Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.
Hepatit B virüsü (HBV) enfeksiyonu küresel bir sağlık sorunudur. Dünya çapında etkilenen 350 milyondan fazla kişi ile, HBV enfeksiyonu karaciğer kanserinin önde gelen nedeni olmaya devam etmektedir. Bu, özellikle gelişmekte olan ülkelerde önemli bir sorundur. Bağışıklık sisteminin HBV’ye karşı etkili bir yanıt vermemesi kronik enfeksiyona yol açar. HBV aşısı mevcut ve yeni antiviral ilaçlar oluşturulmaktadır rağmen, virüs-rezervuar hücrelerinin eradikasyonu önemli bir sağlık konusu olmaya devam etmektedir. Burada açıklanan viral antijen üretimi için bir yöntemdir (Ag) -spesifik CD8+ sitotoksik T lenfositler (CTLs) indüklenen pluripotent kök hücrelerden türetilen (iPSCs) (yani, iPSC-CTLs), HBV replikasyonbastırmak için yeteneğine sahip. HBV replikasyonu farelerde hbv ekspresyonu plazmidi pAAV/HBV1.2’nin karaciğere hidrodinamik enjeksiyonu ile etkin bir şekilde indüklenir. Daha sonra, HBV yüzey Ag-spesifik fare iPSC-CTLs büyük ölçüde karaciğer ve kanda HBV replikasyon bastırır ve hepatositlerde HBV yüzey Ag ekspresyonunu önler, benimsenden aktarılır. Bu yöntem, hidrodinamik enjeksiyon sonrası farelerde HBV replikasyonu gösterir ve kök hücre kaynaklı viral Ag-spesifik CTLs HBV replikasyonbastırmak olabilir. Bu protokol HBV immünoterapi için yararlı bir yöntem sağlar.
Akut enfeksiyon dan sonra, adaptif bağışıklık sistemi (yani, humoral ve hücresel bağışıklık) akut HBV ile ilgili hepatit toplu kontrol eder. Yine de, HBV-endemik bölgelerde insanların bir dizi virüsleri ortadan kaldırmak ve daha sonra kronik bireyler olarak dönüştürmek olamaz. Kronik hastaların %25’inden fazlası (>250 milyon kişi) dünya çapında ilerleyici karaciğer hastalığı gelişir ve karaciğer sirozu ve/veya hepatosellüler karsinom (HCC)1. Sonuç olarak, ısrarla enfekte hücrelerin eradikasyonu genel bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir, mevcut bir aşı olmasına rağmen2 ve çok sayıda antiviral ilaçlar geliştirilmektedir. HBV enfeksiyonu için standart tedavi IFN-α, nükleozit ve nükleotid analogları içerir. Bu ajanlar doğrudan antiviral aktivite ve bağışıklık modülatör kapasiteleri var. Bununla birlikte, HBe antijeninin (Ag)+ anti-HBe antikor (Ab) ve serum HBV deoksiribonükleik asit (DNA) kaybı ile birlikte seropdönüşümü tedavi edilen hastaların yaklaşık %20’sinde ayrı ayrı görünür ve virüsün tüm immünolojik kontrolü HBsAg yoksunluğu ile doğrulanan en fazla% 53. Ayrıca, tedaviye yanıt genellikle dayanıklı değildir. Rekombinant HBs Ag ile profilaktik aşılama enfeksiyonu önlemede son derece etkilidir, ancak terapötik HBs Ag aşısı etkili değildir. Açıkçası, T hücre aracılı bağışıklık yanıtları HBV enfeksiyonu ve karaciğer bozukluğu kontrolünde kritik bir rol oynamaktadır; ancak, kronik hepatit hastalarında, HBV-reaktif T hücreleri genellikle silinir, işlevsiz, ya da tükenmiş dönüştürmek4,5,6. Sonuç olarak, kalıcı HBV enfeksiyonu olan bireylerde, anti-viral ilaç, immüno-modüler sitokinler veya küratif bağışıklama yoluyla HBV’ye özgü bağışıklığı (yani T hücre tabanlı bağışıklık) geri getirme girişimleri başarıya ulaşamaz.
HBV Ag-spesifik T hücrelerinin benimseyen hücre transferi (ACT) sonunda kalan hepatositler wih HBV7ortadan kaldırmak için yönlendirilen etkili bir tedavidir,8. HBV’ye özgü KTK’ların HBV enfekte olmuş farelere aktiretinin geçici, hafif hepatite ve hepatositlerde HBV ribonükleik asit (RNA) transkriptlerinde dramatik bir düşüşe neden olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmalarda, CTLs HBV genlerin transkripsiyonunu inhibe etmedi ama HBV transkript bozulması gelişmiş9. HBV’ye özgü CtL’ler viral enfeksiyonu önlemek ve HBV10,11’intemizlenmesine aracılık etmek için önemlidir. ACT tabanlı ilaçlar için, in vivo resettlement için yüksek reaktivite ile HBV özgü T hücrelerinin in vitro genişleme ideal bir yöntem olduğu ileri sürülmüştür12,13,14; Bununla birlikte, mevcut yaklaşımlar potansiyel tedaviler için hastalardan HBV’ye özgü T hücrelerinin uygun miktar ve niteliklerini üretme, ayırma ve büyütme yetenekleri açısından kısıtlanmıştır.
Klinik çalışmalarda HBV virüs bulaşmış hepatositlere özgü mühendislik T hücreleri vasıtası ile hücre bazlı tedavilerin güvenliği, pratikliği ve prospektif terapötik aktivitesi mevcut olsa da, olumsuz etkileri hakkında endişeler vardır yanlış eşleşmeli T hücre reseptöründen çapraz reaktivite nedeniyle otoimmün yanıtlardan kaynaklanan (TCR)15,16, non-spesifik TCR17 tarafından hedef dışı Ag tanıma ve bir şierik Ag reseptörü (CAR) tarafından hedef dışı toksisite 18.000 , Sağlıklı dokularla 19. Şu anda, genetiği değiştirilmiş T hücreleri, sadece in vivo kısa süreli kalıcılık var, genellikle ara veya daha sonra etkili T hücreleridir. Bugüne kadar, pluripotent kök hücreler (PSCs) naif tek tip Ag-spesifik T hücreleri20, 21,22,23yüksek sayıda üretmek için kullanılabilir tek kaynaktır. İndüklenen PSC’ler (iPSC’ler) sadece birkaç transkripsiyon faktörünün gen transdüksiyonu yoluyla hastanın somatik hücrelerinden dönüştürülür. Sonuç olarak, iPSC’ler embriyonik kök hücreler (ESCs)24benzer özelliklere sahip. Doku replasmanına ek olarak, doku replasmanına ek olarak, kendini yenileme esnekliği ve olasılığı sayesinde, iPSC tabanlı tedaviler rejeneratif tıpta yaygın olarak uygulanabilir. Ayrıca, iPSCs altında yatan alaylar önemli ölçüde mevcut hücre tabanlı tedavileri artırabilir.
Bu yöntemin genel amacı, ACT tabanlı immünoterapi için iPSC’lerden (yani iPSC-CTLs) hbv’ye özgü ctl’ler üretmektir. Alternatif tekniklere göre avantajları HBV’ye özgü iPSC-CTL’lerin tek tip TCR ve naif fenotip olmasıdır, bu da ACT’den sonra daha fazla bellek T hücre gelişimiile sonuçlanır. HBV’ye özgü iPSC-CTL’lerin AKTIV’sinin karaciğerde fonksiyonel CD8+ T hücrelerinin geçişini artırdığı ve hem karaciğerlerde hem de yönetilen farelerin kanlarında HBV replikasyonlarını azalttığı gösterilmiştir. Bu yöntem HBV immünoterapi için viral Ag-spesifik iPSC-CTLs potansiyel kullanımını ortaya koymaktadır ve viral immünoterapi için diğer viral Ag-spesifik iPSC-T hücreleri oluşturmak için adapte edilebilir.
Bu protokol, bir murine modelinde HBV replikasyonlarını bastırmak için ACT olarak kullanılmak üzere viral Ag-spesifik iPSC-CTLs oluşturmak için bir yöntem sunar. Kronik HBV enfeksiyonunda viral genom kararlı bir mini kromozom oluşturur, hepatositin ömrü boyunca devam edebilen kovalent kapalı dairesel DNA (cccDNA). Viral mini kromozomun temizlenmesinin hedeflanması kronik HBV enfeksiyonunun tedavisine neden olabilir. Mevcut antiviral tedavi virüsün ters transkriptazını hedefler ancak nadiren cccDNA tara…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar HBs183-91 (s183) (FLLTRILTI) için cDNA sağlamak için Toronto Genel Hastanesi Araştırma Enstitüsü’nden Dr Adam J Gehring teşekkür- özel A2-sınırlı insan-murine hibrid TCR genleri, ve Dr Pei-Jer Chen Ulusal Tayvan Üniversitesi sağlamak için pAAV/HBV 1.2 yapısı. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü Hibe R01AI121180, R01CA221867 ve R21AI109239 J. S tarafından desteklenmiştir.
HHD mice | Institut Pasteur, Paris, France | H-2 class I knockout, HLA-A2.1-transgenic (HHD) mice | |
iPS-MEF-Ng-20D-17 | RIKEN Cell Bank | APS0001 | |
SNL76/7 | ATCC | SCRC-1049 | |
OP9 | ATCC | CRL-2749 | |
pAAV/HBV1.2 plasmid | Dr. Dr. Pei-Jer Chen (National Taiwan University Hospital, Taiwan) | HBV DNA construct | |
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-specific TCR genes | Dr. Adam J Gehring (Toronto General Hospital Research Institute, Toronto, Canada) | FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 and Vβ28) | |
OVA257–264-specific TCR genes | Dr. Dario A. Vignali (University of Pittsburgh, PA) | SIINFEKL-specific H-2Kb-restricted TCR genes | |
Anti-CD3 (17A2) antibody | Biolegend | 100236 | |
Anti-CD44 (IM7) antibody | BD Pharmingen | 103012 | |
Anti-CD4 (GK1.5) antibody | Biolegend | 100408 | |
Anti-CD8 (53-6.7) antibody | Biolegend | 100732 | |
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody | Biolegend | 505810 | |
Anti-TNF-a (MP6-XT22) antibody | Biolegend | 506306 | |
α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
Anti-HBs antibody | Thermo Fisher | MA5-13059 | |
ACK Lysis buffer | Lonza | 10-548E | |
Brefeldin A | Sigma | B7651 | |
DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
FBS | Hyclone | SH3007.01 | |
FACSAria Fusion cell sorter | BD | 656700 | |
Gelatin | MilliporeSigma | G9391 | |
GeneJammer | Agilent | 204130 | |
HLA-A201-HBs183-91-PE pentamer | Proimmune | F027-4A – 27 | |
HRP Anti-Mouse Secondary Antibody | Invitrogen | A27025 | |
mFlt-3L | Peprotech | 250-31L | |
mIL-7 | Peprotech | 217-17 | |
Nuclease S7 | Roche | 10107921001 | |
Paraformaldehyde | MilliporeSigma | P6148-500G | Caution: Allergenic, Carcenogenic, Toxic |
Permeabilization buffer | Biolegend | 421002 | |
Polybrene | MilliporeSigma | 107689 | |
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 |