ECFC는 녹색 형광 염료로 표지되었고, ECCs+MSCs 스페로이드를 생성하기 위해 결합하기 전에 적형성 염료로 표지되었다. 실시간 기록과 함께, 이 살아있는 세포 형광 표지 기술은 새싹 형성 도중 ECFC 와 MSC의 세포 운동을 추적할 수 있습니다. 형광 이미징은 ECFC 매개 새싹 구조가 중간 식으로 덮여 있음을 보여주었다(그림 2 및 보충 비디오 2). 이것은 두 개의 혈관 세포 사이의 단단한 협회에 의해 새싹 안정성과 내구성을 향상 시키는 새싹 형성 하는 동안 경계 세포로 결합 된 중간 세포 기능 제안.
새로 개발된 공동 배양 스페로이드 분석 시스템은 항 혈관신생 약물을 스크리핑할 수 있는 가능성을 확인하기 위해 FDA 승인 혈관신생 억제제인 베바시주맙(bevacizumab)으로 테스트되었습니다. 베바시주맙으로 전처리된 ECCS+MSCs 스페로이드는 대조군 ECCs+MSCs 스페로이드와 비교하여 투여 의존적 방식으로 감소된 새싹 수 및 누적 싹 길이를보였다(그림 3A, B). 병렬 실험에서, VeGF (50 ng/mL)를 가진 자극에 선행된 베바시주맙으로 전처리된 ECfcs 전용 스페로이드는 또한 투여량 의존적인 방식으로 VEGF 유도 된 새싹 수 및 누적 새싹 길이 감소를 보였다(그림 3C,D) . 참고로, ECFC+MSCs 스페로이드에서 누적 된 새싹 길이를 억제하기 위한 베바시주맙의 IC50 값은 ECFC 전용 스페로이드에 있는 것보다 46배 더 컸다(표1). 이 결과는 ECFC 및 중간 엽전소에 의한 생리학적 관련 혈관 형성을 억제하기 위해 EC 매개 혈관 형성만억제하는 데 필요한 농도와 비교하여 더 높은 농도가 필요하다는 것을 강하게 암시한다.
다음으로, 이종이식 종양 마우스 모델은 생체 내 효과적인 혈장 농도와 상관관계가 있는 예측 가능한 데이터를 제공하는 스페로이드 시스템을 밝히기 위해 베바시주맙 치료로 수행되었다. 인간 유래 교모세포종 U87MG-적-FLuc 세포주면역결핍 마우스에 피하 주사하였다. 1 주에 종양 형성을 확인 한 후, 마우스는 무작위로 다른 치료를받은 3 그룹으로 분할되었다: 대조군 (0 mg/kg), 낮은 복용량 (1 mg/kg), 고용량 (30 mg/kg). 종양 성장은 대조군과 비교하여 30 mg/kg 처리군에서 유의히억제되었다(보충도 3A). 1 mg/kg 처리군은 종양 감소 경향을 보였지만 대조군과 비교했을 때 통계적 차이는 없었다. 베바시주맙 치료 3주동안마우스 혈장 농도는 30 mg/kg에서 568.0±40.62 μg/mL, 38.1±0.72 μg/mL에서 1 mg/kg(보충도3B)이었다. 특히, 효과적인 억제를 보여주는 베바시주맙의 혈장 농도(3주 치료시 30 mg/kg에서 568.0±40.62 μg/mL)는 ECfcs+MSCs 스페로이드(1261.5±214.49 μg/mL)에 의해 밀접하게 달성되었지만 ECFCs 전용 스페로이드(27.97μg/mheroids)는 그렇지 않았습니다. 따라서, ECFC+MSCs 스페로이드 혈관신생 분석 시스템은 동물 실험에 앞서 효과적인 혈장 농도를 예측하기 위한 적합한 분석 시스템으로 간주될 수 있다.
그림 1: ECFC 전용, MSC 전용 및 ECFC+MSCs 스페로이드에서 새싹 형성. (a)ECFC 전용, MSC 전용 및 ECFC+MSC 스페로이드에서 싹이 형성된 대표적인 이미지는 0, 6, 12, 18 및 24시간(스케일 바 = 100 μm)에서 I형 콜라겐 겔에 내장되어 있다. (B)ECFC 전용 및 ECFC+ MSCs 스페로이드(mean±SEM, n = 3)로 형성된 새싹 수의 정량적 그래프. (C)ECFC 전용 및 ECFC+ MSCs 스페로이드(mean±SEM, n = 3)로부터 형성된 누적 새싹 길이의 정량적 그래프. * ECFC 전용과 ECFC+MSCs 스페로이드가 동일한 시점(p ≤ 0.05)에서 유의한 차이를 나타낸다. # 대괄호로 표시된 그룹 간의 유의한 차이를 나타낸다(p ≤ 0.05). 이 수치는 이전 pubication30에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 새싹 구조에서 ECFC 및 EFC의 국소화. 24시간 ECFC 및 MsC 후 새싹 구조에서 두 가지 세포 유형의 위치를 나타내는 대표적인 이미지는 각각 PKH67(녹색) 및 PKH26(적색)으로 형광표시되었고, 3D ECCs+MSCs 스페로이드 혈관신생 분석술을 수행하였다. 화살표는 중간 중간 값으로 ECFC 매개 새싹 구조 (스케일 바 = 100 μm)로 덮여 있음을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: ECFC+MSCs 및 ECFC 전용 스페로이드에서 새싹 형성에 대한 베바시주맙의 억제 효과. ECFC+MSCs 및 ECFC 전용 스페로이드를 베바시주맙으로 처리하였고, 새싹 형성은 24시간 동안 모니터링하였다.(B)베바시주맙으로 처리된 ECfcs+MSCs 스페로이드로부터누적 싹길이의 정량적 그래프(mean±SEM, n=3). (C)베바시주맙(mean±SEM, n=3)으로 처리된 VEGF-자극 ECFCs 전용 스페로이드로부터의 새싹 수의 정량적 그래프. (D)베바시주맙으로 처리된 VEGF-자극 ECFCs 전용 스페로이드로부터의 누적 새싹 길이의 정량적 그래프(mean±SEM, n=3). * 대조군(흰색 막대)(p ≤ 0.05)과 유의한 차이를 나타낸다. # VEGF 처리 군(검정바)(p ≤ 0.05)과 유의한 차이를 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시간 (h) |
아바스틴의 IC 50(μg/mL) | p 값 | |
| ECfcs 전용 스페로이드 | ECFC+ MSCs 스페로이드 | ||
| 6 | 94.62 ± 38.53 | 3058.21 ± 373.31 | 0.003 |
| 12 | 58.61 ± 17.80 | 2006 ± 484.73 | 0.015 |
| 18 | 83.38 ± 54.54 | 1509.51 ± 483.88 | 0.042 |
| 24 | 27.04 ± 9.97 | 1261.51 ± 214.49 | 0.0045 |
표 1: ECFC 전용 또는 ECFc+MSCs 스페로이드에서 누적 된 새싹 길이의 억제를위한 베바시주맙의 IC 50 값. ECFC 전용 스페로이드는 베바시주맙으로 처리한 다음 VEGF(50 ng/mL)로 자극한 후, ECFC 전용 스페로이드로부터 새싹 형성에 필요한 자극을 받았습니다. ECfcs+MSCs 스페로이드는 VEGF 자극 없이 베바시주맙으로 처리하였다. 두 스페로이드를 I형 콜라겐 겔에 내장하고, 각 스페로이드로부터의 새싹 형성은 실시간 세포 레코더를 사용하여 24시간 동안 관찰되었다. 데이터는 평균 ± SEM(n= 3)으로 표현된다.
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Discussion
본 연구는 두 개의 인간 혈관 세포 선조, ECFC 및 MSC에 의해 형성된 공동 배양 스페로이드를 활용한 생체외 혈관 신생 분석 시스템을 개선하여 소개합니다. 내피 세포와 pericytes 사이의 상호 작용 및 통합에 의해 달성. ECs 매개 혈관신생만을 반영하는 다른 체외 혈관신생 분석과 비교하여, 이러한 공동 배양 분석 시스템은 세포 상호작용, 발아, 관 형성을 포함한 생리적 혈관신생의 다단계 캐스케이드를 보다 대표적이며, 및 혈관 성숙. 이 새롭게 확립된 분석 시스템은 또한 타입 I 콜라겐 겔로 스페로이드를 파종시킴으로써 생체 내 세포외 미세환경과 유사합니다. 우리는 3D 공동 배양 스페로이드 혈관 신생 분석 시스템이 신뢰할 수 있고, 반복 가능하며, 쉽게 정량화 할 수 있으며, 가장 중요한 생리학적 관련이 있음을 제안합니다.
공동 배양 스페로이드 분석기를 수행하는 동안, 중화형 I 콜라겐 및 FBS의 적절한 농도로 겔에 스페로이드를 내장하는 것이 필수적이다. 중화형 I 콜라겐의 최종 농도는 1.5 mg/mL이고 FBS의 백분율은 2.5%이다. 예비 실험에서, 콜라겐의 높은 농도 뻣뻣한 젤 귀 착되 고 품질 및 spheroids에서 유래 하는 새싹의 양을 방해. 콜라겐의 적은 농도는 스페로이드의 무결성을 유지할 수 없는 부드럽고 깨지기 쉬운 젤을 생성했습니다. 유사하게, FBS의 더 높은 양은 혈관 신생 인자 자극에 관계없이 기초 수준에서 스페로이드에서 과다한 발아를 일으켰습니다. 낮은 FBS 농도는 세포의 가난한 조건으로 이어졌다. 일관되고 재현 가능한 결과를 얻으려면 적절한 수의 스페로이드가 포함되어야합니다 (약 50 스페로이드 / 웰). 50 개 이상의 스페로이드 / 우물은 우물 내에서 스페로이드의 근접으로 이어질 수 있으며, 이는 비정상적으로 생성 된 콩나물의 품질과 양에 영향을 미칠 수 있습니다.
콜라겐이 실온에서 응고되어 불규칙한 매트릭스를 유발할 수 있기 때문에 중화 및 스페로이드 현탁액과 혼합 단계를 혼합하는 동안 냉각 된 조건에서 타입 I 콜라겐을 유지하는 것이 중요합니다. 스페로이드 현탁액을 콜라겐 용액과 혼합하는 동안, 넓은 구멍을 만들기 위해 끝에 3-5mm 컷1 mL 파이펫 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 이를 통해 점성 콜라겐 용액을 쉽게 취급할 수 있으며 스페로이드가 파열되지 않도록 보호합니다. 스페로이드-부유 콜라겐 용액을 내장한 후 플레이트의 교반은 겔의 무결성을 방해하고 정상적인 새싹 생성을 방해할 수 있는 파손을 초래할 수 있다.
ECFC 및 MSC를 사용하는 공동 배양 스페로이드 분석에서는 5:1 비율이 유지되어야 합니다. 더 많은 수의 MSC를 사용하면 이상적인 새싹 생성에 영향을 줄 수 있는 MSCs의 철새 표현형으로 인해 스페로이드 주위에 퍼지게 됩니다. 적은 수의 MC는 ECFC싹을 자극하고 새싹을 제대로 덮기에는 충분하지 않습니다. 또한, 성장 하는 동안 세포 상태를 확인 하는 것이 필수적이다. 가난한 발아가 관찰되면 세포의 또 다른 건강한 통로를 사용하는 것이 좋습니다. 더 나은 결과를 위해 10 미만의 통로에서 ECFC 및 ECCs를 사용하는 것이 좋습니다.
여기에서, 우리는 생체 외 혈관신생에서 밀접하게 포획하는 공동 배양 스페로이드를 사용하여 향상된 3D 혈관신생 분석 시스템을 제시한다. 2D 단세포 분석 시스템과 비교하여, 이 공동 배양 스페로이드 분석 시스템은 생리학적 조건에서 관 구조를 형성하기 위해 두 혈관 세포 유형 사이의 보다 충실하게 세포 반응을 반영합니다. 그러나, 이 시스템은 생체 내 혈관신생의 복잡한 다단계 과정에 비해 지나치게 단순화된 채로 남아 있다. 생체 내 혈관 생성은 일반적으로 상피 세포, 섬유아세포, 면역 세포 및 풍부한 ECM 단백질을 포함한 다양한 다른 세포 유형의 다중 상호작용을 통해 발생합니다. 이 새로운 시스템의 미래 응용은 생리적 및/또는 병리학적 혈관신생을 보다 정확하게 반영하기 위해 다른 세포 유형 및 ECM의 도입을 포함한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 식품의약품안전처의 보조금(17172MFDDS215), 한국정부의 한국연구재단(NRF) 보조금(2017R1A2B4005463) 및 기초과학연구프로그램을 통해 지원되었다. 한국국립연구재단(NRF)은 교육부의 지원을 받아 (2016R1A6A1A1A03007648)을 지원한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA (1x) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) | Gibco | 21600-010 | PBS (10x) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1x) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
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