Summary
Das dreidimensionale Co-Kultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System wurde entwickelt, um die physiologische Angiogenese nachzuahmen. Co-Kultur-Sphäroide werden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet und in Kollagengel eingebettet. Das neue System ist wirksam für die Bewertung angiogener Modulatoren und liefert relevantere Informationen für die in vivo-Studie.
Abstract
Studien auf dem Gebiet der Angiogenese haben in den letzten Jahrzehnten aggressiv zugenommen, mit der Erkenntnis, dass Angiogenese ein Kennzeichen von mehr als 50 verschiedenen pathologischen Erkrankungen ist, wie rheumatoide Arthritis, Okulopathie, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Tumormetastasen. Während der Entwicklung von Angiogenese-Medikamenten ist es entscheidend, In-vitro-Assay-Systeme mit geeigneten Zelltypen und geeigneten Bedingungen zu verwenden, um den physiologischen Angiogenese-Prozess widerzuspiegeln. Um die Einschränkungen der aktuellen In-vitro-Angiogenese-Assay-Systeme mit hauptsächlich Endothelzellen zu überwinden, haben wir ein dreidimensionales (3D) Co-Kultur-Sphäroid-Sprossen-Assay-System entwickelt. Co-Kultur-Sphäroide wurden von zwei menschlichen Gefäßzellvorläufern, endotheliaalen koloniebildenden Zellen (EFCCs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) mit einem Verhältnis von 5 zu 1 hergestellt. EFCCs+MSCs Sphäroide wurden in die Kollagenmatrix typ I eingebettet, um die extrazelluläre In-vivo-Umgebung nachzuahmen. Ein Echtzeit-Zellrekorder wurde verwendet, um kontinuierlich das Fortschreiten des angiogenen Keimens von Sphäroiden für 24 h zu beobachten. Live-Zell-Fluoreszenz-Etikettierungstechnik wurde auch angewendet, um die Lokalisation jedes Zelltyps während der Sprossenbildung zu traktieren. Das angiogene Potential wurde quantifiziert, indem die Anzahl der Sprossen gezählt und die kumulative Länge der aus den einzelnen Sphäroiden erzeugten Sprossen gemessen wurde. Pro Versuchsgruppe wurden fünf zufällig ausgewählte Sphäroide analysiert. Vergleichsexperimente zeigten, dass EFCCs+MSCs Spheroide eine höhere Sprossenzahl und kumulative Sprossenlänge zeigten als EFCCs-Sphäroide. Bevacizumab, ein von der FDA zugelassener Angiogenese-Hemmer, wurde mit dem neu entwickelten Co-Culture-Sphäroid-Assay-System getestet, um sein Potenzial zur Untersuchung antiangiogener Medikamente zu überprüfen. Der IC50-Wert für EFCCs+MSCs-Sphäroide im Vergleich zu den EFCCs-Sphäroiden war näher an der effektiven Plasmakonzentration von Bevacizumab, die aus dem Xenograft-Tumor-Mausmodell gewonnen wurde. Die vorliegende Studie legt nahe, dass das Sphäroid-Angiogenese-Assay-System von 3D-EFCCs+MSCs für die physiologische Angiogenese relevant ist und eine effektive Plasmakonzentration im Vorfeld von Tierversuchen vorhersagen kann.
Introduction
Es wird erwartet, dass weltweit rund 500 Millionen Menschen von einer angiogenesemodulierenden Therapie bei vaskulären Fehlbildungen wie rheumatoider Arthritis, Okulopathie, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Tumormetastasen profitieren1. So ist die Entwicklung von Medikamenten, die die Angiogenese kontrollieren, zu einem wichtigen Forschungsgebiet in der pharmazeutischen Industrie geworden. Während des Arzneimittelentwicklungsprozesses ist eine in-vivo-Tierstudie notwendig, um die Auswirkungen von Wirkstoffkandidaten auf physiologische Funktionen und systemische Wechselwirkungen zwischen Organen zu untersuchen. Ethische und Kostenfragen haben jedoch die Bedenken in Bezug auf Tierversuche verstärkt2. Daher sind verbesserte In-vitro-Assay-Systeme erforderlich, um genauere und berechenbarere Daten zu erhalten, die zu einer besseren Entscheidungsfindung vor Tierversuchen führen. Aktuelle In-vitro-Angiogenese-Assays messen in der Regel proliferations-, Invasions-, Migrations- oder tubuläre Strukturbildung von Endothelzellen (ECs), die in zweidimensionalen (2D) Kulturplattengesätsind 3 . Diese 2D-Angiogenese-Assays sind schnell, einfach, quantitativ und kostengünstig und haben wesentlich zur Entdeckung von Angiogenese-modulierenden Medikamenten beigetragen. Einige Fragen müssen jedoch noch verbessert werden.
Solche 2D-In-vitro-Assay-Systeme können keine komplexen mehrstufigen Ereignisse der Angiogenese widerspiegeln, die in in vivo physiologischen Bedingungen auftreten, was zu ungenauen Ergebnissen führt, die Diskrepanzen zwischen In-vitro-Assay-Daten und klinischen Studienergebnissen verursachen4. 2D-Kulturbedingungen induzieren auch die Veränderung der zellulären Phänotypen. Zum Beispiel haben ECs nach der Proliferation in 2D-Kulturplatten einen schwachen zellulären Phänotyp, der sich durch eine reduzierte Expression von CD34 und mehrere Signale manifestiert, die die zellulären Antworten steuern5,6. Um die Grenzen von 2D-Kultur-basierten Angiogenese-Assay-Systemen zu überwinden, wurden dreidimensionale (3D) Sphäroid-Angiogenese-Assay-Systeme entwickelt. Sprouting gefolgt von röhrenförmiger Strukturbildung aus Sphäroiden, die von ECs gebildet werden, reflektieren in vivo Neovaskularisationsprozesse7,8. So wurde der 3D-Sphäroid-Angiogenese-Assay als wirksames Assay-System zum Screening potenzieller Pro- oder Anti-Angiogenese-Medikamente betrachtet.
Die meisten 3D-Sphäroid-Angiogenese-Assays verwenden nur ECs, hauptsächlich menschliche Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVECs) oder menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs), um sich auf die zelluläre Reaktion von ECs während der Angiogenese zu konzentrieren. Die Blutkapillaren bestehen jedoch aus zwei Zelltypen: ECs und Pericyten. Die Ausarbeitung einer bidirektionalen Interaktion zwischen ECs und Pericyten ist entscheidend für die richtige Gefäßintegrität und -funktion. Mehrere Krankheiten, wie erblicher Schlaganfall, diabetische Retinopathie und venöse Fehlbildung, sind mit veränderter Pericytdichte oder verminderter Pericyt-Anhaftung an das Endothel9verbunden. Pericyten sind auch als Schlüsselelement des angiogenen Prozesses bekannt. Perizyten werden rekrutiert, um neu gebildete Gefäßstrukturen durch ECs zu stabilisieren. In dieser Hinsicht enthält Mono-Kultur Sphäroid Angiogenese Assay keine Pericyten7,10. Daher können Co-Kultur-Sphäroide, die durch ECs und Pericyte gebildet werden, einen wertvollen Ansatz bieten, um physiologische angiogene Ereignisse genauer nachzuahmen.
Die vorliegende Studie zielte darauf ab, einen 3D-Kokultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay mit einer Kombination von humanen endotheliaalen Koloniebildenden Zellen (EFCKw) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) zu entwickeln, um die In-vivo-Angiogenese genauer widerzuspiegeln. Das Co-Kultur-Sphäroidsystem als In-vitro-Repräsentationsassembly eines normalen Blutgefäßes wurdeerstmals 2001 von Korff et al. gegründet. Sie kombinierten HUVECs und menschliche Nabelarterie glatte Muskelzellen (HUSMCs), und zeigten, dass die Kokultur von zwei reifen Gefäßzellen das Keimpotenzial verringerte. Reife ECs (HUVECs) sind dafür bekannt, nach und nach ihre Fähigkeit zu vermehren und zu differenzieren, was sich negativ auf ihre Angiogenese-Antworten auswirkt12,13. Reife perivaskuläre Zellen (HUSMCs) können eine Endothelzellinaktivierung durch Abrogation des vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktors (VEGF) anregung11verursachen. Der Hauptunterschied zwischen Korffs und unserem Co-Kultur-Sphäroidsystem sind die verwendeten Zelltypen. Wir wandten zwei vaskuläre Vorläufer, EFCKw und MSCs, an, um ein geeignetes Angiogenese-Assay-System zu etablieren, um pro-oder-antiangiogene Wirkstoffe zu untersuchen und zu untersuchen. Die EFC-Staaten sind die Vorläufer von ECs. Die EFCKW verfügen über eine robuste Proliferationskapazität im Vergleich zu ausgereiften ECs14, die es ermöglichen, die Begrenzung der ECs zu überwinden. EFCKW tragen zu einer neuen Gefäßbildung unter vielen postnatalen pathophysiologischen Erkrankungenbei 15,16,17. MSCs sind pluripotente Stammzellen, die in pericyte differenzieren können und so zur Angiogenesebeitragen 18,19.
In früheren Berichten zeigten EFCCs und MSCs synergistische Effekte auf die In-vitro-Rohrbildung20, in vivo Neo-Vaskularisation21,22und verbesserte Reperfusion von ischämischen Geweben23,24. In der vorliegenden Studie wurden EFCCs und MSCs verwendet, um Co-Kultur-Sphäroide zu bilden und in Kollagengel Typ I eingebettet, um eine in vivo 3D-Umgebung widerzuspiegeln. Kollagen gilt als hauptbestandteil der extrazellulären Matrix (ECM) um ECs25. Das ECM spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Zellverhaltens26. Das hier vorgeschlagene Assay-Protokoll kann innerhalb von zwei Tagen mit gängigen Labortechniken einfach und schnell durchgeführt werden. Für eine effektive Zellverfolgung während des Keimvorgangs kann jeder Zelltyp mit einem Echtzeit-Zellrecorder fluoreszierend beschriftet und überwacht werden. Das neu eingerichtete 3D-Cokultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System wurde entwickelt, um die Empfindlichkeit für die Bewertung potenzieller angiogener Modulatoren zu erhöhen und vorher im Vorfeld der in vivo-Studie vorhersagbare Informationen bereitzustellen.
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Protocol
Human EFCCs wurden aus menschlichem peripherem Blut isoliert, wie in einem früheren Bericht27beschrieben. Kurz gesagt, wurde die mononukleäre Zellschicht mit dem Ficoll-Paque Plus vom Ganzen Blut getrennt und im richtigen Medium kultiviert, bis die endotheliaden Kolonien auftauchten. Kolonien wurden gesammelt und EFCCs wurden mit CD31-beschichteten Magnetperlen isoliert. MSCs wurden aus dem anhaftenden mononukleären Zellanteil (MNC) des menschlichen erwachsenen Knochenmarks isoliert. Das Studienprotokoll wurde vom institutionellen Prüfungsausschuss der Duksung Women es University (IRB-Nr. 2017-002-01) genehmigt.
1. Zellkultur
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Vorbereitung von EFCCs und MSCs Mittel- und Beschichtungsplatten
- Bereiten Sie das Endothelzellwachstumsmedium MV2 (ECGM-MV2, außer Hydrocortison) vor, ergänzt durch 10% fetales Rinderserum (FBS) und 1% Glutamin-Penicillin-Streptomycin (GPS).
- Bereiten Sie mesenchymale Stammzellwachstum Medium-2 (MSCGM-2) mit 10% FBS und 1% GPS vor.
- Für die ECFC-Kultur die Zellkulturplatten mit 1% Gelatinelösung beschichten. Um 1% Gelatinelösung herzustellen, 1 g Gelationspulver in 500 ml PBS mit dem Magnetrührer auflösen und mit Autoklaven sterilisieren. Platten können mit 3 ml/60 mm, 5 ml/100 mm oder 15 ml/150 mm 1% Gelatinelösung beschichtet werden. Inkubationsbeschichtete Platten für 15 min in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C und 5%CO2). Danach die verbleibende 1% Gelatinelösung durch Aspiration entfernen und die beschichteten Platten einmal mit PBS waschen.
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Wachsende EFCCs und MSCs
- Samen 1 x 106 EFCKw auf 1% gelatinebeschichteten 150 mm Platten und wachsen mit ECGM-MV2 (10% FBS, 1% GPS) in einem Zellkultur-Inkubator (37°C und 5%CO2)bis 80-90% Konfluenz. Verwenden Sie EFCCs an den Durchgangsnummern 7-10, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
- Samen 1 x 106 MSCs auf unbeschichteten 150-mm-Platten und wachsen mit MSCGM-2 in einem Zellkultur-Inkubator (37°C und 5%CO2)bis 80-90% Konfluenz. Verwenden Sie MSCs an den Durchgangsnummern 7-10, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
2. Herstellung von 1,2% w/v Methylcelluloselösung
- 6 g Methylcellulose in einer 500 ml Glasflasche messen und in einem Autoklaven sterilisieren.
- ECGM-MV2 (ohne FBS und GPS) 20 min bei 60 °C erhitzen und 250 ml erhitztem ECGM-MV2 zu sterilisiertem Methylcellulosepulver hinzufügen. Um sterile Bedingungen zu erhalten, führen Sie den Prozess innerhalb der Durchflusshaube durch.
- Fügen Sie einen sterilisierten magnetischen Rührstab hinzu und mischen Sie die Lösung 20 min auf dem Magnetrührer, bis die Methylcellulose gründlich benetzt und gleichmäßig ohne Klumpen dispergiert ist. 250 ml kalt (4 °C) ECGM-MV2 (ohne FBS und GPS) unter den sterilen Zustand geben und zusätzlich 10 min am Magnetrührer mischen. Dann kühlen Sie die Lösung im Kühlschrank (4 °C) über Nacht.
HINWEIS: Methylcellulose ist ein Kohlenhydratpolymer, das sich bei kühlen Temperaturen durch Schwellung und anschließende Hydratation gut auflöst. - Am nächsten Tag aliquot die Lösung in einem 50 ml Rohr und Zentrifuge bei 5.000 x g für 3 h bei 4 °C. Nehmen Sie die klare viskose Überstandlösung und lagern Sie bei 4 °C bis zur Anwendung bis zu 3-6 Monate.
HINWEIS: Das Sediment kann Restzellulosefasern enthalten, so nehmen Sie vorsichtig die überstande Lösung hinter sich und hinterlassen mindestens 5 ml Volumen. Dieses Volumen kann an die experimentellen Bedingungen angepasst werden.
3. Generierung und Einbettung von EFCCs nur, MSCs-only und EFCCs-MSCs Spheroids
Tag 1
- Vorbereiten von EFCCs und MSCs-Zellsuspension
- Waschen Sie die 80-90% konfluenten EFCKw und MSCs, indem Sie Phosphatgepufferte Saline (PBS) ohne Kalzium und Magnesium und Aspirat hinzufügen.
- Um EFCCs und MSCs von der Kulturplatte zu lösen, inkubieren Sie sie mit 0,05% Trypsin-EDTA für 3 min und 5 min in einem Zellkultur-Inkubator (37°C bzw. 5%CO2),bzw. in einem Zellkultur-Inkubator.
- Inaktivieren Sie Trypsin, indem Sie DMEM-Medium mit 10% FBS und 1% GPS hinzufügen. Pipette die Zellen nach oben und unten, um eine einzelne Zellsuspension zu erstellen.
- Sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 282 x g für 5 min bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie die Zellen im jeweiligen Medium erneut aus.
- Kennzeichnung von EFCKw und MSCs mit Fluoreszenzfarbstoff
HINWEIS: Führen Sie die Zellmembrankennzeichnung von EFCKw mit PKH67 (grün) und MSCs mit PKH26 (roter) Fluoreszenzfarbstoff nach den Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Modifikationen wie folgt durch.- Waschen Sie die Zellen zweimal mit serumfreiem Medium, um FBS zu entfernen.
HINWEIS: Proteine und Lipide in FBS reduzieren die effektive Farbstoffkonzentration für die Kennzeichnung von Zellen durch Bindung. - Zählen Sie EFCCs und MSCs mit einem Hämozytometer unter dem Mikroskop und übertragen Sie 3 x 106 EFCKw und 2 x 106 MSCs in 2 ml Mikroröhren.
HINWEIS: Dies sind die optimalen Zelldichten für die Kennzeichnung von Zellen mit Farbstoffen. Die Verwendung einer großen Anzahl von Zellen verursacht schlechte und heterogene Färbung, während die Verwendung von zu wenigen Zellen zu einer schlechten Zellwiederherstellung führt. - Zentrifugieren Sie die Rohre bei 100 x g für 5 min bei RT, um ein Zellpellet zu erhalten. Sorgsam den Überstand ansaugen und nicht mehr als 15-25 l Restvolumen lassen.
- EFCCs und MSCs in 250 l Verdünnungsmittel C aus dem Farbstoff-Kit wieder aussetzen. Führen Sie die Zellsuspension vorsichtig durch, um eine vollständige Dispersion zu gewährleisten.
HINWEIS: Verdünnungsmittel C ist ein physiologisches Salz und kann die Färbeeffizienz von Farbstoff enden, indem Mizellen gebildet werden. Lassen Sie daher zellennicht lange in Verdünnungs-C stehen und wirbeln Sie die Rohre nicht aus. - Bereiten Sie die Färbelösung für EFCKW vor, indem Sie 5 l PKH67 bis 250 L Diluent C (Endkonzentration von 20 m) und für MSCs hinzufügen, indem Sie 3 l PKH26 bis 250 L Diluent C (Endkonzentration von 12 m) hinzufügen.
HINWEIS: Die endgültigen Farbstoffkonzentrationen unterscheiden sich von den Empfehlungen des Herstellers. Eine hohe Konzentration würde zu Zellverklumpung und Zelltoxizität führen. Eine geringe Konzentration würde für die Färbung nicht ausreichen. - Fügen Sie 250 L EFCCs Zellsuspension zu 250 l Der PKH67-Farbstofflösung und 250 l MSCs zu 250 l Der Farblösung PKH26 hinzu. Mischen Sie die Zellen sofort mit Farbstoffen, indem Sie auf und ab pfeifen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Für bessere Ergebnisse, decken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie und legen Sie auf einen Shaker, um eine ausreichende Mischung während der Färbung zu gewährleisten.
- Beenden Sie den Färbevorgang, indem Sie 0,5 ml FBS zur gebeizten Zellsuspension hinzufügen, und brüten Sie dann 1 min, damit FBS überschüssigen ungebundenen Farbstoff binden kann. Sedimentieren Sie die gefärbten Zellen durch Zentrifugieren bei 100 x g für 5 min.
HINWEIS: EFCCs und MSCs Pellets sind nach der Färbung hellgelb bzw. rosa. - Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und waschen Sie die Zellen zwei Mal mit komplettem Medium, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 100 x g für 5 min und hängen Sie das Pellet in 2 ml jedes komplette Medium wieder auf.
- Waschen Sie die Zellen zweimal mit serumfreiem Medium, um FBS zu entfernen.
- Generieren von ECFC-, MSC- oder ECFC+MSC-Sphäroiden
HINWEIS: Wenden Sie die Hängendrop-Technik an, um Sphäroide zu erzeugen, wie zuvorbeschrieben 28. Die Schritte zur Herstellung von Sphäroiden sind unten angegeben.- Zählen Sie die gebeizten EFCCs und MSCs.
- Aussetzen von gebeizten EFCKW, MSCs oder EFCCs+MSCs in ECGM-MV2 mit 20 % Methylcelluloselösung und 5 % FBS. Bereiten Sie bei einer Zelldichte von 4 x 104 Zellen/ml für EFCCs oder MSCs vor (25 l Zellsuspension enthält 1.000 Zellen). Für zwei Zellsuspensionen von EFCKw und MSCs bei einer Zelldichte von 2 x 104 Zellen/ml-EFCKw und 0,4 x 104 Zell-/ml-MSCs (25 l enthält 500 EFCKW und 100 MSCs)
HINWEIS: Das Verhältnis von EFCCs zu MSCs sollte 5:1 nicht überschreiten. Eine größere Anzahl von MSCs könnte zu übermäßiger Migration und unregelmäßiger Sprossenmorphologie führen. Eine kleinere Anzahl von MSCs könnte zu einer schlechten Interaktion zwischen Zellen führen, was zu einer schlechten Keimung führen könnte. - Bereiten Sie eine Hydratationseinheit vor, indem Sie 15 ml PBS in den Boden einer 150-mm-Kulturplatte einfügen.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in das sterilisierte polystyrolrechteckige Reservoir für den Einsatz von Mehrkanalpipetten. Dispergieren Sie die Zellsuspension gleichmäßig durch Pipettieren.
- Legen Sie 25 L Tropfen Zellsuspension auf die Abdeckung einer 150 mm Kulturplatte mit einer Mehrkanalpipette ab (ca. 100 Tropfen/Abdeckung der 150 mm Platte). Invertieren Sie die Abdeckung über eine PBS-gefüllte Hydratationseinheit und inkubieren Sie in einem Zellkultur-Inkubator für 24 h.
HINWEIS: Die Methylcelluloselösung bietet eine angemessene Viskosität der Suspensionslösung. Wenn die Hängetropfenmethode ohne Methylcelluloselösung durchgeführt wurde, wurden Tropfen leicht nach unten gerutscht, wenn die Abdeckung invertiert wurde (Ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus waren die Sphäroide nach nächtlicher Inkubation ohne Methylcelluloselösung nicht perfekt ausgebildet. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass eine richtige Viskosität durch Methylcelluloselösung notwendig ist, um eine runde Form der Sphäroide zu bilden.
Tag 2
- Embeding Spheroide in neutralisiertes Kollagengel
- Warm es FBS und ECGM-MV2 (ohne FBS und GPS) im Wasserbad (37 °C). Legen Sie kalte Methylcelluloselösung auf eine Arbeitsbank, um raumtemperaturzuwirken.
- Legen Sie eine 24-Well-Platte in einen Zellkultur-Inkubator (37 °C) für die Erwärmung.
- Schneiden Sie die spitzen 1 ml Pipettenspitzen 3-5 mm, um Sphäroide und viskose Suspensionen, wie Methylcelluloselösung und Kollagen Typ I, bequem und genau zu aspirieren.
- Bereiten Sie 3 mg/ml neutralisierte Art I Kollagengel auf Eis nach der Art I Kollagen gel Hersteller Anweisung.
HINWEIS: Die Neutralisation sollte auf Eis durchgeführt werden, um eine Gelation von Kollagen bei Raumtemperatur zu vermeiden. Für einen Brunnen einer 24-Well-Platte werden 500 l neutralisiertes Kollagen benötigt. Bereiten Sie immer 1 ml zusätzliches Kollagenvolumen vor. Kollagengel kann nach der Neutralisation bis zu 2-3 h verwendet werden, wenn es auf Eis gehalten wird. - Ernten Sie die Sphäroide, indem Sie die Abdeckung mit Sphäroiden mit 5 ml PBS spülen. Sammeln Sie sphäroidsuspendierte Lösung in einem 50 ml konischen Rohr. Spülen Sie die Abdeckung mit 5 ml PBS neu, um die restlichen Sphäroide zu erhalten.
HINWEIS: Während der Ernte, genau beobachten, um die Existenz von Sphäroiden zu bestätigen. Für eine visuelle Inspektion, übertragen Sie etwa 50-100 l sphäroid-aufgehängte Lösung auf das Gleitglas, und überprüfen Sie die runde Form der Sphäroide unter dem Mikroskop. - Die Sphäroide durch Zentrifugieren bei 282 x g für 5 min. Den Überstand sorgfältig entsorgen, ohne die Sphäroide zu stören, die nicht mehr als 100-200 l Restvolumen hinterlassen.
- Tippen Sie vorsichtig auf die Wand des Rohres, so dass Sphäroide in der verbleibenden Restlösung von 100-200 l frei aufgehängt werden.
- ECGM-MV2 mit 5% FBS und 40% Methylcelluloselösung in das sphäroidhaltige Röhrchen geben. Das hinzugefügte Volumen wird anhand von ca. 100 Sphäroiden/ml bestimmt. Mischen Sie die Sphäroid-Aufhängung vorsichtig durch Pipettieren mit einer stumpfen 1 ml Pipettenspitze.
HINWEIS: Methylcellulose-Lösung ist weit verbreitet als Suspending-Agent, der sphäroide nicht sedimentieren lässt. Die FBS-Konzentration sollte 5 % betragen. Eine höhere FBS-Konzentration verursacht abnormales Keimen aufgrund übermäßiger Wachstumsfaktoren. Eine niedrigere FBS-Konzentration kann keine gesunden Bedingungen für Zellen aufrechterhalten. - Sphäroid-Suspensionslösung und neutralisiertes I Kollagengel (3 mg/ml) im Verhältnis 1:1 auf Eis mischen. Verwenden Sie eine stumpfe 1 ml Pipettenspitze, um ein Bruch von Sphäroiden zu vermeiden.
HINWEIS: 1 ml der sphäroiden-suspendierenden Kollagengellösung ist für einen Brunnen einer 24-Well-Platte erforderlich. Machen Sie nach Möglichkeit eine zusätzliche gemischte Suspensionslösung. - Wenn die angiogenen Eigenschaften von Wirkstoffen oder Chemikalien getestet werden müssen, übertragen Sie 1 ml der sphäroid-suspendierenden Kollagengellösung in ein 1 ml Mikrorohr und fügen Sie Mittel oder Chemikalien hinzu, gefolgt von einem sanften Mischen mit einer stumpfen 1ml Pipettenspitze.
HINWEIS: Das Volumen von Wirkstoff enden und chemisch können sich auf 200 ml beziffern, was die Kollagen-Gel-Konzentration typI von 1,5 mg/ml auf 1,25 mg/ml verdünnt, aber keine Auswirkungen auf die Kollagen-Gelpolymerisation typ I hat. Fügen Sie die gleiche Fahrzeugmenge zu den Steuersphäroiden hinzu. - Fügen Sie die sphäroid-suspendierende Kollagengellösung in Die Brunnen einer vorgewärmten 24-Well-Platte (0,9 ml/well) durch Pipettieren ein und inkubieren Sie dann 30 min in einem Zellkultur-Inkubator zur Polymerisation.
HINWEIS: Während des Sphäroid-Einbettungsprozesses das Gel nicht durch Aufsetzen der Platte stören. - Bedecken Sie das sphäroid-suspendierende Kollagengel, indem Sie 100 l ECGM-MV2 hinzufügen, die 2,5 % FBS mit/ohne VEGF enthalten. Bei NUR ECFC-Sphäroiden stimulieren Sie die Zellen mit exogener Zugabe von VEGF (Endkonzentration von 50 ng/ml), um richtige Sprossen zu bilden. ECFC+MSC Sphäroide erfordern keine exogene Stimulation durch Wachstumsfaktoren.
- Legen Sie die Platte in einen Echtzeit-Zellrecorder, der in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C und 5%CO2)installiert ist, und konzentrieren Sie sich nach dem Zufallsprinzip auf 5-10 Sphäroide (10x Objektivlinse). Überwachen Sie die Keimbildung der einzelnen fluoreszenzbeschriftten Sphäroide alle 1 h für 24 h ohne Störungen.
4. Quantitate Spheroid Sprouting
- Importieren Sie die Bilddateien in die ImageJ-Software, um die Anzahl der Sprossen zu quantisieren und die Länge jedes Sprossens zu messen. Für Co-Kultur-Sphäroide, kennzeichnen Sie EFCCs mit grünem Fluoreszenzfarbstoff, bevor Sie Sphäroide herstellen. Messen Sie dann die Anzahl und Länge der mit grüner Fluoreszenz gebeizten Sprossen (Ergänzende Abbildung 2). Pro Versuchsgruppe wurden fünf zufällig ausgewählte Sphäroide quantifiziert.
HINWEIS: Sprossen sind kollaborativ verlängerte Strukturen, die durch mehrere EFCCs gebildet werden, die sich aus Sphäroiden erstrecken. Die Sprossenlänge wird gemessen, da die Länge vom Punkt des Sprossenursprungs von der Oberfläche der Sphäroide bis zur Spitze der Sprossen ist. - Geben Sie die Werte als Mittel -SEM von mindestens drei unabhängigen Experimenten aus. Bestimmen Sie den statistisch signifikanten Unterschied durch einwegig esAGfür mehrere Vergleiche oder den Schüler-t-Testfür gekoppelte Vergleiche.
ANMERKUNG: P -0,05 gilt als statistisch signifikant.
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Representative Results
Vergleichsexperimente wurden mit Monokultur-Sphäroiden (nur EFCCs) und Co-Culture-Sphäroiden (EFCCs+MSCs) durchgeführt, um zu untersuchen, ob MSCs eine bedeutende Rolle bei der von EFCCs vermittelten Angiogenese spielen. Die Sprossenbildung aus jedem Sphäroid wurde 24 stunden lang von einem Echtzeit-Zellrecorder überwacht, der das Fortschreiten des angiogenen Keimens aus Sphäroiden erfassen konnte. Das angiogene Potenzial wurde quantifiziert, indem die Anzahl der Sprossen gezählt und die kumulative Länge der aus einzelnen Sphäroiden erzeugten Sprossen gemessen wurde. Fünf zufällig ausgewählte Sphäroide pro Versuchsgruppe wurden analysiert. Bei EFCCs+MSCs Spheroiden war die Anzahl der Sprossen und die kumulative Sprossenlänge im Vergleich zu den EFCCs-Sphäroiden zu allen Zeitpunkten signifikant höher(Abbildung 1A-C). Die Anzahl und Länge der Sphäriden/MSCs-Sphäriden stiegen kontinuierlich um 12 h, aber Anzahl und Länge der EFCCs-Sphäroide nahmen um 6 h zu und änderten sich zu späteren Zeitpunkten nicht (Abbildung 1B,C). Darüber hinaus waren Sprossen, die von EFCCs+MSCs Sphäroiden gebildet wurden, dicker und haltbarer als die, die von EFCCs-nur-Sphäroiden mit/ohne VEGF-Behandlung gebildet wurden (Abbildung 1Aund Ergänzendes Video 1A,B,D). Sprossen nur msCs bildeten keine Sprossen, sondern zeigten eine individuelle Migration von MSCs außerhalb von Sphäroiden (Abbildung 1A und Ergänzendes Video 1C). Diese Ergebnisse zeigen den signifikanten Beitrag von MSCs, Pericyt-Vorläufern, zur zellulären Angiogenese von EFCCs. MSCs sind dafür bekannt, verschiedene Wachstumsfaktoren zu sezernieren29, die EFCKw dazu anregen können, Sprossen und röhrenförmige Strukturen zu bilden.
EFCCs wurden mit grünfluoreszierendem Farbstoff gekennzeichnet und MSCs wurden mit rotfluoreszierendem Farbstoff gekennzeichnet, bevor sie kombiniert wurden, um EFCCs+MSCs Sphäroide zu erzeugen. Zusammen mit Der Echtzeitaufzeichnung kann diese Live-Zell-Fluoreszenz-Etikettierungstechnik die zellulären Bewegungen von EFCCs und MSCs während der Sprossenbildung verfolgen. Fluoreszierende Bildgebung zeigte, dass EFCCs-vermittelte Sprossenstrukturen mit MSCs abgedeckt wurden (Abbildung 2 und ergänzendes Video 2). Dies deutet darauf hin, dass kombinierte MSCs während der Sprossenbildung als perivaskuläre Zellen fungieren, die die Stabilität und Haltbarkeit des Sprossens durch die enge Verbindung zwischen zwei Gefäßzellen verbessern.
Das neu entwickelte Co-Kultur-Sphäroid-Assay-System wurde mit Bevacizumab, einem von der FDA zugelassenen Angiogenese-Hemmer, getestet, um sein Potenzial zur Untersuchung antiangiogener Medikamente zu überprüfen. EFCCs+MSCs Spheroide, die mit Bevacizumab vorbehandelt wurden, zeigten eine verringerte Sprossenzahl und kumulative Sprossenlänge in dosisabhängiger Weise im Vergleich zu Kontroll-EFCCs+MSCs-Sphäroiden (Abbildung 3A,B). In parallelen Experimenten zeigten eFCCs-nur Sphäroide, die mit Bevacizumab vorbehandelt wurden, gefolgt von einer Stimulation mit VEGF (50 ng/ml), ebenfalls eine verringerte VEGF-induzierte Sprossenzahl und kumulative Sprossenlänge in dosisabhängiger Weise (Abbildung 3C,D) . Bemerkenswert ist, dass die IC50-Werte von Bevacizumab zur Hemmung der kumulativen Sprossenlänge in EFCCs+MSCs-Sphäroiden 46-mal größer waren als die in EFCCs-nur-Sphäroiden (Tabelle 1). Dieses Ergebnis impliziert stark, dass eine höhere Konzentration erforderlich ist, um die physiologisch relevante Gefäßbildung durch EFCCs und MSCs zu hemmen, verglichen mit der Konzentration, die nur zur Hemmung der EG-vermittelten Gefäßbildung erforderlich ist.
Als nächstes wurde ein Xenograft-Tumor-Maus-Modell mit Bevacizumab-Behandlung durchgeführt, um zu zeigen, welches Sphäroidsystem vorhersehbare Daten liefert, die mit der in vivo effektiven Plasmakonzentration korrelieren. Das vom Menschen abgeleitete Glioblastom U87MG-Red-FLuc-Zelllinie wurde subkutan an immungeschwächte Mäuse injiziert. Nach der Bestätigung der Tumorbildung nach 1 Woche wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in 3 Gruppen eingeteilt, die verschiedene Behandlungen erhielten: Kontrolle (0 mg/kg), niedrige Dosis (1 mg/kg) und hohe Dosis (30 mg/kg). Das Tumorwachstum wurde in der 30 mg/kg-behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant gehemmt (Zusatzabbildung 3A). Die 1 mg/kg behandelte Gruppe zeigte eine Tendenz zur Tumorabnahme, aber es gab keinen statistischen Unterschied im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Mausplasmakonzentration bei 3 Wochen Bevacizumab-Behandlung betrug 568,0 x 40,62 g/ml bei 30 mg/kg und 38,1 bis 0,72 g/ml bei 1 mg/kg(Zusatzabbildung 3B). Insbesondere wurde die Plasmakonzentration von Bevacizumab mit wirksamer Hemmung (568,0 x 40,62 g/ml bei 30 mg/kg für eine 3-wöchige Behandlung) durch EFCCs+MSCs-Sphäroide (1261,5,214,49 g/ml) erreicht, jedoch nicht durch EFCCs-nur Sphäroide (27,0 x 9,97 g/ml). So kann das EFCCs+MSCs Sphäroid-Angiogenese-Assay-System als geeignetes Assay-System zur Vorhersage einer effektiven Plasmakonzentration im Vorfeld von Tierversuchen betrachtet werden.
Abbildung 1: Sprossenbildung aus Nur-EFCCs, nur MSCs und EFCCs+MSCs-Sphäroiden. (A) Repräsentative Bilder der Sprossenbildung von EFCCs-only,MSCs-only und EFCCs+MSC Spheroids eingebettet in Typ I Kollagengel bei 0, 6, 12, 18 und 24 h (Scale bar = 100 m). (B) Quantitatives Diagramm der Sprossenzahl, die aus EFCCs-only- und EFCCs+MSCs-Sphäroiden gebildet wird (mittelwertig, n = 3). (C) Quantitatives Diagramm der kumulativen Sprossenlänge, die aus EFCCs-only- und EFCCs+MSCs-Sphäroiden gebildet wird (mittelwertig, n = 3). * zeigt signifikante Unterschiede zwischen EFCCs-only und EFCCs+MSCs Sphäroiden gleichzeitig an (p-0,05). - gibt einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen an, die durch eine Klammer angezeigt werden (p - 0,05). Diese Zahl wurde von einer früheren Veröffentlichung30geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Lokalisierung von EFCCs und MSCs in Sprossenstrukturen. Repräsentative Bilder, die Standorte von zwei Zelltypen in Sprossenstrukturen nach 24 h zeigen. EFCCs und MSCs wurden fluoreszierend mit PKH67 (grün) bzw. PKH26 (rot) gekennzeichnet und führten 3D EFCCs+MSCs sphäroidangiogenesis assay durch. Pfeile zeigen, dass MSCs mit EFCCs-vermittelten Sprossenstrukturen abgedeckt wurden (Scale bar = 100 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Hemmende Wirkung von Bevacizumab auf die Sprossenbildung von EFCCs+MSCs und EFCCs-nur-Sphäroiden. EFCCs+MSCs und EFCCs-sphäroide wurden mit Bevacizumab behandelt, und die Sprossenbildung wurde 24 h überwacht. (B) Quantitative randalierte Graphder der kumulativen Sprossenlänge von EFCCs+MSCs Sphäroiden, die mit Bevacizumab behandelt wurden (mittelwertig, n = 3). (C) Quantitatives Diagramm der Sprossenzahl von VEGF-stimulierten EFCCs-nur-Sphäroiden, die mit Bevacizumab behandelt wurden (mittelartig, n = 3). (D) Quantitativer Graph der kumulativen Sprossenlänge von VEGF-stimulierten EFCCs-nur-Sphäroiden, die mit Bevacizumab behandelt wurden (mittelartig, n = 3). * zeigt einen signifikanten Unterschied zur Kontrollgruppe (weißer Balken) (p -0,05). - gibt einen signifikanten Unterschied zur VEGF-behandelten Gruppe (schwarzer Balken) an (p -0,05). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| zeit h) |
IC50 (g/ml) von Avastin | p-Wert | |
| EFCCs-Sphäroid | EFCCs+MSCs Sphäroid | ||
| 6 | 94,62 € 38,53 | 3058,21 € 373,31 | 0.003 |
| 12 | 58,61 € 17,80 | 2006 bei 484,73 | 0.015 |
| 18 | 83,38 bei 54,54 | 1509,51 € 483,88 | 0.042 |
| 24 | 27,04 € 9,97 | 1261,51 € 214,49 | 0.0045 |
Tabelle 1: IC50-Werte von Bevacizumab zur Hemmung der kumulativen Sprossenlänge entweder in EFCCs-only- oder EFCCs+MSCs-Sphäroiden. EFCCs-Sphäroide wurden mit Bevacizumab behandelt, gefolgt von einer Stimulation mit VEGF (50 ng/ml), die für die Keimbildung aus EFCCs-nur-Sphäroiden erforderlich ist. EFCCs+MSCs Sphäroide wurden ohne VEGF-Stimulation mit Bevacizumab behandelt. Beide Sphäroide eingebettet in Typ I Kollagengel, und Sprossenbildung von jedem Sphäroid wurde für 24 h mit einem Echtzeit-Zellrecorder beobachtet. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt: SEM (n = 3).
Ergänzende Abbildung 1: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 2: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 3: Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Ergänzendes Video 1C: Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzuzeigen. (Rechtsklick zum Download.)
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Discussion
Die vorliegende Studie führt ein verbessertes In-vitro-Angiogenese-Assay-System ein, das Co-Kultur-Sphäroide verwendet, die von zwei menschlichen Vaskulärenvorläufern, EFCCs und MSCs, gebildet werden. Durch Wechselwirkung und Einbeziehung zwischen Endothelzellen und Pericyten erreicht. Im Vergleich zu anderen In-vitro-Angiogenese-Assays, die nur die von ECs vermittelte Angiogenese widerspiegeln, ist dieses Co-Kultur-Assay-System repräsentativer für die mehrstufige Kaskade der physiologischen Angiogenese, einschließlich zellulärer Interaktion, Keimung, Röhrenbildung, und Gefäßreifung. Dieses neu eingerichtete Assay-System ähnelt auch der extrazellulären Mikroumgebung in vivo, indem sphärische Sphäroide in Kollagengel Typ I gesät werden. Wir schlagen vor, dass das 3D-Co-Kultur-Sphäroid-Angiogenese-Assay-System zuverlässig, wiederholbar, leicht quantifizierbar und vor allem physiologisch relevant ist.
Bei der Durchführung der Co-Kultur Sphäroid-Assay, Ist es wichtig, Sphäroide in Gel mit entsprechender Konzentration von neutralisiertem Typ I Kollagen und FBS einzubetten. Die beste Endkonzentration von neutralisiertem Kollagen typ I beträgt 1,5 mg/ml, und der FBS-Anteil beträgt 2,5%. In den Vorversuchen führten höhere Kollagenkonzentrationen zu steifem Gel und behinderten die Qualität und Quantität der Sprossen, die von Sphäroiden stammen. Geringere Konzentrationen von Kollagen ergaben weiches und zerbrechliches Gel, das die Integrität von Sphäroiden nicht aufrechterhalten konnte. In ähnlicher Weise verursachten höhere Mengen an FBS ein reichliches Keimen von Sphäroiden auf Basalebene, unabhängig von der Stimulation des angiogenen Faktors. Eine niedrigere FBS-Konzentration führte zu schlechten Bedingungen der Zellen. Für konsistente und reproduzierbare Ergebnisse sollte eine angemessene Anzahl von Sphäroiden eingebettet werden (ca. 50 Sphäroide/Well). Mehr als 50 Sphäroide/Well könnten zu einer Nähe von Sphäroiden innerhalb des Brunnens führen, was die Qualität und Quantität der erzeugten Sprossen ungewöhnlich beeinflussen kann.
Es ist wichtig, Kollagen Typ I unter gekühlten Bedingungen während der Neutralisation und der Mischschritte mit der Sphäroidsuspension zu halten, da Kollagen bei Raumtemperatur gerinnen kann, was zu einer unregelmäßigen Matrix führt. Beim Mischen der Sphäroidsuspension mit Kollagenlösung wird empfohlen, 1 ml Pipettenspitze mit 3-5 mm Schnitt am Ende zu verwenden, um ein breites Loch zu machen. Dies ermöglicht eine einfache Handhabung der viskosen Kollagenlösung und schützt Sphäroide vor Bruch. Eine Agitation der Platte nach dem Einbetten sphäroidsuspendierter Kollagenlösung könnte die Integrität des Gels stören und zu einem Bruch führen, der die normale Sprossenerzeugung behindern kann.
Bei der Co-Kultur-Sphäroid-Assay mit EFCCs und MSCs sollte das Verhältnis 5:1 beibehalten werden. Die Verwendung einer größeren Anzahl von MSCs verursacht eine Ausbreitung um das Sphäroid aufgrund des wandernden Phänotyps von MSCs, der die ideale Sprossenerzeugung beeinflussen kann. Eine geringere Anzahl von MsCs reicht nicht aus, um das Keimen von EFCCs zu stimulieren und die Sprossen ordnungsgemäß abzudecken. Darüber hinaus ist es wichtig, die Zellbedingungen während des Wachstums zu überprüfen. Wenn schlechte Keimung beobachtet wird, wird empfohlen, eine andere gesunde Passage der Zellen zu verwenden. Für ein besseres Ergebnis wird die Verwendung von EFCCs und MSCs in Durchgang weniger als 10 dringend empfohlen.
Hier präsentieren wir ein verbessertes 3D-Angiogenese-Assay-System mit Co-Kultur-Sphäroiden, die die In-vivo-Angiogenese genau erfassen. Im Vergleich zu 2D-Einzelzell-Assay-Systemen reflektiert dieses Co-Kultur-Sphäroid-Assay-System originalgetreuer zelluläre Reaktionen zwischen zwei vaskulären Zelltypen, um unter physiologischen Bedingungen röhrenförmige Strukturen zu bilden. Im Vergleich zum komplexen mehrstufigen Prozess der In-vivo-Angiogenese bleibt dieses System jedoch zu stark vereinfacht. Die vaskuläre Generierung in vivo erfolgt in der Regel durch multiple Interaktion verschiedener anderer Zelltypen, einschließlich Epithelzellen, Fibroblasten, Immunzellen und auch reichlich ECM-Proteine. Zukünftige Anwendungen dieses neuen Systems umfassen die Einführung anderer Zelltypen und des ECM, um die physiologische und/oder pathologische Angiogenese genauer widerzuspiegeln.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde durch ein Stipendium (17172MFDS215) des Ministeriums für Lebensmittel- und Arzneimittelsicherheit, die von der koreanischen Regierung (MSIP) (2017R1A2B4005463) und dem Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) finanziert vom Bildungsministerium (2016R1A6A1A03007648).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA (1x) | Gibco | 25300-054 | |
| Bevacizumab | Roche | NA | Commercial name: Avastin |
| Dulbecco Modified Eagle Medium | Gibco | 11885-084 | DMEM |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (10x) | Gibco | 21600-010 | PBS (10x) |
| Dulbeco's Phosphate buffered saline (1x) | Corning | 21-031-CVR | PBS (1x) |
| Endothelial cell Growth medium MV2 kit | Promocell | C-22121 | ECGM-MV2 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlas | FP-0500A | FBS |
| Gelatin | BD Sciences | 214340 | |
| L-Glutamine–Penicillin–Streptomycin | Gibco | 10378-016 | GPS |
| Mesenchymal stem cell growth medium-2 | Promocell | C-28009 | MSCGM-2 |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| PKH26 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 |
| PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits | Sigma-Aldrich | MINI67 | PKH67 |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Type I collagen gel | Corning | 354236 | |
| Vascular endothelial growth factor A | R&D | 293-VE-010 | VEGF |
References
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