Aqui apresentamos um protocolo para a supressão efetiva da replicação do vírus da hepatite B (HBV) em camundongos utilizando a transferência de células adotivas (ACT) de linfócitos T específicos de antígenos virais derivados de células-tronco (AG). Este procedimento pode ser adaptado para a imunoterapia baseada em ACT potencial da infecção por HBV.
A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é uma questão de saúde global. Com mais de 350 milhões pessoas afetadas em todo o mundo, a infecção pelo HBV continua sendo a principal causa de câncer hepático. Esta é uma grande preocupação, especialmente nos países em desenvolvimento. A falha do sistema imunitário para montar uma resposta eficaz de encontro ao HBV conduz à infecção crônica. Embora a vacina HBV está presente e novos medicamentos antivirais estão sendo criados, a erradicação das células de vírus-reservatório continua a ser um grande tema de saúde. Descrito aqui é um método para a geração de antígeno viral (AG)-linfócitos T citotóxicos CD8+ específicos (CTLs) derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) (ou seja, IPSC-CTLs), que têm a capacidade de suprimir a replicação do HBV. A replicação de HBV é induzida eficientemente nos ratos através da injeção hidrodinâmico de um Plasmid da expressão de HBV, de paav/HBV 1.2, no fígado. Então, a superfície de HBV AG-específico iPSC-CTLs do rato é transferida adoptivamente, que suprime extremamente a replicação de HBV no fígado e no sangue assim como impede a expressão da superfície AG de HBV nos hepatocytes. Este método demonstra a replicação de HBV nos ratos após a injeção hidrodinâmico e que os CTLs AG-específicos virais derivado da pilha de haste podem suprimir a replicação de HBV. Este protocolo fornece um método útil para a imunoterapia de HBV.
Após a infecção aguda, o sistema imunológico adaptativo (i.e., imunidade humoral e celular) controla a maior parte da hepatite aguda relacionada ao HBV. Ainda, um número de povos nas regiões HBV-endêmicas não pode eliminar os vírus e subseqüentemente converter como indivíduos crônicos. Mais de 25% dos pacientes crônicos (> 250 milhões de pessoas) em todo o mundo desenvolvem doença hepática progressiva, resultando em cirrose hepática e/ou carcinoma hepatocelular (HCC)1. Como resultado, a erradicação de células insistentemente infectadas permanece um problema geral de salubridade, embora haja uma vacina disponível2 e inúmeros medicamentos antivirais estão em desenvolvimento. O tratamento padrão para a infecção pelo HBV inclui análogos de IFN-α, nucleósidos e nucleotídeo. Estes agentes têm a atividade antiviral direta e capacidades modulatórias imunes. No entanto, a soroconversão do antígeno de HBe (AG)+ portadores com anticorpo anti-HBe (AB) e a perda de ácido deoxirribonucleico do HBV SÉRICO (DNA) aparecem individualmente em aproximadamente 20% dos pacientes tratados, e o controle imunológico total do vírus verificada pela privação do HBsAg não é superior a 5%3. Além disso, a resposta ao tratamento muitas vezes não é durável. A vacinação profiláctica com HBs recombinante AG é altamente eficaz em impedir a infecção, mas a vacinação terapêutica de HBs Ag não é eficaz. Claramente, as respostas imunes mediadas por células T desempenham um papel crítico no controle da infecção pelo HBV e comprometimento hepático; no entanto, em pacientes com hepatite crônica, as células T HBV-reativas são freqüentemente excluídas, disfuncionais ou convertem exaustos4,5,6. Consequentemente, em indivíduos com infecção persistente por HBV, nenhuma tentativa de restabelecer a imunidade específica do HBV (i.e., imunidade à base de células T) por meio de remédio antiviral, citocinas imuno-modulatórias ou imunização curativa alcançaram sucesso.
A transferência celular adotiva (Act) de células T específicas do HBV AG é um tratamento eficiente direcionado para eventualmente erradicar os hepatócitos remanescentes wih HBV7,8. O ato de CTLs HBV-específicos em ratos HBV-contaminados foi mostrado para causar a hepatite transiente, suave, e uma gota dramática em transcritos do ácido ribonucleico de HBV (RNA) nos hepatocytes. Nesses estudos, a CTLs não inibiu a transcrição dos genes do HBV, mas melhorou a degradação das transcrições do HBV9. As CTLs específicas do HBV são importantes para prevenir a infecção viral e mediar a depuração do HBV10,11. Para remédios baseados em ato, a expansão in vitro de células T específicas do HBV com alta reatividade para a reinstalação in vivo tem sido sugerida como um método ideal12,13,14; no entanto, as abordagens atuais são restritas em relação às suas habilidades para gerar, separar e cultivar quantidades e qualidades apropriadas de células T específicas do HBV de pacientes para as terapias potenciais.
Embora os ensaios clínicos apresentem segurança, praticidade e atividade terapêutica prospectiva de tratamentos à base de células por meio de células T projetadas que são específicas para hepatócitos infectados pelo vírus HBV, há preocupações sobre os efeitos desfavoráveis ocorrendo das respostas auto-imunes por causa do cross-Reactivity doreceptor de célulaT de misemparelhamento (TCR)15,16, reconhecimentodo AG do fora-alvo pelo TCR17 não específico e em-alvo fora-toxicidade por um receptor quimérico de AG (carro) 18 anos de , 19 com tecidos saudáveis. Atualmente, as células T geneticamente modificadas, que só têm persistência a curto prazo in vivo, são geralmente células T intermediárias ou posteriores. Até o momento, as células-tronco pluripotentes (PSCs) são a única fonte disponível para gerar alto número de células T ingênuas de tipo único AG-específico20,21,22,23. Os PSCs induzidos (iPSCs) são convertidos simplesmente das pilhas somáticas de um paciente com o uso da transdução do gene de diversos fatores da transcrição. Como resultado, os iPSCs apresentam características semelhantes às das células-tronco embrionárias (ESCs)24. Devido à flexibilidade e possibilidade para a capacidade infinita de autorenovar, além da reposição tecidual, tratamentos baseados em iPSC podem ser amplamente aplicados na medicina regenerativa. Além disso, os regimentos subjacentes iPSCs podem substancialmente melhorar terapias Cell-Based atuais.
O objetivo geral deste método é gerar uma grande quantidade de CTLs específicos do HBV de iPSCs (ou seja, iPSC-CTLs) para imunoterapia baseada em ACT. As vantagens sobre técnicas alternativas são que iPSC-CTLs específico do HBV têm um único-tipo TCR e phenotype ingênuo, que conduz a mais desenvolvimento da pilha de T da memória após o ato. É demonstrado que o ACT de iPSC-CTLs específicos do HBV aumenta a migração de células T CD8+ funcionais no fígado e reduz a replicação do HBV em ambos os fígados e sangue de camundongos administrados. Este método revela um uso potencial de iPSC-CTLs AG-específicos virais para a imunoterapia de HBV e pode ser adaptado para gerar outras pilhas AG-específicas virais de iPSC-T para a imunoterapia viral.
Este protocolo apresenta um método para gerar o IPSC-CTLs AG-específico viral para o uso como o ato para suprimir a replicação de HBV em um modelo murino. Na infecção crônica por HBV, o genoma viral forma um mini cromossomo estável, o DNA circular covalentemente fechado (cccDNA) que pode persistir ao longo da vida útil do hepatócito. Alvejar o afastamento do mini cromossoma viral pode conduzir a uma cura da infecção crônica de HBV. A terapia antiviral atual visa a transcriptase reversa do vírus, mas raramen…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem o Dr. Adam J Gehring do Instituto de pesquisa do hospital geral de Toronto para fornecer cDNA para HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI)-específico a2-restringiu genes TCR híbridos humanos-murine, e Dr. Pei-Jer Chen da Universidade Nacional de Formosa para fornecer construção de pAAV/HBV 1,2. Este trabalho é apoiado pelo Instituto Nacional de saúde Grant R01AI121180, R01CA221867 e R21AI109239 para J. S.
HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
GeneJammer | Agilent | 204130 | |
HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |