Das dreidimensionale Co-Kultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System wurde entwickelt, um die physiologische Angiogenese nachzuahmen. Co-Kultur-Sphäroide werden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet und in Kollagengel eingebettet. Das neue System ist wirksam für die Bewertung angiogener Modulatoren und liefert relevantere Informationen für die in vivo-Studie.
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Methodenartikel
Dreidimensionales Angiogenese-Assay-System mit Co-Culture-Spheroiden, die von endotheliaalen Koloniebildenden Zellen und mesenchymalen Stammzellen gebildet werden
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Studien auf dem Gebiet der Angiogenese haben in den letzten Jahrzehnten aggressiv zugenommen, mit der Erkenntnis, dass Angiogenese ein Kennzeichen von mehr als 50 verschiedenen pathologischen Erkrankungen ist, wie rheumatoide Arthritis, Okulopathie, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Tumormetastasen. Während der Entwicklung von Angiogenese-Medikamenten ist es entscheidend, In-vitro-Assay-Systeme mit geeigneten Zelltypen und geeigneten Bedingungen zu verwenden, um den physiologischen Angiogenese-Prozess widerzuspiegeln. Um die Einschränkungen der aktuellen In-vitro-Angiogenese-Assay-Systeme mit hauptsächlich Endothelzellen zu überwinden, haben wir ein dreidimensionales (3D) Co-Kultur-Sphäroid-Sprossen-Assay-System entwickelt. Co-Kultur-Sphäroide wurden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, endotheliaalen koloniebildenden Zellen (EFCCs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) mit einem Verhältnis von 5 zu 1 hergestellt. EFCCs+MSCs Sphäroide wurden in die Kollagenmatrix typ I eingebettet, um die extrazelluläre In-vivo-Umgebung nachzuahmen. Ein Echtzeit-Zellrekorder wurde verwendet, um kontinuierlich das Fortschreiten des angiogenen Keimens von Sphäroiden für 24 h zu beobachten. Live-Zell-Fluoreszenz-Etikettierungstechnik wurde auch angewendet, um die Lokalisation jedes Zelltyps während der Sprossenbildung zu traktieren. Das angiogene Potential wurde quantifiziert, indem die Anzahl der Sprossen gezählt und die kumulative Länge der aus den einzelnen Sphäroiden erzeugten Sprossen gemessen wurde. Pro Versuchsgruppe wurden fünf zufällig ausgewählte Sphäroide analysiert. Vergleichsexperimente zeigten, dass EFCCs+MSCs Spheroide eine höhere Sprossenzahl und kumulative Sprossenlänge zeigten als EFCCs-Sphäroide. Bevacizumab, ein von der FDA zugelassener Angiogenese-Hemmer, wurde mit dem neu entwickelten Co-Culture-Sphäroid-Assay-System getestet, um sein Potenzial zur Untersuchung antiangiogener Medikamente zu überprüfen. Der IC50-Wert für EFCCs+MSCs-Sphäroide im Vergleich zu den EFCCs-Sphäroiden war näher an der effektiven Plasmakonzentration von Bevacizumab, die aus dem Xenograft-Tumor-Mausmodell gewonnen wurde. Die vorliegende Studie legt nahe, dass das Sphäroid-Angiogenese-Assay-System von 3D-EFCCs+MSCs für die physiologische Angiogenese relevant ist und eine effektive Plasmakonzentration im Vorfeld von Tierversuchen vorhersagen kann.
Einleitung
Es wird erwartet, dass weltweit rund 500 Millionen Menschen von einer angiogenesemodulierenden Therapie bei vaskulären Fehlbildungen wie rheumatoider Arthritis, Okulopathie, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Tumormetastasen profitieren1. So ist die Entwicklung von Medikamenten, die die Angiogenese kontrollieren, zu einem wichtigen Forschungsgebiet in der pharmazeutischen Industrie geworden. Während des Arzneimittelentwicklungsprozesses ist eine in-vivo-Tierstudie notwendig, um die Auswirkungen von Wirkstoffkandidaten auf physiologische Funktionen und systemische Wechselwirkungen zwischen Organen zu untersuchen. Ethische und Kostenfragen haben jed....
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Protokoll
Human EFCCs wurden aus menschlichem peripherem Blut isoliert, wie in einem früheren Bericht27beschrieben. Kurz gesagt, wurde die mononukleäre Zellschicht mit dem Ficoll-Paque Plus vom Ganzen Blut getrennt und im richtigen Medium kultiviert, bis die endotheliaden Kolonien auftauchten. Kolonien wurden gesammelt und EFCCs wurden mit CD31-beschichteten Magnetperlen isoliert. MSCs wurden aus dem anhaftenden mononukleären Zellanteil (MNC) des menschlichen erwachsenen Knochenmarks isoliert. Das Studienprotokoll wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss der Duksung Women es University (IRB-Nr. 2017-002-01) genehmigt.
1. Zel....
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Ergebnisse
Vergleichsexperimente wurden mit Monokultur-Sphäroiden (nur EFCCs) und Co-Culture-Sphäroiden (EFCCs+MSCs) durchgeführt, um zu untersuchen, ob MSCs eine bedeutende Rolle bei der von EFCCs vermittelten Angiogenese spielen. Die Sprossenbildung aus jedem Sphäroid wurde 24 stunden lang von einem Echtzeit-Zellrecorder überwacht, der das Fortschreiten des angiogenen Keimens aus Sphäroiden erfassen konnte. Das angiogene Potenzial wurde quantifiziert, indem die Anzahl der Sprossen gezählt und die kumulative Länge der aus einzelne.......
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Diskussion
Die vorliegende Studie führt ein verbessertes In-vitro-Angiogenese-Assay-System ein, das Co-Kultur-Sphäroide verwendet, die von zwei menschlichen Vaskulärenvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet werden. Durch Wechselwirkung und Einbeziehung zwischen Endothelzellen und Pericyten erreicht. Im Vergleich zu anderen In-vitro-Angiogenese-Assays, die nur die von ECs vermittelte Angiogenese widerspiegeln, ist dieses Co-Kultur-Assay-System repräsentativer für die mehrstufige Kaskade der physiologischen Angiogenese, einschließlich z.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Danksagungen
Diese Forschung wurde durch ein Stipendium (17172MFDS215) des Ministeriums für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit, die von der koreanischen Regierung (MSIP) (2017R1A2B4005463) und dem Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) finanziert vom Bildungsministerium (2016R1A6A1A03007648).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsin EDTA (1x) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Handelsname: Avastin |
| Dulbecco Modifiziertes Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x) | Gibco | 21600-010 | PBS (10x) |
| Dulbeco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1x) |
| Wachstumsmedium für Endothelzellen MV2 Kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatine | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamin Penicillin– Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymales Stammzellwachstumsmedium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluoreszierende Zellvernetzer-Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluoreszierende Zellvernetzer-Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Natriumhydroxid | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Kollagengel Typ I | Corning | 354236 | |
| Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor A | R& D | 293-VE-010 | VEGF |
Referenzen
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvascular research. 74 (2-3), 172-183 (2007). ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
