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Cancer Research

फेफड़ों के कैंसर सेल लाइन्स में कैंसर स्टेम सेल की रेडियो संवेदनशीलता

Published: August 21, 2019 doi: 10.3791/60046
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Key Laboratory of Carcinogenesis and Translational Research (Ministry of Education/Beijing), Department of Radiation Oncology, Peking University Cancer Hospital and Institute

Summary

कैंसर स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति रेडियोथेरेपी के बाद पतन या गरीब परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है। इस पांडुलिपि फेफड़ों के कैंसर सेल लाइनों में कैंसर स्टेम कोशिकाओं की रेडियो संवेदनशीलता का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन करता है।

Abstract

कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) की उपस्थिति रेडियोथेरेपी के बाद पतन या गरीब परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है। रेडियो प्रतिरोधी सीएससी का अध्ययन रेडियो प्रतिरोध पर काबू पाने के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं. गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (एनएससीएलसी) सेल लाइनों में रेडियो प्रतिरोधी सीएससी के लिए एक मार्कर के रूप में वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनल [2] 1 उपइकाई समरूप 5 की सूचना दी गई है। एक सीएससी मार्कर के एक उदाहरण के रूप में कैल्शियम चैनल $2 $ 1 उपइकाई का उपयोग करते हुए, एनएससीएलसी सेल लाइनों में सीएससी की रेडियो संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं। सीएससी प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा putative मार्करों के साथ हल कर रहे हैं, और हल कोशिकाओं के आत्म नवीनीकरण क्षमता क्षेत्र गठन परख द्वारा मूल्यांकन किया जाता है। कॉलोनी गठन परख, जो निर्धारित करता है कि कितने कोशिकाओं विकिरण की एक निश्चित खुराक के बाद कॉलोनी बनाने के वंशज उत्पन्न करने की क्षमता खो देते हैं, तो हल कोशिकाओं की रेडियो संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए किया जाता है। यह पांडुलिपि सीएससी की विकिरण संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रारंभिक कदम प्रदान करती है, जो अंतर्निहित तंत्र की आगे समझने के लिए आधार स्थापित करती है।

Introduction

रेडियोथेरेपी कैंसर के इलाज में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। तथापि, रेडियो प्रतिरोधी कैंसर स्टेम सेल (सीएससी) के अस्तित्व रेडियोथेरेपी1,2के बाद पतन या खराब परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। सीएससी उनके आत्म नवीनीकरण क्षमता और विषमजात कैंसर कोशिकाओं3उत्पन्न करने की क्षमता की विशेषता है। एक अधिक कुशल डीएनए क्षति की मरम्मत क्षमता या मुक्त मूल अपमार्जन प्रणाली या अन्य तंत्र के उच्च स्तर के साथ बख़्तरबंद, सीएससी अपेक्षाकृत रेडियोथेरेपी4केलिए प्रतिरोधी रहे हैं ,5,6,7 , 8. सीएससी मार्करों की पहचान करना और उनके तंत्र की खोज करने से उन दवाओं के विकास में मदद मिलेगी जो सामान्य ऊतक क्षति को बढ़ाए बिना रेडियो प्रतिरोध को दूर करेंगी।

एनएससीएलसी सेल लाइनों9में रेडियो प्रतिरोधी सीएससी के लिए एक मार्कर के रूप में वोल्टेज-गेट्ड कैल्शियम चैनल $2 ]1 उपइकाई समरूप 5 की सूचना दी गई है। [2] 1 मूल रूप से hepatotocellular कार्सिनोमा (एचसीसी)10के लिए एक सीएससी मार्कर के रूप में पहचान की गई थी। एक ही रोगी में प्राथमिक और आवर्तक ट्यूमर से व्युत्पन्न एचसीसी सेल लाइनों की एक जोड़ी के साथ subtractive प्रतिरक्षण का उपयोग करना, एक एंटीबॉडी नाम 1B50-1 विशेष रूप से आवर्तक एचसीसी कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए पहचान की गई थी। 1B50-1-सकारात्मक कोशिकाओं विवो में इन विट्रो और उच्च tumorigenicity में उच्च क्षेत्र गठन दक्षता से पता चला. इसका प्रतिजन मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचाना गया था, के रूप में कैल्शियम चैनल $2 ] 1 subunit isoform 5. [2] 1 विशेष रूप से CSCs में व्यक्त करता है और सबसे सामान्य ऊतकों में undetectable है, यह CS10को लक्षित करने के लिए एक संभावित उम्मीदवार बना रही है. यह एनएससीएलसी सेल लाइनों के लिए सीएससी मार्कर के रूप में भी कार्य कर सकता है, और विकिरण9के प्रत्युत्तर में डीएनए क्षति मरम्मत की दक्षता को बढ़ाकर आंशिक रूप से एनएससीएलसी कोशिकाओं को रेडियो प्रतिरोध प्रदान करने के लिए दिखाया गया है।

रेडियो प्रतिरोधी सीएससी का अध्ययन रेडियो प्रतिरोध पर काबू पाने के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं. एनएससीएलसी में एक उदाहरण के रूप में 2$1 का उपयोग करते हुए सीएससी की रेडियो संवेदनशीलता का अध्ययन करने के लिए प्रमुख विधियाँ प्रस्तुत की जाती हैं। आमतौर पर, CS एक putative सतह मार्कर के साथ अलग कर रहे हैं, और स्टेम सेल विशेषताओं और सकारात्मक और नकारात्मक सेल आबादी के radiosensitivity तुलना कर रहे हैं. एक सीरम मुक्त माध्यम में क्षेत्र गठन विकास कारकों है कि आत्म नवीनीकरण का समर्थन के साथ पूरक इन विट्रो में कोशिकाओं के स्टेमनेस का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी परख है. उच्च क्षेत्र निर्माण क्षमता वाले कोशिकाओं में प्रतिरक्षाविहीन चूहों10,11,12में इंजेक्ट किए जाने पर उच्च ट्यूमरीनिकता दिखाई देने की संभावना है . कॉलोनी गठन परख तो कोशिकाओं की रेडियो संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो निर्धारित करता है कि कितने विकिरण13की एक खुराक के बाद कॉलोनी बनाने के वंशज उत्पन्न करने की क्षमता खो दिया है.

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Protocol

नोट: कदम संकेत तापमान के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं। जिन चरणों में तापमान का उल्लेख नहीं किया गया है, उनके लिए कमरे के तापमान (18-25 र्ब्) के अधीन कार्य करें। सेल संस्कृति माध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए, और अन्य अभिकर्मकों निर्माता के गाइड के अनुसार संग्रहीत किया जाना चाहिए। कक्षों में जोड़े जाने से पहले मध्यम को 37 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-वार्म किया जाना चाहिए।

1. सेल छँटाई

  1. एंटीबॉडी संयोजन
    नोट: कम ऊष्मायन समय को ध्यान में रखते हुए, प्रत्यक्ष लेबल एंटीबॉडी सेल छँटाई के लिए पसंद किया जाता है। यदि कोई वाणिज्यिक प्रत्यक्ष-लेबल एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं है, तो निर्माता की मार्गदर्शिका के अनुसार एंटीबॉडी को फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए ऐन्जूगेट करने के लिए फ्लोरोरेसिन-कंजुगेटिंग अभिकर्मकों का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)। चूंकि कोशिकाओं को छँटाई के बाद सुसंस्कृत किया जाएगा, सभी चरणों को जैविक सुरक्षा कैबिनेट या लेमिनर क्लीन बेंच में किया जाना चाहिए। संदूषण से बचने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) को छांटने के बाद संस्कृति माध्यम में जोड़ने की सिफारिश की जाती है।
    1. प्रत्येक 10 डिग्री सेल्सियस एंटीबॉडी के लिए संशोधक अभिकर्मक का 1 $ल जोड़ें जिन्हें लेबल किया जाना है। धीरे से मिलाएं.
    2. एंटीबॉडी और संशोधक का मिश्रण सीधे lyophilized fluorescein पर जोड़ें. धीरे से पाइप्ट. अंधेरे में कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 एच या रात के लिए खड़े शीशी छोड़ दें।
    3. एंटीबॉडी के हर 10 डिग्री सेल्सियस के लिए क्वेकर अभिकर्मक का 1 डिग्री सेल्सियस जोड़ें। संयुग्मी का उपयोग 30 मिनट के बाद किया जा सकता है। फ्लोरेसेइन संयुग्मी को 18 महीनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. छँटाई से पहले, संयुग्मी एंटीबॉडी की अनुमापन की सिफारिश की जाती है। उन कक्षों को तैयार की जो व्यक्त करते हैं (उदाहरण के लिए, H1299 या A549 $2 $1 के लिए) और मार्कर (उदा., H1975) व्यक्त न करें. एलिकोट कोशिकाओं और उन्हें विभिन्न सांद्रता में एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट (उदा., 15 ग्राम/एमएल, 7.5 ग्राम/एमएल, 1.5 ग्राम/एमएल, और 0.75 ग्राम/एमएल, क्रमशः)।
    5. प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण (हिस्टोग्राम या डॉट प्लॉट के साथ) प्रदर्शन करें और उस एकाग्रता का चयन करें जिसमें H1299 या A549 की सकारात्मक कोशिकाओं को समप्रकार नियंत्रण से अलग किया जा सकता है और H1975 कोशिकाओं में थोड़ा विशिष्ट संकेत होते हैं।
  2. सेल लेबलिंग
    1. आरपीएमआई 1640 मध्यम में संस्कृति A549 कोशिकाओं के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) में 10 सेमी व्यंजन में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 एक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में. छँटाई के लिए इस प्रकार के रूप में कोशिकाओं को डाइजेस्ट जब वे 80%-90% संगम तक पहुँचने (के बारे में 5-10 x 106 प्रति पकवान कोशिकाओं).
    2. संस्कृति माध्यम को हटा दें। फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 3 एमएल के साथ संक्षेप में कोशिकाओं को धो लें। प्रत्येक डिश के लिए 0.05% trypsin के 3 एमएल जोड़ें. ट्रिप्सिन निकालें और कोशिकाओं को 1-3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाने के लिए अवशिदा ट्रिप्सिन को छोड़ दें। अधिक अपच से बचने के लिए कोशिकाओं की टुकड़ी की अक्सर जांच करें।
      नोट: कुछ सेल लाइनों अपेक्षाकृत पचाने के लिए कठिन हो सकता है, जैसे NSCLC सेल लाइनों H520 और PC9. ऐसी स्थिति में, 3 एमएल ट्रिप्सिन को डिश में छोड़ा जा सकता है, न कि अवशिष्ट ट्रिप्सिन के साथ पाचन। इसके अलावा, पाचन समय बढ़ाया जा सकता है.
    3. जब कोशिकाओं ढीला हो जाते हैं और बर्तन से अलग करने के लिए शुरू, आरपीएमआई के 3 एमएल जोड़ें 1640 मध्यम 10% FBS और pippette के साथ पूरक एक 50 एमएल ट्यूब में सेल निलंबन.
    4. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज. सुपरनेंट को त्याग दें। कक्षों को पुन: निलंबित करने के लिए PBS के 10 एमएल जोड़ें। एक आइसोटाइप नियंत्रण के रूप में एक नई ट्यूब में सेल निलंबन के 0.5 एमएल (या कम से कम 5 x 105 कोशिकाओं) स्थानांतरण। शेष कोशिकाओं छँटाई के लिए कर रहे हैं.
    5. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x ग्राम पर नियंत्रण और प्रयोगात्मक ट्यूबों दोनों को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेंट को त्याग दें।
    6. ऊपर उल्लिखित के रूप में अनुषंगित इष्टतम एकाग्रता के लिए पीबीएस में फ्लोरोसेंट डाई-संयोजित समप्रकार नियंत्रण या एंटीबॉडी को कम करके धुंधला करने के लिए काम कर समाधान तैयार करें।
      नोट: इस प्रयोग में, FITC-संयुग्मी 1B50-1 ($2 के एंटीबॉडी) को 7ण्5 ग्राम/एमएल में पतला किया गया था। कार्य समाधान का वॉल्यूम कक्ष मात्रा पर निर्भर है.
    7. लगभग 2-5 x 107 कोशिकाओं/एमएल पर प्रत्येक कार्य समाधान के साथ नियंत्रण और प्रयोगात्मक कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और धीरे से मिश्रण करें। अंधेरे में 30-40 मिनट के लिए आरटी में नमूने इनक्यूबेट करें।
    8. नमूनों में पीबीएस के 10 एमएल जोड़कर कोशिकाओं को धो लें, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीरे से मिश्रण करें और अपकेंद्रण करें। पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    9. नियंत्रण और प्रयोगात्मक कोशिकाओं के लिए नए 50 एमएल ट्यूबों पर क्रमशः 40 डिग्री मीटर सेल प्रतिभेदियों रखो। छलनी पर सेल निलंबन लागू करें और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा.
      नोट: यह चरण सेल clumps कि सेल सॉर्टर की केशिका ब्लॉक कर सकते हैं निकालता है।
    10. प्रवाह-थ्रू को 300 x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए निकाल दें। सुपरनेंट को त्याग दें। 0ण्2-1.0 एमएल पीबीएस के साथ कक्षों को पुन: स्थानाट करें फिर प्रवाह साइटोमेट्री के लिए 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित हो जाते हैं।
  3. प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा सेल छँटाई
    1. धनात्मक एवं ऋणात्मक कोशिका जनसंख्या एकत्र करने के लिए दो 5 एमएल ट्यूब तैयार कीजिए। प्रत्येक ट्यूब में आरपीएमआई 1640 मध्यम का 1 एमएल जोड़ें। सेल सॉर्टर के संग्रह मंच पर ट्यूब रखें।
    2. डॉट प्लॉट के साथ क्रमशः नियंत्रण कक्षों और प्रयोगात्मक कक्षों का विश्लेषण करें. पैरामीटर आगे तितर बितर (FSC) और साइड स्कैटर (एसएससी) के साथ लाइव कोशिकाओं गेट। FL-1 तीव्रता के अनुसार लाइव कोशिकाओं की सकारात्मक और नकारात्मक आबादी गेट.
    3. $2$1-धनात्मक कोशिकाओं को एकत्रित करें तथा र्2 र्1-ऋणात्मक कोशिकाएँ लीजिए। प्राप्त कक्षों की संख्या रिकॉर्ड करें.
    4. यह पुष्टि करने के लिए कि काटी गई कोशिका जनसंख्या का विभिन्न स्तर है, एक मात्रात्मक बहुलक शृंखला अभिक्रिया (QPCR) की जा सकती है।
      1. ग्वानिडिनियम थायोसाइनेट अभिकर्मक के साथ सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं के आरएनए निकालें और निर्माता की गाइड के अनुसार सीडीएनए में आरएनए को रिवर्स करें। SYBR हरी अभिकर्मक के साथ QPCR प्रदर्शन. प्राइमर के अनुक्रम इस प्रकार हैं: $2 ]1-F, CAGTTGAGATGATG; [2]1-R, TTGTGAGCAGGTGTGTC; जीएपीडीएच-एफ, जीटीसीजीजीटीसीएसीगटीजीजी; और GAPDH-R, AAAAGCAGCCGGTGACC.

2. क्षेत्र गठन परख

नोट: क्षेत्र गठन परख कोशिकाओं के आत्म नवीनीकरण क्षमता निर्धारित करने के लिए लागू किया जाता है। आत्म नवीनीकरण क्षमता वाले सेल इस सीरम-मुक्त अर्धठोस माध्यम में क्षेत्रों का निर्माण कर सकते हैं जो विकास कारकों के साथ पूरक हैं। सभी कदम एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट या स्तरीय साफ बेंच में किया जाना चाहिए. संदूषण से बचने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) को छांटने के बाद संस्कृति माध्यम में जोड़ने की सिफारिश की जाती है।

  1. मध्यम तैयारी
    1. 2x DMEM/F-12 माध्यम को 475 एमएल आसुत जल में DMEM/F-12 पाउडर के 1 L पैकेज को पुनर्गठित करके तैयार करें। जोड़ें 2.438 ह नाहको3| pH को 7ण्0-7.2 में धीरे-धीरे 1 छ नह या 1 छ भ्भ् को हिलाते हुए जोड़कर समायोजित करें। 500 एमएल के अंतिम आयतन में आसुत जल जोड़ें। 0ण्2 डिग्री मीटर फिल्टर के माध्यम से छानने के द्वारा माध्यम को स्टरलाइज़ करें।
    2. आसुत जल के 100 एमएल में 2 ग्राम मिथाइलसेलुलोस जोड़कर 2% मेथिलसेलुलोस घोल तैयार की। समाधान ऑटोक्लेव. ऑटोक्लेविंग के बाद मेथिलसेल्यूलोस कपास जैसी स्थिति दिखा सकता है। बोतल को धीरे-धीरे पीछे करके मिलाएं और इसे प्राकृतिक शीतलन के लिए छोड़ दें। यह रात भर एक पारदर्शी semisolid हो जाएगा.
    3. स्व-नवीकरण माध्यम के 20 एमएल प्राप्त करने के लिए, 50 एमएल ट्यूब में 2x DMEM/F-12 माध्यम के 10 एमएल जोड़ें। मध्यम करने के लिए B27 के 400 $L जोड़ें. रिकॉमबिनेंट मानव epidermal विकास कारक जोड़ें (EGF) की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 25 एनजी / रिकॉमबिनेंट मानव बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक जोड़ें (bFGF) की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 25 एनजी / 20 एमएल के अंतिम खंड तक पहुंचने के लिए 2% मेथिलसेल्यूलोस जोड़ें।
    4. भंवर द्वारा माध्यम मिक्स इतना है कि आत्म नवीनीकरण माध्यम प्राप्त की है.
  2. कोशिका बोने
    1. 2000 कोशिकाओं/एमएल तक पहुंचने के लिए स्वयं-नवीनीकरण माध्यम में काटी गई कोशिकाओं को स्थानांतरित करें और उन्हें एक संक्षिप्त भंवर के साथ मिलाएं। एक अल्ट्रा कम लगाव 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से सेल निलंबन के 100 $L जोड़ें. प्लेट के रिम पर कुओं का उपयोग न करें, क्योंकि माध्यम इन कुओं में वाष्पित होने की अधिक संभावना है। इन कुओं में बाँझ पानी डालें।
    2. 10-14 दिनों के लिए सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति। दिन में आत्म नवीनीकरण माध्यम के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें 5-7.
  3. क्षेत्र गिनती और गणना
    1. बोने के 10-14 दिनों के बाद, 50 से अधिक कोशिकाओं (लगभग) के साथ या एक माइक्रोस्कोप (4x उद्देश्य लेंस, 10x नेत्रिका) के तहत 100 डिग्री से अधिक व्यास के साथ क्षेत्रों की संख्या गिनती।
      नोट: अच्छी तरह से ऊपरी बाएँ से शुरू, गोलों की गिनती, जबकि माइक्रोस्कोप की जॉयस्टिक के साथ सही की ओर क्षैतिज उद्देश्य तालिका चलती है. फिर, उद्देश्य तालिका को दृश्य फ़ील्ड की मध्य पंक्ति में ले जाएँ और गोले को दाएँ से बाएँ की गणना करें. फिर, निचली पंक्ति में जाएँ और बाएँ से दाएँ की गणना करें. 96 अच्छी थाली का एक अच्छी तरह से तीन पंक्तियों के भीतर गिना जा सकता है.
    2. गोले के निर्माण की दक्षता की गणना बीजित कोशिकाओं की संख्या से विभाजित गोलों की संख्या के रूप में कीजिए। धनात्मक तथा ऋणात्मक कोशिका जनसंख्या के बीच गोले की निर्माण दक्षता की तुलना की जा सकती है।

3. कॉलोनी गठन परख

नोट: कॉलोनी गठन परख कोशिकाओं की रेडियो संवेदनशीलता निर्धारित करने के लिए लागू किया जाता है। विकिरण रेडियोथेरेपी के लिए इस्तेमाल किया एक रैखिक त्वरक द्वारा दिया जा सकता है। प्रयोगशाला उपयोग के लिए सेल विकिरण प्रणाली भी इस्तेमाल किया जा सकता है अगर उपकरण उपलब्ध है. चरण 3.1, 3.2.3, और 3.2.6 एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट या पटल स्वच्छ बेंच में किया जाना चाहिए. संदूषण से बचने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन) को छांटने के बाद संस्कृति माध्यम में जोड़ने की सिफारिश की जाती है।

  1. कोशिका बोने
    1. 0 Gy समूह सहित प्रत्येक विकिरण खुराक के लिए एक 6 अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें. 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए मध्यम के 1.5 एमएल जोड़ें. कॉलोनी गठन परख के लिए संस्कृति माध्यम पारंपरिक RPMI 1640 मध्यम 10% FBS के साथ पूरक है (के रूप में नाम "पूर्ण 1640").
    2. पूर्ण 1640 मध्यम से 1000 कोशिकाओं के साथ पतला काटा कोशिकाओं /
    3. कुओं में सेल निलंबन जोड़ें. प्लेटों को क्षैतिज रूप से हिलाएं ताकि कोशिकाओं को कुओं में समान रूप से वितरित किया जा सके। प्रत्येक खुराक समूह में जोड़ी गई मात्रा रिकॉर्ड करें.
      नोट: आम तौर पर, बीज 200 कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से 0 Gy, 2 Gy के लिए 200 कोशिकाओं, 4 Gy के लिए 400 कोशिकाओं, 6 Gy के लिए 800 कोशिकाओं, और 1600 कोशिकाओं के लिए 8 Gy, क्रमशः. यह पूर्व-अनुभव में unsorted कोशिकाओं में सेल संख्या को समायोजित करने के लिए बेहतर है।
    4. सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति।
  2. विकिरण
    1. कोशिकाओं कुओं के नीचे से जुड़ी है के बाद (आमतौर पर एक दिन बोने के बाद, और अब समय सेल प्रसार पर विचार करने की सिफारिश नहीं है), सेल विकिरण प्रदर्शन करने के लिए आगे बढ़ें.
    2. 20 बउ x 20 बउ विकिरण क्षेत्र में 1 बउ की गहराई पर प्रत्येक खुराक के लिए मॉनीटर इकाइयों (म्यू) की संख्या की गणना कीजिए।
      नोट: विकिरण क्षेत्र के लिए म्यू जेड खुराक (cGy)/आउटपुट कारक की संख्या/प्रतिशत गहराई के लिए (पीडीडी)। उदाहरण के लिए, 20 cm x 20 cm फ़ील्ड के लिए आउटपुट कारक 1.066 है, 1.0 cm के लिए PDD 0.987 है, और 8 Gy (800 cGy) के लिए MU की संख्या 760 (800/1.066/0.987 ] 760.35 है। यदि प्रत्येक खुराक के लिए एकाधिक प्लेटें विकिरणित करने की आवश्यकता है, तो एक बड़ा फ़ील्ड भी उपयोग किया जा सकता है, और MU की संख्याओं को फ़ील्ड के आकार के अनुसार पुन: परिकलित करने की आवश्यकता है. आउटपुट कारक और पीडीडी अलग त्वरक में अलग अलग हैं। इन पैरामीटरों के लिए विकिरण भौतिकविदों का संदर्भ लें।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से पूरा 1640 जोड़ें माध्यम की ऊंचाई के लिए 1 सेमी तक पहुँचने के लिए.
      नोट: 6 अच्छी तरह से थाली के सेल विकास क्षेत्र निर्माता की गाइड पर पाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि वृद्धि क्षेत्र 6 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए 9.5 cm2 है, और 1.5 एमएल मध्यम और 0.4 एमएल सेल निलंबन के दिन पहले जोड़ा गया है, तो अच्छी तरह से 7.6 एमएल माध्यम जोड़ें. ऊंचाई खुराक निर्माण के लिए आवश्यक है. 0.8 सेमी से कम की मध्यम ऊंचाई की सिफारिश नहीं की जाती है।
      नोट: विकिरण के दौरान प्लेटों को कवर रखें। जब प्लेटें सेल संस्कृति कमरे और विकिरण चिकित्सा कक्ष के बीच स्थानांतरित कर रहे हैं, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेटों लपेटो या उन्हें एक साफ बॉक्स में डाल संदूषण से बचने के लिए. मध्यम फैल बाहर से बचने के लिए प्लेटों फ्लैट पकड़ो.
    4. एक 20 सेमी x 20 सेमी विकिरण क्षेत्र निर्धारित करें। उपचार सोफे पर 1.0 सेमी मोटाई के एक ऊतक-तुल्य बोलू रखें, और उन्हें संपर्क में रखने के लिए बोलस पर 6 अच्छी तरह से प्लेट रखें। सुनिश्चित करें कि पूरी प्लेट विकिरण क्षेत्र के भीतर है। स्रोत त्वचा दूरी के रूप में सेट 100 सेमी. उपचार सोफे की ऊंचाई का समायोजन करके लेजर स्तर के लिए मध्यम सतह के स्तर संरेखित करें।
      नोट: एक ही विकिरण खुराक के साथ प्लेट्स एक ही समय में radiated किया जा सकता है. इस मामले के लिए, एक बड़ा विकिरण क्षेत्र की आवश्यकता है, और MU की संख्या संबंधित आउटपुट कारक के अनुसार पुन: परिकलित किया जाना चाहिए। सुनिश्चित करें कि सभी प्लेटें विकिरण क्षेत्र के भीतर हैं।
    5. अनुक्रम में प्रत्येक थाली के लिए प्रत्येक सौंपा खुराक उद्धार.
      चेतावनी: रैखिक त्वरक केवल योग्य तकनीशियनों द्वारा संचालित किया जा सकता है. विकिरण से दूर रखें।
    6. प्लेटों को वापस सेल संस्कृति के कमरे में ले लो. प्रत्येक अच्छी तरह से पूरा माध्यम के 2 एमएल के साथ माध्यम बदलें. सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति। माध्यम हर 3-5 दिनों में बदलें.
  3. धुंधला
    1. 7-10 दिनों के विकिरण के बाद, जब कई कालोनियों फार्म और इससे पहले कि वे बहुत बड़े हो जाना और एक साथ विलय, तो धुंधला प्रदर्शन और इस प्रकार की गिनती. मध्यम निकालें और पीबीएस के साथ संक्षेप में धो लें. कोशिकाओं को ठीक करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 4% formaldehyde के 1 एमएल जोड़ें।
      चेतावनी: Formaldehyde अस्थिर है. एक धूआं हुड में formaldehyde का प्रयोग करें.
    2. निर्धारण के 10 मिनट के बाद, formaldehyde निकालें और आसुत पानी के 2 एमएल प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार के साथ धो लें.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से 1% क्रिस्टल बैंगनी दाग समाधान के 1 एमएल जोड़ें. 10 मिनट के लिए दाग. क्रिस्टल बैंगनी दाग समाधान निकालें, और आसुत पानी के साथ धोने 3 बार. पानी निकालें और प्लेटें सूखी.
  4. कॉलोनी गिनती और गणना
    1. 50 से अधिक कोशिकाओं के साथ कालोनियों की संख्या की गणना. कम से कम 50 कोशिकाओं के साथ छोटी कालोनियों को शामिल न करें। एक माइक्रोस्कोप के तहत कालोनियों की जाँच करने के लिए 50 कोशिकाओं द्वारा गठित एक कॉलोनी की छाप पाने के लिए और यह एक मार्कर कलम के साथ थाली के तल पर निशान.
      नोट: कुओं की फोटो खींच और सॉफ्टवेयर ImageJ का उपयोग कर गिनती प्रक्रिया की सुविधा होगी.
    2. उपनिवेश निर्माण दक्षता की गणना कीजिए क्योंकि बीज-कोशिकाओं की संख्या से विभाजित कालोनियों की संख्या। 0 Gy पर कॉलोनी गठन दक्षता द्वारा विभाजित एक निश्चित विकिरण खुराक पर कॉलोनी गठन दक्षता के रूप में अस्तित्व के अंश की गणना।
    3. y-अक्ष के रूप में x-अक्ष और अस्तित्व अंश के रूप में खुराक का उपयोग करना, एक अस्तित्व वक्र प्राप्त किया जा सकता है. धनात्मक तथा ऋणात्मक कोशिका आलंबों के बीच उत्तरजीविता वक्रों की तुलना की जा सकती है।

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Representative Results

र्ं2ं १-१-उच्चतथा र्2े1-निम्न अ549 कोशिकाओं को हल किया गया था (चित्र 1क)। कुछ मार्करों अलग आबादी दिखा सकते हैं और गेट करने के लिए आसान कर रहे हैं. हालांकि, कुछ मार्करों सिर्फ उच्च और कम अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाने के बजाय अलग सकारात्मक और नकारात्मक आबादी. इस स्थिति में, एक समप्रकार नियंत्रण gating के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। सॉर्ट किए गए कक्षों में $2 $1 का व्यंजक ुपीसीआर द्वारा मान्य किया जाता है. CACNA2D1की अभिव्यक्ति , जीन जो $2 $1 को एन्कोड करता है, हल किए गए में अधिक होता है [2]1-उच्च कोशिकाओं की तुलना में $2]1-निम्न कोशिकाओं (चित्र 1B)।

गोलों की विशिष्ट आकृति विज्ञान चित्र 2कमें दर्शाया गया है। गोले के निर्माण की दक्षता की गणना र्2 र्1-उच्च तथा र्2 र्1-निम्न कोशिकाओं (चित्र 2ठ)में की जाती है। [2]1 उच्च कोशिकाओं उच्च क्षेत्र गठन दक्षता से पता चला, एक उच्च आत्म नवीकरण क्षमता का सुझाव. सेल कालोनियों के विशिष्ट चित्र चित्र 3कमें दर्शाए गए हैं। लगभग 50 कोशिकाओं के साथ एक कॉलोनी एक माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जा सकती है और एक संदर्भ के रूप में चिह्नित किया जा सकता है। प्रत्येक खुराक पर एक जीवित रहने के अंश की गणना की जा सकती है, और उत्तरजीविता वक्र चित्र 3खमें प्रस्तुत किए गए हैं। 2 र्1़-उच्च कोशिकाएँ र्2र्1़र्रक् त कोशिकाओं की तुलना में विकिरण के लिए अपेक्षाकृत प्रतिरोधी होती हैं।

समूहों के बीच महत्व का मूल्यांकन करने के लिए अयुग्मित दो तरफा छात्र का टी-परीक्षण किया गया था। च और 0.05 का मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना गया था। डेटा माध्य और मानक विचलन (SD) के साथ प्रदर्शित किए जाते हैं. इसी तरह के परिणामों के साथ कम से कम तीन जैविक रूप से स्वतंत्र प्रयोगों से प्रतिनिधि डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं.

Figure 1
चित्र 1: A549 में $2 $1-उच्च और $2 $2 $1-निम्न कोशिकाओं को सॉर्ट करना। (क) प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का 2 $1 व्यंजक। कोशिकाओं को आइसोटाइप नियंत्रण के आधार पर गेट किया जाता है। (ख) QPCR द्वारा उच्च और निम्न जनसंख्या में 2 $1 अभिव्यक्ति की पुष्टि। त्रुटि पट्टियाँ SD इंगित करती हैं. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: क्षेत्र निर्माण परख [2]1-उच्च और ] 2 $1-निम्न A549 कोशिकाओं. (क) क्रमबद्ध र्2 र्1-उच्च तथा र्1 र्1-निम्न कोशिकाओं (ब़त 200 उ) द्वारा निर्मित गोलों की प्रतिनिधि आकृति विज्ञान। (बी) $2$1-उच्च और $2 $1-निम्न कोशिकाओं की क्षेत्र निर्माण दक्षता। त्रुटि पट्टियाँ SD (**p और lt; 0.001) इंगित करती हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: कालोनी निर्माण परख $2$1-उच्च और ]2 ]1-निम्न A549 कोशिकाओं की। (क) क्रमबद्ध र्1-उच्च तथा र्2 र्1-निम्न कोशिकाओं द्वारा निर्मित कालोनियों के प्रतिनिधि चित्र। (ख) $2$1-उच्च और र्2 र्1-निम्न कोशिकाओं के जीवन रक्षा वक्र। वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या के लिए अच्छी तरह से प्रति 200 कोशिकाओं थे 0 Gy, 400 कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से 4 Gy, और 8 Gy के लिए 800 कोशिकाओं. त्रुटि सलाखों एसडी (* * पी और lt; 0.05, * * * पी और lt; 0.001) से संकेत मिलता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल इन विट्रो में कैंसर सेल लाइनों में सीएससी की विकिरण संवेदनशीलता का अध्ययन करने के तरीकों का वर्णन करता है। इस अध्ययन में, एनएससीएलसी सेल लाइनों में $2$1 की अभिव्यक्ति निरंतर है। इसलिए, gating एक समप्रकार नियंत्रण पर आधारित है। छँटाई करने से पहले, प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एकाधिक कक्ष रेखाओं में अभिव्यक्ति की जाँच की जानी चाहिए और QPCR या पश्चिमी ब्लॉट द्वारा मान्य किया जाना चाहिए. यह अनुशंसा की जाती है कि एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के नीचे फ्लोरोसेंट को देख कर, या QPCR द्वारा (सॉर्टिंग के बाद) द्वारा प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा, सॉर्ट किए गए $2$1-उच्च और $2$1-निम्न कोशिकाओं की 2 $1 व्यंजक का पुन ः पुन विश्लेषण करने की अनुशंसा की जाती है।

क्षेत्र गठन परख आत्म नवीनीकरण क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल तरीका है, जो प्रारंभिक रूप से putative सीएससी की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस विधि का उपयोग ग्लियोमा या स्तन कैंसर कोशिकाओं में स्टेम कोशिकाओं की विशेषता के लिए न्यूरोस्फीयर या मैम्स्फियर को संस्कृति के लिए किया गया है , और इस सूत्र को अन्य प्रकार के कैंसर की संस्कृति में संशोधित किया गया है4,6,10. EGF और bFGF सीरम मुक्त माध्यम में स्टेम कोशिकाओं के आत्म नवीनीकरण का समर्थन कर सकते हैं; हालांकि, बुनियादी मध्यम और विकास कारक विभिन्न प्रकार के सेल culturing के लिए अलग हो सकता है. अर्धठोस माध्यम का उपयोग कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए किया जाता है ताकि गोले एक साथ क्लस्टरिंग के बजाय कोशिका प्रसार द्वारा बनते हैं। अल्ट्रालो लगाव प्लेट प्रयोग में क्षेत्र आकारिकी बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है। इसके अतिरिक्त, चूंकि सीएससी क्षेत्र संस्कृति के बाद समृद्ध होते हैं, जब गोले एकत्र किए जाते हैं, पचाते हैं, और द्वितीयक क्षेत्र के गठन के लिए वरीयता प्राप्त होते हैं, तो बाद के क्रमिक संचरण9,10में क्षेत्र निर्माण दक्षता में वृद्धि होने की संभावना होती है। सीएससी की विशेषता के लिए एक और अधिक कठोर मानदंड vivo सीमित कमजोर पड़ने परख में है, जिसमें हल सकारात्मक और नकारात्मक कोशिकाओं की संख्या की एक श्रृंखला प्रतिरक्षा की कमी चूहों में subcutaneously इंजेक्शन हैं, तो सकारात्मक में tumorogenic कोशिकाओं की आवृत्तियों और ऋणात्मक कोशिका जनसंख्या की गणना10,14की जाती है . यदि एक putative कैंसर स्टेम सेल मार्कर क्षेत्र गठन परख द्वारा की पहचान की है, vivo सीमित कमजोर पड़ने परख में आगे की विशेषता की सिफारिश की है.

इस अध्ययन में सीएससी की विकिरण संवेदनशीलता का मूल्यांकन किया जाता है। कालोनी गठन परख रेडियो संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए एक शास्त्रीय तरीका है। महत्वपूर्ण में समानांतर कुओं में कोशिकाओं की एक ही संख्या सीडिंग. प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा सेल निलंबन की मात्रा 100 $L से अधिक है यह सुनिश्चित करने के लिए एक उपयुक्त श्रेणी के लिए एक उपयुक्त श्रेणी के लिए सेल संख्या समायोजित करें। वॉल्यूम बहुत छोटा है, तो त्रुटि बढ़ ने करने के लिए संभावित है। सेल विकिरण के लिए, एक 1 सेमी ऊंचाई के साथ मध्यम खुराक बिल्ड-अप के लिए जोड़ा जाता है, और एक ऊतक-तुल्य बोलस को खुराक बैकस्कैटर के लिए प्लेट के नीचे रखा जाता है। शोधकर्ताओं को विकिरण भौतिकविदों और तकनीशियनों को कोशिका विकिरण मॉडल स्थापित करने और खुराक की गणना करने के लिए उल्लेख करने की सिफारिश की जाती है।

यह पांडुलिपि सीएससी के रेडियो संवेदनशीलता अध्ययन के लिए प्रारंभिक कुछ कदम प्रदान करती है। इसके अलावा तंत्र अध्ययन डीएनए क्षति की मरम्मत, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की निकासी, सेल चक्र गिरफ्तारी, आदि से संबंधित प्रोटीन शामिल हो सकतेहैं 15. इन प्रयोगों कोशिकाओं की एक बड़ी राशि की जरूरत है; इसलिए, कोशिकाओं के कई व्यंजन तैयार करने की जरूरत है. सीएससी जीनों के ओवरएक्सप्रेशन या नॉकआउट/

इन तरीकों संभावित कैंसर के ऊतकों में सीएससी की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है. झांग एट अल वर्णित CD166-सकारात्मक लिन नकारात्मक कोशिकाओं NSCLC शल्य चिकित्सा नमूने12से अलग. ऊतक एक बाँझ ब्लेड के साथ कटा हुआ और एक एंजाइम कॉकटेल के साथ पचा रहे थे. सेल उपभेदों के माध्यम से पारित करके एकत्र कोशिकाओं छँटाई के लिए लेबल थे, और फिर क्षेत्र गठन परख और vivo सीमित कमजोर पड़ने परख में विशेषता. सीएससी मार्कर के रूप में $ 2 के लिए, यह hepatotocellular कार्सिनोमा शल्य ऊतकों और छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर रोगी व्युत्पन्न xenograft ऊतकओं10,16में सीएससी को अलग करने के लिए सूचित किया गया है। कोशिकाओं की एक उच्च संख्या को ध्यान में रखते हुए विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं, यह अपेक्षाकृत बायोप्सी में सीएससी को अलग करने के लिए मुश्किल है या ट्यूमर कोशिकाओं घूम. वैकल्पिक रूप से, बायोप्सी के वर्गों धुंधला संभवतः ट्यूमर में सीएससी के अस्तित्व के लिए सुराग प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, इस अनुमानित आवेदन रोगी ऊतकों और नैदानिक डेटा में मूल्यांकन किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81402535 और 81672969) और राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान और विकास परियोजना (2016YFC0904703) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Trypsin-EDTA (10X), no phenol red Thermo Fisher 15400054 Dilute in to 0.05% (1X) with autoclaved distilled water
1B50-1 This antibody is produced and friendly supplied by Laboratory of Carcinogenesis and Translational Reseach (Ministry of Education/Beijing), Department of Cell Biology, Peking University Cancer Hospital and Institute. See reference 10. Alternatively, commercial antibody of calcium channel α2δ1 subunit can be used (ABCAM, ab2864) (Yu, et al., Am J Cancer Res, 2016; 6(9): 2088-2097)
4% formaldehyde solution Solarbio G2160
A549 ATCC RRID: CVCL_0023
B27 Thermo Fisher 17504044
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher 1336
Centrifuge Eppendorf 5910R
DMEM/F-12 Thermo Fisher 12500062
EGF Recombinant Human Protein Thermo Fisher PHG0311
Fetal bovine serum Thermo Fisher 16140071
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher PHG0261
Flow cytometer/cell sorter BD FACSARIA III
H1299 ATCC RRID: CVCL_0060
H1975 ATCC RRID: CVCL_1511
Lightning-Link Fluorescein Kit Innova Biosciences 310-0010
linear accelerator VARIAN CLINAC 600C/D
Methyl cellulose Sigma Aldrich M7027
Penicillin-Streptomycin, Liquid Thermo Fisher 15140122
Phosphate buffered saline Solarbio P1020
RPMI-1640 Thermo Fisher 11875093
SYBRGREEN TOYOBO QPK-201
TRIzol Thermo Fisher 15596026
Violet crystal staining solution Solarbio G1062

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 150 रेडियो संवेदनशीलता कैंसर स्टेम सेल फेफड़ों के कैंसर रेडियोथेरेपी कॉलोनी गठन परख क्षेत्र गठन परख प्रवाह साइटोमेट्री
फेफड़ों के कैंसर सेल लाइन्स में कैंसर स्टेम सेल की रेडियो संवेदनशीलता
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Sui, X., Geng, J. H., Yu, H. M., Li, Y. H., Wang, W. H. Radiosensitivity of Cancer Stem Cells in Lung Cancer Cell Lines. J. Vis. Exp. (150), e60046, doi:10.3791/60046 (2019).

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